自然杂志 | PASTOR技术实现单分子蛋白质突变与修饰精确测序

蛋白质在生物学中的多样性非常重要，特别是在疾病识别和治疗开发中。然而，现有的蛋白质测序技术面临着许多挑战，如检测灵敏度、动态范围、分析通量和设备成本等问题。为了解决这些问题，研究人员提出了一种基于纳米孔的新型蛋白质分析平台。纳米孔技术最早用于核酸测序，通过感知分子穿过纳米孔时的电流变化，可以直接读取分子信息，无需标签。这种技术不仅能区分肽段和蛋白质，还能实时监测蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体的相互作用，并检测氨基酸和翻译后修饰，如磷酸化和糖基化。

在这一研究中，研究人员开发了一种基于纳米孔的长链蛋白质单分子读取方法。通过结合ClpX解折酶的作用，使蛋白质以受控方式通过CsgG纳米孔，成功对长达数百个氨基酸的蛋白质链进行了测序。这项技术能够识别单个氨基酸的突变以及蛋白质链上的翻译后修饰。为了提高测序准确性，研究人员展示了多次读取同一蛋白分子的能力，并探讨了蛋白条形码测序的潜力。此外，他们还开发了一个物理模型，用于模拟基于氨基酸残基体积和电荷的纳米孔信号，从而增强了信号数据的解释能力。这项研究证明了在单分子层面上识别和表征完整蛋白质形式的可能性，为未来蛋白质测序和条形码技术的发展奠定了基础。

研究还开发了一种基于纳米孔和ClpX解折酶的蛋白质测序技术，称为PASTOR。该技术的核心在于通过纳米孔读取单分子蛋白质链的电流信号，并结合机器学习和物理建模技术实现蛋白质序列的精准测序。研究人员设计了特殊的蛋白质结构块（每块59个氨基酸）并引入单个氨基酸突变，利用双酪氨酸标记来分割电流信号，从而实现对氨基酸序列的识别和翻译后修饰的检测。

在蛋白质通过纳米孔的过程中，ClpX解折酶从反电极方向拉动蛋白质，通过监测电流信号变化捕捉蛋白质的结构信息。研究发现，不同突变蛋白的电流信号有明显区别，可以区分单个氨基酸的突变。通过对电流信号的进一步分析，研究人员揭示了不同氨基酸突变如何影响电流信号。他们还开发了一个物理模型，将每个氨基酸的体积和电荷与电流信号关联起来，通过机器学习技术优化分类模型，实现对不同氨基酸突变的准确识别。

为提高测序准确性，研究团队引入了“滑动序列”策略，使蛋白质可以多次通过纳米孔，显著提高了测序准确性。在20种氨基酸分类任务中，多次读取将准确率从单次读取的28%提升至61%。在7种氨基酸分类任务中，准确率从66%提升至99%。

此外，研究还展示了PASTOR技术在检测激酶磷酸化方面的应用能力。通过设计特定的磷酸化位点序列并利用纳米孔技术检测这些位点的磷酸化状态，研究人员能够精准量化并检测蛋白质分子上的多种磷酸化状态。实验结果显示，PASTOR技术能够实时跟踪并检测到蛋白质解折过程中不同折叠结构的动态变化，并在面对复杂折叠蛋白质时保持较高的读取准确性。

这项研究展示了PASTOR技术在单分子水平上识别完整蛋白质序列并表征翻译后修饰的潜力，为未来蛋白质测序和条形码技术的应用提供了有力支持。研究结果表明，该技术有望在高通量蛋白质功能研究和精准医学领域发挥重要作用，特别是在疾病标志物的检测和治疗靶点的发现方面。