细胞 | 谢一轩/柴培远等发现修饰RNA碱基acp3U系糖RNA中N-聚糖结合位点

糖基化是生物分子中最常见且重要的修饰之一，这种修饰在许多生物过程中如细胞识别、信号传导、蛋白质折叠与稳定性以及免疫反应中起着关键作用。已知的糖基化分子主要包括蛋白质和脂质。然而，斯坦福大学诺贝尔化学奖得主Carolyn Bertozzi的博士后Ryan Flynn在一次实验中发现，唾液酸的非天然分子SiaNAz能够通过细胞自身的代谢途径标记RNA分子。这一发现引发了一系列研究，2021年发表在Cell上的论文首次提出了RNA糖基化的可能性。随后，关于RNA糖基化的标记、监测及其生物功能的研究在多个期刊上发表。然而，科学界对于RNA糖基化的存在仍存疑，其中一个关键问题是RNA如何与N-聚糖连接，这对于验证糖RNA的存在以及研究其合成途径和生物功能至关重要。由于糖RNA分子的含量极低，传统方法难以获取这一重要信息。

2024年8月21日，现任波士顿儿童医院助理教授的Ryan Flynn与华盛顿圣路易斯大学医学院的生物质谱专家Benjamin Garcia课题组在Cell上发表文章，首次证明了修饰的RNA碱基acp3U是糖RNA中N-聚糖的结合位点。研究团队开发了一种新型化学工具rPAL，在温和高碘酸氧化条件下，与糖RNA上的唾液酸中的邻二醇发生特异性反应，形成醛基，再利用带有生物素的羟胺实现糖RNA的特异性标记。结果表明，rPAL技术不仅能够特异性标记糖RNA，而且与之前的方法相比，信号增益提高了150倍。

在建立rPAL技术后，研究人员通过生物素-亲和素系统和强洗涤条件对糖RNA进行了富集，并对其进行了灵敏的RNA修饰质谱分析。结果显示，acp3U核苷在多种条件下均被广泛检测到。基于PNGase F酶的释放反应，将N-糖与底物连接的酰胺转化为羧基，研究人员推测acp3U中的羧基由PNGase F酶解产生。在含有不同氧同位素的水中分别对富集的糖RNA进行PNGase F释放后，分析产物显示acp3U在两个条件下产生了标记的质量，并且与acp3U标准样品的质谱信息完全一致，证实了之前的猜想。进一步，通过糖苷内切酶Endo F2和Endo F3进行酶解，留下单N-乙酰葡萄糖胺记号，再通过靶向质谱鉴定，提供了RNA与糖质相连的直接证据。

最后，研究团队通过敲除acp3U合成酶家族中的DWDT2基因，发现糖RNA信号显著降低，这从生物学层面揭示了acp3U生物合成对糖RNA的影响，进一步证明了acp3U与糖RNA之间的联系。

综上所述，该研究首次揭示了糖RNA在分子结构和生物学基础方面的信息，为糖RNA的存在提供了直接证据，并为后续RNA糖基化的生物合成及生物功能研究奠定了基础。Ryan Flynn课题组近期再次发表文章，提供了RNA O-糖基化存在的证据。这些发现不仅丰富了我们对RNA糖基化的理解，还为未来开发基于糖RNA的新型诊断和治疗策略提供了更多可能性。