Vesicular Stomatitis

▲ 详细日程见文末 ▲1摘要在过去的两个世纪里，动物-人类界面在疫苗学的进步中发挥了核心作用。许多传统的兽医疫苗是通过生长，减弱，灭活和分离感兴趣的病原体而开发的。虽然这些方法非常成功，但我们已经达到了一个程度，它们在很大程度上已经用尽，需要替代方法。此外，尽管亚单位疫苗具有增强的安全性，并为接种疫苗和感染动物（DIVA）方法之间的联合区分创造了机会，但直到最近，它们的功能在很大程度上仅限于可以通过体液免疫控制的疾病。我们现在拥有新一代佐剂和递送系统，除了高滴度抗体应答外，还可以引发CD4+T细胞和/或CD8+T细胞应答。我们回顾了当前的疫苗平台技术，描述了它们在兽医疫苗学中的作用，并讨论了如何了解它们的行动方式，以便对其部署做出明智的决定，为一种健康带来更广泛的益处。2简介疫苗学植根于一系列经验性发现和技术创新，这些发现和创新逐渐改变了疫苗的设计和交付方式，以预防和控制疾病。动物-人类的交互一直是一个疫苗学进展的基本要素，从爱德华·詹纳（EdwardJenner）使用牛痘作为人类天花疫苗，到从牛结核杆菌中衍生出卡介苗（BCG）作为人类结核病疫苗，再到通过对动物和人类病原体进行基因操作来创建新型疫苗载体。根据技术发展，疫苗学历史大致分为两个阶段。第一个阶段是经验时代，反映了依靠分离、减毒、灭活和分离目标病原体以产生疫苗抗原的试错法。尽管这些方法本质上是“有根据的猜测”，特别是在了解保护性宿主免疫反应方面，但它们仍然非常成功，目前使用的大多数人类和兽用疫苗都是通过这种方式开发的。20世纪70年代初重组DNA技术的出现是一个重大进步，影响了生物学的所有领域。这与用于处理数据的信息技术创新相吻合，标志着所谓的理性疫苗开发时代的开始，提供了合成基因序列的能力，操纵病原体基因组并以与自然感染期间表达的格式密切相似的形式表达重组蛋白质，消除了对病原体生长的依赖。我们现在所处的时代，新的疫苗技术正在迅速发展和在人类和一系列兽医物种中进行测试，有机会减少我们对小型啮齿类动物作为生物医学模型的依赖，并了解更多关于不同物种疫苗安全性和有效性的知识。这对于跨越物种障碍的人畜共患病病原体的疫苗接种尤其有价值。我们仍然需要从动物和人类的角度了解宿主-病原体相互作用和对人畜共患病病原体的免疫反应，但通过解决这个问题，我们可以产生可用于新型疫苗开发的知识，造福动物和人类健康，即所谓的“一种健康疫苗学”方法。在这里，我们回顾了历史上支持疫苗设计的关键技术进步，我们阐述了疫苗平台技术的定义，并在兽医疫苗学和全球“全健康”议程的背景下对其进行讨论。3动物-人类交互的疫苗学詹纳在18世纪末的实验证明牛痘可以作为一种安全和保护性的人类天花疫苗，这是医学上的一个里程碑，使得世界卫生组织（世界卫生组织）于1980年认证全球根除天花。从詹纳的实验到路易斯·巴斯德在疫苗学领域的下一个重要里程碑，中间差不多有100年的时间。在19世纪末，巴斯德偶然发现，意外减毒的多杀性巴氏杆菌可以预防鸡霍乱。这促使他开发了第一种故意减毒的疫苗，不是针对鸡霍乱的，而是针对另一种动物疾病炭疽热。他证明，接种经温度处理的炭疽杆菌可以保护反刍动物免受实验性毒力杆菌的攻击。这是第一种针对人畜共患病病原体的疫苗，可导致动物和人类致命感染。巴斯德的发现引发了细菌疾病减毒疫苗开发的迅速发展。这是由于在实验室中分离和培养细菌的能力，这先于病毒的生长能力。第一个狂犬病疫苗是一个值得注意的例外，因为它基于感染组织的匀浆，而不是培养。这很快就被用于梭菌疾病的第一个灭活和亚组分类毒素疫苗所取代。这些疫苗比活疫苗具有安全优势，但免疫原性较低，因此需要加入佐剂以激活有效的免疫反应。20世纪中叶组织培养技术的出现为这些方法应用于开发病毒疾病的减毒活疫苗和灭活疫苗铺平了道路。这导致了兽医疫苗学最伟大的成就之一，即基于普劳赖特组织培养牛瘟疫苗（TCRV）在全球根除牛瘟。至关重要的是，疫苗根除计划得到了诊断能力和麻疹病毒系统发育创新的支持。表1总结了动物-人类界面疫苗学的主要成就。表1. 动物-人类交互疫苗学具有里程碑意义的技术进步，带来“全健康”的共同利益。兽医疫苗学领域的重大技术进步和成就，导致在兽医疫苗立法中纳入了平台技术主文件（PTMF）。有关疫苗开发的完整历史，请参阅参考文献[1]。有关目前使用不同平台技术的已获许可的商业兽用疫苗的信息，请参阅参考文献[16]。缩写词：APHIS：动植物卫生检查局；EMA：欧洲药品管理局；兽用医药产品委员会；FeLV：猫白血病病毒；IHNV：传染性造血坏死病毒；TCRV：组织培养牛瘟疫苗；USDA：美国农业部。*(https://www.aphis.usda.gov/animal_health/vet_biologics/publications/memo_800_213.pdf)；**（https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-datarequirements-vaccine-platform-technology-master-files-vptmf_en.pdf）4全健康世界卫生组织（世界卫生组织）将“全健康”定义为“一种设计和实施计划、政策、立法和研究的方法，在这种方法中，多个部门进行沟通和合作，以实现更好的公共卫生成果(https://www.who.int/news-room/questions-and-answers/item/one-health).新冠肺炎大流行加强了“全健康议程”的重要性，以及为什么我们不能孤立地看待人类健康、动物健康和环境健康。世界卫生组织特别强调，人畜共患病是“全健康”方法特别相关的一个领域。人畜共患病原体占新出现的人类感染的75%，对动物健康、人类健康和粮食安全构成重大全球威胁。世界卫生组织与联合国粮食及农业组织（粮农组织）和世界动物卫生组织（动物卫生组织）密切合作，促进采取多部门办法应对动物与人之间的公共卫生威胁。动物卫生组织是动物和动物传染病研究战略联盟（STAR-IDAZ）国际动物健康研究联合会（IRC）的合作伙伴之一，该联合会协调全球动物研究，以加快疾病控制工具和战略的交付(https://www.star-idaz.net/).这包括一个交互式通用研究路线图，以指导优先疾病缺口分析驱动的疫苗开发。这可以与公开的交互式在线工具结合使用，该工具旨在从疫苗目标产品简介（TPP）的识别到发现、产品开发和注册过程，识别兽医疫苗开发中的瓶颈。这些交互式在线工具中描述的疫苗开发研究阶段关键步骤的总结路线图如图1所示。图1.疫苗开发研究路线图摘要 从疾病鉴定到原型疫苗开发的路线可以定义一系列步骤，包括病原体的特征、宿主免疫反应、抗原生产、抗原递送、安全性和有效性的评估。确定最终疫苗目标产品概况（TPP）并影响路线图进展的多个因素如图2所示。兽用疫苗开发的完整互动研究路线图可以在参考文献中找到。后期疫苗开发和注册的管道也可以在参考文献中找到。5疫苗平台技术疫苗平台技术被定义为利用共同骨架或载体为针对不同疾病的疫苗提供特定抗原的技术。这包括（但不限于）欧洲药品管理局（EMA）兽医用药品委员会（CMVP）定义的基于蛋白质（例如病毒样颗粒[VLP]），基于载体（例如病毒，细菌，原生动物），基于核酸（例如DNA和RNA）和基于复制子（例如自扩增RNA）(https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-datarequirements-vaccine-platform-technology-master-files-vptmf_en.pdf)。疫苗平台技术的这一具体定义与EMA CMVP战略直接相关，该战略将疫苗平台技术主文件（PTMF）纳入其兽医法规。该战略的基本目标是通过减少行政监管负担，同时确保最高水平的人类和动物健康和环境保护，加速免疫兽医药品（IVMP）的开发。这将通过将PTMF作为IVMP档案的独立组成部分来实现，无论引入何种抗原，其基本上都不会改变。因此，一旦获得认证，PTMF可以用于利用通用平台技术的不同疫苗提交。EMA CMVP发布的疫苗PTMFs数据要求指南于2022年1月28日生效。这些准则的基本原则已经被人畜共患预期和防备倡议（ZAPI）采用。ZAPI是由创新药物倡议支持的欧盟公私合作伙伴关系，并为一种新型多聚体蛋白质支架颗粒（MPSP）平台技术起草了PTMF，该技术是其“一种健康方法”战略的一部分。MPSP平台技术正在用于开发针对中东呼吸综合征（MERS）病毒（人畜共患）、裂谷热（RVF）病毒（人畜共患）和施马伦贝格病毒（人畜共患潜力）的疫苗。在这篇综述中，我们正在研究2022年采用的EMA CVMP疫苗平台技术的定义。2018年，美国农业部（USDA）动植物健康检查局（APHIS）发布了含有使用通用平台从感兴趣基因表达的抗原的兽医疫苗许可证指南(https://www.aphis.usda.gov/animal_health/vet_biologics/publications/memo_800_213.pdf）。美国农业部动植物检疫局指南也旨在加快使用已建立的平台生产的兽医疫苗的监管过程，但没有以与欧洲药品管理局CVMP指南相同的方式指定PTMF（表1）。尽管兽用疫苗的开发时间通常比人类疫苗短（3-6年，而不是10-15年），但新冠肺炎大流行表明，在需要时，使用平台技术开发人类疫苗的监管流程可以得到简化，兽用疫苗PTMF的采用将进一步缩短这一过程。疫苗开发的起点是构建一个TPP（图2）。这可作为决策工具，以确保最终产品满足最终用户的期望，否则疫苗不太可能被部署。安全性始终是最重要的，需要有效性，但许多其他因素影响疫苗开发。这些因素的相对影响取决于所讨论疾病的影响、感兴趣的物种以及是否存在替代疾病控制方法，如生物安全和诊断。不应孤立地看待替代方法与疫苗接种的关系。事实上，区分接种疫苗和免疫动物的能力（DIVA）可能是制定针对牛结核病等疾病的疫苗部署政策的主要因素。新的疫苗平台技术能够引发高水平体液和细胞免疫反应，并同时提供多种已确定的抗原，这为结合DIVA方法预防和控制兽医疾病创造了令人兴奋的机会，包括以多种血清型存在的病原体。图2.影响兽医疫苗学平台技术部署的因素 疫苗目标产品概况（TPP）的构建规定了成功疫苗的理想特征，应在早期研发阶段建立。安全性和有效性是至关重要的总体标准。一旦确定了TPP，多种因素会影响新疫苗的设计和最终被终端用户接受。缩写：TPP，目标产品概况；DIVA，感染动物与接种动物之间的区别。6基于蛋白质的疫苗平台技术(a). 表达系统大肠杆菌是第一个被广泛研究用于重组蛋白表达的表达系统，也是第一个用于保护猫免受猫白血病病毒（FeLV）感染的原核表达兽用疫苗的首选系统。FeLV gp70表面蛋白在大肠杆菌中表达，与氢氧化铝和Quil A（一种纯化的皂苷衍生物）一起交付，通过在接种后引发强烈的体液和回忆反应成功保护猫。这种疫苗在许多方面都很突出，尤其是因为30年来仍然没有抗逆转录病毒人类疫苗。大肠杆菌是一种非常成功的蛋白质表达系统，但疫苗抗原的一个缺点是表达的重组蛋白可能无法反映天然蛋白的构象，因此无法引发保护性反应。对于构象和糖基化对保护很重要的抗原，酵母、昆虫或哺乳动物细胞等真核表达系统是首选。酵母表达已被用于人类疫苗（在纳米颗粒部分描述），但迄今为止尚未广泛用于兽医疫苗生产。相比之下，感染了杆状病毒载体的卵巢昆虫细胞表达了感兴趣的抗原，导致了许多兽医疫苗的产生。杆状病毒具有很强的启动子，导致感染细胞内重组蛋白的高产量。此外，昆虫细胞表达的重组蛋白经历翻译后修饰，包括糖基化、磷酸化和信号肽切割。虽然糖基化与哺乳动物细胞中产生的不同，但该平台已成功用于生产针对猪圆环病毒2型和猪瘟等疾病的商业疫苗。哺乳动物或禽类细胞可以说是表达兽用病毒疫苗重组蛋白的最佳手段，因为它们最有可能模拟宿主在自然感染过程中遇到的抗原结构和糖基化模式。然而，迄今为止研究的许多哺乳动物细胞表达系统都面临着与表达稳定性差和抗原产量低有关的技术困难。虽然中国仓鼠卵巢（CHO）细胞往往是哺乳动物表达细胞系的首选，但已采用其他几种细胞系，如幼年仓鼠肾（BHK）细胞、人胚胎肾（HEK）细胞和Vero细胞。基于植物或植物细胞培养的表达系统具有快速大规模廉价生产相对大量重组蛋白的优势。第一种在烟草植物中使用这种表达系统的许可疫苗是针对家禽新城疫病毒（NDV）感染的疫苗，并且已经在许多物种中进行了其他兽用疫苗应用的研究，包括传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、ETEC、牛病毒性腹泻病毒（BVD）和牛疱疹病毒。（b）佐剂蛋白质亚基疫苗的成功取决于这些蛋白质的配制和递送方式，以引发安全有效的免疫反应。基于矿物盐的佐剂已被广泛用于人类和兽医学，具有出色的安全性，主要似乎刺激体液免疫，尽管其确切作用机制尚不清楚，但似乎在动物和人类之间有所不同。兽用疫苗中使用的新一代佐剂包括各种油包水（W/O）、水包油（O/W）和水包油包水（W/O/W）的乳液制剂、皂苷、聚合物、Toll样受体（TLR）激动剂和各种细胞因子[19]。这些配方的引入得到了对其作用模式的详细免疫学知识的支持。特别有趣的是，矿物盐基佐剂无法刺激多种物种的细胞免疫反应。例如，一种基于免疫刺激复合物（ISCOM）的疫苗已被证明可以引发细胞回忆反应和以马体内IFN-c产生为特征的Th-1型免疫力，脂质体制剂可以引发猪体内的细胞毒性CD8 + T细胞反应，油包水乳液可以引发以绵羊体内IFN-c产生为特征的Th-1型免疫力，而传统的矿物盐基佐剂无法实现这些效果。(c).纳米颗粒有效刺激免疫反应的另一种系统是以20-100nm大小的颗粒形式递送重组蛋白。这包括由自组装成模仿病毒大小和形状但缺乏遗传物质的结构的分子组成的病毒样颗粒（VLP），以及可以由有机或无机材料构建的可生物降解的聚合物纳米颗粒。1986年，第一种使用重组DNA技术的许可疫苗也碰巧是第一种VLP疫苗，非凡的技术成就。重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是在酵母中表达并组装成直径为22nm的VLP。之前的乙型肝炎疫苗是基于从受感染供体的血浆中收集的灭活病毒。重组疫苗不仅更容易生产，更安全，而且更具免疫原性，引发更高滴度的中和抗体(https://www.nature.com/articles/d42859-020–00016-5)。我们现在知道VLP被树突状细胞吸收，刺激CD4+和CD8+T细胞诱导对靶抗原的细胞和体液免疫应答，解释了它们的高免疫原性。VLP可以使用细菌，酵母，植物和哺乳动物细胞产生，但迄今为止最合适的系统是昆虫细胞表达。这是猪圆环病毒2（PCV2）VLP疫苗的首选系统，该疫苗基于在昆虫细胞中表达的PCV2重组衣壳蛋白。VLP的免疫刺激特征加上表达系统的选择使其成为针对兽医物种中一系列病原体的疫苗设计的流行选择。它们已被证明在猪的PCV2等主要增强策略中是有效的，但也被证明可以在单次注射后保护鸡免受H7N9流感的致命攻击。聚合物纳米粒子可以由天然（chi-tosan）和合成（聚酯，聚酸酐和聚[二甲基硅氧烷]）材料合成，并用于递送包裹的抗原，这些抗原到达淋巴系统以在引流淋巴结中呈递，并在单次注射后诱导体液和细胞免疫。这项相对较新的兽医疫苗学技术正在评估由一系列病毒和细菌病原体引起的疾病，包括牛病毒性腹泻病毒（BVDV-1），牛呼吸道合胞病毒（BRSV），牛副流感3（BPI3V），牛腺病毒，牛疱疹病毒-1（BHV-1），鸟分枝杆菌亚种副结核，流产布鲁氏菌和边缘无浆体。7疫苗载体平台针对新型冠状病毒肺炎大流行启动的疫苗开发计划的成功证明了病毒载体疫苗平台在人类医学中的适应性和功能。然而，使用载体技术的疫苗在三十多年前首次引入兽医学，现在涵盖了一系列病毒，细菌和原生动物载体平台技术。最广泛使用的载体平台技术是基于病毒的技术。兽医疫苗学的大多数早期研究集中在复制大型DNA病毒，特别是痘病毒，疱疹病毒和腺病毒。选择这些基因是因为它们能够掺入外源基因而不影响其感染性或体内复制能力。20世纪80年代，通过将病毒糖蛋白G插入痘病毒痘苗中并以口服诱饵的形式传递给野生动物，开发了一种狂犬病疫苗（表1）。这种疫苗在欧洲和美国都导致了野生动物狂犬病的虚拟根除，通过减少狂犬病向人类的传播，这对一种健康来说是一个巨大的成功。牛痘也被探索（但尚未获得许可）用于许多其他兽医疾病，包括猪瘟、传染性胃肠炎、猪流感、禽传染性支气管炎、猫白血病和新城疫。尽管取得了这些成功，但使用痘苗作为载体仍存在许多潜在的问题，其中包括在野外条件下与其他痘病毒重组的担忧，尽管在天花根除运动中有着良好的记录，偶尔会出现不良反应。改良的安卡拉痘苗（MVA）是一种特征非常明确的痘苗减毒衍生物，它通过在禽细胞中重复传代而失去了在哺乳动物细胞中复制的能力，增加了其作为疫苗载体的安全性。实验性MVA二价疫苗已被证明可以保护绵羊免受裂谷热（RVF）和蓝舌病病毒（BTV）的侵害，许多其他痘病毒已被评估为兽医疫苗学的载体，包括金丝雀痘和禽痘，它们已成功用于许多商业禽类和哺乳动物疫苗。尽管它们被广泛使用，但对痘病毒载体在不同兽医物种中诱导免疫的确切免疫机制知之甚少。最值得注意的是，尽管它们在诱导中和抗体方面明显有效，但它们对细胞免疫的影响尚不明确。腺病毒作为人类基因传递的潜在载体已被广泛研究，因此其特性已被充分了解。它们具有高度可操作性，可以改变其复制能力，细胞趋向性，免疫原性和插入感兴趣的抗原，使其成为一种非常便携的疫苗平台技术。一系列人类和动物病毒已被评估为潜在的疫苗载体，可能最值得注意的是复制缺陷型黑猩猩腺病毒ChAdOx1和人类腺病毒血清型26（Ad26）载体，用于接种人类抗SARS-CoV-2。腺病毒的一个特殊特征是它们能够感染或转导骨髓细胞，激活先天免疫感觉机制，并通过MHC I类和II类的有效抗原加工和呈递触发适应性免疫，导致CD8+和CD4+T细胞和B细胞活化，产生针对感兴趣抗原的高抗体滴度和效应细胞免疫。根据所讨论的疾病，对每个平台引发的细胞效应机制的详细了解可以为其部署提供信息。值得注意的是，用于控制COVID-19大流行的腺病毒载体指导细胞对Th-1型谱的反应，其特征在于产生IFN-c，TNF-α和IL-2，与保护性宿主对SARS-CoV-2感染的反应相关。尽管迄今为止腺病毒载体尚未广泛用于兽医物种，但潜力明显存在，目前正在开发各种疫苗。有趣的是，SARS-CoV-2 ChAdOx1疫苗推出最终采用的主要加强策略部分基于免疫猪的免疫学读数，这是一个实践中健康疫苗学的一个很好的例子。ChAdOx1载体也被用于通过引发中和抗体成功地保护反刍动物免受RVF流产的影响，作为单次疫苗。同样的疫苗主种子病毒（用于生产疫苗的病毒原种）也被用于开发人类疫苗以防止RFV，这是控制人畜共患病原体的常见疫苗设计对健康有益的另一个例子。基于载体的疫苗的单次免疫方案的许多优点之一是避免了抗载体免疫。几项研究表明，预先存在的对人类Ad5的免疫力降低了其载体能力对人类免疫HIV和埃博拉病毒的功效，并且抗Ad中和抗体和抗Ad T细胞可以阻止转导并杀死转导的细胞。然而，抗载体免疫对靶抗原反应的影响绝不是确定的。使用同源载体（水泡性口炎病毒[VSV]）接种人类预防拉沙热，然后接种埃博拉病毒，即使接受者有可检测的抗VSV反应，也能预防埃博拉病毒。随着SARS-CoV-2疫苗的推出和COVID-19大流行的同步发展，我们现在看到了抗载体免疫数据的出现。有迹象表明，抗载体免疫可能会影响抗SARS CoV-2的尖峰反应，但也有数据表明，可检测到的抗载体对Ad26的反应并不相关。接种疫苗后有抗尖峰反应，这表明我们在抗载体免疫方面还有很多需要学习的地方。这些知识对于告知单次加强，初次加强和多次加强疫苗方案非常有用。减毒疫苗可以通过诱导对主要靶标和不同病原体的外源抗原的免疫来适应作为多价疫苗“载体”。这是使用黄热病疫苗作为插入外源基因的骨架的新型平台技术的基础，以诱导对登革热病毒，西尼罗河病毒和日本脑炎病毒的伴随保护。这种方法已成功用于兽医疫苗学。火鸡疱疹病毒（HVT）是家养火鸡中普遍存在的非致病性病毒，被归类为马立克氏病病毒（MDV）中的第三种血清型。HVT在鸡中也是非致病性的，但它确实诱导了一种病毒血症，这种病毒血症与诱导针对MDV1的保护性免疫应答有关，并且自20世纪60年代末以来一直被用作针对马立克氏病的活疫苗。HVT已被修饰以表达其他病原体的抗原，以产生针对马立克氏病和其他家禽疾病（如新城疫，传染性法氏囊病和传染性喉气管炎）的多价疫苗。这些多价载体疫苗已经建立了一个新的标准，为最终用户提供了方便的分娩和同时保护免受重要家禽病原体的侵害。细菌和原生动物也被研究作为兽医疫苗载体的潜力。它们激活病毒免疫反应的不同分支，并可以通过不同的部位感染，如粘膜。其中一种细菌是鼠伤寒沙门氏菌，它与大肠杆菌有关，因此接合、转化和转导系统是众所周知的。最近，一种利用重组减毒沙门氏菌疫苗技术的疫苗已被开发出来，可以通过饮用水或喷雾来控制由a型产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎(https://www.huvepharma.com/news/article/huvepharma-inc-introducesnew-vaccine-to-combat-necrotic-enteritis/).研究开发家禽疫苗的另一种潜在载体平台技术是基于顶复门寄生虫，如Eimeria。目前正在探索这种方法来开发针对空肠弯曲杆菌、弓形虫、传染性法氏囊病、坏死性肠炎以及可能的其他艾美耳球虫物种的疫苗。虽然目前还没有使用该平台技术的许可疫苗，但该方法提供了利用低成本大规模疫苗递送方法（孵化场喷雾、水中和饲料中）进行内源性和多种外源性抗原递送以对抗各种家禽病原体的可能性。8核酸疫苗平台核酸疫苗基于编码目标抗原的DNA或RNA，并且可以以各种形式递送以诱导免疫反应。2005年，第一种获得许可的核酸疫苗是一种兽医DNA疫苗，用于保护加拿大大西洋鲑鱼免受传染性造血坏死病毒疾病的侵害（表1）。尽管随后的DNA疫苗已被许可用于鱼类和马，但它们尚未在兽医物种中广泛应用。新冠肺炎大流行后，第一种人类DNA疫苗获得了许可，这种疫苗可以使用压在皮肤上的高压无针设备进行注射，为大规模疫苗接种提供了实际优势。与DNA疫苗相比，人们越来越关注RNA。由于RNA固有的不稳定性，人们对这种方法持一定程度的怀疑态度。然而，通过细胞膜稳定和递送RNA以翻译靶抗原的技术进步为疫苗设计开辟了新的途径。这种方法的起源可以追溯到20世纪80年代末，当时信使核糖核酸链与脂肪滴混合，并输送到人体细胞中合成蛋白质。这导致了信使核糖核酸可能是一种疫苗平台技术的概念，但最初的吸收是有限的。又一次，新冠肺炎大流行加速了两种新的人类mRNA疫苗的开发和紧急批准。这些疫苗基于编码严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型刺突蛋白的信使核糖核酸，该刺突蛋白在脂质纳米颗粒中配制，用于保护性递送至胞质溶胶。两种疫苗都能诱导高滴度的中和抗体，其中最主要的策略诱导的抗体滴度超过了在新冠肺炎恢复期血清中观察到的抗体滴度。与基于腺病毒载体的新冠肺炎疫苗一样，mRNA疫苗也诱导具有类似Th-1型偏倚的CD4+和CD8+细胞免疫，尽管这些细胞反应的程度似乎更低，更依赖于加强剂量。这些知识支持对这些平台未来部署的知情决策，包括它们在兽医疫苗学中的应用。值得注意的是，到目前为止，还没有获得许可的兽医信使核糖核酸疫苗。一个相关的平台是基于基因工程复制子的自我扩增（sa）RNA，可以作为病毒复制子颗粒（VRP）递送，saRNA包装在病毒颗粒中，或作为体外转录后产生的完全合成的saRNA。与常规mRNA相比，这些saRNA可以在较低剂量下表达更高水平的抗原，提供潜在的成本效益。一种基于甲病毒的saRNA载体，衍生自委内瑞拉马脑炎病毒甲病毒，已被评估用于兽医应用，并且是美国农业部批准的两种商业猪疫苗的基础，用于控制传染性猪流行性腹泻和猪流感。至于病毒载体，saRNA具有诱导对平台本身扩增过程所涉及基因产物的免疫的理论风险。9兽医疫苗学的机遇新冠肺炎大流行迅速加速了平台技术在人类医学中的应用。伦敦卫生与热带医学院运营的疫苗跟踪器显示，目前有300多种疫苗正在研发中，其中100多种正在进行临床试验(https://vac-lshtm.shinyapps.io/ncov_vaccine_landscape/).其中包括（但不限于）本文所述的平台技术（蛋白质亚基、VLP、病毒载体、DNA和RNA）。这些努力的一个前所未有的科学成果将是详细了解这些不同平台在保护和相关免疫反应方面如何对抗同一疾病。这将为这些平台在人类和兽医疫苗学中的未来部署做出明智的决定，从而带来巨大的“全健康”效益。正如我们所见，不同的平台技术诱发不同类型的免疫反应。利用这些信息，结合对病原体的了解、宿主保护性免疫反应的功能知识以及所需TPP的构建，可以对新型疫苗设计做出明智的决定（图2）。然而，关于兽类感染和疫苗接种免疫反应的综合数据的可用性仍然是一个可以改进的领域。这种研究因缺乏兽类免疫试剂而受到阻碍，但现在正在通过免疫工具箱等举措来解决这一问题。最终，这些研究将提供关于跨物种疫苗平台技术比较功能的详细知识，从而使“全健康”受益。最重要的是，兽医疫苗需要为最终用户所接受和部署。实用性不能被定义为一种特征，而是包含了许多可以直接相互影响的特征（图2）。例如，疫苗的购买成本将受到生产商品成本、引发保护性免疫所需的注射次数和必要交付基础设施（如冷链）的影响。因此，有效的单次注射疫苗可以通过鼻内接种诱导家畜的粘膜保护性免疫的可能性，如原型BSRV聚合纳米颗粒疫苗，是兽医疫苗平台技术的一个非常重要的进步。10结论因此，从这篇综述中可以清楚地看到，需要改进兽医专业知识，整合关于人畜共患病威胁的知识，这些知识可以转化为全球健康政策，以实现“全健康”的共同利益，包括疫苗接种。此外，我们需要意识到，只影响动物的非人畜共患病仍然对动物福利和粮食生产系统产生直接影响。它们还可以对环境和社会产生影响，影响公共卫生、福祉和环境，如气候变化。及时引入拟议的监管立法，有可能加快基于明确定义的平台技术的兽用疫苗的注册，为控制动物疾病和实现更广泛的“全健康”共同利益提供了令人兴奋的新机遇。参考资料：Entrican G, Francis MJ. Applications of platform technologies in veterinary vaccinology and the benefits for one health. Vaccine. 2022 May 3;40(20):2833-2840. doi: 10.1016/j.vaccine.2022.03.059. Epub 2022 Apr 2. PMID: 35382957.为了推动兽用生物制品行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展、乘风济海将于2024年4月17日-18日在南京共同举办“兽用生物制品研发和产业化大会”，系中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）中的一个分领域专业会议。诚邀全国相关领域研究者共享学术盛会。名称：兽用生物制品研发和产业化大会时间：2024年4月17日-18日（周三-周四）地点：南京国际展览中心主办单位：生物制品圈、抗体圈、四叶草会展，乘风济海媒体支持：药时空、细胞基因研究圈报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请（严格审核通过）。大会日程注：大会日程以会议现场为准。中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）是一场将“政、产、学、研、用、管、投”各方精英围绕全产业链新资源展开的合作大会，将于2024年4月16日-18日在南京国际展览中心举办。大会将主打“全产业链新资源对接”，围绕投资、立项、临床前研发、临床研究、生产、供应链国产化、销售、MAH合作、国际品种合作、公司股权合作与并购全产业链，为中国医药同仁带来全新的资源与商机。大会下设的同期会议包括：宠物药品、食品、保健品新资源大会兽用生物制品研发和产业化大会透皮技术研发生产与注册开年分享会吸入制剂研发、生产与注册新机遇新进展分享会中国改良新药与缓控释制剂全产业链合作大会多肽产业创新与发展大会新药典新型辅料与包材产品与技术交流会新药典新型实验室仪器与耗材实操演示交流会陆续更新中......识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

基于细胞培养的载体疫苗和病毒治疗药物的生产越来越受到人们的关注。所使用的载体不仅截留了感染细胞的能力，而且还诱导了强大的免疫反应。使用两种基于重组水泡性口炎病毒（rVSV）的构建体，我们对集成的封闭式一次性灌流系统进行了概念验证研究，该系统允许连续的病毒收获和澄清。使用悬浮 BHK-21 细胞以及水疱性口炎病毒和新城疫病毒 (rVSV-NDV) 的融合溶瘤杂交体，利用改良的交替切向流装置 (mATF) 或切向流深层过滤 (TFDF) 系统进行细胞截留。由于前者的中空纤维具有较大的内腔（0.75 mm；孔径0.65μm），因此可以防止感染过程中形成的多核合胞体造成的膜阻塞。然而，病毒颗粒被完全截留。相比之下，TFDF过滤单元（内径3.15 mm，孔径2-5μm）不仅可以实现高活细胞密度（VCC，16.4-20.6×10 ^6 cells/mL），而且可以连续收获和澄清载体。与优化的批次工艺相比，在澄清的滤液中获得了高11倍的传染性病毒滴度（最大7.5×10 9 TCID 50 /mL）。使用HEK293-SF细胞和表达绿色荧光蛋白的rVSV载体，灌流培养实现的最高VCC为11.3×10 ^6 cells/mL，滤液中感染性病毒滴度高达7.1×10 10 TCID 50 /mL。不仅可以连续收获，还可以进行澄清。虽然单位细胞病毒产量相对于作为对照的批次工艺有所下降，但获得了增加的时-空产量。关键点•使用 TFDF 灌流系统生产病毒载体使时-空产量提高 460%•使用 TFDF 系统可以连续收获和澄清病毒•TFDF 灌流系统在建立强化载体生产方面具有巨大潜力在对抗传染病的不懈追求中，在细胞培养中生产的重组载体疫苗在过去十年中受到了欢迎。与其它疫苗平台相比，基于病毒载体的疫苗保留了感染细胞的能力，从而通过增加体液和细胞免疫来诱导强大的免疫反应。基于腺病毒载体的SARS-CoV-2 疫苗成功大规模应用及其针对多种传染病的潜在应用，推动了开发新型重组载体疫苗以及改进当前生产工艺的巨大研究努力（到 2023 年将占全球疫苗研发领域的 14%）。其中一种载体基于重组水泡性口炎病毒（rVSV）。由于其广泛的向性、高滴度的快速复制动力学、低病毒致病性、人类中罕见的预先存在的抗载体免疫力以及易于基因操作，rVSV 在疫苗和溶瘤应用中受到欢迎。将 rVSV 的天然糖蛋白替换为任何目的糖蛋白，可以递送外源抗原，从而为疫苗应用引发强大的体液和细胞免疫，同时降低与生产相关的生物安全标准（例如，针对高致病性病毒）。使用 rVSV 生产平台生产的各种候选疫苗已显示出对埃博拉病毒、SARS-CoV-2、马尔堡病毒、拉沙病毒、安第斯病毒、乙型肝炎病毒、鼠疫耶尔森氏菌、呼吸道合胞病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、尼帕病毒、寨卡病毒、人乳头瘤病毒、动物模型中的流感病毒的预防效果；有些正在临床试验中进行测试。尽管预防功效得到充分证明，但目前只有一种基于 VSV 的扎伊尔埃博拉病毒疫苗 (rVSV-ZEBOV) 于 2019 年获得 FDA 和 EMA 批准。rVSV 作为溶瘤药物的使用特别令人感兴趣，因为其高致细胞病变性、快速复制周期、不整合到宿主基因组中、IFN 敏感性、选择性感染和有效诱导肿瘤细胞凋亡，满足病毒疗法的所有关键特征。进一步的基因修饰方法，例如用异源融合糖蛋白假型化先天糖蛋白，生成可以递送基于融合的病毒繁殖的嵌合构建体，进一步增强基于 rVSV 的构建体的溶瘤能力。一种基于 rVSV 的新型构建体含有新城疫病毒 (NDV) 的融合突变蛋白，并在各种肿瘤模型中显示出有希望的临床前功效。为了满足前所未有的需求以及许多基于 rVSV 的疗法所需的高输入剂量，需要强化当前基于批次的生产策略。与传统的贴壁生产相比，在化学成分确定的培养基中使用悬浮细胞系可以设计更容易规模放大的工艺，以获得更高的细胞密度和更小的占地面积。通过建立灌流培养，用新鲜培养基不断更换营养耗尽的培养基，同时使用细胞截留装置将细胞截留在生物反应器中，甚至可以获得更高的细胞密度。灌流模式下的工艺强化可提高病毒滴度、单位细胞病毒产量 (CSVY)、时-空产量 (STY) 和单位体积病毒生产率 (VVP)，已针对不同病毒和载体（例如寨卡病毒、甲型流感病毒（IAV）、慢病毒载体（LV）、腺相关病毒（AAV）、rVSV-COV-2、改良安卡拉痘苗病毒）进行了详细阐述。然而，通过瞄准更高的细胞密度，CSVY可能会降低（高细胞密度效应），从而降低STY和VVP。对于高细胞密度培养，广泛采用基于膜的系统，即交替切向流（ATF）和切向流过滤（TFF）组件。这些系统的一个主要缺点是过滤器污染的风险（尽管 ATF 具有自清洁反冲功能）和病毒颗粒截留，这会导致病毒在细胞环境中的生物反应器内积聚，直到完全收获生物反应器培养液。由于病毒释放通常会导致细胞裂解，细胞碎片和 DNA 随着时间的推移而增加，同样增加了培养液的粘度，并进一步增加了膜堵塞的风险。由于细胞蛋白酶的释放、病毒颗粒对细胞碎片的吸附以及病毒温度敏感性，在生物反应器内长时间停留会对病毒感染性产生负面影响。此外，rVSV-NDV 等融合溶瘤构建体会在灌流培养物中形成大型多核合胞体（>100 μm），可能会阻塞常用中空纤维膜的小尺寸管腔。克服这一问题的一种方法是使用非膜系统，例如声学过滤器或倾斜沉降器；然而，这些系统通常很复杂或与工业规模的生物反应器不兼容，并且细胞截留效率较低。或者，可以使用允许病毒颗粒通过的膜。最近，这一点已在利用与 ATF 系统连接的管状膜（VHU，孔径约 10 μm）生产 IAV 缺陷型干扰颗粒中得到证实。使用切向流深层过滤 (TFDF) 灌流组件（孔径 2–5 μm），已显示可以连续收获 LV 和 AAV。这使得感染性病毒颗粒的停留时间更短，并且可以立即将收获的材料储存在冷却罐中，以提高病毒稳定性，从而提高病毒产量和生产率。例如，使用用于 IAV 生产的声学沉降器进行连续病毒收获，相对于使用带有 PES（孔径0.2 μm）的中空纤维膜的灌流运行，将 CSVY 和 VVP 提高了 1.5 倍。此外，TFDF 组件可以将连续病毒收获和澄清结合在一个步骤中，减少单元操作数量，从而节省时间和金钱。总而言之，这可以实现上游（病毒生产）和下游工艺（病毒纯化）的直接整合，进一步降低成本，同时提高灵活性和生产力。在这项研究中，我们评估了 TFDF 灌流系统作为新型细胞截留装置的适用性，以及在单次操作中实现灌流培养和连续收获过滤以及澄清（降低浊度）的适用性。将两种不同的基于 rVSV 的载体（一种诱导经典的细胞病变效应，另一种介导细胞融合反应）的生产工艺强化与优化的批次工艺进行比较。详细的试验操作和结果，请参考原文。用于灌流培养的 TFDF 设置方案，具有手动调整 (I) 或自动 (II) 灌流控制。BHK-21 细胞通过 Levitronix 磁力离心泵以单向流连续泵入 30 cm 2 TFDF 组件（孔径 2–5.0 μm）。分别使用天平和 KrosFlo 的集成流量传感器控制进料和入口的流量。对于细胞生长期，滤液流量可以手动调节（I，使用 KrosFlo 控制器）或控制（II，使用电容探针）。较大的橙色圆圈表示细胞，黑色椭圆表示病毒颗粒，虚线表示不同类型的信号传输。使用配备 3-L 模块化适配器并连接到 mATF 的 SB10-X，在灌流模式下，在 BHK-21 细胞中生产 rVSV-NDV。以0.9×10 ^6 cells/mL接种BHK-21细胞，并在批次生长期后56小时开始灌流。随着时间的推移手动调整灌流速率。对于细胞截留，使用 0.65 μm mPES 中空纤维膜。一旦达到44.5×10 ^6 cells/mL的VCC （MOI为1E-4），进行感染，将温度降低至34℃，并暂停灌流4小时。A VCC（实心符号）和活性（空心符号）。B单位细胞灌流速率（实心符号）和灌流速率（虚线，收集的滤液重量除以 WV）。C在生物反应器（实心符号）和滤液（空心符号）内测量的感染性病毒滴度。使用与 TFDF 系统连接的 3-L STR 在灌流模式下在 BHK-21 细胞中生产 rVSV-NDV 的关键工艺参数。BHK-21细胞以0.8×10 ^6 cells/mL接种，并在批次生长期后46-51小时使用TFDF组件（孔径2-5μm）开始灌流。第一次 TFDF 运行（TFDF1，紫色方块）是手动调整的，而第二次 TFDF 运行（TFDF2，粉色圆圈）是根据电容探针测量的生物量进行控制。一旦达到14×10 ^6 cells/mL的VCC （MOI为1E-4），进行感染，温度降至34℃，并暂停灌流1-2小时。A活细胞密度（实心）和活性（空心）。B单位细胞灌流速率（实心）和灌流速率（虚线，收集的滤液重量除以 WV）。C生长和感染过程中 TFDF 膜的细胞截留效率（实心）和浊度降低（空心）。D细胞生长和感染阶段的跨膜压 (TMP)。虚线表示感染时间。BHK-21 细胞在TFDF1（紫色方块）和 TFDF2（粉色圆圈）灌流模式下生成的 rVSV-NDV。在反应器（实心）和滤液（空心）中测量的A感染性病毒滴度 (TCID 50 /mL)、C双链 DNA (μg/mL) 和E总蛋白 (mg/mL)的时间进程。TFDF 膜允许通过滤液连续收获 rVSV-NDV。B、D、F将滤液收集在多个部分（“收获瓶 1-4”）中，每 12-24 小时更换一次，以防止病毒感染性丧失。瓶 1 指从 0 至 24 hpi 收集的滤液，瓶 2 指 24–36 hpi，瓶 3 指 36–48 hpi，瓶 4 指 48–60 hpi。“最终收获”是指在最终收获步骤中回收的材料（浓度1，洗滤；最终浓度2）。“累计”是指所有瓶子的累计产量和最终收获量。使用不同生产模式和工艺的 rVSV-NDV 溶瘤病毒效力值的比较。在 48 hpi 时测定了Huh7 肿瘤细胞的活性，包括批次模式（红色三角形）、声学沉降器灌流（AS1，蓝色实心三角形；AS2，空心蓝色三角形）和 TFDF 灌流（TFDF1，紫色方块；TFDF2，粉色圆圈）。非线性回归分析后，从剂量反应曲线确定IC 50和log IC 50值。所有值均以三次重复的平均值报告，其中n =3。在 HEK293-SF 细胞中以批次模式生产 rVSV-GFP。使用一个摇瓶（SF 1，50 mL WV，红色圆圈）、一个 1 L STR（STR 1，700 mL WV，浅绿色方块）和一个 3 L STR（STR 2，2100 mL，深绿色方块）进行三批生产运行）。细胞以0.3–0.4×10 ^6 cells/mL接种并培养至1.1–1.3×10 ^6 cells/mL。感染前，温度从 37°C 降至 34°C。细胞以 1E-3 的 MOI 被感染。A VCC（实心符号）和活性（空心符号）。B传染性病毒滴度（TCID 50 /mL）。使用与 TFDF 系统连接的 3-L STR 在灌流模式下在 HEK293-SF 细胞中生产 rVSV-GFP。循环在接种前开始。HEK293-SF细胞以0.8×10 ^6 cells/mL接种，并在批次生长24小时后使用TFDF组件（孔径2-5μm）开始灌流。随着时间的推移手动调整灌流速率。感染前，温度降至34°C。以1E-3的MOI感染细胞(10×10 ^6 cells/mL)，并暂停灌流1小时。A活细胞密度（实心）和活性（空心）。B单位细胞灌流速率（实心）和灌流速率（虚线，收集的滤液的重量除以 WV）。C生长和感染期间 TFDF 膜的细胞截留效率（实心）。D反应器（实心符号）和滤液（空心符号）中的感染性病毒滴度 (TCID 50 /mL) 相对于感染后时间 (h) 进行绘制。渗透线显示的最后时间点 (31 hpi) 是指最终收获步骤。讨论第一种基于 rVSV 的疫苗，即埃博拉病毒疫苗 Ervebo®，已于 2019 年获得批准（EMA 2019；FDA 2019）。此外，用于疫苗和溶瘤应用的多种基于 rVSV 的构建体目前正在进行临床试验。因此，无论用途如何，开发高产量的生产平台对于满足临床试验和市场需求都至关重要。与传统载体平台相比，rVSV-NDV 诱导合胞体给生产工艺带来了额外的挑战。在这项概念验证研究中，我们评估了 TFDF 系统在强化高细胞密度生产方面的通用性，适用于两种不同的基于 rVSV 的构建体（rVSV-NDV 和 rVSV-GFP），以实现连续的病毒收获和澄清。使用 mATF 生产 rVSV-NDV中空纤维膜的产物截留是基于 ATF 的细胞培养生产的一个众所周知的挑战，它阻止了病毒颗粒等的连续收获。为了评估中空纤维膜用于生产形成大型多核合胞体的融合溶瘤病毒的适用性，选择了市售的 0.65 μm mPES 膜，其内腔尺寸比之前观察到的合胞体 (120–140 μm) 大，连接到 mATF，并表征病毒截留。膜材料对产物截留的影响尚未完全阐明。虽然一些研究发现，由于负电荷密度较高，使用聚砜 (PS) 膜的抗体截留率比聚醚砜 (PES) 和 mPES 更明显，但其它研究报告了更有利的理化和结构特性 (PS 膜开放的孔结构和高孔隙率，即使在 0.34 μm 的低孔径值下也能收获黄热病病毒颗粒（~50 nm）)。除了膜材料之外，孔径大小对于产物截留也起着至关重要的作用。令人惊讶的是，与较低孔径（例如 0.2 μm）相比，具有较高孔径（例如 0.65 μm）的膜通常表现出更高的产物截留率。较大孔径更明显的异质孔隙分布会增加污染的敏感性，因为沿膜的滤液通量的变化使得较大的孔隙容易沉积颗粒和浓差极化。此外，由病毒诱导的细胞裂解引起的小尺寸细胞碎片（0.2-0.5 μm）可以进入较大的膜孔，导致膜堵塞和产物滞留，但不会进入较小的膜孔。使用 HEK293 细胞进行 rVSV-NDV ATF 生产时，使用 0.2 μm PES 中空纤维膜，在观察到第一次合胞体形成后，即在 18 hpi 时，导致膜完全堵塞。因此，膜的选择主要基于内部纤维腔而不是孔径或材料。与使用 0.2 μm PES 膜 (0.8 L/min) 的初始 ATF 运行相比，选择了更高的中空纤维内部流速 (1.5 L/min)，以通过提高剪切应力，增加膜上的反冲洗，并防止或阻碍合胞体的形成。令人惊讶的是，所产生的 5490 s-1 剪切速率不会影响细胞生长，因为高VCC 值44.5×10 ^6 cells/mL 达到了 0.031 1/h 的高细胞特异性生长速率，也没有阻止合胞体的形成。然而，正如之前用声学沉降器观察到的那样，形成的合胞体较小（直径最大为 75 μm），允许进入较大的纤维，这可能防止完全堵塞。然而，高中空纤维流速与1.91 L/h/m 2的低滤液通量的组合并没有阻止膜对rVSV-NDV的截留。18 hpi 时，97% 的感染性病毒已被截留，这进一步凸显了使用中空纤维膜连续收获病毒颗粒的挑战。使用 TFDF 生产 rVSV-NDV作为概念验证，我们开始利用 TFDF 系统作为细胞截留装置，用于灌流和随后的连续收获过滤。性能通过细胞生长、TMP、生物反应器和滤液浊度以及病毒渗透性的量化来表征。TFDF 系统的使用使 BHK-21 细胞能够获得高 VCC，尽管剪切应力大大降低，但与 mATF 系统相比，其生长行为相似。由于之前实验中在非常高的 VCC 下获得的 CSVY 较低，因此感染的目标细胞密度大幅降低。与之前报道的批次培养相比，所有灌流培养的代谢摄取率均略有增加。剪切应力的增加，特别是在 ATF 和 TFF 系统中，已被确定为底物吸收率增加的原因之一。通过电容探针控制灌流速率并没有改善整体工艺性能，但在整个生长阶段稳健地保持稳定的 CSPR 值（图3），从而减少了 15% 的培养基消耗。与 TFDF1 的手动灌流控制相比，由于部分过度补料，CSPR 值较高，葡萄糖水平无法稳定维持，在感染前降至 5 mM 以下。TFDF2 生长速率的略微增加很可能导致葡萄糖摄取增加，从而增加乳酸形成。为了支持更高的 VCC，应增加 CSPR 的设定点以用于未来的电容控制运行。深层过滤（DF）与切向错流过滤（TF）的组合提供了多种好处，例如膜表面的剪切、最大限度地减少过滤器内颗粒的沉积，同时允许在 DF 的通道内捕获一些颗粒，而不会阻塞通过同一通道的液体流动。即使在病毒感染后，两次 TFDF 运行的 TMP 值也较低（低于 0.3 psi），细胞截留效率较高（>99%），滤液浊度较低（降低>95%），表明颗粒突破最小。先前的研究已经证明了 TFDF 系统连续收获 AAV 和 LV 的适用性。正如预期的那样，我们还在同时采集的生物反应器和滤液样品中实现了相同密度的感染性病毒。对于两次运行，计算出的感染性病毒穿过膜的百分比都超过 100% 是不可能的，只有在滤液样品中测得的滴度高于生物反应器样品时才能实现。虽然与理论产量相比仅得出 78% 的总回收率，但这很可能是由于在室温下储存收获物时部分功能损失，以及 TCID 50测定本身的相当大的误差（±0.3 log）。蔗糖对蛋白质和有囊膜病毒载体的稳定作用是众所周知的，然而，它主要作为冷冻保护剂，或者只是复杂储存配方的一小部分。因此，过早添加蔗糖可能不足以防止降解，应优先将收获的大部分料液直接冷却至 4°C。在病毒生产方面，我们的强化 TFDF 工艺在滤液中实现了迄今为止报道的最高感染性病毒滴度 5.6–7.5x10 ^9 TCID 50 /mL。与优化的批次工艺相比，VCC 增加了 5 至 6 倍，但感染性病毒滴度甚至高出 11 倍以上。此外，CSVY 提高了一倍，STY 提高了 460%（5.6 倍），并且达到了类似的 VVP。最后，将 TFDF 运行与使用相同细胞系、但不同细胞截留装置的其它灌流培养进行比较。与 AS 和 ATF 灌流相比，TFDF 系统中达到的最大滴度分别高出3倍和 1.5 倍。这也反映在 VVP 和 STY 方面，对于 TFDF 运行，它们始终高出两倍以上。令人惊讶的是，随着各个系统 VCC 的增加，CSVY 急剧下降。对于 ATF 培养，达到最高 VCC 44.5×10 ^6 cells/mL，获得最低 CSVY，清楚地表明存在“高细胞密度效应”。造成这种效应的一个主要原因通常是营养物质的缺乏或抑制性铵和葡萄糖的积累。一项研究表明，铵和乳酸浓度分别为 2-3 mM 和高于 20-30 mM，会对病毒生产力和细胞生长产生负面影响。然而，在任何运行中都没有观察到营养限制或乳酸和铵积累到过高浓度。这表明其它原因，包括非监测代谢物或未知细胞因素的限制或积累，可能发挥了作用，并有待进一步研究。另一个原因可能是合胞体的形成，根据所使用的系统，观察到合胞体发生差异延伸。如果细胞不融合，病毒复制可能会更有效，因为我们观察到，尽管溶瘤水平相似，但使用非融合 VSV 时，在溶瘤应用中会产生更高的滴度；然而，悬浮培养系统中是否也是如此，尚不完全清楚，需要进一步研究。无论如何，应该非常仔细地考虑三种灌流系统的直接比较，因为各种生产参数是不同的。为了公平比较，重新评估应包括相同的生物反应器设置和相似的感染细胞密度。然而，对于我们的概念验证研究来说，这超出了范围。融合溶瘤病毒和合胞体的形成给过程控制和生产过程的放大带来了新的挑战。我们假设细胞融合取决于三个因素：高 VCC、低剪切应力和长细胞间接触时间。所有三个因素的组合最有可能促进大型多核合胞体的形成。批次模式生产与低VCC（高达3.2×10 ^6 cells/mL）、低剪切应力和短细胞间接触时间相关，并且不会导致合胞体的形成。使用 ATF 或 TFDF 系统进行生产可实现高 VCC（高达 44.5×10 ^6 cells/mL）；然而，剪切率急剧增加（高达 5490 1/s），并且细胞与细胞的接触时间很短，导致小尺寸合胞体的形成。AS 等截留系统结合了高 VCC（高达 29.7×10 ^6 cells/mL）、低剪切率（约 340 1/s）和较长的细胞间接触时间。声场和再循环回路（3-12 分钟，促进大型多核合胞体的形成。在批次模式下，通过在低 VCC 下补充 CaCl 2诱导聚集来增加细胞间接触，但不会导致合胞体的形成，突出了所有三个因素的复杂相互作用。未来的研究可以考虑调查悬浮培养中合胞体形成的实际原因，以更好地控制其形成。然而，生产过程中悬浮培养物是否形成合胞体与病毒固有的融合性无关，因为融合蛋白在其基因组内编码，需要表达才能进行感染。尽管如此，还是进行了效力测定，以评估生产方式以及生产过程中合胞体的形成或不形成对病毒诱导溶瘤能力的潜在影响。正如所预期的，溶瘤效力不受生产模式或合胞体发生的影响（图5）。批次和灌流模式下的 rVSV-GFP 生产为了使我们的概念验证研究更进一步，我们还想评估基于 rVSV 的载体的高产病毒生产工艺的 TFDF 性能，以使用模式载体 rVSV-GFP 作为疫苗的可能应用。与批次模式下的 STR 1 工艺相比，使用灌流模式和 TFDF 组件的工艺强化使 VCC 提高了6倍，达到 11.3×10 ^6 cells/mL，STY 提高了 1.9 倍，从而缩小了生物反应器的占地面积。然而，与 STR 批次相比，观察到 VVP 降低了 3.3 倍以上，CSVY 降低了 1.6 倍以上。如前所述，这种下降很可能是由于“高细胞密度效应”。由于既没有观察到受监测营养物质的限制，也没有观察到抑制性副产物的积累，很明显，这种灌流工艺肯定还有优化的空间，希望能获得更高的 VCC。目前，该灌流运行只是概念验证运行，仅用于评估 TFDF 系统。下一步可以设想测试不同的补料方案、培养基成分或添加物。使用 TFDF 组件，我们能够直接收获 rVSV-GFP 颗粒，同时通过深层过滤进行澄清并完全回收。我们的概念验证研究以及 LV和 AAV的数据似乎表明，用于灌流中连续收获病毒的 TFDF 将在下一代工艺中发挥重要作用，也可能适用于其它病毒。此外，所有 HEK293-SF 细胞均截留在生物反应器内，从而实现全部产能。与批次生产（0.034至0.028 1/h）相比，使用TFDF组件的灌流培养显示出略低的单位细胞生长速率（0.022 1/h），这表明这里还有改进的空间，需要进一步优化。如前所述，将收获物冷却至 4 °C 可提高病毒稳定性。事实上，我们发现最终收获批次的回收率为 103.5%。总体而言，TFDF 组件作为我们测试的基于 rVSV 的载体和细胞系的灌流系统表现出了非常好的性能。此外，连续的病毒收获以及通过 TFDF 组件一步进行的澄清可以简化工艺操作，并有助于为未来开发一种集成的、可放大的（高达 2000 L）且经济的工艺。原文：S. Göbel, L. Pelz, C. A. T. Silva, et al., Production of recombinant vesicular stomatitis virus-based vectors by tangential flow depth filtration. Applied Microbiology and Biotechnology, 2024.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：狂犬病是一种古老的疾病，自人类和犬首次互动以来，已有数千年的历史。自公元前一世纪以来，这种疾病引起的惊人死亡人数引发了狂犬病预防策略。在过去的100年里，为了预防人类和动物的狂犬病，人们进行了无数次尝试来研制狂犬病疫苗。巴斯德前的疫苗学家通过开发第一代疫苗为狂犬病疫苗的实际历史铺平了道路。对低反应性和高免疫原性疫苗的进一步改进导致了胚胎疫苗、组织培养疫苗、细胞培养疫苗、改良活疫苗、灭活疫苗和佐剂疫苗的发展。重组技术和反向遗传学的发展使人们对狂犬病病毒基因组有了深入的了解，并促进了基因组操作，这反过来又导致了下一代狂犬病疫苗的出现，如重组疫苗、病毒载体疫苗、转基因疫苗和核酸疫苗。这些疫苗非常有助于克服传统狂犬病疫苗的缺点，提高免疫原性和临床疗效。从巴斯德到现代疫苗，狂犬病疫苗的发展经历了无数的挑战；这些开创性的工作为目前预防狂犬病的成功疫苗的产生奠定了基础。在未来，科学技术的进步和研究重点肯定会为更复杂的狂犬病疫苗候选物铺平道路。01介绍自从近40，000年前人类和犬开始交往以来，狂犬病就具有重要的历史意义。美索不达米亚的记录揭示了一种非常危险的“疯犬”疾病的存在，这揭示了犬与一种最致命的狂犬病病毒的相互作用。狂犬病是一种致命的传染性人畜共患疾病，由狂犬病病毒引起。该疾病继续对全球公共卫生构成严重威胁，特别是在发展中国家。这种急性进行性脑炎每年造成约60，000人死亡，主要在非洲(36.4%)和亚洲(59.6%)。其中，南亚约占世界人类狂犬病死亡总数的40%。据估计，狂犬病每年造成的损失为5.835亿美元，亚洲和非洲的牲畜损失约为1230万美元。犬狂犬病存在于87个不同的国家，是人类狂犬病病例的主要因素。然而，包括日本、英国、丹麦、瑞典、希腊、爱尔兰、冰岛、葡萄牙、新西兰、澳大利亚、瑞士、芬兰、挪威、法国和比利时在内的一些国家已经根除了狂犬病。该疾病的主要永久传播者是狂犬病病毒(RABV)，该病毒是狂犬病病毒科中狂犬病病毒属的一个模式种弹状病毒科。它是一种子弹形病毒，具有约12 kb的单链负向RNA基因组，编码3’至5’的五种主要结构蛋白，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA聚合酶(L) 。N、P和L蛋白产生核糖核蛋白复合物，紧密包裹负向RNA基因组，并负责指导病毒在感染细胞的细胞质中复制。RABV G蛋白是唯一暴露在病毒表面的病毒蛋白，是导致病毒致病性的主要因素，并作为一级保护性抗原，导致针对狂犬病的保护性免疫。该疾病影响包括人类在内的所有温血动物，并且狂犬病病毒已经将其宿主范围扩大到哺乳动物目食肉目和翼手目。参见MEGACHIROPTERA。然而，在这些宿主中，犬是发展中国家人类感染的最重要的宿主，而野生动物则是发达国家的宿主。除了犬之外，几种蝙蝠，尤其是吸血蝙蝠，也在美洲大陆的人类狂犬病病毒传播中起着至关重要的作用。相反，在非洲、亚洲和欧洲的旧世界国家，狂犬病病毒是通过蝙蝠传播的。其他家畜，包括猫、牛、马、绵羊和山羊，可能感染狂犬病并将其传播给人类。受感染的犬咬伤占人类狂犬病病例的97%，其次是猫咬伤(2%)和其他动物咬伤(1%)，包括猫鼬、狐狸、狼、豺和其他野生动物咬伤。幸运的是，狂犬病疫苗已经成为预防这种致命的病毒性人畜共患病感染的最有效工具。狂犬病疫苗既可用于预防，也可用于治疗，如果在暴露于狂犬病后及时接种，当前的疫苗会更有效。暴露后预防(PEP )，包括清洁RABV暴露部位的伤口，必要时使用狂犬病免疫球蛋白(RIG )，并使用多剂狂犬病疫苗，或暴露前预防(PrEP )，在暴露(RABV)前使用多剂狂犬病疫苗，是世界卫生组织(世卫组织)建议的预防人类狂犬病的两种主要免疫方案。《到2030年在全球范围内消除由犬引起的人类狂犬病死亡的全球战略计划》由世界卫生组织(WHO)、世界动物卫生组织(WOAH)、联合国粮食及农业组织(粮农组织)和全球狂犬病控制联盟(GARC)于2018年推出。它特别强调通过每年大规模接种疫苗来预防犬类狂犬病，接种疫苗的犬类数量至少达到70 %。自Louis Pasteur于1885年6月6日开发出第一种用于暴露前免疫和暴露后预防的疫苗以来，一个多世纪已经过去了。此外，多年来已经开发了几种狂犬病疫苗，现在正用于预防或控制人类和动物的狂犬病。世界上许多国家使用基于细胞培养的灭活狂犬病疫苗；然而，这些疫苗需要多次接种才能产生强有力的体液免疫反应，并且在发展中国家用于免疫人和动物更加昂贵。尽管灭活神经组织疫苗相对便宜，但由于其负面副作用，如某些个体的神经麻痹并发症，它们已在许多国家被淘汰。使用SAD-Bern、Evelyn Rokitnicki Abelseth (ERA)和SAD-B19毒株的减毒活疫苗可以用较少量的病毒有效地引发保护性免疫反应，但偶尔仍有可能在动物中引起狂犬病，因为病毒在宿主中繁殖期间存在残余毒力或致病性突变。对安全、反应性更低、免疫原性更强的疫苗的进一步需求导致了下一代疫苗的开发。通过引入反向遗传学技术和重组DNA技术方面的遗传操作，目前对RABV生物学的理解已经得到了极大的提高。这也大大加快了创新疫苗的创造，为下一代疫苗创造了一个平台。最初的基因修饰疫苗通过删除编码磷蛋白或基质蛋白的基因改变了狂犬病病毒基因组，使无致病性疫苗病毒即使在免疫低下的小鼠中也缺乏神经毒性。转基因疫苗，如rERAG333E、ERAG3G和SPBN GAS GAS毒株，在引发显著的免疫反应方面具有特殊的地位。出于安全考虑，重组疫苗的进一步变异是通过操纵狂犬病病毒基因组来编码糖蛋白的两个拷贝来进行的或就核酸疫苗而言仅表达狂犬病病毒糖蛋白(RAVG )，例如编码RABV G蛋白的pCIneo质粒或基于mRNA的狂犬病疫苗SFV-RVGP 。然而，这些疫苗不能保持明显免疫反应。对致病性较低的病毒作为RAVG载体分子的进一步开发已经产生了病毒载体疫苗，这为野生动物的口服疫苗接种提供了有希望的平台。目前，基于病毒载体的疫苗RABORAL V-RG和ONRAB在控制野生动物狂犬病中备受青睐。目前关于引入非正常狂犬病疫苗接种的研究也代表了亚洲暴露后预防的范式转变。这篇综合综述从神话的范式概述了狂犬病疫苗的起源所走过的道路，以及在狂犬病疫苗的实际历史中，随着不同类型的常规疫苗的发展，这条道路是如何前进的。此外，该综述强调了具有先进基因技术的当前疫苗的出现，并强调了狂犬病疫苗研究在消除狂犬病方面的未来重点。此外，本综述提供了全面的信息，并强调了不同国家使用的各种类型的抗狂犬病疫苗，它们的优点，局限性，成功故事以及失败，这将使我们能够为“到2030年控制犬介导的人狂犬病”设计控制策略。02狂犬病疫苗的历史狂犬病预防的历史始于公元前一世纪，有许多关于狂犬病及其治疗的神话和教条。直到十九世纪，对人类或动物的狂犬病还没有一致的诊断或治疗方法。技术，包括烧灼，建议用于治疗狂犬病伤口，在某些情况下，他们甚至切除或截肢。然而，所有这些信念从来没有解决人类和动物中令人震惊的死亡问题。公元25年，人们开始从科学的角度看待狂犬病。公元25年的塞尔苏斯促进了咬伤后伤口的早期治疗。1198年，摩西·迈蒙尼德描绘了被咬个体的长潜伏期。后来，依诺增爵八世·摩尔根尼于1769年确定了狂犬病病毒在神经组织中的偏好。1804年，Georg Gottfried Zink证明了患有狂犬病的动物的传染性唾液可能是传染源。1852年，法国药剂师阿波利奈尔·布沙尔达是第一个考虑接种疫苗预防狂犬病的科学家。1881年，法国兽医Pierre-Victor Galtier通过静脉注射狂犬病病毒，在绵羊中实现了第一次狂犬病免疫实验。尽管疫苗开发的历史是由前巴斯德时代的疫苗学家开创的，但狂犬病疫苗开发的实际历史是在1885年由路易斯·巴斯德作为一种应急管理手段开始的，甚至在疾病的病原体被确定之前。最初，狂犬病的病因学不符合Koch的细菌理论，因为他们不能培养任何与该疾病有关的传染因子。甚至在19世纪晚期，狂犬病被认为是由一种寄生虫引起的，类似于孢子虫。直到1903年，他们都无法证明任何导致这种疾病的“滤过性病原体”。狂犬病病毒体的大小直到1936年才被确定，而对致病原的电子显微镜探索直到1962年才出现。尽管有这些限制，在1881年，巴斯德和他的团队与Chamberland，Roux和Thuillier可以跟踪狂犬病病毒在患有狂犬病的动物的中枢神经系统中的存在。03第一代疫苗:巴斯德疫苗(神经组织疫苗)第一代疫苗的时代始于Louis Pasteur，他开发了第一种狂犬病疫苗，这种疫苗是从受感染的兔子脊髓中提取的，通过晒干使狂犬病病毒物理失活。通过多次传代和街毒(野生型)狂犬病病毒对实验动物的适应，巴斯德能够改变病毒在毒力和潜伏期方面的特性。通过将稳定量的街毒病毒制剂接种到兔硬脑膜上，重复传代超过50次，巴斯德观察到从接种到狂犬病扩散的潜伏期的一致性固定为7天。因此，他把这种病毒称为“固定”病毒。在对作为自然宿主的犬进行了几次实验后，1885年7月6日，巴斯德首次将他的实验性狂犬病疫苗注射给一个9岁的男孩约瑟夫·梅斯特，他有多次严重的狂犬病犬咬伤。咬后约2天，小男孩接受了13次注射风干的狂犬病病毒感染的兔脊髓悬液，其毒性逐渐增加，持续11天。巴斯德的这一战略性疫苗接种将梅斯特从狂犬病的死亡边缘拯救了出来。然而，巴斯德疫苗的主要缺点是它含有毒性越来越强的狂犬病病毒。此外，有人担心灭活的一致性，因为很少报告接种疫苗后出现狂犬病的病例。此外，无法生产足够的疫苗来满足需求是提供大规模疫苗生产的主要挑战。然而，巴斯德的方法随后被使用了50多年，之后在狂犬病疫苗制备中引入了重大的改进。04化学修饰的费米&森普尔疫苗通过费米在1908年和森普尔在1911年进行的简单化学修饰，巴斯德疫苗得到了进一步的改进。较新的神经组织疫苗(NTVs)是由大卫·森普尔爵士在印度卡苏里的中央研究所(CRI)从成年绵羊(森普尔疫苗)中研制出来的。他们用化学试剂，如苯酚，使受感染的绵羊或山羊的大脑失去活性。苯酚的加入，虽然灭活了巴斯德疫苗，但仍然扭曲了蛋白质结构，破坏了狂犬病病毒的抗原性。此外，还报告了严重的副作用，如格林-巴利综合征(GBS)和传播传染性海绵状脑病的危险。虽然这种疫苗在世界许多地方广泛使用，但世卫组织最终在几乎所有国家暂停使用。05无髓磷脂组织疫苗尽管费米疫苗和森普尔疫苗是成功的，但由于髓磷脂水平高，一些接种个体的致敏作用以及少数致命性脑炎病例的致敏作用增强，因此需要替代性的、反应原性较低的疫苗。在20世纪40年代，与疫苗接种相关的过敏性脑脊髓炎和中枢神经系统脱髓鞘疾病的临床研究受到了极大的关注。后来，鸡胚或鸭胚和新生啮齿动物脑等含胚卵的出现，作为生产狂犬病疫苗的介质，使得疫苗开发的旅程更加安全。临床证据显示，在胚胎和新生动物神经组织中缺乏导致疫苗副作用的物质。前苏联的研究人员利用老鼠开发了一种新生啮齿动物大脑疫苗。1964年，Fuenzalida和他的团队从乳鼠脑(乳鼠脑-SMB)中通过酚灭活并随后部分纯化开发了无髓磷脂灭活狂犬病疫苗。新生动物组织中髓鞘质的缺乏使得SMB疫苗与森普尔疫苗相比反应原性较低。然而，研究表明，该疫苗并非完全不含髓磷脂，其他不良成分的存在会导致严重的不良反应。因此，与世卫组织的建议一致，全球的国家监管机构决定在该疫苗长期使用十年后停止使用该疫苗。06胚胎疫苗1931年，欧内斯特·w·古德帕斯彻(Ernest W. Goodpasture)利用含胚卵对各种人类病毒进行了改造，这为进一步研制狂犬病疫苗提供了一个新的平台。在使用活的动物之后，含胚胎的蛋被用于开发狂犬病疫苗。在1940年，狂犬病毒Flury株被用于1天大的小鸡。该毒株随后在鸡胚中建立。Flury low egg passage (LEP)疫苗由经历了40-50代卵并进一步从33%全胚胎悬浮液冻干的减毒活病毒组成。麻风疫苗被用于大规模的犬类疫苗接种，但仍有一些残余毒力，特别是在小猫、猫和牛中。随后，通过一系列近180次或更多次的卵传代生产了Flury高卵传代(HEP)疫苗。虽然这种疫苗在20世纪50年代和60年代进行了人体试验，但由于疫苗的效力不令人满意，最终被停止使用。在20世纪50年代末，鸭胚胎成为疫苗生产中鸡胚的替代品，他们开发了用于狂犬病的鸭胚胎疫苗(DEV )，该疫苗在10%的全胚胎悬浮液中含有狂犬病病毒，使用β-丙内酯灭活。这种疫苗在美国被广泛用于人类，直到20世纪80年代。由于不良反应和抗原性差，这些疫苗后来被停用。狂犬病病毒对胚胎的成功适应为替代脑组织疫苗带来了希望。尽管不同的战略方法可以略微提高这些疫苗的质量，但关于它们的安全性、有效性和免疫原性的问题并没有得到完全的认可。因此，这些疫苗在全球许多地区暂停使用，集中于用于繁殖狂犬病病毒的细胞基质的研究导致了细胞培养疫苗时代的到来。07第二代疫苗:细胞培养疫苗用于病毒繁殖的细胞培养系统的建立导致了狂犬病疫苗开发的新范式，这导致了第二代细胞培养疫苗的产生。细胞培养系统是生产病毒疫苗的常用方法，因为它比神经组织疫苗和基于卵的系统有许多优点。它提供了一个确定的安全性和有效性，以及减少了交货时间和更高的过程灵活性。1930年，在鸡胚脑细胞的初级外植体中完成了狂犬病毒的培养，并且该病毒进一步维持了5个连续传代。后来，研究集中于固定RABV在小鼠胚胎脑组织中的繁殖。1942年，Plotz和Reagan在鸡胚细胞的初级外植体中首次成功地从患狂犬病病例的脑中直接体外分离和培养了街毒狂犬病病毒。后来，1958年提出了在非神经元组织中培养狂犬病病毒的概念，这导致了使用固定狂犬病病毒(来源于感染狂犬病的小鼠脑)和街毒狂犬病病毒(分离自患狂犬病的犬的唾液腺)从原代仓鼠肾细胞中首次组织培养狂犬病疫苗。Kissling能够通过15次细胞培养传代连续繁殖固定的病毒，并且还通过4次传代成功地维持了街毒病毒。在此之后，1960年，Fenje使用细胞培养物实现了狂犬病病毒株的首次适应，该细胞培养物可能用于疫苗生产，使用在小鼠脑中繁殖的街毒 Alabama Dufferin (SAD)株，并通过交替传代在原代仓鼠肾细胞培养物和小鼠脑中适应。后来，在1963年，Kissling和Reese在原代仓鼠肾细胞中制备了第一种实验性细胞培养狂犬病疫苗，即原代仓鼠肾细胞疫苗(PHKCV )，所述原代仓鼠肾细胞接种有先前适应的攻击病毒标准(CVS)株的固定狂犬病病毒。1968年，使用固定毒株CL-60(街毒 Alabama Dufferin[SAD]狂犬病病毒的衍生物)开发的PHKCV在加拿大获得许可。后来，在1971年，使用前苏联的Vnukovo-32毒株生产了PHKCV。在Kissling之后，科学家们开始采用不同的细胞培养系统来繁殖各种狂犬病病毒株，以用于疫苗开发。在1964年，Abelseth使用在原代猪肾细胞中繁殖的狂犬病病毒SAD株开发了用于家畜的减毒狂犬病疫苗。后来，在1965年，近藤利用原代鸡胚细胞培养物的敏感性，繁殖了一种适应卵细胞胚的Flury-HEP狂犬病毒株，开发了一种用于人类的灭活狂犬病疫苗。在1969年，Wiktor使用从幼仓鼠肾细胞衍生的BHK-21细胞系生产纯化的浓缩狂犬病疫苗。利用巴斯德病毒(PV)的胎牛肾细胞狂犬病疫苗和利用Pitman- Moore毒株(PM)的犬肾细胞狂犬病疫苗分别于1974年和1978年研制成功。它们中的每一个都获得了在荷兰使用的许可。通过使用二倍体细胞株生产疫苗的现代细胞培养技术，高质量狂犬病疫苗的生产逐渐变得可行。随后，固定的RABV在人类二倍体细胞株HDCS“WI 38”中生长，这是由Hayflick和Moorhead于1961年开发的53].后来在20世纪70年代中期，WI-38细胞系被转换为MRC-5细胞系，用于开发许可的人类二倍体细胞疫苗(HDCV) 。HDCV是第一种不含任何佐剂的纯化、浓缩和冻干狂犬病疫苗。此外，HDCV的副作用更少。因此，世卫组织推荐狂犬病HDCV作为金标准参考疫苗，但人类二倍体细胞疫苗的病毒产量较低，并且在许多发展中国家不太经济实惠。这使得开发与人二倍体细胞疫苗同样有效的替代疫苗成为必要，这导致了纯化鸭胚胎细胞疫苗和纯化鸡胚细胞疫苗的开发。在1971年，使用先进的纯化方案改进的完全鸭胚胎来源的组织疫苗接种，促进了使用CVS株生产纯化的鸭胚胎细胞疫苗(PDE cv )。1985年，瑞士血清和疫苗研究所批准了利用Pitman-Moore毒株的PDECV疫苗。此外，PDECV在某些欧洲和亚洲国家注册；然而，它在美国没有被授权。这些疫苗被证明优于DEV，因为它们完全不含卵蛋白和髓鞘碱性蛋白，而卵蛋白和髓鞘碱性蛋白是过敏性脑脊髓炎的重要来源。后来，在1972年，使用Flury HEP病毒，开发了纯化的鸡胚细胞疫苗(PCECV)。后来，在Flury LEP病毒的帮助下，另一种PCECV被开发并灭活，用作疫苗免疫犬数年。第二个人用PCECV是通过在鸡胚成纤维细胞(CEF)中适应Flury LEP株而开发的，并于1984年在欧洲获得批准。在美国，使用LEP-c25病毒生产了另一种PCECV，并于1997年获得许可。目前，PCECV是最常用的人用狂犬病疫苗之一。由于具有相当的免疫原性和耐受性，纯化的鸭胚胎细胞疫苗(PDECVs)或纯化的鸡胚胎细胞疫苗(PCECVs)已成为世界许多地方预防人狂犬病的人二倍体细胞疫苗的有效替代选择。       然而，原代培养系统对细胞分裂有固有的限制。二倍体细胞株，如WI-38、MRC-5和FRhL-2，具有大约50次连续传代的有限寿命，此后，细胞变得衰老。尽管它们具有繁殖能力，但适应疫苗生产的大规模商业培养在技术上具有挑战性。这导致了使用连续细胞系生产疫苗。1962年，非洲绿猴肾细胞产生了Vero细胞系。与原代培养细胞相比，产生更高的病毒滴度，细胞培养系统的简单放大，以及在疫苗中使用的长期历史而不引起任何安全问题，使得Vero细胞系在各种病毒的繁殖中具有吸引力。在1980年代早期，狂犬病病毒在Vero细胞中繁殖用于疫苗生产。Vero细胞支持多种狂犬病病毒的复制，包括HEP、CVS、Mokola病毒、Duvenhage蝙蝠病毒和Lagos蝙蝠病毒。Vero细胞的好处是大大降低了生产狂犬病疫苗的成本，并使大多数发展中国家能够获得狂犬病疫苗。进一步将纯化的Vero细胞衍生狂犬病疫苗(PVRV)引入临床实践对于预防狂犬病仍然至关重要。1985年，纯化的Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)在欧洲获得许可。此外，世卫组织提出用通过细胞培养开发的更有效、更安全的疫苗取代神经组织疫苗。目前，PVRV在全球范围内广泛使用。作为疫苗生产过程中的一个进步，一种增强的无血清PVRV-下一代(PVRV-NG)疫苗从灭活的兔瘟病毒PM株中生产出来。这种下一代疫苗的免疫原性和安全性使其成为狂犬病预防的新选择。08狂犬病疫苗的最新进展尽管多年来已经发明了许多抗狂犬病疫苗来保护人类和动物免受狂犬病的侵害，但是候选疫苗的安全性和免疫原性仍然是最重要的。然而，疫苗开发的基本概念，如减毒和灭活，始终是正在进行的狂犬病疫苗创新的支柱。狂犬病疫苗研究的持续努力主要集中于提高候选疫苗的免疫原性和安全性，这导致了改良或灭活疫苗的出现。8.1.改良活疫苗(MLV)  改良活疫苗通常是通过改变天然存在的病毒的致病性来生产的，因此它可以产生强大的免疫反应，而不会导致临床疾病。大多数科学家通过在不同细胞中连续传代来改造病毒，以确保未来疫苗的安全性，这导致了针对包括狂犬病在内的各种疾病的减毒活疫苗的开发。狂犬病毒的原始SAD (街毒 Alabama Dufferin)毒株是目前使用的所有减毒疫苗的来源，这些疫苗在细胞培养中经过多次传代后，都发生了不同程度的减毒。大多数改良活疫苗通过用克隆幼仓鼠肾细胞的连续体外选择或通过在小鼠体内的连续传代而减毒。在一些亚洲国家，一种鸡胚来源的MLV疫苗Flury株已经被研制出来并用于动物。与此同时，MLV疫苗使用了用仓鼠肾细胞生产的街毒-Alabama-Dufferin (SAD)毒株供进一步使用。为了创造一种在质量上优于Flury-LEP疫苗接种的疫苗，1974年，加拿大引入了减毒活疫苗株Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA )，作为Flury低卵传代疫苗，该疫苗由于疫苗中的组织碎片而具有负面后果。最终，Flury低卵传代疫苗在20世纪70年代末被韩国兽医局用ERA毒株取代。通过肌内途径接种ERA减毒活疫苗的家畜(包括犬、羔羊、山羊和猫)没有表现出任何临床症状，并且没有从它们的唾液腺或脑中回收疫苗株，但是它仍然引发了强烈的免疫反应和升高的病毒中和抗体(VNA)滴度。不幸的是，近50%接受脑内注射疫苗的犬出现了明显的临床症状，如厌食、发热、严重震颤、轻瘫和瘫痪。由于它们的残余毒力，这仍然是改良活疫苗的主要缺点。此外，MLV对温度波动更为敏感，意外自行接种MLV狂犬病疫苗对接种者来说风险很大。尽管MLV的免疫原性更强，并且犬可以安全有效地接受改良的活狂犬病疫苗株(ERA、Flury和SAD)，但最终，世卫组织在2004年停止推荐注射用MLV狂犬病疫苗。8.2.灭活狂犬病疫苗  灭活疫苗的历史始于大约一个世纪前，当时在某些非洲和亚洲国家使用了针对狂犬病开发的灭活神经组织疫苗。大多数传统狂犬病疫苗使用与野生型病毒具有相同抗原特性的完全灭活病毒。已经证明，用完全灭活的病毒进行免疫，通过激活辅助性和细胞毒性T细胞，并防御致命的脑内狂犬病病毒攻击，导致病毒中和抗体的产生。在全球范围内，已经使用各种狂犬病病毒毒株生产了灭活狂犬病疫苗，包括CVS 11、Pittman-Moore-NIL2、RC-HL(由西原毒株生产)和巴斯德病毒毒株。目前，批准用于人类的狂犬病疫苗是基于在细胞培养物或胚胎鸭或鸡蛋系统中繁殖的灭活纯化狂犬病病毒。通常使用β丙内酯(BPL)、紫外线、乙酰乙胺或二元乙烯亚胺(BEI)灭活狂犬病疫苗株。BPL是最常用的灭活剂；然而，它价格昂贵，并且在37℃下不稳定。由于苯酚和甲醛可能会扭曲抗原位点的结构，因此不再建议将其用于病毒灭活。相比之下，BEI处理起来不太危险，并且具有稳定性好、成本低和易于制备的优点。然而，较低的免疫原性、昂贵以及在暴露前尤其是暴露后免疫中需要多次接种方案是灭活疫苗的基本缺点[66].因此，为了增强免疫应答，抗原佐剂被包含在灭活疫苗中。这导致了佐剂疫苗的发展。8.3.佐剂狂犬病疫苗  佐剂是通过增强炎性反应来增加或调节对疫苗的免疫反应的物质，所述炎性反应是抗原驱动的原始B和T细胞刺激所必需的。由于灭活疫苗、亚单位疫苗和合成疫苗的使用，佐剂一直备受关注，灭活疫苗、亚单位疫苗和合成疫苗基本上是弱免疫原性的，佐剂作为补充用于增强免疫原性，并由于其免疫扩增能力而产生更有效的疫苗。佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝和皂角苷，是常用的佐剂。然而，目前使用的大多数佐剂是铝盐。尽管明矾是第一个被批准用于人类的佐剂，但据称明矾延迟了抗体的早期产生，并且在诱导细胞免疫方面并不同样有效。某些制剂对少数抗原的不利副作用、毒性和有限的佐剂性是佐剂的主要缺点，这使得开发合成衍生物，如胞壁酰二肽、脂质体、QS21、单磷酰脂质、MF-59和免疫刺激复合物(ISCOMS)作为替代佐剂成为必要。近年来，许多研究集中于开发替代佐剂以提高灭活狂犬病病毒疫苗的免疫原性和有效性，并且开发了多种其他化合物，包括靛玉红根多糖、CpG寡脱氧核苷酸、单磷酰脂质A (MPLA)、β-葡聚糖，金黄色葡萄球菌来源的透明质酸(HA)和卡介苗纯化蛋白衍生物(PPD)。这些候选佐剂肯定是未来开发新型佐剂狂犬病疫苗的有前途的平台，具有增强的免疫增强潜力和降低的不良健康影响的风险。09下一代疫苗修饰活疫苗的残余毒力所带来的风险以及灭活疫苗的低免疫原性和引发保护性免疫反应所需的大量抗原和重复剂量保证了对更安全和更经济的狂犬病疫苗的需求。目前，重组DNA技术和反向遗传学等技术的出现，使人们对狂犬病病毒基因组有了深入的了解，并促进了基因操作，这反过来为更有效和更安全的疫苗带来了更大的希望，降低了成本，提高了稳定性和免疫原性。这导致了针对重组狂犬病病毒株或个体重组狂犬病抗原糖蛋白(G蛋白)的下一代疫苗的时代，这有助于克服减毒活疫苗的缺点。9.1.转基因疫苗  遗传修饰的病毒是通过生物技术方法对病毒基因组进行遗传修饰，通过定向插入、缺失、人工合成或改变核苷酸序列而产生的，并且仍然保留感染能力。大多数狂犬病疫苗包括以某种方式使病毒减毒、弱化或灭活，从而使其毒性特征变得无效。对病毒基因组的遗传学关注已经证实糖蛋白(G)与RABV致病性最相关，并且已经发现了与病毒致病性相关的某些氨基酸位点。因此，就在这些氨基酸中产生位点特异性突变或插入修饰的糖蛋白而言，对亲本狂犬病病毒株的进一步遗传操作将消除残余致病性，消除潜在的毒力回复，减少潜在的原始氨基酸回复突变，并增强所得突变体的安全性，这反过来将是产生高度减毒狂犬病疫苗的有希望的选择。特别是，这些疫苗对于发展中国家甚至发达国家野生动物栖息地的流浪犬的大规模免疫接种是至关重要的，并且作为各种研究努力的结果，已经开发了许多突变疫苗株。开发了在RVG (G333E)的残基333处具有精氨酸至谷氨酸突变的遗传修饰的ERA疫苗株野生型(rERA)。通过对犬的肌肉注射和对小鼠的口服免疫，这种活的rERAG333E可诱导产生强而持久的RVNA，其强度高于ERA株野生型(rERA)。此外，使用反向遗传学，在rRABV的RVG基因的氨基酸位置333突变了完整的基因组，并且在BHK/T7–9细胞中拯救了辅助质粒，导致ERAG3G株的构建，该株在小鼠中进一步口服免疫后，显示出对致病性RABV的完全防御。另一种新毒株ERAGS是一种在RVG第194位和第333位具有位点特异性突变的rRAVB，在免疫接种的小鼠中发现其对高致病性RABV是非致病性的、极其安全且高度有效。一种新的和高度减毒的双糖蛋白狂犬病病毒构建体，SPBN GASGAS，通过在氨基酸位置194和333处的突变和一个额外的相同改变的糖蛋白基因从狂犬病毒株SAD L16产生。通过降低回复毒性的潜在风险和增强细胞凋亡，所得突变体具有改善的安全性。最近，SPBN gas已经作为口服接种的有效狂犬病疫苗候选物占据了特殊的位置，以减轻某些发展中国家(如泰国、海地、纳米比亚和摩洛哥)自由漫游的犬的狂犬病。9.2.重组狂犬病疫苗  出于安全考虑和提高免疫原性，通过编辑狂犬病毒基因组以编码糖蛋白的两个或多个拷贝，或使用仅克隆和表达狂犬病毒糖蛋白(RAVG)的策略，产生了进一步的重组疫苗变体。编码两个拷贝的糖蛋白基因的重组狂犬病疫苗构建体在小鼠中提供了更好的保护，并在犬中提供了针对攻击病毒标准-11 (CVS-11)株的毒性攻击的保护。这些研究还揭示了含有两个拷贝的G基因的RABV增加了G基因的表达，这大大提高了疫苗的效力，增强了免疫原性，产生了更高水平的病毒中和抗体并降低了致病性。G基因表达的增加与细胞凋亡的增强相关，这有助于诱导与宿主免疫反应相关的基因的强烈上调，这在被减毒RABV株感染的神经元中观察到。因此，这些重组RABV株可能是未来有前途的灭活疫苗候选株。9.3.基于核酸的狂犬病疫苗  来自致病病毒的遗传物质被用于核酸疫苗中，以产生针对传染性物质的保护性免疫反应。由核酸制成的疫苗具有成本效益高、安全高效的潜力。此外，由核酸疫苗引起的免疫反应仅集中于选定的病原体抗原。核酸疫苗可以是DNA(如质粒)或RNA(如信使RNA (mRNA))，并显示出治疗多种疾病的显著潜力。这是基于将DNA克隆到递送质粒中或通过直接接种信使RNA (mRNA)在宿主细胞中表达抗原。此外，宿主机制将有助于内源性蛋白质合成，这模拟了引发针对所表达抗原的细胞和体液反应的自然感染。9.3.1.狂犬病DNA疫苗  通常，足够水平的病毒中和抗体针对狂犬病病毒糖蛋白，这反过来与狂犬病保护相关。使用重组DNA技术可以容易地将糖蛋白基因克隆到合适的表达载体中，这有利于糖蛋白在体内的有效表达，并导致狂犬病DNA疫苗的生产。自1994年以来，DNA疫苗被认为是一种更经济有效的狂犬病预防方法，其可行性已在多种动物模型中得到证实，包括伴侣动物[84].巴斯德病毒(PV)、攻击病毒标准(CVS)、Evelyn Rokitnicki-Abelseth (ERA)或街毒病毒分离株的糖蛋白序列用于评估DNA狂犬病疫苗。RV糖蛋白在各种表达载体中表达，包括pSG5、pCIneo、pVR105、DNAVACC，并成功地在实验动物中产生特异性免疫反应。尽管该技术已被证明是有效的，但它的广泛使用，尤其是在狂犬病暴露后预防中的广泛使用，受到较慢和较弱的免疫反应的阻碍。然而，糖蛋白编码质粒与化学佐剂的共同给药或细胞因子基因的共同递送和创新的递送技术，包括DNA注射后的电穿孔和与传统灭活狂犬病疫苗的共同给药，在增强免疫应答方面是有效的，并增加了它们预防和管理狂犬病的潜力。此外，载体设计和递送系统的当前发展也为提高狂犬病DNA疫苗的有效性带来了希望。然而，与质粒DNA整合到宿主染色体、对质粒DNA载体的耐受性的形成、抗原和自身免疫相关的风险需要在它们被开发成广泛使用的疫苗之前得到关键解决。9.3.2.狂犬病RNA疫苗  RNA疫苗是最简单的核酸疫苗，是一种极具潜力的疫苗开发替代平台。RNA疫苗比DNA疫苗有许多优点。RNA疫苗直接在细胞质中翻译，消除了转运到细胞核中的需要，导致快速抗原表达，而没有可能与宿主基因组整合的风险。众所周知，RNA是一种强有力的佐剂，它通过模式识别受体，如Toll样受体或视黄酸诱导基因I样受体。信使RNA (mRNA)自我复制的能力导致目前两种主要类型的RNA疫苗的发展:传统的非扩增mRNA疫苗和来自RNA病毒载体的自我扩增mRNA疫苗(也称为复制子)，例如塞姆利基森林病毒(SFV )，其保持复制活性。研究表明，编码RABV G基因的传统的基于非扩增mRNA的狂犬病疫苗刺激有效的VNAs和抗原特异性CD4+和CD8+接种小鼠的t淋巴细胞并保护它们免于致死性脑内攻击感染。类似地，发现基于mRNA的狂犬病疫苗在具有有效VNA水平的家猪中具有免疫原性。一种基于自扩增mRNA的狂犬病疫苗，其重组SFV含有编码RABV G蛋白的RNA(SFV-RVGP )，该疫苗可引起功能性三聚体RABV G蛋白的高表达水平，诱发与商用狂犬病疫苗相当的抗体水平，并且在产生细胞免疫反应方面比蛋白疫苗更有效。然而，一个主要的挑战是RNA疫苗的不稳定性，这是由于RNase介导的降解或由于带负电荷的mRNA分子与带负电荷的细胞膜相互作用而导致的静电排斥，导致RNA递送后抗原的瞬时表达，这需要引起高度重视。9.4.狂犬病蛋白亚单位和肽疫苗  蛋白质疫苗通过使用肽或蛋白质作为抗原来刺激免疫系统。蛋白质抗原可以从引起传染性疾病的病原体中天然产生，可以是完整形式，也可以是衍生的裂解产物。蛋白质亚单位疫苗也可以在重组系统中作为异源蛋白质产生，包括重组细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，作为天然来源的替代物。RABV G蛋白是病毒致病性的主要决定因素，也是负责诱导针对狂犬病的保护性免疫的主要保护性抗原。因此，G蛋白(从感染细胞中纯化)的有效性已在各种系统中被确定，并被用作预防狂犬病的蛋白疫苗的形式。然而，发现这些方法并不有效。酵母衍生的蛋白质未能在小鼠中引发保护性免疫反应，这很可能是由于终产物折叠不良[95].显示在昆虫细胞中产生的杆状病毒来源的G蛋白是免疫原性的，但所需的大量纯化可能会使这种方法不经济。目前，使用转基因植物生产疫苗越来越重要。研究人员还利用植物，如番茄、玉米、哈密瓜和烟草来表达RABV G蛋白，以制造可食用疫苗。这种疫苗可以在摄入后在小鼠中产生可检测的VNA反应和对抗攻击的保护。尽管这些类型的疫苗有可能以低成本生产，但有几个明显的缺点，包括免疫原性、疫苗在水果中的稳定性、在胃中的降解以及肠道免疫反应。因此，尽管可食用疫苗是一个理想的选择，但在它们被认为可以替代狂犬病疫苗之前，还需要更多的研究。除了蛋白疫苗，许多RABV G蛋白的抗原表位已被鉴定，模拟这些G蛋白表位的合成肽已被生产并用作疫苗。用包封狂犬病病毒G5抗原区的合成肽接种的动物产生具有强亲和力但低中和潜力的抗体。发现狂犬病病毒糖蛋白的肽模拟表位(RABVG位点III模拟表位(C-KRDSTW-C ))在小鼠中具有更强的免疫原性，并为未来的狂犬病疫苗提供了新概念。然而，由蛋白质或肽制成的疫苗具有中等的免疫原性；65kDa病毒糖蛋白被合成，形成三聚体，并在三个可能的位置之一被适度N-糖基化。狂犬病病毒糖蛋白必须正确折叠成其天然三聚体形式，以便产生能够中和病毒的抗体，但这对于蛋白质疫苗来说仍然是一个挑战。9.5.肠胃外病毒载体狂犬病疫苗  通过将感兴趣的抗原克隆到异源病毒中开发了病毒载体疫苗，该异源病毒将作为载体分子在宿主细胞内转移感兴趣的外源基因，从而导致其随后的表达。第一个表达外源基因的病毒载体是在1972年由猿猴病毒40产生的；从那时起，不同的病毒，包括腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、水泡性口炎病毒和慢病毒，已经被遗传修饰以使其无致病性，并被改造成疫苗载体，其可以潜在地刺激免疫系统对抗由编码的转基因产生的蛋白质。病毒载体引发的抗原特异性细胞免疫反应和强而持久的抗体水平及其固有的佐剂性使它们成为狂犬病疫苗开发中更有效的候选物。一些研究人员针对不同的病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白。RVG疫苗接种的重组腺相关病毒(AAVs)增强了单次肌肉接种的狂犬病毒中和抗体(RVNAs)的保护水平。几种腺病毒(Ads)已被广泛用作疫苗开发中的疫苗载体，因为它们产生强烈的体液和细胞免疫应答。特别是，对编码狂犬病病毒糖蛋白的猿猴Ad载体进行了狂犬病疫苗接种试验。一种基于黑猩猩腺载体狂犬病病毒糖蛋白克隆AdC68-rab。通过肌肉注射接种疫苗后四周，GP将小鼠的RVNA滴度提高到超过建议标准的水平。基于C组黑猩猩Ad载体的ChAd155-RG的单次肌内注射在小鼠中诱导了高RVNA滴度和更有效的细胞免疫，以及在兔中非常快速、持续、强健和持久的rvna，并且在猕猴中rvna的保护水平持续长达48周。这些作用相当于一剂、两剂或甚至三剂Rabipur疫苗诱导的作用。与其他Ad血清型相比，发现具有黑猩猩Ad血清型68 (AdC68)和人类Ad血清型5 (AdHu5)的ChAdOx2 RabG具有更高的免疫原性，并且仅通过单次IM剂量在体内引发高水平的RVNAs。通过肌肉内、鼻内和口服免疫在小鼠和犬中产生的由鸡2型腺病毒狂犬病病毒糖蛋白(CAV2-RVG)产生的保护性免疫应答是相当可观的。此外，其他病毒载体，包括副痘病毒Orf病毒(ORFV)、水泡性口炎病毒(VSV)，貉痘病毒(RCN) ，单循环黄病毒、新城疫病毒(NDV) 和牛疱疹病毒I型(BHV-1)表达狂犬病病毒糖蛋白，有效地诱导RVNAs，并保持为有效的疫苗候选物。尽管如此，病毒载体的一个常见障碍是宿主对某些载体的预先存在的免疫力，这可能会使疫苗的效力最小化。然而，这可以通过使用在宿主中具有低血清流行性的替代载体来避免。此外，病毒载体狂犬病疫苗的开发已经向前迈进了一步，成为口服狂犬病疫苗候选药物和基础工具，以减少全球野生动物物种中狂犬病病毒的死亡人数。10口服狂犬病疫苗动物疫苗是通过减少动物传染病病原体来保护公众健康的有效方法。狂犬病疫苗开发的悠久历史已经为肠胃外疫苗接种策略提供了许多有效的疫苗。然而，通过肠胃外疫苗接种对野生动物或自由活动的家畜(如宠物犬)进行疫苗接种仍然是一个挑战。因此，对根除狂犬病的替代疫苗接种策略的需求导致了口服狂犬病疫苗(ORV)的发展。口服疫苗使用诱饵口服给药，所述诱饵设计有封装在可口诱饵材料中的疫苗悬浮液密封小袋，所述诱饵材料例如动物肠、鸡头、蛋和基于犬粮的材料，这取决于目标物种。食用时，咀嚼运动使小袋穿孔，将疫苗悬浮液释放到口中。在这里，疫苗主要被腭扁桃体吸收，在进入部位进行少量复制后，引发保护性免疫反应。目前，有两种商业许可的ORV可用于野生动物狂犬病免疫。它们是改良活疫苗(MLV)和基于载体的疫苗(VBV)。在改良活疫苗中，狂犬病病毒被改良以减弱其毒力，但仍具有触发免疫系统产生抗体的能力。在基于载体的疫苗中，编码抗原性糖蛋白的基因被插入到病毒载体中，其可以通过在免疫接种时表达插入的狂犬病病毒糖蛋白来诱导免疫应答。自1978年以来，口服狂犬病疫苗(ORV)已经成功地用于控制欧洲和美国野生动物狂犬病。10.1.改良狂犬病活病毒口服疫苗  改良活狂犬病病毒口服疫苗的开发始于1935年，来源于街毒阿拉巴马达费林(SAD)狂犬病病毒株。这种亲代SAD毒株是从美国患狂犬病的犬的唾液腺中分离出来的。随后SAD株在非自然宿主中的连续传代，如小鼠、鸡胚和非神经细胞系，包括仓鼠肾和猪肾细胞，进一步热稳定，产生了高度减毒的SAD-Bern、Evelyn Rokitnicki Abelseth (ERA)和SAD-B19株。这些毒株构成了第一代ORV，它是欧洲控制野生动物狂犬病的基石，并已在全球广泛使用。此外，为了改善第一代ORV的安全性，使用单克隆抗体在狂犬病病毒SAD株中诱导选择突变，产生第二代ORV、SAD VA1、SAG1或SAG2株。1990年，通过影响糖蛋白333位氨基酸残基的两个连续突变，从狂犬病病毒的SAD-Bern株中分离出一种双无毒突变株SAG2株。由于其安全性和遗传稳定性，SAG2毒株被证明是SAG1的改良版本。尽管这些疫苗成功地降低了野生动物的狂犬病水平，但在大多数狂犬病流行的国家，仍然需要在大量自由活动的犬群中有效地控制狂犬病。这就需要一种更安全的候选疫苗，在大规模犬类疫苗接种活动中补充肠胃外疫苗，这一点仍然至关重要[23].因此，反向遗传学的现代技术促进了定点突变，并且针对狂犬病病毒基因组中选定位置的特定变化导致了第三代MLV的发展。目前，SPBN GAS和ERA G333是目前用于犬科动物的两种第三代疫苗。尽管两种疫苗株来自不同的亲本株，但它们在G蛋白的氨基酸残基333处仍有相似的突变。这些位点特异性缺失和插入进一步提高了现有MLV的安全性和免疫原性。然而，对MLVs的一个主要担忧是疫苗病毒发生随机突变的可能性，这可能会使它们回复到引起狂犬病的毒性形式。据报道，第一代MLVs的颅内接种在免疫抑制小鼠中引起狂犬病。此外，有报告显示，在欧洲免疫抑制的狐狸和非目标物种中，在接种第一代MLV疫苗后，出现了11例疫苗相关狂犬病病例，占分发的4800万诱饵剂量的1 %。相比之下，第二代和第三代疫苗没有这方面的现场病例报告。在某些发展中国家，当使用SPBN气体时，在自由漫游的犬中产生免疫反应的现场试验的成功是可观的。使用在泰国供应的含有SPBN气体的口服诱饵对2444只犬进行注射疫苗接种，这些地方的大约65.6%的流浪犬进行了有效的口服免疫接种。通过在海地野外条件下对犬进行大规模接种，对犬口服狂犬病疫苗的免疫反应进行了评估，结果显示，78%的犬在食用诱饵后产生了免疫反应。通过对纳米比亚当地自由活动的犬接种疫苗后长达56天的血清转化免疫反应进行监测，高度减毒疫苗株SPBN GASGAS的免疫原性通过口服疫苗成功保护了约79%的犬。这些调查证实了疫苗株SPBN GASGAS的免疫原性和ORV在发展中国家减少犬传播狂犬病的能力。此外，通过实验证明了在印度果阿流浪犬中使用口服诱饵进行狂犬病疫苗接种的可行性，该研究支持了这样的观点，即ORV将是一种有望显著提高犬疫苗接种覆盖率的新方法。此外，我认为在印度使用ORVs作为肠胃外大规模犬类疫苗接种计划的补充是可行的，并且能够接触到该国自由漫游的犬类群体。10.2.基于病毒载体的口服狂犬病疫苗  基于载体的疫苗的开发有助于克服与MLVs相关的风险。这些基于病毒载体的狂犬病疫苗更有希望用于兽医和人类。几项研究工作已经产生了有效的基于病毒载体的ORV。将表达狂犬病病毒糖蛋白的重组痘苗病毒作为口服狂犬病疫苗在诱饵中进行测试，并显示在几种野生动物中诱导保护性免疫。在疫苗开发中，多种腺病毒被广泛用作疫苗载体，因为它们能产生强烈的免疫反应。在控制北美野生动物狂犬病方面，基于表达狂犬病糖蛋白(ONRAB)的可复制人类5型腺病毒(AdHu5)的口服疫苗诱饵的开发令人鼓舞。与第二代复制型腺病毒载体相比，第一代复制缺陷型腺病毒载体的功效和安全性得到了提高。一些报道显示，发现在E1缺失的AdHu5载体中表达的狂犬病病毒糖蛋白在啮齿动物和犬科动物中更有前途。然而，在45–90%的人群中，针对AdHu5的可检测病毒中和抗体(VNAs)的预先存在的免疫被发现抑制了由AdHu5载体引起的免疫反应。为了克服这些问题，目前，稀有血清型的人腺病毒或非人类物种腺病毒，如黑猩猩和犬科动物，已被用于载体构建和疫苗开发。表达狂犬病病毒糖蛋白的基于重组黑猩猩腺病毒血清型68的疫苗(AdC68)的鼻内或口服给药途径在新生小鼠中诱发有效的VNAs。通过口服途径，这种疫苗在年轻、暴露前的个体中的效果令人鼓舞。此外，基于黑猩猩腺病毒载体的狂犬病疫苗显示可保护犬免受致命狂犬病病毒的攻击。研究记录了通过在小鼠和犬中口服免疫，用犬腺病毒2狂犬病病毒糖蛋白(CAV2-RVG)产生的保护性免疫应答。目前，有两种商业许可的VBV可用于控制野生动物狂犬病。RABORAL V-RG，其使用重组痘苗病毒载体，和ONRAB，与重组人腺病毒载体。使用VBVs的主要问题之一是可能由载体病毒本身引起的感染。研究强调，在美国，暴露于重组痘苗病毒载体疫苗可能会导致人类严重的皮肤炎症以及孕妇和免疫功能低下者的并发症，但是还没有关于腺病毒载体的公开报道。此外，对针对载体的现有免疫的潜在干扰是载体疫苗的主要问题，因为它阻止了针对狂犬病的充分免疫反应的产生。然而，目前的病毒载体已被改造成能够逃避预先存在的免疫，并使其更像是一种潜在的递送系统。口服疫苗在有效控制野生动物狂犬病方面的成功故事及其在实验研究中引发免疫的潜力突出表明了口服疫苗作为一种替代性战略疫苗在发展中国家控制狂犬病方面作为非肠道疫苗补充的有效性。不同疫苗开发的当前研究的细节以及不同疫苗的优点和缺点总结于表1和表2.表1.狂犬病疫苗的研究现状*未指定疫苗名称         表2.当前狂犬病疫苗的优缺点11皮内狂犬病疫苗接种疫苗刺激免疫反应的能力也取决于疫苗的接种途径。皮内接种将抗原递送到表皮和真皮之间的空间。该空间在解剖学上是免疫刺激的有利位置，因为皮肤的真皮和表皮层是抗原呈递细胞的丰富来源，例如朗格汉斯细胞、真皮树突细胞和真皮巨噬细胞，已知它们参与疫苗诱导的免疫反应，并且皮肤被视为理想的疫苗接种目标。真皮的毛细血管和淋巴管的广泛网络也使得白细胞和树突细胞更容易从皮肤行进到次级淋巴器官。大多数狂犬病疫苗通过肌内(IM)途径施用增加量的抗原。因此，由于这些抗原的价格以及偶尔的稀缺性，它的使用在许多不发达国家受到限制。通过皮内(ID)途径施用的减少剂量(通常为抗原标准剂量的10%或20%)能够引发类似于通过IM途径施用的标准剂量所引起的免疫反应。在美国，1986年首次批准了狂犬病疫苗ID法的暴露前免疫，随后开发了一种成本有效的多位点皮内(ID)免疫方法。世卫组织专家委员会于1991年建议皮内注射现代狂犬病疫苗用于暴露后预防。根据世卫组织的一项综述，用于暴露后预防(PEP)或PrEP的通过ID途径给药的细胞培养狂犬病疫苗(每肌内剂量的效力> 2.5 IU)具有与通过IM途径给药的相同疫苗相同或更高的功效。同样，通过各种方法在牛中接种的狂犬病暴露前预防性疫苗的有效性揭示了通过ID途径中和狂犬病病毒(RVNA)的可观水平的抗体。采用eRIG和皮内注射5天(0、3、7、14和28天)PEP方案治疗狂犬病伤口浸润的联合治疗方案可以挽救人类、牛和犬的生命，而皮内注射途径由于其节省剂量的效果而被证明更加经济。类似地，通过皮下注射、肌肉注射和静脉注射施用灭活细胞培养狂犬病疫苗被发现是安全且具有免疫原性的。这些临床试验为在因费用而无法获得PEP的地区推广ID给药狂犬病疫苗提供了信心，并且ID作为一种比肌内免疫节省成本和剂量的替代免疫策略应该得到鼓励。12狂犬病病毒免疫:自然感染与狂犬病疫苗12.1.对天然狂犬病病毒感染的免疫，包括体液和细胞反应  RABV通常感染神经系统(NS)。然而，在感染的早期阶段，病毒粒子被“注射”到肌肉和皮肤中，在病毒进入神经系统之前，它可能会在周围引起免疫反应。一旦RABV进入NS，它不太可能引起初级适应性免疫反应，因为NS是一个免疫特权位置，因为它缺乏专业的抗原呈递细胞和淋巴组织。然而，在进入NS后，RABV在感染后引起早期先天免疫反应，其特征在于抗病毒、化学吸引和炎症反应，所有这些都涉及被感染的神经元。由于在NS中的免疫效力不足，RABV使用免疫亚策略来逃避宿主免疫反应，从而成功适应宿主系统，并且细胞介导的免疫(CMI)反应在阻止病毒入侵和抑制RABV在感染初期进入外周神经系统(PNS)中起着关键作用。然而，血脑屏障是CMI反应的一个重大障碍。此外，通过产生干扰素β在神经元细胞上表达HLA-G分子导致原始人类T细胞转化为调节性T细胞，抑制性细胞因子如白细胞介素10的产生导致细胞免疫抑制。此外，体液免疫系统是对抗狂犬病病毒的关键防御机制。中和抗体可以阻断病毒的传染性，并阻止病毒粘附到免疫个体的神经元细胞上。根据研究，当暴露于RABV时，未接种疫苗的动物不能产生最佳水平的中和抗体，这使得病毒能够到达神经系统，表现为疾病。12.2.狂犬病疫苗免疫，包括体液和细胞反应  狂犬病疫苗最重要的功能是通过激活CD4+t淋巴细胞诱导持续的抗体反应。虽然通常认为细胞毒性T细胞比抗体更能从组织中清除病毒感染，但狂犬病是一个例外。此外，CD8+t细胞活化导致临床上与瘫痪相关的致病反应。基于在神经系统中产生强有力的有害CD8反应的高风险，这一知识通常应防止使用活疫苗，如DNA疫苗或重组病毒，作为暴露后免疫接种。然而，由于活免疫的有效性，这些新一代疫苗仍然适用于暴露前的疫苗接种方案。保持神经系统完整性的最佳选择是灭活的暴露后疫苗，它主要在CD4+t细胞的帮助下促进B细胞活化。因为暴露后免疫接种在外周次级器官中建立了免疫反应，它们很可能提供保护。活化淋巴细胞，CD4-产生浆细胞，分泌抗体进入神经组织实质中和病毒。13使用疫苗和抗体治疗狂犬病的方法13.1.狂犬病疫苗疗法每年有数千人死于狂犬病，其中大多数发生在亚洲和非洲。然而，如果暴露后预防(PEP)得到及时有效的实施，狂犬病是可以通过接种疫苗来预防的。根据可能的狂犬病动物相互作用的性质，狂犬病暴露大致分为三类:I、II和III。任何被发现具有狂犬病风险的暴露都需要进行PEP，包括接种疫苗、对所有咬伤和抓伤进行彻底清洗和消毒、用RIG进行局部伤口浸润(仅适用于III类)，以及对所有咬伤和抓伤进行及时的局部治疗。PEP的主要目的是在暴露后阻止临床狂犬病的发作。PEP方案通常在施用人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)后仅进行一次，随后在治疗的第0天进行第一次疫苗接种，并在第3、7和14天进行接下来的三次免疫接种，从而确保足够的病毒中和抗体(VNAs)并提供针对狂犬病的保护。对于免疫受损的人，建议在第28天进行第五次接种，并在PEP方案完成后的7至14天检测血清转化。对于之前接受过暴露前或暴露后狂犬病预防的患者，仅应在第0天和第3天进行两次加强剂量的狂犬病疫苗接种。先前接种过疫苗的人不应接种HRIG 。根据世卫组织标准，每毫升血清中超过0.5国际单位的VNA滴度被认为足以对人类和动物提供保护。13.2.基于狂犬病免疫球蛋白(RIG)的狂犬病治疗狂犬病免疫球蛋白(RIG)是一种特异性靶向G蛋白表位的多克隆或单克隆抗体，发现其在病毒进入中枢神经系统(CNS)之前非常有效地中和RABV。这将提供即时抗体，直到身体通过积极产生抗体对疫苗做出反应。RIG有两个品种，人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)和马狂犬病免疫球蛋白(ERIG )，一般来说，20 IU/kg体重的HRIG和40 IU/kg的ERIG剂量用于中和狂犬病病毒。一般来说，伤口周围的区域应该注射球蛋白，理想的是在暴露的当天或首次注射疫苗后7天，这有助于在神经肌肉接头处初步中和病毒。RIG仍然是暴露后预防(PEP)的重要组成部分，因为它在宿主对免疫产生主动免疫之前的关键阶段提供被动免疫。不幸的是，一旦病毒进入中枢神经系统，这些抗体仅限于穿过免疫特权血脑屏障(BBB)来抵抗病毒感染。然而，研究表明，通过静脉注射同时施用RIG和BBB渗透性增强剂，如细胞因子MCP-1或高渗溶液高渗阿拉伯糖的有效性，关键是允许抗体穿过BBB并进入中枢神经系统，中和来自CNS的RABV，并防止小鼠和大鼠中狂犬病的发展。因此，RIG的这种治疗方法可以作为治疗狂犬病的有前途的选择。13.3.基于小干扰RNA (siRNA)的狂犬病疗法一类大约21-23bp的双链RNA分子，称为siRNA，也称为短干扰RNA或沉默RNA，通过RNAi途径降解转录后的mRNA来抑制特定基因的表达。基于siRNA的靶基因的基因沉默已经成为对抗许多疾病和障碍的抗病毒防御的一种选择。研究集中于编码siRNA的质粒或靶向特定RABV基因的基于病毒载体的siRNA系统，其被构建并测试抗狂犬病效力。特别是，基于病毒载体的siRNAs通常提供针对致死性RABV攻击的显著保护，并有效抑制相关基因表达和RABV增殖。最近的研究也强调了siRNAs可以作为RABV治疗可能性的潜在RIG替代品。14狂犬病疫苗的未来展望狂犬病疫苗开发的最新进展产生了预防和根除狂犬病的有利工具。然而，在不久的将来，我们将关注某些领域。新发明的疫苗目前的发展是相当可观的；然而，开发新的疫苗输送系统仍然是一个重要的研究领域，这将有助于制定有效的战略措施来根除这种疾病。由于在储存和运输过程中暴露于不利的温度而导致疫苗效力不足，因此狂犬病疫苗的失败非常有必要研究开发可以在常规冷链之外储存和运输的潜在狂犬病疫苗，这必将通过提高疫苗递送的有效性、效率和可负担性而彻底改变疫苗分销。最近对病毒载体疫苗的糖基质热稳定(SMT)技术的研究将成为未来消除疫苗冷链储存需求的新平台。新型佐剂(cPG、胶体锰盐、BAFF等)的进一步探索。)将肯定是提高灭活抗狂犬病疫苗效力的有希望的选择。创造多价疫苗的应用机会很有希望。成功开发基于双价病毒载体的狂犬病和犬瘟热疫苗将有可能用单一候选疫苗控制这两种疾病，特别是在发展中国家。此外，未来的疫苗开发应着眼于创造一种具有广谱保护效力的多价疫苗，同时考虑到狂犬病病毒的其他成员，这将对减少这种最致命的疾病非常有效尽管狂犬病疫苗和由细胞培养物生产的RIGs的质量和可获得性已逐步提高，但人们一直对创造抗病毒疗法有适度的兴趣，这保证了通过潜在的抗病毒药物对临床应用的潜在治疗干预的研究。在天然宿主中使用小干扰RNA (siRNA)的狂犬病疫苗的更多研究或基于双特异性抗体(BsAb)的狂犬病病毒疗法的发展在狂犬病的治疗方面具有更有希望的选择。此外，改进动物暴露后疫苗接种和重新定义各种疫苗的接种方案仍然是当务之急。在目标宿主中进一步开发新的和改进的免疫原性口服诱饵疫苗将非常有利于控制狂犬病，特别是在发展中国家通过大规模犬类疫苗接种计划在自由漫游的犬类群体中。15结论抗狂犬病疫苗发展的传奇以及从巴斯德到现代免疫时代狂犬病疫苗发展所走过的道路经历了许多起起落落。然而，尽管如此，这些开创性的工作为目前成功开发预防人类死亡和遏制犬狂犬病的疫苗奠定了坚实的基础，因此具有很大的价值。此外，利用先进的科学技术操纵狂犬病病毒基因组和新型疫苗载体的疫苗开发路线图肯定会在不久的将来为疫苗研究提供杰出的发展。然而，犬媒狂犬病流行国家的当务之急是对家犬和易接近的社区犬使用注射疫苗进行大规模犬疫苗接种，并对难以捕捉的散养犬补充口服疫苗。这种综合方法可以使到2030年全球消除犬传播的人类狂犬病死亡的全球战略计划成为现实。参考来源：Natesan K，Isloor S，Vinayagamurthy B，Ramakrishnaiah S，Doddamane R，Fooks AR. Developments in Rabies Vaccines: The Path Traversed from Pasteur to the Modern Era of Immunization. Vaccines (Basel). 2023 Mar 29;11(4):756. doi: 10.3390/vaccines11040756. PMID: 37112668; PMCID: PMC10147034.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。