Vesicular Stomatitis

摘要：疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病负担方面发挥着重要作用。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限的资源下迅速设计和生产出安全有效的疫苗。在这里，我们关注从传统的预防性疫苗到针对慢性疾病和癌症的治疗性疫苗的广泛领域的疫苗开发，提供了八种不同疫苗形式（减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗）以及针对五种实体瘤（肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和胃癌）、三种传染病（人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒引起的疾病）和三种常见慢性疾病（高血压、糖尿病和血脂异常）的治疗性疫苗的最新进展的全面概述。我们旨在提供有关疫苗技术、平台、应用和潜在下一代预防性和治疗性疫苗技术的新的见解，为未来疫苗设计铺平道路。 1.引言 疫苗接种是保护易感人群和控制传染病最经济有效的手段。因此，疫苗被认为是20世纪十大公共卫生成就之一。疫苗的使用使人类能够在全世界范围内根除天花，消除大多数国家的脊髓灰质炎，并控制白喉、百日咳、破伤风、腮腺炎、麻疹、风疹、流感嗜血杆菌B型等传染病，在世界部分地区显著降低了发病率和死亡率。然而，由SARS-CoV-2引起的当前COVID-19大流行已导致超过5亿确诊病例和超过600万人死亡。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限资源下迅速开发安全有效的疫苗。此外，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV）和Epstein-Barr病毒（EBV）在内的几种由传染性病原体引起的严重疾病尚未开发出疫苗，需要新的疫苗开发策略。总的来说，疫苗使人们能够过上更健康、更长寿的生活。然而，随着预期寿命的增加，非传染性疾病（NCDs）的负担，如癌症、自身免疫疾病、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病等，已经增加。NCDs，也称为慢性疾病，是由遗传疾病以及生理、环境和生活方式因素的组合引起的，并且可以持续很长时间。根据世界卫生组织报告，每年有4100万人死于NCDs，占全球死亡人数的71%。这种疾病负担的转变加剧了治疗NCDs的疗法的迫切需求。传统的预防性疫苗通过向健康个体接种抗原来预防疾病，从而建立特异性免疫，这主要发生在传染病上。治疗性疫苗用作暴露后治疗，以增强免疫系统对抗诸如慢性感染、癌前病变或癌症等先前存在的疾病。治疗性疫苗旨在调节人体免疫系统，并诱导细胞介导的免疫反应，以针对与NCDs相关的细胞或分子，而不是病原体或病原体感染的细胞。治疗性疫苗与预防性疫苗在一些重要方面有所不同。由于预防性疫苗通常给予健康人，这些人对不良事件的容忍度很低。相比之下，治疗性疫苗通常是暴露后治疗，并且患者高度耐受。成熟的传统疫苗和快速增长的新型疫苗技术促进了全球预防性和治疗性疫苗的开发。近年来，免疫学、分子生物学和基因组学的进步导致了更有效的疫苗成功。mRNA疫苗（Comirnaty、Spikevax、AWcorna）和病毒载体疫苗（Convidecia、AZD1222、Ad26.COV2.S）针对COVID-19大流行，是有史以来开发最快的疫苗。肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗（Prevnar13、Prevnar 20）基于蛋白结合疫苗技术。人乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Gardasil、Gardasil 9、Cervarix、Cecolin和Wozehui），基于基因工程技术设计，通过表达病毒样颗粒（VLP）预防与HPV相关的癌症。脑膜炎球菌B型疫苗（Trumenba、Bexsero）代表了从基因组到疫苗的“反向疫苗学”策略。最后，新型佐剂重组带状疱疹疫苗，Shingrix，扩大了免疫功能低下人群的免疫力。疫苗的不断发展提高了我们对免疫学和免疫基础的理解，针对NCDs的疫苗成为研究的新“热点”。目前，有前列腺癌疫苗（Provenge）、膀胱癌疫苗（TheraCys）、结肠癌疫苗（OncoVAX）、黑色素瘤疫苗（M-VAX和Melacine）、肾细胞癌疫苗（Oncophage）、肺癌疫苗（Racotumomab和CIMAvaxEGF）等。此外，治疗性疫苗在高血压、慢性乙型肝炎等疾病领域也取得了巨大进展。本综述旨在提供我们对最新疫苗技术、平台、应用和潜在下一代疫苗技术的当前进展和理解的概述。本综述将讨论预防性疫苗和治疗性疫苗。根据疫苗的成分，预防性疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、多肽疫苗、DNA和mRNA疫苗。此外，根据疾病分类，治疗性疫苗可分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性疾病的疫苗。我们相信，本综述将为疫苗技术和开发提供见解。 2.预防性疫苗开发的进展 2.1.减毒活疫苗 减毒活疫苗是通过保留抗原性但通过化学或其他方法遗传工程改造或减毒（减弱）的有机体创建的。通常，这些疫苗能够诱导具有长期持久性的体液和细胞免疫反应；然而，仍然存在毒力逆转的风险，这使得疫苗不适合对抗高度致病性变体。此外，减毒疫苗的有效期较短，热稳定性差，对储存和运输有严格的要求；这在大流行情况下会导致响应缓慢。由于减毒疫苗可能恢复到有毒形式，它们也可能在免疫功能低下的人中引起严重疾病。尽管存在这些问题，并且因为好处大于风险，减毒活疫苗仍然是疫苗开发中一个宝贵的平台。目前许可的减毒疫苗列表包括天花（牛痘）（ACAM2000）、麻疹、腮腺炎和风疹病毒（M-M-RII）、结核病（卡介苗（BCG））、霍乱（Vaxchora）、流感（FluMist）、登革热（Dengvaxia；四价）、轮状病毒（Rotarix）、水痘病毒、伤寒（Vivotif）、黄热病（YF-Vax）等等（表1）。 表1 中国目前许可的疫苗类型 根据世界卫生组织发布的一份文件（https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines），有两种减毒活COVID-19疫苗正在进行临床试验：由Codaenixin与印度血清研究所合作开发的COVI-VAC，以及由Meissa Vaccines，Inc.开发的MV-014-212。正在进行研究以提高减毒活疫苗的安全性并进一步减少其毒力；这通过增加复制保真度、通过密码子去优化以及通过病毒基因组的工程改造进行了测试。Vignuzzi等人试图利用通过增加复制保真度限制病毒种群多样性的观察，这可以显著降低组织嗜性和病毒致病性。结果表明，在动物感染模型中，具有减少遗传多样性的脊髓灰质炎病毒变种激发了保护性免疫反应。这种限制病毒准种群多样性为RNA病毒的稳定减毒疫苗工程提供了一种新方法。密码子对去优化（CPD）是另一种有效的病毒减毒策略，它利用次优密码子对来减毒重编码病毒。Groenke等人通过改变同步密码子的位置，在重编码基因组中增加了次优密码子对和CpG二核苷酸的数量。他们在流感A病毒上的研究显示，次优密码子对引起了减毒，而CpG二核苷酸比例的增加没有效果。此外，他们表明次优密码子对可以降低去优化密码子对mRNA的稳定性和翻译效率。因此，蛋白质产量的减少直接导致病毒减毒。最近，Trimpert等人构建了一个COVID-19候选减毒活疫苗，名为sCPD9，通过大规模编码SARS-CoV-2基因组（通过CPD方法修改），并在罗布罗夫斯基矮仓鼠中评估了疫苗的免疫原性和保护效果。作者表明，sCPD9的单次鼻内接种激发了针对当前四个SARS-CoV-2变体的交叉中和抗体反应：B.1.1.7（阿尔法）、B.1.351（贝塔）、B.1.1.28.1（伽马）和B.1.617.2（德尔塔），保护免受类似COVID-19的疾病。一种减毒活COVID-19疫苗，COVI-VAC，通过使用同义次优密码子对编码病毒刺突蛋白的一部分而开发。作者发现，该疫苗在仓鼠模型中刺激了高水平的中和抗体，高度减毒的COVI-VAC在单次鼻内剂量下具有保护性。该疫苗现在正在进行III期临床试验（ISRCTN15779782）。安伯（amb）突变是使减毒活疫苗更安全、更有效的一种新策略。这种方法通过将遗传密码扩展到流感病毒基因组中，显示出在产生活体但复制无能力的病毒疫苗方面的前景。研究人员通过含有正交翻译机制的转基因细胞系扩展了流感A病毒基因组的遗传密码。这种方法在转基因细胞系中创建了早终止密码子（PTCs）——携带病毒足够具有感染力但在常规细胞中无法复制，同时在转基因细胞系中产生高繁殖力和遗传稳定的后代病毒。在小鼠、雪貂和豚鼠模型中，这种活疫苗激发了对亲本和抗原性不同的菌株的强大免疫反应。另一种有前景的基因工程减毒病毒的方法是工程化病毒基因组。研究人员报告了一种脊髓灰质炎病毒2型疫苗株（nOPV2）的开发，他们在其中引入了对Sabin2基因组的50个非翻译区域的修改，以稳定减毒决定因素。在这种方法中，2C编码区域防止重组，3D聚合酶限制了病毒的适应性。这种菌株在遗传上比原始的Sabin2菌株更稳定，不太可能恢复毒力。在临床前和临床研究中，nOPV2具有免疫原性，并可能导致脊髓灰质炎病毒的完全根除。另一组合理设计了一种减毒水痘疫苗候选物，v7D，其中删除了毒力因子ORF7。该病毒在MRC-5成纤维细胞和人类PBMC（VZV传播载体）中的复制类似于野生型病毒，但在感染人类皮肤和神经细胞时严重受损。然而，v7D在体外和各种小动物中具有与vOka相当的免疫原性。最后，v7D在非人类灵长类动物中耐受性良好且具有免疫原性。这种疫苗目前正在中国进行II期试验（ChiCTR1900022284）。未来减毒疫苗的开发应该专注于选择更稳定的病毒株，并采用基因编辑策略来稳定减毒因素。 2.2.灭活疫苗 灭活疫苗是从病原体（如病毒或细菌）的灭活形式中提取的，这些病原体经过培养后，通过物理或化学方法灭活，使其不再具有传染性或毒性。灭活疫苗包括全灭活疫苗或部分灭活疫苗（Toxoid疫苗）。Toxoid疫苗使用细菌产生的灭活毒素，这些毒素的毒性已被抑制，但保留了免疫原性。与减毒疫苗和基因工程疫苗相比，灭活疫苗具有开发周期短、生产工艺相对成熟、非传染性、高安全性等优点。灭活疫苗的生产成本通常较低，并且由于它们耐温，可以长时间储存。灭活疫苗通常诱导体液免疫反应，而细胞免疫较弱。通常需要多次接种才能产生保护性免疫，从而降低疫苗依从性。在灭活过程中，病毒抗原可能在结构上受损，导致抗原性降低，疫苗的免疫原性降低。有许多批准的灭活疫苗：代表性的例子包括甲型肝炎病毒疫苗（HAVRIX和VAQTA）、脊髓灰质炎病毒疫苗（IPOL）、日本脑炎病毒（IXIARO）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳（INFANRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳吸附和灭活脊髓灰质炎病毒疫苗（KINRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗吸附（DAPTACEL）疫苗、流感疫苗（Fluarix四价）、人类狂犬病疫苗（RabAvert和Imovax）、肠道病毒71型（Inlive）、肾综合征出血热疫苗、蜱传脑炎疫苗（FSME-Immun），以及COVID-19疫苗（CoronaVac、WIBP-CorV、BBIBP-Cor）（表1）。在撰写本文时，全球已有11种针对COVID-19疾病的灭活疫苗获得有条件或紧急使用批准（包括中国5种疫苗）。从其他病原体研究中，已开发出一种寨卡病毒灭活疫苗候选物（PIZV）。在两次免疫剂量后，含铝佐剂的候选PIZV在CD-1和AG129小鼠中显示出高度免疫原性，从而支持PIZV候选物进入临床开发（NCT03343626）。历史上，手足口病（HFMD）的爆发主要由肠道病毒71和柯萨奇病毒A16引起。最近，柯萨奇病毒A6和A10与全球散发HFMD病例和爆发的增加有关。在一项研究中，柯萨奇病毒A6、A10和A16（CA6、CA10和CA16）在不同条件下通过甲醛或b-丙内酯（BPL）灭活，并检查了免疫效果。作者发现，CA10和CA16在BPL灭活（BI）后的免疫效果优于甲醛处理。此外，双三价治疗诱导了足够的中和抗体和细胞介导的免疫反应，表明BI-CA6、CA10和CA16作为潜在的多价疫苗候选物。灭活疫苗平台相对成熟，高度安全，可用于快速应对新出现的病原体，因此对于应对爆发至关重要。 2.3.多糖和多糖-蛋白结合疫苗 多糖疫苗是由基于碳水化合物的聚合物制成的，如来自细菌病原体的荚膜结构的壁酸或肽聚糖。一些针对细菌荚膜多糖的疫苗，例如脑膜炎球菌A/C/Y/W-135疫苗（Meningune-A/C/Y/W-135）、肺炎球菌疫苗（Pneumovax 23）和伤寒Vi多糖疫苗（Typhim Vi）（表1），已被批准用于预防侵袭性脑膜炎和伤寒疾病。然而，由于多糖不像蛋白质那样在主要组织相容性复合体（MHC）分子上被处理和展示，多糖疫苗通常显示出较弱的免疫原性、持久性差，并且只产生T细胞非依赖性免疫反应。没有T细胞的参与，这些疫苗不会引起记忆免疫反应或亲和力成熟，并且诱导的抗体——主要是IgM和IgG2——不适合激活补体，导致免疫保护无效且短暂。 多糖结合疫苗可以克服多糖疫苗的缺点。多糖结合疫苗是通过将病原体的荚膜多糖共价连接到蛋白载体上制备的，例如白喉类毒素（DT）、破伤风类毒素（TT）、改良的白喉毒素称为CRM197、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物（OMPC）或H. influenzae蛋白D HiD。蛋白载体和多糖同时出现在MHC-II上，导致T细胞受体（TCR）识别并激活Th反应。Th与B细胞之间的相互作用将改善和塑造抗体的滴度和质量以及B细胞记忆反应。共价结合方法包括标准化学交联和生物结合技术。目前批准的多糖结合疫苗通常是通过化学方法生产的，包括肺炎球菌13价、15价和20价结合疫苗（Prevnar 13, Vaxneuvance, Prevnar 20）、B型流感嗜血杆菌结合疫苗（Liquid PedvaxHIB, HIBERIX, ActHIB）和两种脑膜炎球菌结合疫苗（A, C, Y, W, MenQuadfi；A, C, Y和W-135, MENVEO, Menactra）（表1），等等。最近，Enotarpi等人报告了使用MenA，一种稳定的糖模拟结合疫苗，诱导针对A群脑膜炎奈瑟菌的保护性抗体。该团队生成了一系列未乙酰化的carbaMenA寡聚体，这些寡聚体被证明比荚膜多糖（CPS）更稳定，并表明八聚体（DP8）的随机O-乙酰化改善了抗MenA CPS抗体结合的抑制，并在与CRM197结合后诱导了抗MenA保护性小鼠抗体。这种方法可用于生成稳定的新糖结合疫苗。 生物结合技术允许多糖和载体蛋白在微生物内生物合成，通常是大肠杆菌。然后通过来自N-连接蛋白糖基化系统的特定寡糖转移酶在体内偶联蛋白质。近年来，生物合成因其经济性、快速性和效率而受到青睐。由这项技术生产的第一种多糖结合疫苗候选物是志贺氏菌多糖结合疫苗（GVXN SD133），由瑞士GlycoVaxyn AG开发，已完成I期临床试验（NCT01069471）。研究证明了GVXN SD133疫苗的良好安全性，所有测试剂量均能引起对志贺氏菌O1多糖的显著体液反应。蛋白载体也产生了功能性抗体，证明了这种新技术在保持碳水化合物和结合蛋白表位方面的优势。另一种针对志贺氏菌flexneri 2a（Flexyn2a）的生物结合疫苗在I期研究（NCT02388009）的所有时间点和所有组别中，接种后均引起了统计学上显著的S. flexneri 2a脂多糖（LPS）特异性体液反应。结果表明Flexyn2a具有令人满意的安全性，产生了强大的体液反应。这种疫苗目前正在进行IIb期（NCT02646371）。总体而言，多糖结合疫苗平台比其他平台显示出更多的潜力，并提供了解决细菌疫苗紧迫问题和挑战的解决方案，通过逐步使用生物合成技术。 2.4.重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗采用基因工程方法，在合适的宿主细胞中表达病原体特异性基因，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞等。重组亚单位疫苗通常具有良好的安全性和稳定性。然而，由于外源蛋白通常显示MHC II类反应，通常不会产生强烈的T细胞反应，因此需要佐剂刺激和多次接种以增强免疫原性，这可能不适用于呼吸道黏膜免疫。目前批准的人类重组亚单位蛋白疫苗包括流感疫苗（FluBlok）、带状疱疹疫苗（Shingrix）、脑膜炎球菌B群疫苗（Trumenba、Bexsero）和COVID-19疫苗（ZF2001、Nuvaxovid）（表1）。近年来，随着反向疫苗学、结构生物学、基因组学和蛋白质组学理论和技术的进步，重组亚单位疫苗免疫原逐渐进入理性设计的新时代。反向疫苗学的过程是利用自下而上的方法从基因组到疫苗开发疫苗。2013年批准的Bexsero脑膜炎B群疫苗是反向疫苗学的经典案例。它基于对致病微生物的关键保护或毒力抗原的全基因组预测和筛选，然后开发新疫苗；这样的例子包括三个抗原：淋病奈瑟菌肝素结合抗原（NHBA）、因子H结合蛋白（fHbp）和淋病奈瑟菌粘附素A（NadA）。Shingrix是葛兰素史克开发的重组亚单位佐剂疫苗，由水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白gE重组蛋白组成，并补充了新的佐剂AS01B。对带状疱疹的整体疫苗效力在老年人（≥50岁）中为97.2%。Shingrix的成功强调了佐剂在疫苗开发中的关键作用。NVXCoV2373（Nuvaxovid）是一种含有昆虫细胞表达的S-三聚体和Matrix-M佐剂的重组蛋白疫苗。最近的临床结果显示，该疫苗对任何关注或感兴趣的变体的疫苗效力为92.6%。结核病亚单位疫苗M72/AS01E（葛兰素史克）包含两个M72重组融合免疫原（MTB32A和MTB39A）与佐剂系统AS01E结合，并为M. tuberculosis感染、HIV阴性成年人提供约50%的疾病进展到活动性肺结核的保护约3年。此外，另一种重组亚单位结核病疫苗（GamTBvac）被证明由两个结核分枝杆菌抗原融合（Ag85A和ESAT6-CFP10）组成，与明胶结合域固定在明胶上，并与由DEAE-明胶核心和CpG寡脱氧核苷酸（TLR9激动剂）组成的佐剂混合。II期的结果显示出有希望的安全性和耐受性，诱导了抗原特异性干扰素-γ反应、表达Th1细胞因子的CD4+ T细胞和IgG反应。结构生物学也有助于疫苗的理性设计。RSV表面融合（F）蛋白存在于两种构象中：前融合（pre-F）和后融合（post-F）构象。基于前F和抗体的高分辨率复合物结构，F蛋白被修改以在前融合状态下稳定（DS-Cav1）。I期临床显示，针对前融合特异性表面RSV F的血清抗体的中和活性增加了10倍以上。其他人设计并获得了一种基于结构探究的稳定RBD-sc-dimer疫苗分子。RBD的C末端的N602残基与另一个RBD的N末端串联设计，提高了RBD二聚体的稳定性和中和抗体反应。根据官方报告，疫苗的III期临床数据显示，该疫苗对18岁及以上人群的任何严重程度的COVID-19的保护效力为81.43%（NCT04646590）。这些结果代表了基于结构的疫苗设计的临床证据，预示着精准疫苗学的新时代的曙光。重组亚单位疫苗平台具有技术优势，如安全性和效率，以及良好的稳定性和成熟的产业。然而，安全有效的佐剂对提高疫苗效力至关重要。结构生物学、反向疫苗学和新型佐剂的新技术将促进重组蛋白疫苗的设计。 2.5.病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗 病毒样颗粒（VLPs）是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米尺寸（20-200纳米）颗粒，它们的结构和免疫原性与天然病毒相似。VLPs不包含病毒遗传物质，因此可以模拟病毒抗原性而不具致病性。VLPs具有高度重复的抗原表位阵列，有利于被树突状细胞（DCs）吞噬并呈现给MHC I类和II类分子。它们可以激活身体，诱导强烈的细胞和体液免疫反应，使其成为疫苗开发的理想平台。目前批准的VLPs疫苗包括乙型肝炎疫苗（Hepavax-B、Engerix-B、Recombivax HB、HBVaxPro、Heplisav-B、Fendrix、Hepavax-Gene）、HPV疫苗（Cervarix、Gardasil、Gardasil 9、Cecolin和Wozehui）、乙型肝炎E疫苗（Hecolin）、疟疾疫苗（Mosquirix）和COVID-19疫苗（Covifenz）（表1）。此外，多种基于VLPs的预防性疫苗已进入临床试验阶段，主要针对诺如病毒、轮状病毒、BK多瘤病毒、狂犬病、RSV、HIV、流感病毒等。疟疾疫苗的研发仍然是一个巨大的挑战。GSK的科学家使用截短的环孢子蛋白（CSP）结合乙型肝炎表面抗原（HBsAg）生成名为RTS的蛋白质。然后，RTS与另一个游离的HBsAg在酵母细胞中共表达，生成RTS,S VLPs。然而，尽管RTS,S/AS01的三剂疫苗最初对临床疟疾具有一定的保护作用，但疫苗的效力随时间减弱，在高于平均水平的疟疾寄生虫暴露中效果较差。然而，RTS,S疫苗的开发大大提高了我们实现开发有效安全疟疾疫苗的长期目标的机会。最近，提出了VLPs的嵌合设计，以保护免受多型病原体的侵害。作者用系统发育上密切相关的环区域替换了HPV L1环区域。HPV33/58/52 VLPs的三型嵌合体在小鼠和非人灵长类动物中诱导的中和滴度与三种野生型VLPs混合物相当。作者目前正在开发基于这一策略的七种交叉疫苗，针对20种HPV变体。Medicago Inc.开发的一种基于植物的VLPs COVID-19疫苗最近在加拿大获得授权使用。该疫苗含有SARS-CoV-2刺突（S）蛋白（原始菌株）的VLPs以及AS03佐剂，显示出71%的效力，保护18至64岁的试验参与者（https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines/medicago.html）。 纳米颗粒疫苗（NPVs）使用纳米材料作为载体、链接器或免疫调节剂，通过物理或化学方法将特定抗原和佐剂连接起来。这种基于纳米载体的传递系统可以保护疫苗免于过早降解，提高其稳定性，并促进免疫原传递到抗原呈递细胞（APCs），特别是DCs。此外，纳米颗粒提供了合适的疫苗给药途径，并增强了具有缓慢释放特性的抗原摄取，从而产生强烈的体液、细胞和粘膜免疫反应。纳米颗粒可以来自脂质体、VLPs以及金属或非金属无机、聚合物和脂质。但与其他疫苗候选物一样，NPVs的生产充满了许多困难和挑战。例如，一些NPVs可能会引发系统性或局部炎症反应，而一些纳米材料会在细胞中积累，导致其在体内长期保留，可能导致血管血栓形成。此外，在生产和储存成本方面仍存在一些限制。 自组装蛋白支架也在疫苗开发中得到广泛应用；例如I53-50、铁蛋白、mi3和IMX313颗粒。I53-50是通过计算工程设计的双组分蛋白，可自组装成二十面体纳米颗粒。该系统已用于RSV、流感病毒和HIV疫苗的开发，这些I53-50疫苗候选物在动物模型中诱导了强烈的抗体反应。在COVID-19疫苗开发中，一种多价SARS-CoV-2刺突受体结合域纳米颗粒（RBD-NP）疫苗在小鼠中显示出保护作用，仅需一次免疫。这种RBD-NP疫苗在非人灵长类动物中引发了多样化的多克隆抗体反应，目前正在进行临床试验（NCT04742738，NCT05007951）。另一项研究展示了一种疫苗，该疫苗显示了SARS-CoV-2刺突蛋白的多个副本，以诱导强烈的中和抗体反应，从而提供对高剂量SARS-CoV-2挑战的保护。铁蛋白是一种天然蛋白笼，由24聚体结构组成，具有八个三重轴，可用于展示三聚体抗原，如流感血凝素（HA）或HIV Env蛋白。一种基于铁蛋白的疫苗候选物目前正在进行针对EBV（传染性单核细胞增多症、各种癌症和自身免疫疾病的原因）的I期临床试验（NCT04645147）。一些COVID-19疫苗也被设计为使用铁蛋白来展示RBD或刺突三聚体，形成纳米颗粒，这两种疫苗候选物在临床前研究中都显示出了提高的抗体反应。最后，mi3 NP是理性设计的i301纳米笼的突变形式，显示出比原始形式更高的产量、均匀性和稳定性。基于RBD的mi3疫苗可以诱导针对SARS-CoV-2变体和SARS-CoV的中和抗体。mi3已被用于开发流感、典型猪瘟和疟疾疫苗。通过遗传融合、标签/捕手组装或化学交联可以实现抗原到支架的展示。与基于蛋白质的纳米颗粒疫苗相关的主要挑战是在融合到或展示在支架上时保持抗原的结构构象。纳米颗粒疫苗是一个激动人心的平台，用于灵活的抗原展示，在疫苗开发中具有巨大的潜力。 2.6.病毒载体疫苗 病毒载体疫苗使用减毒病毒疫苗株或非复制病毒作为载体，有效地将抗原基因代码传递到宿主细胞核中以诱导免疫反应。病毒基因组可以稳定地接受大基因片段的插入并表达特定抗原，从而可以使用病毒载体技术开发多种疫苗。抗原可以精确合成、修改并针对宿主中的特定细胞。病毒载体诱导的身体反应类似于对自然感染的反应，导致强烈的体液和细胞免疫反应。病毒基础疫苗的主要关注点是针对载体的预先存在的免疫力，这削弱了疫苗引起的抗体诱导和T细胞反应。目前，许多病毒载体，如人类和黑猩猩腺病毒（Ad和ChAd）、水泡性口炎病毒（VSV）、改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）、麻疹病毒（MV）、痘病毒、新城疫病毒（NDV）和其他病毒已被用作疫苗开发的载体。批准的病毒载体疫苗包括埃博拉病毒疫苗和COVID-19疫苗。由CanSino Biotechnology, Inc.开发的首个获得许可的埃博拉病毒疫苗基于腺病毒（Ad5）载体，已获得国家药品监督管理局（NMPA）的批准（表1）。其他包括由Merck开发并由食品药品监督管理局（FDA）批准的复制能力VSV基础埃博拉疫苗ERVEBO；由Janssen Cilag International N.V.（Janssen）开发的编码扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白的腺病毒Ad26，Zabdeno；Mvabea，一种MVA，编码扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒和马尔堡病毒的糖蛋白，以及由Janssen开发的Tai Forest埃博拉病毒的核蛋白。迄今为止，已有五种批准的病毒载体COVID-19疫苗：由CanSino开发的基于腺病毒载体的Ad5；基于重组ChAdOx1腺病毒载体（ChAd）平台的AZD1222（Vaxzevria），由AstraZeneca开发；由印度血清研究所有限公司开发的Covishield（ChAdOx1_nCoV-19）；由Janssen开发的Ad26.CoV2.S疫苗；以及基于Ad26和Ad5载体的Sputnik V，由俄罗斯加马利亚研究所开发。 中国疾病预防控制中心（中国疾控中心）已开发出一种基于DNA疫苗与复制能力天坛牛痘（rTV）疫苗结合的HIV疫苗（DNA/rTV），该疫苗包含gag、pol和env基因。这种疫苗在恒河猴中对同源和异源挑战后的病毒获取具有保护作用。DNA/rTV疫苗在I期（ChiCTR-PRC-10001287）中安全并诱导免疫反应。2021年11月，使用DNA/rTV疫苗的II期临床试验（ChiCTR1900021422）已完成。研究人员还构建了一种包含刺突蛋白的复制能力重组病毒（rVSV-SARS-CoV-2）的COVID-19疫苗。结果显示，通过鼻内（i.n.）给药的rVSV-SARS-CoV-2疫苗在猕猴中诱发的中和抗体水平是肌肉注射（i.m.）途径的8倍。同样，基于NS1-del基础的减毒流感病毒载体的结核病疫苗也已进入I期临床试验（NCT03017378）。厦门大学、香港大学和北京万泰生物药业开发了一种基于减毒流感病毒的COVID-19疫苗，DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1（鼻内流感基础-RBD），目前正在进行III期临床试验（ChiCTR2100051391）。 由于其制造平台的多功能性和在流行病或大流行期间的响应时间，病毒载体疫苗越来越多地用于预防性疫苗的生产。然而，罕见的风险事件仍然是一个需要解决的重要问题，以充分利用这一平台在未来的潜力，这在传染病和癌症中具有重要意义。 2.7.肽疫苗 免疫系统对抗原作出反应，通常集中在少数氨基酸（aa）或肽段上，主要是B细胞和T细胞表位。肽疫苗旨在识别病原体上的肽序列，这些序列能够诱导保护性免疫反应，然后使用这些肽序列来全合成疫苗物质。由于它们是合成的，没有突变或逆转的风险，肽抗原可以快速修改以产生特定的反应。然而，这种方法在实践和理论上仍然存在困难。肽疫苗本身通常免疫原性不足，需要多次免疫才能有效。免疫原性可以通过将表位肽与载体蛋白融合、将表位肽与载体蛋白化学链接或人工合成相关肽的重复序列来增强。表位通常不是简单的氨基酸序列；然而，结构表位——具有精确构象——有时可能是抗体结合所必需和充分的。因此，以构象依赖的方式呈现肽是肽疫苗设计的重要考虑因素。先进的肽疫苗目前正在临床试验中，包括针对流感病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1、疟疾和阿尔茨海默病的疫苗。 最近，图宾根大学医院开发了一种基于肽的COVID-19疫苗候选物，名为CoVac-1，由来自SARS-CoV-2的多个病毒蛋白（刺突、核衣壳、膜、包膜和开放阅读框8（ORF8））的T细胞表位组成。这与Toll样受体1/2激动剂XS15结合，在Montanide ISA51 VG中乳化。在I期，开放标签试验（NCT04546841）中，CoVac-1显示出有利的安全性，并且在所有参与者中诱导了针对多种疫苗肽的SARS-CoV-2特异性T细胞反应，由多功能Th1 CD4+和CD8+ T细胞介导。这些发现表明CoVac-1诱导了一种广泛、强大且与关注变体无关的T细胞反应。 一种疟疾疫苗PEV3B含有来自恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）和环孢子蛋白（CSP）的两个多肽。临床试验Ia（NCT00400101）和Ib（NCT00513669）阶段证明了病毒体配方的PEV3B的安全性和免疫原性。事实上，在大多数时间点上，AMA-1和CSP肽抗原特异性IgG滴度显著高于对照组。这些发现为进一步开发针对疟疾的多价病毒肽疫苗提供了坚实的基础。 一种新型通用流感疫苗Multimeric-001（M-001），由BiondVax Pharmaceuticals Ltd.开发，包含来自A型和B型流感病毒的HA、NP和M1蛋白的保守表位，旨在保护免受多株和多季节流感病毒株的侵害。七个已完成的临床试验表明，该疫苗安全、耐受性好，并对广泛的流感毒株具有免疫原性。然而，在2020年10月，M-001的III期临床试验（NCT03450915）并未显示安慰剂组和接种组在减少流感疾病方面有显著差异。在HIV疫苗研究中，一种融合肽（FP）共价链接到关键孔虫血蓝蛋白（KLH）的赖氨酸残基上，命名为FP-KLH，被设计为在Env三聚体初次免疫后作为增强剂。这种组合免疫方案在小鼠中诱发了单克隆抗体，中和了高达31%的208种HIV-1跨亚型菌株。对豚鼠和猕猴的免疫诱导了类似的广泛的融合肽导向的中和反应，表明HIV-1融合肽是疫苗诱导广泛中和抗体的靶标。 肽疫苗的开发作为一种方法吸引了各种治疗领域的关注，包括癌症、阿尔茨海默病和丙型肝炎病毒。尽管如此，肽疫苗仍然存在挑战，包括较弱的免疫原性和不一致的免疫反应，这应该通过表位设计、载体优化和新佐剂的结合进一步改进和发展。 2.8.DNA和mRNA疫苗 核酸疫苗由DNA疫苗和mRNA疫苗组成。DNA疫苗使用编码蛋白质的细菌质粒，在哺乳动物启动子下，然后驱动宿主细胞中的抗原表达。DNA疫苗可以诱导体液和细胞免疫，具有长期免疫反应，并且易于制造和扩大规模。针对流感、乙型肝炎、HIV、疟疾、SARS-CoV-2和癌症等传染性和非传染性疾病的DNA疫苗已在数百项人类临床试验中进行了测试。最近，印度在2022年批准了第一种用于人类紧急使用的DNA疫苗。由Zydus Cadila开发的ZyCoV-D疫苗采用了非复制和非整合的质粒DNA，携带SARS-CoV-2的基因。ZyCoV-D使用无针系统，将免疫以狭窄的流体流形式传递到皮肤中，显著减少了副作用。在III期临床试验的中期报告中，ZyCoV-D疫苗的有效性达到了约66.6%。治疗组中诱发的不良事件的发生相似。总的来说，ZyCoV-D疫苗在III期试验中被验证为有效、安全和具有免疫原性。然而，许多DNA疫苗的免疫原性低于其他疫苗平台，并且与在其他哺乳动物中看到的临床结果相比，临床结果令人失望。此外，安全性问题，如质粒DNA整合到基因组DNA中。过去对DNA疫苗整合进行了广泛研究，但没有证据表明发生了整合。DNA疫苗受到其较弱的免疫原性的限制，需要施用更大的剂量。此外，它们有效的递送仍然是未来研究的问题。 mRNA疫苗通过将与病原体特定蛋白相对应的信使RNA（mRNA）引入宿主细胞而发挥作用。mRNA疫苗主要包括传统的非复制型mRNA和自复制mRNA（SAM）。获得许可的COVID-19疫苗BNT162b2和mRNA-1273都是非复制型mRNA疫苗。自复制RNA（SAM）具有编码RNA复制因子的完整基因。与传统mRNA相比，SAM具有更持久和更高水平的抗原表达。SAM疫苗所需的剂量也远低于传统mRNA疫苗。非复制型和SAM疫苗在引入细胞质时表达高水平的异源基因。mRNA疫苗可以激活先天免疫系统并发挥固有的佐剂效应。mRNA疫苗具有免疫原性；被模式识别受体（PRRs）如TLR3和TLR7/8识别；在接种部位产生细胞因子；并招募和驱动先天免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）的激活和成熟。对于适应性免疫，mRNA的翻译过程在细胞质中完成以产生目标抗原，然后被有效加工成多肽并呈现给MHC-I分子，引发细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。翻译后的抗原随后被分泌并在MHC-II蛋白上呈现给辅助T细胞（Th），以引发CD4+ T细胞反应，这通过炎症细胞因子刺激B细胞产生中和抗体并激活吞噬细胞。与传统疫苗类似，为了克服脂质双层并将mRNA疫苗转移到细胞质中，已开发了各种mRNA疫苗的递送方法，包括基因枪、电穿孔、脂质纳米颗粒（LNPs）等。 COVID-19 mRNA疫苗Comirnaty（BioNTech/Pfizer）是FDA于2021年8月首次批准用于人类的mRNA药物；Spikevax（Moderna）疫苗也于2022年1月在美国获得授权，并随后在其他国家使用（表1）。Comirnaty和SpikeVax是LNP配方的、修饰核苷的mRNA疫苗，编码SARS-CoV-2的S蛋白的前融合稳定形式。在一项涉及43,548名参与者的研究中，接种两剂疫苗后BNT162b2预防COVID-19的有效性为95%。严重不良事件的发生率很低，疫苗组和安慰剂组之间相似。在涉及30,420名志愿者的III期临床试验中，mRNA-1273疫苗预防COVID-19的有效性为94.1%，同样，严重不良事件很少见。另一种mRNA疫苗（CVnCoV），由CureVac开发，已进入IIb/III期临床试验。然而，CVnCoV对有症状的COVID-19的有效性为48.2%，随着SARS-CoV-2变种的出现，该试验被暂停。另一种mRNA疫苗ARCoV，由中国的Walvax Biotechnology开发，已于2022年9月获得印尼药品机构的紧急使用授权。ARCoV热稳定，可在室温下至少存放一周。ARCoV在I期临床研究中被证明是安全且耐受性良好，并能诱导强大的体液和细胞免疫反应，支持进一步的大规模临床研究和人类使用。 目前，有超过25种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗候选物正在进行临床试验。此外，还有许多针对其他传染病的mRNA疫苗的临床试验，包括寨卡病毒（NCT04064905）、流感病毒（NCT03345043, NCT03345043）、巨细胞病毒（NCT04232280, NCT03382405, NCT03382405）、RSV（NCT04528719）、基孔肯雅病毒（NCT03829384, NCT03325075）和狂犬病（NCT02241135, NCT04062669）。 环状mRNA（circRNA）是一种非编码单链RNA，通过添加内部核糖体进入位点（IRES）和/或通过在5′UTR中纳入特定的核苷修饰，可以实现蛋白表达。这一新平台已被证明由于转录本的延长半衰期，在真核细胞中产生强大且稳定的翻译。最近，Qu等人报告了一种SARS-CoV-2 Omicron circRNA疫苗，该疫苗在小鼠和猴子中诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并有效抵抗SARS-CoV-2。 与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有类似活病毒的免疫反应机制，没有感染或整合到宿主基因组的风险，更稳定，能够有效表达抗原蛋白，并且通过快速且成本效益高的大型生产过程生产。从理论上讲，mRNA疫苗的开发只需要在成熟的技术平台上替换抗原序列；因此，在预防和控制新出现的传染病方面提供了相当大的优势。然而，mRNA疫苗在翻译效率和稳定性方面仍然存在一些挑战。此外，了解安全性和抗体反应的持续时间需要更长期的数据。总体而言，mRNA技术为疫苗、治疗以及更多领域提供了一个令人兴奋和有希望的途径。 2.9.当前和未来的中国预防性疫苗市场 中国是目前少数几个能够通过其工业基础设施提供足够疫苗供应能力的国家之一。近年来，中国在疫苗研发方面做出了巨大努力，并取得了显著进展，其疫苗市场正逐渐繁荣起来。根据NMPA批准的药品信息，中国市场上有94种预防性疫苗，可以预防38种疾病（表2）。其中，80种疫苗是国内生产的，11种来自国外；国产疫苗作为市场的主力，而一些战略性疫苗的供应，如白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌联合疫苗（DTwP/Hib）、五价轮状病毒疫苗、四价和九价HPV疫苗以及带状疱疹疫苗仍然依赖外部制造商。最近，国产HPV疫苗和肺炎球菌疫苗的批准展示了中国在疫苗开发和制造领域的巨大潜力。中国还开发了手足口病疫苗（EV71）、戊型肝炎疫苗和埃博拉疫苗等新型疫苗。这些成就为SARS-CoV-2出现后多技术疫苗突破的快速部署奠定了坚实的基础。目前中国市场上的传染病疫苗包括流感、水痘、脑膜炎球菌性脑膜炎、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、狂犬病、白喉、百日咳、破伤风、b型流感嗜血杆菌、脊髓灰质炎、结核病、霍乱、轮状病毒、脓疱疮、气管炎、手足口病、破伤风、伤寒、副伤寒、黄热病、钩端螺旋体病、蜱传脑炎、日本脑炎、麻疹、腮腺炎、风疹、鼠疫、肺炎球菌肺炎、炭疽、布鲁氏菌病、COVID-19、宫颈癌、细菌性痢疾、埃博拉出血热、肾综合征出血热、带状疱疹。然而，与全球市场相比，中国仍然缺乏一些疾病的疫苗，如登革热、B群脑膜炎球菌和疟疾。同时，值得注意的是，中国大多数疫苗目前基于传统疫苗平台，如灭活或减毒活疫苗、基因工程疫苗。第三代疫苗技术如病毒载体和核酸疫苗的开发才刚刚开始，中国市场上还没有核酸疫苗。 表2 中国当前许可的疫苗市场 对于重要疾病，如HIV、RSV、寨卡病毒和巨细胞病毒疫苗，尚未在全球成功开发和上市。此外，主要传染病病原体的其他亚型或突变逃逸株也在不断演变。因此，带来了许多挑战，如现有疫苗覆盖不足，如COVID-19、流感、结核病等疫苗。此外，一些现有的传染病疫苗对某些特定类型预防效果较差，如B群脑膜炎球菌疫苗、人类乳头瘤病毒疫苗、肠道病毒EVD68、超级细菌疫苗等。此外，中国无法独立满足高风险或特殊人群的疫苗需求，如老年人的带状疱疹疫苗。最后，联合疫苗是一线可以预防多种疾病并让人们通过较少的注射获得保护的疫苗。未来，应加强新一代疫苗技术的开发，如病毒载体疫苗和核酸疫苗。 3.治疗性疫苗的发展进展 与预防性疫苗不同，治疗性疫苗是指在已经感染病原体或患有特定疾病的患者中诱导特异性或非特异性免疫反应以治疗疾病进展的生物制品。因此，治疗性疫苗的主要目标是诱导肿瘤消退、根除微小残留病、建立持久的抗肿瘤记忆以及避免非特异性或不良反应。治疗性疫苗主要分为四类：基于肽/蛋白的疫苗、基于细胞的疫苗、基于DNA或RNA的疫苗和基于病毒载体的疫苗。根据疾病分类，治疗性疫苗可以分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性病的疫苗。首个获得FDA批准的癌症疫苗，Sipuleucel-T（Provenge，由Dendreon公司商业化），目前用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌。Provenge是一种自体的、基于树突状细胞的疫苗，装载有与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）融合的前列腺酸性磷酸酶（PAP）抗原；这种疫苗首次实现了利用患者的自身免疫细胞攻击癌细胞的理念。迄今为止，已有超过30,000名男性患者接受了Provenge治疗，临床上已证明可以延长晚期疾病男性患者的生命。Provenge的批准在治疗性疫苗领域内具有重要意义，并强调了抗癌疫苗可以发挥作用的事实，从而为进一步投资癌症疫苗开发提供了动力。 3.1.治疗性疫苗在癌症方面的应用 3.1.1.治疗性疫苗在肺癌方面的应用 肺癌（LC）是最常被诊断出的癌症，也是导致癌症相关死亡的主要原因，由于预后不佳和临床结果差，给全球公共卫生带来了沉重负担，5年生存率为19%；实际上，肺癌占癌症总病例的11.4%，占全球癌症总死亡人数的18.0%。LC分为两个主要组织类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。传统的抗癌疗法（手术、放疗和化疗）在遏制进展方面的有效性有限，因此，全球范围内正在积极开展针对LC的治疗性疫苗设计研究（表3）。2008年，古巴开发了世界上第一个有效的治疗性疫苗CIMAvax EGF用于NSCLC，后来在古巴、秘鲁和委内瑞拉批准用于一线化疗后的晚期（IIIB和IV期）NSCLC治疗。CIMAvax EGF由人重组表皮生长因子（EGF）与脑膜炎奈瑟菌重组P64K蛋白共价结合而成。EGF调节细胞生长和分裂，NSCLC患者中EGF的过度表达与细胞生长和分裂失控有关。CIMAvax EGF通过刺激免疫系统产生特异性针对EGF的抗体，抑制其与癌细胞上的相应受体结合，从而减缓癌细胞的无控制生长。II期和III期临床试验表明，CIMAvax EGF耐受性良好，并延长患者生存期，特别是60岁以下患者的中位总生存期（OS）分别为18.53个月和7.55个月。另一种疫苗Vaxira是一种免疫治疗剂，由小鼠γ型抗异型单克隆抗体Racotumomab和氢氧化铝组成。Racotumomab特异性诱导针对在多种实体瘤中过度表达的Neu-糖基化GM3神经节苷脂（NeuGcGM3）的抗体反应。目前正在评估多种癌症适应症，包括黑色素瘤、乳腺癌和肺癌。Vaxira治疗NSCLC的临床试验结果显示，中位生存时间为8.23个月，略高于对照组的6.8个月；Vaxira治疗组的中位无进展生存时间为5.33个月，对照组为3.9个月，证明了Vaxira优于安慰剂。基于II/III期研究的有希望的结果，Racotumomab于2013年在古巴和阿根廷推出，作为晚期NSCLC患者的皮下注射治疗。Tedopi是一种基于新表位的疫苗，具有针对HLA-A2+的限制性修饰新表位，针对肺癌中经常表达的五种肿瘤相关抗原：CEA、HER2、MAGE2、MAGE3和P53。在II期试验中，Tedopi在预处理的晚期NSCLC患者中显示出17.3个月的OS，并具有可管理的安全性。ATALANTE-1——一项随机、开放标签、两步、III期研究——比较了Tedopi与标准治疗（SoC）在HLA-A2+ NSCLC患者中的疗效，这些患者在ICI治疗后疾病进展的第二或第三线治疗。Tedopi通过刺激杀手T细胞，使它们能够发现并消除癌细胞，这是治疗疾病的关键过程。结果显示，在63名Tedopi组患者中，有29名患者至少存活了12个月，12个月生存率为46%，远高于预定的25%。一名54岁的晚期LC患者，在接受了五次Tedopi注射后，肿瘤迅速缩小（从39毫米缩小到23毫米）。在本报告发布时，患者的生存期已超过20.6个月，仍在观察中。现在，由于其出色的临床数据，Tedopi已获得美国FDA的孤儿药指定，用于治疗HLA-A2阳性NSCLC。 表3 市场上或处于临床开发阶段的针对不同疾病的治疗性疫苗 3.1.2.治疗性疫苗在乳腺癌方面的应用 乳腺癌（BC）是全球第二常见的恶性肿瘤，每年有超过226万例新病例。它也是女性癌症相关死亡的主要原因。迄今为止，截至2021年6月23日，共有44项正在进行的（即活跃的、不招募；招募；尚未招募）临床试验正在研究BC的治疗性疫苗。就疫苗平台而言，大多数BC疫苗是基于肽的（N=20，45.5%），而大约有10项（22.7%）的临床试验正在测试基于细胞的BC疫苗；新技术开发的病毒载体疫苗占6项（13.6%），而基于基因的BC疫苗正在8项（18.2%）临床试验中进行评估。 人表皮生长因子受体-2（HER2）是乳腺癌疫苗的理想靶点，是一种细胞表面受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性，在高达75%的BC中表达。HER2在细胞生长、存活和分化中发挥着极其重要的作用。针对HER2的基于肽的疫苗能够诱导持久的特异性细胞和体液免疫反应，以抑制HER2阳性肿瘤细胞的生长，显示出高免疫原性、强特异性和良好的安全性。在II期临床试验（NCT00524277）中，HER2衍生的肽疫苗GP2，即HER2跨膜域（TMD）的亚优势表位，与GM-CSF（一种FDA批准的免疫佐剂）结合使用。这种组合刺激了抗原呈递细胞（如DC等）的增殖，并进一步诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别和摧毁表达HER2/neu的癌细胞。此外，GP2疫苗耐受性良好，没有严重的不良反应，接受GP2疫苗治疗的BC患者在手术后以及Herceptin治疗后5年的无病生存率达到100%。此外，与单独接受GM-CSF治疗的患者相比，BC复发率为0%，而后者为89.4%。基于E75（HER2/neu 369-377，KIFGS LAFL）的疫苗是治疗BC患者最广泛研究的策略。然而，目前的结果表明，E75疫苗仅对三阴性BC患者并且在治疗与曲妥珠单抗联合使用时对表达HLA-A24的患者提供了显著的临床益处；需要进一步评估这些效果。其他基于肽的疫苗也在临床试验中（表3）：AE37（HER2/Neu 776-790，GVGSPYVSRLLGICL；II期临床试验中），TPIV100（一种使用sargramostim作为佐剂的多表位疫苗，针对HER2；II期临床试验中），MVFHER-2（aa597-626；I期临床试验中）和MVF-HER-2（aa266-296；I期临床试验中）（MVF-HER2是两种嵌合型曲妥珠单抗样（MVF-HER2，aa597-626）和小扰素样（MVF-HER2，aa266-296）HER2 B细胞肽基疫苗的组合）。此外，基于细胞的治疗性疫苗是患者特定的，需要一种安全的方法进行个性化疫苗开发（Arab等人，2020年）。目前有多种针对HER2的基于细胞的疫苗正在开发中（表3）：DC细胞（NCT02061423，NCT04348747），PBMC细胞（APC8024），以及同种异体细胞（NCT00847171）已被用作免疫原进行免疫。初步结果表明，这些疫苗耐受性良好，并提供了特异性抗HER2细胞免疫反应。目前，正在考虑用于提高BC治疗性疫苗效果的各种方法：包括选择合适的细胞亚群、佐剂的选择以及不同的工程方法（如基于VLP或基于基因的疫苗）。然而，这些优化的临床益处仍有待验证。 3.1.3.治疗性疫苗在结直肠癌方面的应用 结直肠癌（CRC）是世界上第三常见的癌症，仅次于LC和BC，发病率为10.0%，死亡率为9.4%。CRC的标准治疗是手术、化疗和放疗，这些治疗可能结合使用。然而，这些治疗有许多副作用，许多患者在一系列治疗后仍然会复发。因此，为这一患者群体开发替代的有效治疗方法至关重要。尽管，目前还没有FDA批准的CRC疫苗，但已评估了多种疫苗用于治疗CRC，包括自体、DC、肽和基于病毒载体的疫苗。OncoVAX是一种自体结肠癌疫苗，与活的卡介苗（BCG）混合，用作CRC切除术后患者的辅助治疗。III期临床试验（NCT02448173）结果表明，OncoVAX对III期结肠癌患者没有显著影响，但在平均5.8年的随访期间。OncoVAX显著延长了II期结直肠癌患者的无复发期，并降低了总体复发风险和死亡风险。作为一种主动特异性免疫治疗（ASI），OncoVAX在免疫调节佐剂（BCG）的帮助下增强了患者肿瘤细胞的免疫原性，以刺激患者对自体（患者特定）肿瘤细胞的免疫反应。基于ASI的治疗程序通常假定患者肿瘤细胞上存在不同的肿瘤抗原，并且这些抗原在正常细胞中不存在或浓度较低。 最近的研究报告了一种基于腺病毒的疫苗，用于治疗结直肠癌（CRC），并在I期临床试验（NCT01972737）中取得了积极结果。研究发现，CRC抗原鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）能够在小鼠中引发针对肿瘤的抗原特异性CD8+ T细胞反应，而不是CD4+ T细胞，从而在不引起自身免疫的情况下提供抗肿瘤免疫。由人类5型腺病毒（Ad5）（作为载体）、PADRE（在大多数人类HLA分子背景下活跃的CD4+ T细胞表位）和GUCY2C组成的Ad5-GUCY2C-PADRE疫苗也经过了测试：在I/II期临床试验中，10名CRC患者接受了疫苗接种，并在6个月内进行了随访。作者发现Ad5-GUCY2C-PADRE安全地产生了针对抗原的细胞毒性CD8+细胞，但没有产生自身免疫性CD4+ T细胞，且没有严重的不良反应。 在2020年美国临床肿瘤学会（ASCO）大会上，梅奥诊所报告了一种新的治疗方法疫苗PolyPEPI1018，专门为MSS型CRC设计，可以有效延缓肿瘤进展。PolyPEPI1018是一种多肽疫苗，由六种合成肽组成。这些肽段包括来自7种保守的癌症睾丸抗原（CTAs）（TSP50、EpCAM、Survivin、CAGE1、SPAG9、MAGE-A8、FBXO39）的12个独特的免疫原性表位，这些抗原在mCRC中经常表达。这种疫苗经过优化，以诱导持久的CRC特异性T细胞反应。在OBERTO临床I/II期试验（NCT03391232）中，共有11名患者接受了PolyPEPI1018疫苗接种：3名患者进一步肿瘤进展，5名患者病情稳定，3名患者部分肿瘤缓解，2名患者的肿瘤缩小到可以接受手术的程度。值得注意的是，在手术后原发肿瘤中没有发现存活的肿瘤细胞，表明肿瘤细胞被杀死了。因此，这些初步发现表明PolyPEPI1018对MSS mCRC肿瘤具有早期临床活性，可以有效延缓肿瘤进展。因此，需要进一步研究以调查PolyPEPI1018的疗效。此外，还有多项旨在寻找正确的抗原刺激物的试验正在进行中。 3.1.4.治疗性疫苗在肝癌方面的应用 肝癌是全球最常见的癌症之一，发病率为4.7%，死亡率为8.3%。肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，通常发生在由酗酒、代谢综合征或乙型肝炎（HBV）或丙型肝炎（HCV）病毒感染引起的慢性肝病背景下。事实上，HBV和HCV感染被认为是HCC的主要风险因素。尽管HCC有各种治疗方法，包括预防性疫苗，包括HBV疫苗，已被报告可以降低HCC的发病率；尽管如此，患者总体生存率的变化仍然远未令人满意，对于更有效的治疗方法存在巨大的未满足需求。癌胚抗原糖蛋白-3（GPC3）在80%的HCC中特异性高表达，但不在正常组织中表达，因此被认为是抗原特异性免疫治疗的理想靶点。事实上，Nobuhiro等人已经发现GPC3肽可以在小鼠中诱导免疫反应，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和抗肿瘤活性，而不会引发自身免疫现象。因此，大多数基于肽的HCC疫苗主要针对GPC3抗原。 在一项II期临床病例对照研究（UMIN-CTR，UMIN000002614）中，比较了接种和未接种GPC3肽疫苗的患者的无病生存（DFS）、总生存（OS）和CTL诱导。研究证实，无论是否接种GPC3肽疫苗，80%的患者都会复发。然而，术后辅助疫苗接种可能会使1年复发率降低约15%，5年和8年生存率分别提高约10%和30%。此外，GPC3 IHC染色阳性的患者更有可能诱导CTLs，60%的患者生存超过5年。另外两种肽鸡尾酒疫苗（ONO-7268MX1 [JapicCTI-121933]和ONO-7268MX2 [JapicCTI-142477]），包含GPC3、在HCC中上调的含有WD重复的蛋白（WDRPUH）和类似内切核酸酶VIII的三个表位（NEIL3），在两项I期研究中评估了晚期HCC。除了GPC3，WDRPUH和NEIL3也被确定为HCC中的潜在免疫治疗靶点。其中，WDRPUH具有促进生长的活性，抑制WDRPUH可以延缓癌细胞的生长，而NEIL3作为一种肿瘤抗原，其编码基因在HCC中表现出高频的杂合性丧失，表明它可能是一个潜在的肿瘤抑制基因，在DNA修复中发挥作用。接种ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的HCC患者显示出良好的耐受性，并诱导了CTL反应。一些患者还表现出长期疾病控制，ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的疾病控制率分别为52.9%和35.7%，报告了9名和5名患者的病情稳定。这些结果暗示了这些疫苗在治疗HCC方面的潜在用途。 IMA970A是一种由16种新发现的在HCC患者肿瘤组织中过度表达的肿瘤相关肽（TUMAPs）组成的基于肽的HCC疫苗。IMA970A与免疫刺激剂CV8102一起给药，可以诱导平衡的Th1/Th2免疫反应。在这些TUMAPs中，有7种限制在HLA-A02上，5种限制在HLA-A24上，4种限制在HLA-II类上。处于非常早期、早期和中期HCC的患者被纳入接受单次低剂量环磷酰胺的预疫苗输注，然后是9次皮内疫苗接种。初步结果显示疫苗具有良好的安全性，但免疫原性数据尚未公布（NCT03203005）。此外，甲胎蛋白（AFP）作为HCC最广泛使用的血清标志物，可以改善预后并用于监测治疗反应；AFP衍生肽疫苗的安全性和有效性也在临床试验中得到了验证。 另一种HCC的治疗性疫苗是基于个性化肽疫苗。2017年，一项I/II期研究评估了一种新的治疗方法对晚期HCC的疗效和安全性：基于个性化肽疫苗（PPV-DC-CTL）的细胞免疫治疗与放疗相结合。结果显示疫苗耐受性良好，未引起严重副作用，研究中的9名患者病情控制良好，有效率（RR）为33%，疾病控制率（DCR）为66%。治疗效果明显优于单独报告的经导管动脉化疗栓塞（TACE）、索拉非尼和化疗。另一种个性化肽疫苗是使用仅来自恶性肿瘤细胞的非同义突变表位肽作为抗原（称为新抗原）；这些肽与MHC一起在肿瘤中表达，因此被T细胞特异性识别，引发强烈的抗肿瘤免疫反应。最近，刘团队发现个性化新抗原疫苗策略在预防HCC术后复发方面安全、可行且有效，并且通过ctDNA中的相应新抗原突变监测HCC进展也很有用；实际上，这为HCC患者的个性化医疗提供了可靠信息。在一项I期临床试验（ChiCTR1900020990）中，10名有血管侵犯的HCC患者在接受HCC诊断后2个月内进行了根治性手术切除和预防性TACE。通过肿瘤和周围组织全外显子测序鉴定非同义体细胞单核苷酸变异。对于疫苗，使用了6-20个体细胞点突变或RNA编辑新抗原长肽（27aa），并与ploy:IC佐剂混合作为抗HCC复发治疗。结果显示没有明显的治疗相关不良事件：新抗原疫苗可以有效地诱导和激活HCC患者的特异性免疫反应，并相应地延长这些患者的无复发生存期。患者的中位RFS为7.4个月，证实了个性化新抗原疫苗预防HCC患者术后复发的安全性和可行性。总之，我们讨论了几个涵盖癌症治疗肽疫苗的积极结果的例子，表明在人类中诱导CTLs是有希望的。但到目前为止，还没有观察到完全和明确的康复病例。需要进一步设计和筛选具有高免疫原性的有效的肽序列，辅以高效佐剂，或与其他免疫疗法结合，以实现更好的肿瘤消退。 3.1.5.治疗性疫苗在胃癌方面的应用 人们一直在推动研究癌症疫苗在各种肿瘤组中的作用，包括胃肠道癌症。胃癌（GC）是世界第五大癌症，2020年的发病率为5.6%，死亡率为7.7%。大多数GC患者在晚期被发现，局部晚期疾病或转移性扩散导致的不可切除病变的5年OS率仅为5%至15%。近年来，在免疫检查点抑制剂的治疗下，GC取得了巨大进展，但GC的治疗性疫苗仍处于临床阶段（表3）。因此，许多研究正在探索将免疫检查点抑制剂与化疗和其他药物或疫苗结合使用的潜力。例如，在之前的一项研究中，晚期GC患者接受了人类白细胞抗原（HLA）-A24限制性的人类血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）-1084和VEGFR2-169多肽疫苗与S-1加顺铂的组合治疗，中位生存时间达到14.2个月。另一种选择，胃泌素-17-白喉毒素免疫原（G17DT；Gastrimmune），一种抗胃泌素17免疫原，已确认可以提高针对胃泌素17的高亲和力中和抗体，可以阻断胃泌素刺激的生长并抑制胃泌素与CCK-2受体的相互作用。G17DT现在已经在许多肿瘤治疗中用于被动和主动免疫治疗，包括原发性和转移性疾病。实际上，作者证实，当与5-氟尿嘧啶加顺铂结合使用时，G17DT可以刺激体内的免疫反应，并且有免疫反应的患者生存时间更长。 如上所述，肿瘤特异性抗原是免疫治疗的潜在靶点。通过比较GC样本和正常组织之间的差异蛋白表达研究，已经鉴定出四种癌症特异性抗原——FOXM1、DEPDC1、KIF20A和URLC10；这四种抗原在肺癌、食管癌、膀胱癌和其他癌症中也上调。 血管生成是肿瘤进展的关键机制，血管内皮生长因子（VEGF）是已知最有效和特异性最强的血管生成促进因子，因此，它被用作许多疫苗的靶点。OTSGC-A24是一种针对FOXM1、DEPDC1、KIF20A、URLC10和VEGFR1的HLA-A24:02结合肽疫苗混合物。在I/Ib期临床试验（NCT01227772）中，观察到24名携带HLA-A24:02单倍型的晚期胃癌患者的显著CTL反应，患者的总生存期为5.7个月（Sundar等人，2018年）。 除了肿瘤抗原，新抗原或识别新抗原的T细胞存在于大多数癌症中，为个性化疫苗设计提供了特异性和高度免疫原性的目标。I/II期临床试验（NCT03480152）评估了一种名为mRNA-4650的mRNA疫苗，该疫苗由多达20种不同的mRNA组成，编码定义的新抗原、驱动基因的突变和HLA-I预测的表位。在转移性胃肠道癌症患者中，疫苗被证明是安全的，并诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，这些反应在疫苗接种前未被检测到。然而，尚未观察到客观的临床反应，疫苗可能只与其他免疫疗法结合使用以增强治疗效果。 最近，Ursula Wiedermann团队开发了一种治疗性B细胞表位疫苗（IMU-131/HER-Vaxx），并在Ib期临床试验（NCT02795988）中验证了其在HER2/neu过度表达的胃食管腺癌（GEA）患者中的免疫原性和有效性。IMU-131/HER-Vaxx由来自HER2/neu细胞外域的三个融合B细胞表位（P4、P6和P7）组成，与CRM197偶联，并用Montanide佐剂。针对IMU-131肽的抗体通过结合HER2受体的三个不同区域并参与二聚体环，阻止两个HER2受体的二聚体化，从而抑制细胞内信号传导。这种阻断HER2信号通路被认为比单独使用曲妥珠单抗更有效。相比之下，CRM197（CRM；交联材料），一种酶失活的非类毒素白喉毒素形式，已被成功用作各种疫苗的伴侣，可以快速激活具有异质性Th1和Th2细胞因子谱的CD4+ T细胞，用于激活B细胞和调节诱导抗体的数量。在大多数14名接种GEA患者中，检测到针对HER2的特异性抗体和T细胞反应，IMU-131显示出良好的耐受性和安全性。 3.2.治疗性疫苗在病毒性传染病方面的应用 3.2.1.治疗性疫苗在乙型肝炎病毒方面的应用 乙型肝炎病毒（HBV）属于Hepadnaviridae家族，是一种部分双链的包膜DNA病毒。如上所述，HBV感染是导致HCC的重要因素之一，但并非所有HBV感染都会发展成癌症。相反，由HBV引起的慢性乙型肝炎（CHB）对公共卫生的影响更大。尽管经过数十年的积极疫苗接种，全球有20亿人的乙型肝炎血清学特征，其中2.5亿人患有慢性乙型肝炎。目前，只有两种批准用于CHB的药物：核苷类似物和聚乙二醇干扰素（IFN），这两种药物在抑制病毒复制方面有效，但无法清除病毒基因组或从感染肝细胞的血清中清除HBV表面抗原（HBsAg）。因此，迫切需要探索新的治疗途径。目前，有2种治疗性疫苗（NASVAC和YIC）已完成III期临床试验。此外，还有3种疫苗已完成II期临床试验，其中2种（GS-4774和HB02 VAC-ADN）未达到主要终点，1种（εPA-44）达到了治疗终点并进入III期临床试验。还有3种治疗性疫苗（CVI-HBV-002、VBI-2601和HepTcell）处于II期临床试验中，许多处于I期临床试验中（表3）。 乙型肝炎病毒（HBV）衣壳主要由乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和HbxAg组成。目前，大多数HBV治疗性疫苗侧重于HBsAg和HBcAg作为主要免疫原。在一项III期临床试验中，对CHB的初治患者使用NASVAC进行治疗，NASVAC是一种包含HBsAg和HBcAg的治疗性疫苗。作者发现，在80名接受NASVAC疫苗接种的患者中，有85%的患者丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高，并清除了HBeAg。另一项III期临床试验评估了一种含铝佐剂的治疗性乙型肝炎疫苗（YIC），由抗原（HBsAg）-抗体（HBIG[乙型肝炎免疫球蛋白]）免疫复合物组成。本研究旨在通过改变患者体内HBV抗原的过程和存在来消除免疫耐受。不幸的是，疫苗的III期结果未能达到临床终点，即在患者中实现HBeAg血清转换。 一项II期试验（NCT02174276）评估了GS-4774疫苗的疗效，该疫苗由HBs、HBc和HBx融合抗原组成。结果显示，尽管GS-4774安全并对CD8+ T细胞有强烈的免疫刺激作用，但它未能降低患者体内的HBsAg水平。计划探索该药物与其他抗病毒药物联合使用的疗效。 最近的一项研究报告了HBxAg单独作为主要免疫原的潜力。HBxAg在携带HBV的小鼠中诱导了全身HBx特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，并显示出明显的HBs和HBV-DNA耗竭，保护作用至少持续30天。尽管这项研究仅处于临床前阶段，疫苗展示的HBV清除效果使其未来的发展充满希望。另一种目前有前景的疫苗是基于脂质体的纳米脂肽疫苗εPA-44（NCT00869778）。在HLA-A2阳性的进展性CHB患者中，900微克的εPA-44有限浓度导致HBeAg血清转换率显著高于安慰剂组，并具有持续的停药后效果。正在进行一项III期临床试验（ChiCTR2100043708）。 基于病毒载体或基因组的其他CHB治疗性疫苗也在进行中。一项I期临床试验（NCT02431312）评估了INO-1800（编码HBsAg和HBcAg的DNA质粒）单独或与INO-9112（编码人类白细胞介素12的DNA质粒）疫苗联合使用的安全性、耐受性和免疫原性。初步免疫学数据显示，接受INO-1800治疗的患者可以产生识别HBV核心成分的T细胞，并通过干扰素γ释放的方式从肝脏清除HBV。此外，INO-1800可以激活和扩增CD8+杀手T细胞；尽管其他临床数据尚未公布（https://clinicaltrials.gov）。 在另一项I/II期临床试验中，一种名为ANRS HB02 VAC-AND的基于DNA的疫苗，编码HBsAg，在用NAs治疗的CHB患者中诱导了持久的HBV特异性CD4+ T细胞反应，但大多数患者在停用NAs后经历了病毒学反弹。 3.2.2.人乳头瘤病毒治疗性疫苗 宫颈癌是女性中第四常见的癌症，主要由持续感染高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）引起。根据世界卫生组织的数据，2020年全球约有604,127名女性新诊断为宫颈癌，死亡341,831人。尽管有多种预防性疫苗可用，宫颈癌的发病率和死亡率仍然很高，没有批准的非手术治疗方法。因此，研究HPV治疗性疫苗是必要的。与专注于HPV L1蛋白的预防性疫苗不同，治疗性疫苗主要针对在肿瘤细胞中高度表达的HPV早期蛋白E5、E6和E7。基于E6/E7蛋白的疫苗有多种不同形式已进入临床试验（表3），数据显示具有良好的开发潜力。实际上，五种不同的DNA治疗性疫苗（GX-188E、VGX-3100、pNGVL4a-CRT/E7（解毒）、pNGVL4a-Sig/E7（解毒）/HSP70、MEDI0457）被证明耐受性良好且临床有效。其中，VGX-3100疫苗已进入III期临床试验。 VGX-3100是第一种针对与HPV相关的宫颈癌前病变的免疫疗法。它包含HPV16和18的E6和E7 DNA，并使用CELLECTRA 5PSP电穿孔技术进行肌肉注射。结果显示，VGX-3100可以引发全身免疫反应，在三剂疫苗接种者中有49.5%的组织病理学退行，HPV清除率为40.2%，高于安慰剂接种者（30.6%和15.4%）。目前正在进行一项III期试验（REVEAL），以确认VGX-3100在HPV16/18阳性高度鳞状病变（CIN2/3）女性中的疗效、安全性和耐受性。 考虑到与宫颈癌完全缓解相关的疫苗单药治疗结果有限，使用疫苗和免疫疗法药物的联合治疗可能提供更强大的免疫反应。另一种基于DNA的疫苗pgDE7h（编码与1型单纯疱疹病毒（HSV-1）糖蛋白D（gD）融合的HPV16 E7）被发现与吉西他滨（Gem）联合具有协同抗肿瘤效果，吉西他滨是一种在临床上用于多种肿瘤的核苷类似物。这种组合诱导了肿瘤特异性细胞毒性CD8+ T细胞并根除了现有肿瘤。此外，一项研究发现，pembrolizumab与GX-188E（一种设计用于表达HPV16和HPV18的E6和E7蛋白，与Flt3L的细胞外域和组织型纤溶酶原激活剂的信号序列融合的基于DNA的疫苗）联合使用为CIN3患者提供了一种新的可能方案。 蛋白基疫苗由抗原呈递细胞（APCs）处理，导致通过HLA I类和II类呈现抗原，用于产生无类型限制的CD8+和CD4+ T细胞反应。TVGV1是一种融合蛋白基疫苗，由两种抗原组成，铜绿假单胞菌外毒素和KDEL内质网保留信号，与HPV16 E7融合，并用CpG ODN或GPI-0100佐剂。这种疫苗已被证明可以诱导T细胞反应，并为HPV16转化的B6肿瘤提供强大的抑制。目前正在进行一项IIa期临床试验，针对高危HPV宫颈感染的女性（NCT02576561）。 还有几种基于多肽的疫苗使用非E6/E7蛋白作为免疫原。PDS0101是一种基于肿瘤相关抗原MUC1的非MHC限制性疫苗，该抗原在肿瘤中高度表达。这种疫苗使用R-1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（R-DOTAP）（一种激活TLR7的脂质体载体）作为佐剂。在I期剂量递增试验（NCT02065973）中，发现PDS0101安全且耐受性良好。疫苗接种以非MHC限制性方式在所有患者中解决了CIN。已启动几项将PDS0101与其他免疫调节疗法结合使用的II期试验（表3）。 3.2.3.治疗性疫苗在人类免疫缺陷病毒方面的应用 自20世纪80年代初首次临床观察到艾滋病并随后分离出病因性逆转录病毒HIV以来，尽管进行了40年的深入研究，HIV/AIDS疫情仍然是对人类构成重大全球健康威胁的疾病。实际上，截至2020年，仍有3800万人感染HIV。目前的治疗策略包括使用抗逆转录病毒疗法（ART），这已帮助将艾滋病从一种危及生命的疾病转变为一种可管理的慢性病，并显著延长了HIV感染者的预期寿命。然而，由于存在由潜伏感染细胞形成的病毒库，患者需要接受终身维持治疗。在缺乏有效的HIV-1根除策略的情况下，HIV研究工作集中在开发治疗方法上。 SARS-CoV-2大流行向世界介绍了一种有效的基于mRNA的疫苗，该疫苗封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中。ICVAX是一种基于PD1的HIV-1 DNA疫苗，编码由人类可溶性PD1结构域与两个马赛克Gag-p41抗原融合的重组抗原，可以诱导针对不同HIV-1亚型的广泛和多功能T细胞反应；这些发现突出了将基于PD1的DNA疫苗方法转化为临床使用的巨大潜力。一项II期临床试验（NCT01492985）评估了基于DNA的疫苗（GTU-MultiHIV B clade）与基于多肽的疫苗（HIV-LIPO-5）联合治疗的疗效，并发现DNA和LIPO-5疫苗的主要-增强免疫接种比单独疫苗诱导了更广泛的多功能T细胞，但在中断抗逆转录病毒治疗后未能控制病毒血症，表明将疫苗策略与其他基于免疫的干预措施结合的重要性。其他疫苗形式，如AGS-004，由成熟的自体树突状细胞和体外转录的自体HIV抗原编码RNA组成，正在IIb期临床试验中进行验证。与安慰剂组相比，AGS-004诱导了强烈和多功能的HIV特异性T细胞反应。然而，未检测到抗病毒效果。另一项研究将单核细胞衍生的树突状细胞（MD-DC）基疫苗（装载大量HIV-1热灭活自体抗原）与聚乙二醇化干扰素α-2a（IFNα-2a）结合使用，在慢性HIV-1患者中取得了次优结果。总的来说，开发针对HIV的疫苗还有很长的路要走。 3.3.治疗性疫苗在慢性病方面的应用 心血管疾病（CVD）是全球主要的慢性疾病死因，高血压、血脂异常和糖尿病是CVD的主要原因。高血压、血脂异常和糖尿病的疫苗研究已有60多年的历史。随着各种疫苗构建模型的逐步改进，目前许多治疗性疫苗正在进行临床试验，但由于治疗依从性差，还没有疫苗上市。 3.3.1.治疗性疫苗在高血压方面的应用 肾素-血管紧张素系统（RAS），包括肾素、血管紧张素I（Ang I）、血管紧张素II（Ang II）和AT1R，是高血压治疗性疫苗的主要靶点。最早的高血压疫苗针对肾素。然而，由于对肾脏的损害，它们最终被终止。随后，针对AngI的高血压疫苗的疗效，如PMD2850和PMD3117，也在许多临床试验中得到验证，但都以失败告终。Ang II是许多高血压疫苗的另一个主要靶点，如瑞士Cytos公司在2007年开发的CYT006-AngQb（由Ang II结合噬菌体Qβ（AngQb）VLP组成的疫苗）。该疫苗耐受性良好，并在所有受试者中诱导了抗Ang II抗体，半衰期约为4个月。同样基于Ang II，Koriyama等人构建了编码Ang II和HBcAg融合蛋白的Ang II DNA疫苗，可以有效降低血压至少6个月。2022年，进行了一项安慰剂对照剂量递增研究，以调查针对改良Ang II DNA疫苗（AGMG0201）的安全性、耐受性和免疫反应。结果显示AGMG0201耐受性良好，也可以诱导抗血管紧张素II抗体。 除了针对RAS的疫苗外，廖团队还开发了一种针对交感神经系统α1D-肾上腺素受体的降压疫苗（ADRQβ-004），在大鼠中显示出良好的降血压效果，并且能够有效预防高血压动物的血管结构重塑、心肌肥大和纤维化以及肾脏损伤。吴等人设计了来自人类L型钙通道（CaV 1.2）的表位CE12，并分别将其结合到Qβ VLPs和HBcAg VLPs上，以测试该表位在高血压动物中的疗效。Qβ-CE12和HBcAg-CE12-CQ10疫苗都能有效地降低高血压啮齿动物的血压，HBcAg-CE12-CQ10还改善了L-NAME诱导的肾脏损伤。戴等人开发了一种针对内皮素-1（ET-1）类型A受体（ETAR）的疫苗ETRQβ-002，并证实该疫苗可以显著减少由单羧胺（MCT）和Sugen/低氧引起的大鼠肺动脉高压；它还改善了肺动脉的任何病理重塑。总之，针对RAS的Ang II和AT1R、SNS的α1DAR肾脏和LCaCd、ETAR的疫苗构成了一系列高血压治疗性疫苗的候选物，并为高血压疫苗的联合治疗奠定了基础。 3.3.2.治疗性疫苗在糖尿病方面的应用 糖尿病（DM）是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，是全球成人中高度流行的慢性疾病。全球估计有3.82亿人患有DM，预计到2035年这一数字将接近6亿。DM可以根据疾病的发病机制分为1型和2型。1型DM是一种自身免疫性疾病，自身免疫T细胞攻击产生胰岛素的β细胞。谷氨酸脱羧酶（GAD）是1型DM自身免疫反应的主要靶点；尽管几项基于GAD的疫苗临床试验产生了矛盾的结果。令人惊讶的是，卡介苗（BCG）疫苗被用于1型DM患者。一项为期8年的随访临床试验显示，BCG疫苗提供了长期效果：它被良好地耐受，并且在DM患者中导致血糖和Treg特征基因的表观遗传变化稳定减少。2017年，李等人设计的D41-IA2(5)-P2-1疫苗被认为是1型DM的一种有希望的治疗方法。D41-IA2(5)-P2-1由DPP4的肽段、胰岛素瘤抗原-2（IA-2）的抗糖尿病B表位和来自人类热休克蛋白60（HSP60）的P277肽的Th2表位（P2：IPALDSLTPANED）组成，可以显著控制高血糖。与D41-IA2(5)-P2-1类似，由李Z等人设计的U-IA-2(5)-P2-1（UIP-1）嵌合疫苗也能在免疫后成功增加小鼠的胰岛素水平并降低血糖水平。 尽管2型DM的病理机制尚不清楚，但已知有4个靶点：脂肪组织抗原、生长抑素、依赖葡萄糖的胰岛素变性多肽（GIP）和胃饥饿素。白细胞介素-1β（IL-1β）是2型DM发病机制中的主要促炎底物，有证据表明减少IL-1β活性可能成为2型DM的新治疗策略。由全长重组IL-1β与Qβ VLPs偶联组成的疫苗hIL1bQb，在2型DM患者的临床前和临床、随机、安慰剂对照、双盲研究中进行了测试。结果显示，针对IL-1β的Hil1bQb疫苗安全且耐受性良好，在这些患者中，接种6剂900微克剂量后可检测到中和IL-1β特异性抗体反应。目前，DM的发病机制和葡萄糖代谢的关键靶点仍然不清楚。在糖尿病疫苗领域的进一步探索预计将提供新的解决方案。 3.3.3.治疗性疫苗在血脂异常方面的应用 血脂异常是CVD的关键风险因素，通常以高低密度脂蛋白（LDL）胆固醇、低高密度脂蛋白（HDL）胆固醇或高甘油三酯血症为特征。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶9型（PCSK9）通过受体内化和随后的溶酶体降解调节LDL受体表达，是已知的抗高脂血症药物或疫苗靶点。迄今为止，抑制PCSK9最先进的方法是单克隆抗体（mAbs），如众所周知的alirocumab和evolocumab，它们于2015年获得FDA批准，并为PCSK9疫苗的开发提供了坚实的临床证据。AT04A和AT06A是两种AFFITOPE肽疫苗候选物，通过诱导PCSK9特异性抗体治疗高胆固醇血症。I期临床试验（NCT02508896）的结果显示，AT04A和AT06都是安全和免疫原性的，但只有AT04A表现出显著的LDLc降低活性。还有其他针对PCSK9的疫苗；例如，基于Qβ VLP的疫苗PCSK9Qβ-003。这种疫苗可以显著降低Balb/c小鼠和LDLR+/−小鼠的总胆固醇和PCSK9表达，并上调肝脏LDLR、SREBP-2、肝细胞核因子-1α（HNF-1α）和HMG CoA还原酶水平。此外，由PCSK-9短肽与KLH融合组成的疫苗在男性载脂蛋白E（ApoE）缺乏小鼠中引起了针对PCSK9的显著长期抗体反应。一个免疫原性肽段，称为免疫原性融合PCSK9-破伤风（IFPT），使用DSPE-PEG-马来酰亚胺脂质（L-IFPT）结合到纳米脂质体表面，并吸附到Alhydrogel上（L-IFPTA+）；这种疫苗候选物在高胆固醇血症小鼠中诱导了针对PCSK9肽段的高IgG抗体反应，并降低了高达58.5%的血浆浓度。 最近，血管生成素样蛋白（ANGPTL）3作为降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和甘油三酯（TG）水平的新靶点受到了关注。针对ANGPTL3的抗体、反义寡核苷酸和小干扰RNA作为靶向ANGPTL3抑制剂已经开发出来，并正在进行临床试验（NCT03409744、NCT03452228、NCT03747224）。Fukami等人设计了3种针对ANGPTL3的表位肽基疫苗（E1-E3），其中E3（32EPKSRFAMLD41）肽段没有引起细胞毒性，并显著降低了ob/ob小鼠循环中的甘油三酯、LDL-C和小而密的LDL-C（sd-LDL-C）水平；它还减少了肥胖引起的脂肪肝病。除了PCSK9和ANGPTL3的靶点外，还需要研究其他与胆固醇和甘油三酯代谢相关的靶点疫苗，如ApoB-100，以加速推广有效抑制血脂异常的疫苗。 4.结论和未来展望 疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病的负担方面发挥着重要作用。在过去20年中，可以有效预防的疾病类型持续增加到40多种。实际上，HPV疫苗对相关恶性肿瘤的预防效果的出现以及前列腺癌治疗性疫苗的推出，标志着疫苗的效用从传统的预防进一步扩展到治疗。然而，许多重大传染病的病原体因素和潜在干预措施仍然不明确，特别是那些由复杂病原体感染（如艾滋病和结核病）和以肿瘤和代谢性疾病为代表的慢性疾病引起的疾病。这些疾病的疫苗开发是世界级的。对于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2等突发重大传染病，弱免疫反应或意外的免疫反应（如抗体介导的感染增强、ADE）是创新疫苗研究中难以解决的问题。 因此，新一代更有效疫苗的开发需要在以下四个方向上做出努力。 (i) 佐剂：与佐剂相关的有几个重要因素需要考虑。需要控制和改进佐剂的物理化学性质，优化生产流程，并深入研究分析佐剂的作用机制，以充分了解它们对免疫系统的影响。我们还需要继续探索佐剂和肿瘤抗原的最佳组合，以增强疫苗的免疫原性，并致力于设计针对不同病原体的亚单位抗原、蛋白质或肽的新复杂佐剂；这将得到化学和新材料合成技术的帮助，以增强抗原向免疫细胞的靶向传递（下一点），并克服肿瘤免疫抑制微环境对抗原呈递的抑制。这也可能有助于激活肿瘤特异性T细胞在免疫耗竭和衰老状态下，并促进记忆T细胞的形成。 (ii) 传递系统：药物/疫苗传递系统的最终目标是将货物传递到目标部位，并具有预定的释放动力学和作用持续时间。没有单一的工具适合所有形式的治疗，不同的疫苗形式各有优势和劣势，需要优化以实现传递和治疗。实际上，需要了解人与人之间、人与动物之间在药物吸收、分布、代谢和消除方面的差异，并探索不同疫苗抗原或药物与传递系统的最佳组合。COVID-19大流行提醒我们，未来是不确定的，我们需要不断发展新的传递系统，以适应多样化和精确疫苗发展的趋势。还应注意传递系统的效率和靶向性，更多关注传递系统本身的安全性和临床转化可行性。 (iii) 新抗原的发现和筛选：结合临床和实验室研究成果，全面运用和评估多组学数据和其他自动化高通量功能筛选工具，积极发展新的理论和技术，用于各个领域独特或通用疫苗靶点的筛选和发现。此外，通过下一代测序和生物信息技术，需要设计更有效的预测算法，提高发现有效的肿瘤抗原作为疫苗靶点的几率。 (iv) 联合治疗：由于肿瘤的异质性和复杂的免疫抑制微环境，单一免疫治疗往往无法提供良好的结果，通常导致低反应率或继发性耐药。因此，免疫治疗通常倾向于与不同的治疗方法联合使用。免疫疗法，如免疫检查点抑制剂（ICI）和过继细胞疗法（ACT），已经彻底改变了癌症治疗，特别是对于转移性癌症。实际上，这已经通过在设计肿瘤疫苗时结合多个肿瘤靶点，以及在补充使用免疫疗法来多样化肿瘤治疗中看到。的确，发挥这些优势并避免弱点可以显著改善癌症患者的治疗。 疫苗在历史上已经证明可以提供健康和福祉，新技术为应对传统方法失败的挑战提供了新的可能性。然而，关于新技术的安全性的数据有限，需要考虑疫苗生产和转化的可行性，以及人类免疫反应的复杂性。新技术和策略将有助于解决现在或未来人类面临的复杂或严重疾病，这些知识对于设计有效的疫苗将非常重要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:复制缺陷型病毒载体疫苗相较于传统亚单位疫苗具有多个优势，包括强大的抗体反应、对消除病原体感染细胞至关重要的细胞反应，以及在无需佐剂的情况下诱导高度免疫原性和持久的免疫反应。人乳头瘤病毒（HPV）是一种拥有超过200种基因型的微生物，在诱导人类肿瘤方面发挥着关键作用，大多数与HPV相关的恶性肿瘤都表达HPV蛋白。与HPV感染相关的肿瘤，主要是由HPV16感染引起的，包括影响宫颈、肛门、阴道、阴茎、外阴和口咽部的肿瘤。近年来，利用病毒载体开发治疗性HPV疫苗以治疗由HPV感染引起的癌前病变或肿瘤的研究迅速增长，目前有许多研究管线正在进行中。同时，筛选最佳抗原需要更多的基础研究和更优化的方法。在临床前研究方面，我们介绍了用于评估疫苗效果的各种模型，强调了它们各自的优缺点。此外，我们介绍了使用HPV病毒载体的治疗性疫苗的最新研究进展，特别是适应症、初步效果、联合用药等。总的来说，本文总结了当前病毒载体治疗性HPV疫苗在HPV感染、抗原选择、载体、效果评估和临床试验进展方面的研究情况。 介绍 已经检测到数百种人类乳头瘤病毒（HPV），它是一种常见的性传播病毒，感染男性和女性的生殖器区域，包括阴茎、外阴（阴道外区域）、肛门的皮肤，以及阴道、宫颈和直肠的内衬。大多数HPV感染是无症状的，某些高风险HPV类型可导致癌症。在全球范围内，HPV是最突出的致癌传染病之一，与多种恶性肿瘤相关，最常见的是宫颈癌。几乎所有宫颈癌病例都与HPV感染有关，特别是高危HPV类型，尤其是HPV16。HPV还与阴道、阴茎、肛门和口咽癌有关。根据最近的研究，超过五分之一的15岁以上男性感染了一种或多种高危HPV基因型。HPV预防性疫苗显示出卓越的免疫原性，可预防HPV相关癌前病变和肿瘤的发展。全球HPV疫苗接种覆盖率存在显著的区域差异。澳大利亚的HPV疫苗覆盖率在世界上是最高的，而许多中低收入国家覆盖率相对较低。尽管已有96个国家将HPV疫苗纳入国家免疫计划，但由于疫苗推广缓慢、筛查和早期诊断率低以及治疗资源有限，中低收入国家的HPV相关肿瘤负担仍然沉重。2024年5月，世界卫生组织（WHO）发布文件明确指出，HPV治疗性疫苗是消除与HPV感染相关的肿瘤的重要手段。Partha Basu等人对2022年1月31日之前的12项HPV治疗性疫苗的II/III期临床试验进行了荟萃分析，共有734名女性接受了用于CIN2/3的HPV治疗性疫苗。414名患者恢复正常或CIN1，疫苗组的总回归比为0.54（95%置信区间0.39至0.69）；而在五项随机对照试验中，接受安慰剂的166名女性的总回归比为0.27（95%置信区间0.20至0.34）。此外，Aida Petca等人分析了2018年1月至2024年1月的临床试验，发现HPV疫苗在皮肤癌和疣中也有一定的治疗效果。当然，免疫原性和效果存在差异，尽管有希望，但仍有提高效果的空间。 重组病毒载体已被用于传递特定病原体的抗原超过40年，包括腺病毒（ADV）、痘病毒、单纯疱疹病毒（HSV）、水泡性口炎病毒（VSV）、慢病毒载体（LV）、巨细胞病毒（CMV）、麻疹病毒（MV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）。病毒载体被设计为将抗原传递到特定的细胞和组织。病毒载体疫苗可以进一步优化，以增强在抗原传递过程中目标细胞中转基因的表达。病毒载体已在临床前和临床试验中作为针对各种传染病的疫苗，如HIV、疟疾、埃博拉病毒和Covid-19。随着Covid-19在全球的传播，包括病毒载体疫苗在内的多种疫苗平台已经蓬勃发展。基于病毒载体的治疗性HPV疫苗也已开发并进入临床试验阶段，一些产品最近宣布了最新的临床结果。本文提供了对HPV疫苗技术发展态势的深入理解，突出了所使用的载体、它们旨在针对的疾病、为最佳免疫反应选择的抗原、用于评估其效果的指标以及在临床评估中取得的显著进展。 HPV感染及其与各种癌症类型的关联 HPV感染已被确定为大多数宫颈癌病例的主要原因。此外，不同解剖部位的癌症也与HPV有关，尽管程度不同。根据2012年全球癌症数据库和五大洲癌症发病率（CI5-X）数据库，88%的肛门癌、78%的阴道癌、50%的阴茎癌、24.9%的外阴癌和30.8%的口咽癌归因于HPV。到目前为止，共有14种HPV基因型被严格归类为"高风险"，主要是因为它们诱导癌变的潜力显著增加。其中，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59被国际癌症研究机构（IARC）特别指定为1组致癌物，这突出了它们的异常威胁。此外，HPV66和HPV68也属于这一高风险类别，进一步扩大了对这些潜在危险基因型的担忧。在中国2023年进行的一项研究中，发现HPV16、58、52、33和31/18是CIN 2和CIN3队列中流行的主要高风险人类乳头瘤病毒（hrHPV）。同时，研究强调了与单纯HPV16感染相关的CIN1、CIN2和CIN3病例的细分，分别为22.06%和46.24%的CIN1和CIN2，以及显著的55.21%的CIN3。这突出了HPV16的致癌性，使其成为宫颈癌前病变和恶性肿瘤发展中最强大的hrHPV类型。HPV 16还负责大约50-80%的生殖道肛门癌，包括阴道、外阴、阴茎和肛门癌。其他导致这些癌症的常见HPV类型包括HPV 33、31、18等。此外，在口咽癌领域，HPV 16在全球范围内是被识别最多的类型，HPV 33、18、31和35紧随其后。值得一提的是，在全球范围内，HPV-16也是男性中最常见的HR-HPV类型，占5%，其次是HPV 51（3%）、HPV 52（3%）、HPV 59（2%）和HPV 18（2%）。因此，HPV 16仍然是对人类健康威胁最大的类型，当前的HPV治疗性疫苗主要针对HPV16。然而，VGX3100的临床试验，这是一种针对HPV16和HPV18的治疗性疫苗，发现持续性病变可能与其他HPV感染有关，这表明患者在治疗前可能已有混合感染。因此，未来的HPV治疗性疫苗应该旨在覆盖更广泛的HPV类型，不仅仅是HPV16。 HPV结构特征和治疗性HPV疫苗的抗原选择 HPV还会导致生殖道疣和复发性呼吸道乳头状瘤病。HPV具有大约8kb大小的环状双链DNA基因组，早期和晚期区域分别编码早期（E1、E2、E4、E5、E6和E7）和晚期（L1和L2）蛋白。晚期蛋白指的是L1（55 kDa）和L2（64-78 kDa）蛋白。每个病毒衣壳由72个L1五聚体和少量L2蛋白组成。L1是一种分子量约为55 kDa的蛋白，是病毒粒子的主要结构成分，位于衣壳的外层，L1 ORF是HPV最保守的区域。因此，L1的ORF相似度<60%被认为是传统HPV分型的依据。L2位于衣壳的内层，在病毒感染中发挥多种重要作用。L2与L1相互作用，促进衣壳组装和稳定性。此外，L2蛋白参与病毒进入宿主细胞，通过与宿主细胞膜融合相关的机制引入病毒基因组。此外，L1和L2都是预防性HPV疫苗的抗原选择。 早期HPV蛋白包括七种蛋白，E1-E7。E1是HPV基因组中最大且最保守的ORF，编码600-650个氨基酸，并参与病毒复制和转录的调控。E2蛋白增强病毒转录和稳定复制；然而，E2可以强烈抑制E6和E7蛋白的表达，并诱导HPV阳性细胞生长停滞和衰老。然而，研究已证实E2单独可以在没有HPV基因组的情况下诱导细胞p53依赖性凋亡。携带牛乳头瘤病毒E2基因的MVA载体被用于治疗。E4在HPV类型间差异很大，以类似配体的方式发挥作用。研究表明HPV E4有助于E6/E7病毒扩增。E5是一种小的、疏水性的跨膜蛋白，是一种致癌基因。E6和E7是最常用于治疗性疫苗的抗原。E6（150个氨基酸）可以降解p53以促进细胞增殖，调节TOLL样受体-9的表达。E6抑制RIG-I介导的IFN-β、趋化因子和IFN刺激基因的诱导，并介导HPV感染细胞的免疫逃逸。E7（100个氨基酸）可以降解Rb并导致肿瘤细胞增殖。 与其他肿瘤疫苗的要求一致，HPV相关肿瘤疫苗的要求是1.肿瘤细胞高表达或特异性表达抗原蛋白。2.蛋白质可以被自然加工成合适的肽以呈现。3.肽与MHC分子有高亲和力4.肽/MHC复合物与相应的T细胞TCR有亲和力。值得注意的是，人群中HLA（编码MHC蛋白）的多样性影响免疫反应的产生。研究最多的蛋白是E6和E7，已确认它们具有高细胞免疫原性，目前是HPV相关肿瘤疫苗的首选。由于E6和E7可以分别降解p53和Rb，导致肿瘤发生，E6和E7作为抗原通常被突变以消除它们的肿瘤形成能力。此外，E2和E5也被发现在肿瘤中表达并表现出良好的免疫原性，有成为疫苗的潜力。 病毒载体平台的优势 使用病毒载体作为疫苗平台可以在不需要佐剂的情况下诱导先天免疫反应。此外，类似于自然感染过程，目标细胞中的病毒载体（没有任何外部佐剂）能够激发强大的体液和细胞免疫反应。病毒感染后，目标细胞激活与抗病毒途径相关的途径，如cGAS-STING途径、IFN信号通道、TNF信号途径等。所有这些都具有协同抗肿瘤效果。同时，病毒感染可以增强巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，并诱导和训练巨噬细胞记忆细胞以加强肿瘤细胞监视。病毒载体激活的自然杀伤（NK）细胞也是主要的抗肿瘤细胞。此外，病毒载体携带特定抗原，可以促进人体中抗原的有效表达，促进宿主细胞的抗原呈递，激活树突状细胞（cDCs），产生强烈、持久的细胞免疫以持续清除目标细胞，从而成为治疗性疫苗的主要机制。记忆CD8+T细胞使身体能够长时间预防疾病。尽管治疗性疫苗涉及的体液免疫不是效果评估的主要部分，但越来越多的研究发现B细胞和浆细胞分泌的抗体在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，包括可以激活经典补体途径（补体依赖性细胞毒性，CDC）、杀死目标细胞并激活参与Fc受体抗体依赖性细胞毒性效应（ADCCs）的抗体。 复制缺陷型病毒载体，包括5型腺病毒、26型腺病毒、ChAdOx1、弹状病毒（VSV）、黄病毒（YF117D）、沙粒病毒和改良牛痘病毒安卡拉株（MVA）已被用作治疗HPV相关肿瘤的治疗性疫苗。由于它们的复制缺陷，病毒载体拥有广泛的临床流行病学和临床试验数据，显示出良好的安全性概况。腺病毒（Ads）是一种常用的疫苗载体，由于能够感染非分裂和分裂细胞，对不同细胞具有广泛的嗜性，由于作为附加体存在，插入致癌的低风险。然而，人群中常见的Ad5中和抗体可能会降低这类疫苗的有效性。因此，开发了罕见的血清型，如Ad26，以及非人腺病毒，如ChAdOx1。它们在人群中的血清阳性率低或没有，但与非常罕见的凝血障碍、血栓形成和血小板减少综合症（TTS）相关。MVA源自牛痘病毒，具有高容量的转基因插入能力和对哺乳动物细胞的广泛嗜性，因为感染是通过被动膜融合发生的。VSV基因组简单，可以诱导粘膜免疫；然而，它具有神经毒力的潜力。黄病毒和沙粒病毒是新兴的疫苗载体，已被用作拉沙热和埃博拉病毒疫苗。 HPV治疗性疫苗的临床前评估 与其他主动免疫治疗产品类似，在临床前阶段，治疗性HPV疫苗需要使用适当的模型进行验证，包括诱导适当的免疫反应、细胞和体液免疫以及杀死肿瘤细胞。通常在健康动物中检测免疫反应，C57BL/6和非人灵长类动物（猕猴和恒河猴）是最常用的动物种类（表1）。为了评估疫苗的肿瘤抑制效果，TC-1细胞表达HPV16-E6和-E7以及激活的Ras致癌基因，用于C57BL-6小鼠分析含HPV16 E6/E7抗原的治疗性疫苗对肿瘤微环境（TME）中免疫细胞类型的抗肿瘤效果和变化。此外，设计表达HPV6-E6的MOC1细胞用于评估PRGN-2012在C57BL/6小鼠中的抗肿瘤效果。还有其他源自C57BL/6小鼠的癌细胞系：C3细胞，通过使小鼠胚胎细胞永生化和转染产生，表达完整的HPV16基因组，以及来自小鼠扁桃体上皮的mEER细胞，在更好地转化至头颈鳞状细胞癌（HNSCC）方面具有优势。然而，C57BL/6小鼠只表达H-2 Kb和H-2 Db MHC类I分子，限制了它们的类I表位库。因此，提出了开发更适用的动物模型以验证疫苗效果的建议。通过肌内（IM）注射慢病毒颗粒表达E7/HPV16转基因的比格犬已被验证为持久感染的潜在模型。与HPV16在系统发育和表型上相似的猕猴乳头瘤病毒3型（MfPV3）也适合猕猴持续生殖器感染。然而，比格犬和猕猴难以携带肿瘤，因此难以评估疫苗的抗肿瘤效果。值得注意的是，SfPV1/兔乳头瘤病毒模型，它诱导长期持续性感染和病变的恶性进展，适合于肿瘤抑制和持续性感染模型。 尽管如此，在评估肿瘤疫苗的效果时，利用动物模型不能忽视物种特异性差异。因此，迫切需要建立更好的替代评估系统，以更好地模拟人类反应。疫苗的免疫原性和肿瘤抑制效果可以在人源化小鼠中展示。然而，肿瘤细胞需要相应的HLA分子转导和抗原表达才能有效治疗。体外诱导的人外周血单个核细胞（PBMC）检测可以检测疫苗反应，样本量大，并进行体外杀伤测试；然而，这不能模拟具有复杂肿瘤细胞组成的疫苗效果测试。类器官可以更好地模拟肿瘤细胞组成和免疫抑制微环境，可以用作肿瘤疫苗抑制的补充。然而，体外测试不能有效评估疫苗剂量和程序。总体而言，建议采用多种并行评估策略进行HPV治疗性疫苗的临床前评估，基于每种评估系统的各自缺陷。 当前使用HPV病毒载体的治疗性疫苗的研究现状 随着肿瘤免疫疗法的出现，如PD-1/PD-L1抑制剂、嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）疗法、T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）疗法等产品，体内特异性肿瘤T细胞的杀伤能力得到了进一步证实。肿瘤疫苗作为有效激活全身肿瘤反应性T细胞的治疗方式，也成为了许多研究者关注的焦点。针对HPV相关肿瘤的治疗性疫苗的开发已经进入了一个新阶段。本文总结了现有的HPV治疗性疫苗（表2）。根据最近的报告，截至2024年3月20日，只有TA-HPV（表达改良HPV-16和-18 E6和E7基因的重组牛痘病毒）和VTP-200（由ChAdOx1-HPV和MVA-HPV组成的初免-加强疫苗）已完成II期临床试验。此外，PRGN-2009处于临床II期，而Vvax-001已进入临床II期。然而，Ad-E6E7和Ad26.HPV18的I期由于抗病毒效力低和入组率低而终止。其他临床试验均未进入II期。 在I期中，TA-HPV在29名Ib期或IIa期宫颈癌患者中显示出免疫原性；8名患者产生了HPV特异性血清学反应，4名患者在单次接种后产生了HPV特异性CTLs。TA-HPV结合TA-CIN（由HPV16-E6/E7/L2组成的重组融合蛋白）显示出显著效果，10名HPV 16阳性的高级别VIN女性中有9名展示了HPV 16特异性增殖性T细胞和/或血清学反应，3名患者除此之外还展示了病变缩小或症状缓解。在27名患有3级阴道内上皮瘤变的患者和2名患有3级阴道内上皮瘤变的患者中，观察到6名患者（17%）的病变大小减少，15名（62%）的症状得到了改善。 HPV病毒载体治疗性疫苗的抗原主要是E6和E7蛋白，无论是单独的还是融合蛋白的形式。某些疫苗结合了HPV18的E6和E7蛋白，以扩大疫苗的潜在受益人群。值得一提的是，研究人员已逐渐开始应用生物信息学方法设计和构建目标蛋白，以实现对更多HPV类型的免疫覆盖：研究人员通过选择六个早期蛋白的保守区域并生成共识序列来代表五种hrHPV基因型，设计了合成基因‘5GHPV3’，并将‘5GHPV3’分别插入ChAdOx1和改良牛痘MVA载体中进行ChAdOx1-HPV和MVA-HPV[89]；PRGN-2012是建立在黑猩猩腺病毒载体平台上的，融合了通过生物信息学方法和蛋白工程选择的HPV蛋白区域，以引发针对HPV感染细胞的免疫反应。 在女性中进行了一项严格的临床试验，评估Ad26和MVA载体疫苗成分的安全性和免疫原性，这些女性患有由HPV16或HPV18引起的宫颈感染（NCT03610581）。值得一提的是，PRGN-2012适用于治疗复发性呼吸道乳头状瘤病、乳头瘤病毒感染和刺激对低风险HPV6/11类型的免疫反应的Papillomaviridae。HPV治疗性疫苗普遍用于治疗癌症和癌前病变。在肿瘤形成过程中，形成了一个免疫抑制微环境，MHC分子的下调、Treg细胞的浸润和免疫检查点蛋白如PD-L1的过度表达。治疗性疫苗能够提高系统性细胞毒性CD8+T细胞的水平，并促进肿瘤组织内CD8+细胞计数的增加。在此基础上，研究已证实，肿瘤疫苗与免疫检查点阻断（ICB）的结合可以大大提高肿瘤反应率并增强抗肿瘤免疫反应。从病毒载体HPV治疗疫苗的临床试验来看，如果选择HPV相关肿瘤作为适应症，研究人员会选择PD1/PD-L1抑制剂作为联合用药，如Atezolizumab、Pembrolizumab和Avelumab。如2020年欧洲医学肿瘤学会（ESMO）会议上所报告，在34名患有各种复发/转移性HPV阳性癌症的患者中，使用TG4001联合Avelumab进行治疗性疫苗接种后，1名患者显示出完全反应（CR），7名患者根据RECIST 1.1标准实现了部分反应。因此，肿瘤治疗性疫苗和免疫检查点抑制剂的结合代表了未来治疗的一个重要方向。 病毒载体也可以产生强大的免疫反应，包括抗肿瘤细胞免疫和中和抗体。因此，一些研究人员选择异源载体加强疫苗接种，以刺激更强的抗HPV免疫反应，类似于初免-加强疫苗ChAdOx1-HPV和MVA-HPV，以及初免-加强疫苗Ad26.HPV16和MVA.HPV16/18。 结论 本文总结了使用重组病毒载体开发治疗性HPV疫苗的进展，包括病毒载体、抗原选择、效果评估和临床试验。目前，HPV相关肿瘤疫苗主要通过诱导免疫反应和抑制肿瘤生长来实现其效果。几种基于病毒载体的治疗性HPV疫苗已进入临床试验，显示出令人满意的安全性和耐受性。此外，它们在治疗效力方面也显示出鼓舞人心的免疫原性和肿瘤抑制效果。基于病毒载体的HPV疫苗在未来的发展中具有光明的前景。 在未来的研究中，治疗性病毒载体HPV疫苗将朝以下方向发展：1. 研究更安全、更有效的病毒载体，这些载体在人群中表现出降低的毒力，同时保持感染更多APC细胞的能力，从而引发更强大的细胞免疫反应。2. 不限于E6或E7的抗原。利用生物信息学，我们旨在设计一种增强型“超级抗原”，它能够扩大对多种HPV类型的覆盖，并与更广泛的HLA分型个体兼容。在开发过程中，必须注意某些事项：1. 选择合适的平台用于体外临床前评估疫苗效力至关重要。2. 随着更多临床试验数据的可用性，HPV疫苗的治疗策略将逐渐完善。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：溶瘤病毒（OVs）正成为癌症治疗的潜在选择。自然和基因工程病毒表现出多种抗肿瘤机制。OVs通过直接细胞溶解、通过抗原释放增强免疫系统以及激活炎症反应来发挥作用，或者间接通过干扰肿瘤微环境中的不同类型元素、改变肿瘤细胞的能量代谢和抗血管生成作用。OVs的作用是多方面的，它们与宿主和肿瘤细胞有多种相互作用。在溶瘤病毒治疗中的一个重要障碍是病毒进入肿瘤细胞的途径以及它可能与不同的生物和非生物载体结合的可能性。在许多临床试验中，OVs已被证明能够消除对标准治疗有抵抗力的癌细胞（黑色素瘤、肺癌和肝癌）；然而，病毒本身的作用存在几种抗性元素。因此，有必要评估OVs与其他标准治疗方式（如化疗、免疫治疗、靶向治疗和细胞治疗）的结合，以提高反应率。本综述提供了OVs、它们在溶瘤病毒治疗中的使用以及这种疗法与目前用于癌症治疗的标准疗法的未来前景的全面更新。 1.引言 病毒通常被认为是导致人体致命感染的恶魔，但近几十年来，人们开始意识到可以将它们转变为保护天使，用作对抗恶性细胞的武器。使用病毒治疗癌症的想法源于一些病例报告中记录的肿瘤消退与病毒感染之间的关联。 近年来，溶瘤病毒（OVs）因其能够选择性地攻击和破坏肿瘤细胞，并可能刺激抗肿瘤免疫而受到特别关注。工程化肿瘤选择性靶向OVs具有可控的安全概况和对不同癌症的有效性，具有许多优势。被选为破坏肿瘤细胞的候选病毒必须具备某些特征：它必须是促炎性的，不应引起慢性传染病，对各种人群安全，应在肿瘤细胞中发挥溶解活性，并应具有整合到宿主基因组中的能力。促炎性的溶瘤病毒具有以下特征：存在可被免疫系统识别的抗原性，感染性，复制以触发强烈的免疫反应，以及有助于免疫识别和炎症反应的基因变异。 基因工程在开发具有可控安全概况和对广泛癌症高效性的OVs中发挥着重要作用。在这方面，OVs必须通过修改非编码突变并添加或删除某些功能、基因和非编码元素，专门为相应的肿瘤类型和肿瘤突变量身定制，以赋予它们额外的有益特性。癌症治疗使用OVs的三个研究方向是：病毒复制、肿瘤生长和免疫激活。因此，OVs的主要靶标是肿瘤细胞、宿主免疫和肿瘤微环境。大多数病毒载体通过释放肿瘤相关抗原引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后引发抗肿瘤免疫反应。通过激活抗肿瘤免疫，OVs超越了ICIs和其他精确靶向药物的表现。OVs表现出广泛的抗肿瘤免疫增强特性。必须识别具有适当分子特征的患者，以从OV治疗中受益。因此，发现OV治疗的预测性生物标志物很重要。 2.溶瘤病毒治疗的有吸引力的病毒  病毒治疗是一种基于将OV感染的细胞引入被诊断出恶性肿瘤的宿主的治疗方法，可能是一种创新的未来癌症治疗方法。最近的研究揭示了使用OVs通过诱导系统性抗肿瘤免疫来特异性破坏肿瘤细胞。然而，这个过程并不像看起来那么简单，因为并非所有细胞类型和病毒都可用作此目的。了解不同类型病毒对选定肿瘤的肿瘤趋向性，以及它们可以包含的联合疗法，决定了选择适当和准确的病毒肿瘤治疗选项，以增加治疗的整体有效性。OVs可以是单链或双链RNA或DNA病毒，分为自然病毒株和基因修饰病毒。下面描述了合格的病毒肿瘤治疗候选病毒的主要类型，主要特征（表1）以及益处和问题（表2）： 单纯疱疹病毒（HSV），包括两个血清型（HSV-1和HSV-2），是一种带有核衣壳的包膜病毒，保护着双链DNA。HSV作为溶瘤病毒的优势如下：（i）大基因组和复杂结构，使得插入大片段和多个转基因成为可能，而不影响病毒效率；（ii）能够感染大多数类型的恶性细胞；（iii）插入多个转基因的灵活性；（iv）尽管在大部分人群中存在高频率的抗病毒抗体，但它们并不阻止病毒复制。HSV通过四种病毒糖蛋白，即gB、gD、gH和gL，与各种细胞受体结合。基于基因修饰HSV的Talimogene laherparepvec（T-VEC），编码人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），是唯一获得FDA和EMA批准用于治疗IIIB/C–IVM1a黑色素瘤的七个溶瘤HSV之一。T-VEC刺激局部和系统性抗肿瘤免疫反应。T-VEC已在两项II期临床研究中进行了评估——一项是与放射疗法联合治疗局部晚期皮肤血管肉瘤（NCT02923778），另一项是软组织肉瘤。OH2是另一种基因工程2型溶瘤HSV，表达GM-CSF以促进抗肿瘤免疫反应。G207是一种基因工程单纯疱疹病毒，缺失ICP 34.5和ICP 6区域的基因，具有直接溶瘤效应，也可以刺激系统性抗肿瘤免疫反应。G207衍生的三种基因组修饰的工程病毒是G47∆，在肿瘤中高度复制，并具有更多的细胞病理效应。 腺病毒（Ad），具有双链DNA基因组和二十面体衣壳，其C末端负责识别细胞受体。腺病毒溶瘤疗法的优势如下：病毒还破坏了癌症干细胞，触发了各种细胞死亡信号，并释放了许多损伤相关分子模式分子（DAMPs），如高迁移率盒1（HMGB1）、热休克蛋白（HSPs）和核酸。腺病毒诱导局部炎症反应，产生大量病毒颗粒，并释放肿瘤抗原，具有直接和间接溶瘤效应。 大多数溶瘤腺病毒（oAds）与柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）结合感染细胞。Ad是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒，并且由于其高遗传稳定性和可用性，是该领域研究最多的病毒之一。遗传稳定性指的是病毒保持其遗传物质，特别是治疗或所需基因，而不会随着时间的推移发生显著突变或改变的能力。2005年，中国FDA批准了第一种oAd Oncorine与化疗联合用于治疗鼻咽癌。截至2021年，人类腺病毒工作组已识别出104种注册的腺病毒基因型，其中18种目前正在进行病毒肿瘤治疗测试，自2005年至2021年共进行了59项试验。为了使溶瘤治疗有效，病毒需要基因工程改造，非必需基因必须被其他增强治疗效果的基因所取代。 正在研究的三种基因工程腺病毒，也称为条件复制腺病毒（CRAd），如下所示。第一代CRAd由Onyx-015代表，它结合并灭活p53和Ixovex-1，阻止肿瘤生长，并参与不同的临床试验。第二代CRAd包含一个工程化腺病毒Delta-24-RGD（DNX-2401），针对视网膜母细胞瘤（Rb）的肿瘤抑制途径。第三代CRAd由一种与DNX-2401相似的病毒代表，E1A启动子发生变化，以提高肿瘤抑制性能。 Maraba，一种弹状病毒，最近被认为是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒。使用这种病毒的想法源于在溶瘤病毒治疗试验中使用类似病毒——水泡性口炎病毒，这种病毒具有更强的溶瘤活性。体外实验中，Maraba病毒对正常细胞表现出非常广泛的肿瘤趋向性，良好的肿瘤选择性和低毒性。此外，在异种移植模型中进行的体内研究显示了强大的抗肿瘤活性和优越的治疗效力。 麻疹病毒（MeV）是一种RNA副黏液病毒，对包括卵巢癌和乳腺癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤和胶质母细胞瘤在内的广泛癌症类型具有趋向性。MeV溶瘤治疗正在与其他疗法（如化疗）联合测试，用于腹膜或卵巢癌的治疗。MeV与宿主细胞的相互作用是通过三种受体介导的，即Nectin-4、CD46和SLAM/CD150。由于存在预先存在的抗麻疹抗体，系统性给药MeV可能很困难，因此开发了几种策略，如使用细胞载体运输病毒，编码抑制免疫系统的基因，用非反应性糖蛋白替换某些糖蛋白，或与免疫抑制药物联合给药。MeV具有有利的安全性概况和有限的毒性，MeV特异性T细胞反应可能增加溶瘤病毒治疗的有效性。 新城堡病病毒（NDV）是一种在鸟类中自然发现的1型禽类副黏液病毒。它已经被用于溶瘤治疗研究五十年了；因为它不通过重组进行基因交换的过程，所以它是高度安全的。 这一点从人类是非许可宿主这一事实上可以看出。NDV通过其RIG-I受体，可以减缓肿瘤活性，并且具有非常广泛的肿瘤趋向性，包括对乳腺癌、结直肠癌和头颈部癌的趋向性。 呼肠孤病毒在环境中很常见，通过根除病毒感染的肿瘤细胞，其抗癌活性可以得到增强。尽管呼肠孤病毒已被作为治疗黑色素瘤、骨髓瘤和胶质瘤的治疗选择进行研究，但也在进行其他恶性肿瘤的试验（表3），如胰腺癌、肺癌和结直肠癌（与pelareorep和atezolizumab联合进行的GOBLET研究）。 柯萨奇病毒对膀胱癌有肿瘤趋向性，特别是。一些研究人员已经研究了柯萨奇病毒B3对结直肠癌治疗的溶瘤活性，并显示出显著的肿瘤生长抑制作用，但也出现了一些严重的副作用，如心肌炎和胰腺炎。在一项II期临床试验中，对无法切除的黑色素瘤患者进行柯萨奇病毒A21（V937）瘤内注射，6个月无进展生存率为38.6%（95% CI，26.0至52.4）（表3）。 小病毒是临床上研究用于癌症病毒治疗的最小病毒。已经研究了三种重要的方法来提高这种病毒的溶瘤活性，即与其他各种抗癌剂结合，制备具有升级的溶瘤和免疫调节功能的新型小病毒，以及使用细胞复合物作为生物标志物来监测对小病毒治疗的反应（表3）。 3.溶瘤病毒治疗的抗癌机制  3.1.选择OV  理想的OV必须满足以下要求：（i）高度靶向肿瘤细胞；（ii）快速复制和扩展；（iii）低免疫原性，减弱抗病毒反应；（iv）强烈激活免疫反应。 病毒复制和扩展涉及一系列过程，病毒在宿主生物体内复制自身并增加数量。不同类型病毒的具体机制可能有所不同，但这里是一般概述： 1. 附着和进入，病毒首次使用表面蛋白附着在特定宿主细胞上，然后通过与细胞膜直接融合或通过内吞作用进入宿主细胞。2. 释放病毒基因组。一旦进入宿主细胞，病毒将其遗传物质（DNA或RNA）释放到细胞中。3. 复制和转录。病毒基因组控制宿主细胞的机制以复制和转录其遗传物质。DNA病毒通常在宿主细胞核中复制，而RNA病毒在细胞质中复制。4. 翻译和蛋白质合成：宿主细胞的核糖体被劫持以使用病毒RNA或DNA中的指令合成病毒蛋白。5. 组装。新合成的病毒组分（蛋白质和遗传物质）被组装形成完整的病毒颗粒。6. 成熟，组装好的病毒颗粒经历成熟并获得感染其他细胞的能力。7. 释放。成熟的病毒从宿主细胞中释放出来，要么通过细胞溶解（细胞破裂），要么通过从细胞膜出芽。8. 传播和扩展。释放的病毒可以感染邻近的细胞，重复复制周期，并导致宿主内病毒种群的扩展。 低免疫原性，减弱抗病毒反应，指的是免疫系统对病毒表现出减少或弱反应的情况，特别是当病毒已经被减弱或削弱用于各种目的时，如疫苗开发。减弱的抗病毒反应涉及使用弱化的病毒形式作为疫苗。病毒被修改以减少其毒力，使其更不有害，同时仍然保留刺激免疫反应的能力。这种方法旨在诱导提供针对自然更强病毒形式的保护的免疫反应。T-VEC就是一个减弱的溶瘤病毒的例子。 在确定破坏恶性细胞的OV时，首先要考虑的是病毒骨架。DNA病毒具有多重优势，因为它们具有更稳定的基因组，并且比RNA病毒更容易进行基因工程。DNA病毒的免疫原性低于RNA病毒，并且具有更多的修复机制，减少了复制过程中错误的可能性。一些DNA病毒，如逆转录病毒，具有将其遗传物质整合到宿主基因组中的能力。RNA病毒体积较小，可以穿过血脑屏障，并且比DNA病毒具有更恒定的复制能力；然而，它们的遗传不稳定性和突变率高于DNA病毒。最常用的平台是那些带有DNA病毒的平台，如HSV-1和Ad。基因工程是增强OVs某些特性的替代方法。据报道，临床试验中有三分之二的病毒已经被基因工程改造。1991年首次尝试使用HSVs对OVs进行基因工程改造。今天，第四代基因工程溶瘤病毒可用于肿瘤免疫治疗。基因工程OVs的研究重点是提高它们的效力和安全性，主要是促进选择性复制，减少免疫原性，促进肿瘤破坏，并减弱病毒致病性。迄今为止，已有20多个病毒家族经过基因工程改造；这些包括MeVs、NDVs、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒（VVs）、HSVs、Ad、痘病毒、粘液病毒和水泡性口炎病毒（VSVs）。这些转变的目的是针对病毒复制、免疫刺激的启动和肿瘤相关抗原的释放。一些临床前研究表明，工程化的OVs通过诱导所需的免疫反应发挥免疫调节作用。一个例子是通过添加GM-CSF或ICAM-1转基因来刺激宿主免疫反应。一个代表性的例子是VSV，其包膜中的糖蛋白已经被修改以减少病毒的神经毒性。已经为OVs的基因工程开发了各种策略。必须了解病毒的生物学和遗传学，以了解病毒与宿主之间的关系，并理解细胞如何防御病毒感染。基因工程使用具有不同机制的转基因来破坏肿瘤细胞。采用不同的策略替换病毒中的不同蛋白质以增加肿瘤靶向。许多病毒受体在癌细胞中高度表达，允许病毒在癌细胞中的摄取量高于正常细胞。一些受体，如层粘连蛋白、CAR、CD 46和CD155，在不同的癌细胞中表达过多，导致Ad、Sindbis病毒和Poliviruses的摄取量增加。一些病毒蛋白对肿瘤细胞有毒，并可以在病毒暴露时直接杀死细胞，而在病毒复制之前，如Ad编码的E3死亡蛋白和E4或f4蛋白。在一项研究中，VSV的糖蛋白G被一种脑膜炎病毒的变异蛋白替换，以增加VSV对恶性细胞的选择性。另一种策略是增加宿主对肿瘤的反应。T-VEC疫苗包含一个被基因改造以表达GM-CSF的Ad，增加了抗原呈递细胞（APCs）进入肿瘤免疫抑制微环境的招募，导致招募各种细胞因子，放大抗肿瘤活性。药物递送的效力与将药物递送到肿瘤床而不损害正常细胞有关，并将药物保持未降解直到它到达肿瘤。在一项研究中，用人血清白蛋白包裹的溶瘤Ad延长了病毒的存活率。在另一项研究中，人血清白蛋白涂层的腺病毒保护它免受中和抗体的侵害。 3.2.OVs的抗肿瘤机制 已经描述了OVs对肿瘤细胞作用的各种机制（图1）。 图1. 溶瘤病毒的作用机制。肿瘤细胞内病毒的复制引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后释放肿瘤抗原激活免疫系统，重塑肿瘤微环境（TME），激活抗血管生成机制，增加肿瘤突变细胞中病毒复制，并传播病毒感染到其他肿瘤细胞。 OVs，无论是自然产生的还是由于基因工程修改，都表现出肿瘤选择性，通过靶向恶性细胞表面的受体，在癌细胞中优先复制，并引起癌细胞内途径和基因表达的细胞内异常，但不影响健康细胞。OVs可以感染健康细胞，但它们展现出抑制病毒传播的机制，这些机制在癌细胞中通常缺失。因此，在VSV感染中，正常细胞可以产生I型干扰素来阻止病毒复制，但大多数癌细胞I型干扰素信号传导有缺陷。研究表明，Semliki病毒感染在肿瘤细胞中诱导分泌WNT配体（WNT2B和WNT9B）和β-catenin（CTNNB1）的稳定，并以反馈机制减少IFNB1的表达，有利于减弱宿主的抗病毒反应。一些研究报告称，两个小鼠细胞系（NR6和B82），不表达表皮生长因子受体（EGFR），对呼肠孤病毒感染相对有抵抗力，但转染了编码EGFR基因的相同细胞系表现出显著更高的敏感性。这种感染效率的提高需要功能性EGFR，因为在表达突变EGFR的细胞中没有观察到，就像在肿瘤细胞中一样。诸如HPV、HCV和KSHV等致瘤病毒感染，已经发展出在感染期间减弱肿瘤抑制基因（如p53和RB）的机制，以促进病毒增殖，强调了这些守门人基因在控制病毒感染中的重要性。 OVs采用的主要抗肿瘤机制如下：(i) 直接肿瘤裂解；(ii) 通过激活抗肿瘤活性重塑TME；(iii) OVs的基因靶向；(iv) 破坏和重塑肿瘤部位的血管系统；(v) 肿瘤细胞的代谢重编程；以及(vi) OVs诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）。3.2.1.直接肿瘤裂解 OVs采用的经典抗肿瘤机制是在癌细胞内复制，随后直接裂解这些细胞；这种机制被称为直接病毒诱导的溶瘤作用（图2）。因此，转基因表达并触发宿主免疫反应，从而激活抗肿瘤免疫。 图2. 溶瘤病毒（OVs）通过内吞作用或靶向一个或多个受体进入肿瘤细胞。OVs直接溶瘤作用的机制如下：(A) 大量OV复制，随后破坏溶酶体、自噬和细胞溶解；(B) OV改变通透性和线粒体代谢，随后发生细胞溶解；(C) OV决定肿瘤细胞应激反应，触发JNK途径和caspase级联反应，随后发生细胞溶解；(D) OV表面的蛋白质与TRAILR1和TRAILR2受体结合，激活TRAIL介导的凋亡（BioRender.com）。 有报道称，经过工程改造的新城堡病病毒导致肿瘤细胞线粒体膜通透性丧失，随后发生ICD。M1病毒诱导内质网应激介导的凋亡，随后肿瘤细胞溶解。携带TRAIL基因的工程病毒A4，可在病毒表面诱导TRAIL蛋白的表达，能够与肿瘤细胞上的TRAILR1或TRAILR2受体结合，并促进凋亡。这一机制通过直接肿瘤裂解在局部诱导肿瘤细胞死亡，但它也通过激活免疫系统（图2D）触发系统性反应，并激活参与肿瘤血管化的内皮细胞，减少肿瘤血管生成。3.2.2.通过激活抗肿瘤活性重塑TME OVs的抗肿瘤活性的一个复杂机制是TME重塑，激活抗肿瘤活性，局部OV诱导的炎症，以及对感染和未感染肿瘤细胞的间接介导凋亡。 肿瘤细胞的溶解释放肿瘤抗原，并在宿主中引发系统性抗肿瘤免疫反应。TME是一个由免疫细胞、血管和功能障碍的代谢途径组成的活跃的支持网络，这些途径刺激肿瘤细胞的增殖。一些环境由于肿瘤抗原水平降低和肿瘤抑制免疫细胞的浸润而被认为是免疫学上的“冷”。OVs是强大的免疫疗法剂，能够影响免疫抑制环境，创造一个有利于宿主免疫系统作用的免疫学上的“热”环境。OVs介导TME的重塑，创造一个有利于抗肿瘤免疫细胞的涌入和激活的环境，有利于肿瘤的消除（图3）。 图3. 冷TME包含基质和免疫抑制细胞。OVs引起细胞死亡。将抑制性免疫和代谢环境重塑为热TME。CAF，癌相关成纤维细胞；DC，树突细胞；IFN，干扰素；IL，白介素；MDSC，髓源性抑制细胞；NK，自然杀伤细胞；OV，溶瘤病毒；TME，肿瘤微环境；Treg，调节性T细胞（Biorender.com）。 OVs经历复制和扩增，这是肿瘤破坏的主要因素，导致新的肿瘤细胞被感染。这些复制和扩增过程是OVs特有的，并不在其他非生物癌症治疗中发现。 DC/T细胞激活 OVs通过包括先天免疫和适应性免疫以及诱导ICD在内的各种机制触发抗肿瘤免疫活性。 释放DAMPs。溶瘤病毒(OVs)导致内质网(ER)应激，随后是凋亡，病毒病原体相关分子模式(PAMPs)的释放，肿瘤相关抗原，损伤相关分子模式(DAMPs)的释放，以及先天免疫的激活。PAMPs与病毒元素一起结合到Toll样受体(TLRs)上，诱导树突状细胞(DCs)的成熟和细胞因子的释放。OVs激活的ICD可以随后释放其他DAMPs，如钙网蛋白(CRT)，ATP，热休克蛋白(HSPs)，尿酸，高迁移率族蛋白盒1(HMGB1)，以及细胞因子(IFN-α，IFN-γ，肿瘤坏死因子-α和白介素1,6,8和12)。DCs的激活。DAMPs也可以在DCs的TLR4配体(HMGB1和CRT)的支持下启动DCs的成熟。DCs在肿瘤中很少见，但代表与适应性和先天免疫系统相关的强大的专业抗原呈递细胞(APCs)。通过溶瘤效应调节肿瘤微环境中的DC群体提供了新的肿瘤抗原，并支持DCs的渗透和成熟。抗原呈递给CD4+和CD8+ T细胞后，激活效应T细胞反应，这些细胞记忆信息，在淋巴结中增殖，并迁移到肿瘤。遗传工程被用来通过删除或添加有效载荷(单克隆抗体，细胞因子和趋化因子)来修改溶瘤病毒，以增加肿瘤微环境中的免疫反应并限制不良反应。其中一个例子是添加GM-CSF，这是一种触发DCs转化为强大的APCs的细胞因子。临床前数据证明了GM-CSF武装HSVs的远隔效应。IL12也参与了DCs，T细胞和自然杀伤(NK)淋巴细胞在肿瘤微环境中的成熟，抑制调节性T细胞(Tregs)和MDSC活性，并诱导M1型巨噬细胞的极化。关于IL12的一个主要问题是其与致命炎症综合征的关联，这是由于IL12在全身的积累。为了避免这些毒性，工程化了一种表达IL12突变形式的oAd，以安全给药。 巨噬细胞的参与 TME中M2型巨噬细胞的存在是大多数癌症低总生存率的强大预后因素。在TME水平上，OVs作用于M2型巨噬细胞，这些细胞被重极化为M1表型，并表达各种促炎细胞因子和趋化因子(IFN-γ，CXCL10，各种白介素)，等等，这些因子加强了抗肿瘤免疫环境；这种效应已在一些OVs的研究中显示，包括VSVs，HSVs，呼肠孤病毒(RV)，副黏病毒(MeV和MuV)，GLV-1h68和Ad5 D24-RGD。 NK细胞的参与 NK细胞是溶瘤病毒疗法的重要介导者。此外，NK细胞参与对抗病毒感染，因此，它们可能对OVs的效力产生不利影响。OVs对NK细胞的影响包括促进NK细胞从循环中招募到肿瘤，增强NK细胞激活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。OVs有能力裂解肿瘤细胞并触发免疫原性细胞死亡，随后释放DAMPs，被DCs检测到，促进炎症。此外，OVs感染DCs，作为对感染，肿瘤和髓样细胞的反应，产生趋化因子，招募NK细胞进入肿瘤。此外，DCs和其他髓样细胞产生各种细胞因子，增强NK细胞存活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。当NK细胞被激活时，它们产生大量的IFN-γ并杀死肿瘤细胞。NK细胞配体在癌细胞表面的配体也由OVs调节。此外，OVs感染的细胞释放病毒蛋白，被NK细胞识别，增加激活受体的表达，并增强杀死肿瘤细胞。一些OVs介导增加细胞因子和趋化因子的产生，随后表达NK细胞抑制配体，如肿瘤细胞中的MHC-I。 已经证明，IL2武装的仙台病毒在血管肉瘤小鼠模型中增加了NK细胞的招募。在另一项研究中，表达IL-2的细小病毒(H-1PV)在胰腺导管腺癌模型中增加了NK细胞的激活。工程化的天花病毒(VV)，VV∆TK∆N1L，武装有IL12，并删除了胸苷激酶和N1L基因，作为新辅助治疗在各种小鼠和仓鼠手术癌症模型中使用时延长了存活时间。 中性粒细胞的参与 已经证明了基于VV和VSV的病毒促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤效应。在临床前实验中，发现TGF-β极化的N2中性粒细胞具有促肿瘤效应，而1型IFN极化的N1中性粒细胞具有促免疫和抗肿瘤结果。N1促进CD8+ T细胞的招募和激活以及细胞因子的产生，如VGF，TNF-α，GM-CSF和IL12。一种名为PVSIPO的重组脊髓灰质炎病毒疫苗株，包括一个异源内部核糖体进入位点，被证明可以促进前列腺和乳腺癌中中性粒细胞的积累，并与改善存活相关。 Tregs的参与 Tregs也通过高表达转录因子Foxp3诱导强烈的免疫抑制活性。已经证明，感染AdCMV∆24可以降低TME中的Treg水平。最近的研究报告说，溶瘤VV可以直接感染并减少小鼠癌症模型中的Treg数量，随后产生抗肿瘤效应。 基质修饰 一些OVs针对肿瘤基质并重塑细胞外基质(ECM)以改善其抗肿瘤效应。一种表达松弛素的oAd与各种调节剂结合形成平台oAd/IL-12/GM-RLX，导致ECM降解，增强治疗性单克隆抗体的渗透，并在胰腺癌模型中促进抗肿瘤效应。此外，一种表达PH20透明质酸酶的oAd导致ECM中透明质酸的降解，从而改善了其传播。癌症相关成纤维细胞(CAFs)在许多癌症中上调，并通过成纤维细胞激活蛋白(FAP)激活基质中的成纤维细胞。肿瘤相关周细胞是胶质母细胞瘤模型中的主要基质细胞亚群。一种oAd，ICOVIR15，减少了FAP+周细胞，胶质母细胞瘤细胞和GMP相关基质FAP+小鼠细胞的数量。另一种溶瘤VV，Western reserve double-deletion (WRDD)，已被证明针对CAFs并在黑色素瘤中具有抗肿瘤效应。 3.2.3.OVs的基因靶向 基因靶向是OVs的主要抗肿瘤机制。例如，呼肠孤病毒利用通常在癌细胞中改变的特定细胞特征。在肿瘤细胞中，癌基因被激活，肿瘤抑制基因被灭活，导致特定蛋白的信号传导调节，如TP53，PTEN，RB1和RAS，并激活肿瘤形成，血管生成，抑制凋亡，侵袭和转移。这些信号级联被OVs靶向，调节肿瘤细胞中的各种信号通路。已经研究了呼肠孤病毒对肿瘤细胞培养的作用，并确定了病毒在肿瘤细胞内的有选择性复制步骤—Ras突变可以促进呼肠孤病毒进入和肿瘤转化，增强OVs的产生，诱导凋亡，并在呼肠孤病毒感染后防止干扰素产生，允许病毒由于有缺陷的抗病毒反应而扩散。呼肠孤病毒通过与特定细胞表面受体相互作用进入细胞。癌细胞上这些受体的表达或可及性的变化可能增强病毒进入和感染它们的能力。溶瘤VVs和VSVs只能感染肿瘤细胞并促进由于ras/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的高表达而破坏内皮细胞。有些病毒，如呼肠孤病毒，对肿瘤细胞有天然的偏好，而其他病毒，如Ads，VSVs和HSVs，必须适应这种对肿瘤细胞的选择性。 被OVs感染的健康细胞通过不同的机制抑制病毒的传播，这些机制在肿瘤细胞中通常不足。细胞的I型IFN相关抗病毒潜能与其对VSV对癌细胞的选择性相关。正常细胞产生I型IFN以防止病毒复制；然而，大多数肿瘤细胞的I型IFN产生有缺陷，因此，它们被提议用于VSV感染。3.2.4.破坏和重塑肿瘤部位的血管系统 影响肿瘤血管生成的因素由癌基因介导的蛋白的表达和诱导细胞条件的因素组成，如低pH值、缺氧、营养缺乏或诱导活性氧(ROS)。OVs的抗血管生成方式如下：(i) 直接感染肿瘤细胞，随后裂解新形成的血管的血管内皮细胞；(ii) OVs触发的免疫反应，导致细胞聚集和血流减慢；(iii) 表达病毒蛋白，阻断肿瘤诱导的促进血管生成的因子的合成（图4）。 图4. 溶瘤病毒(OVs)诱导的抗血管生成机制。(A) OVs促使中性粒细胞的招募，发展为微血栓和缺血，随后发生凋亡。(B) 工程化病毒可以诱导内皮细胞的直接裂解。(C) OVs可以调节转录因子，减少IL8的产生，从而刺激凋亡。(D) OVs与血管生成蛋白相互作用，下调VEGF的表达。(BioRender.com)。 许多OVs具有直接的抗血管特性。一种含有人类端粒酶逆转录酶元素的腺病毒，OBP-301，被设计用来调节E1基因的表达，产生具有抗血管生成效应的IFN-gamma，选择性地破坏小鼠结肠肿瘤中的癌细胞。在血管内，VSVs刺激血栓形成和炎症。 最重要的因素包括CRT、ATP、HMGB1、热休克蛋白（HSPs）和annexins[135]。增强树突细胞吞噬抗原的DAMPs之一是CRT。ATP从凋亡细胞释放并结合到巨噬细胞和单核细胞上的P2Y2受体，加速凋亡细胞的清除。HMGB1激活未成熟树突细胞中的TLR4，导致树突细胞成熟并加速树突细胞对肿瘤抗原的摄取。热休克蛋白（HSPs）能够结合到树突细胞受体上，刺激抗原肽；它们也刺激内在的促炎级联反应。Annexin A1（ANXA1）在解决炎症过程中和协助树突细胞活动方面发挥着重要作用。参与ICD发展的其他因素包括细胞因子、趋化因子、核酸和转录因子。一些溶瘤病毒（OVs）对肿瘤组织有天然的趋向性，而另一些则经过基因改造在肿瘤细胞中复制以检测特定目标并传递某些基因（图5）。 图5. 由天然溶瘤病毒（OVs）诱导的免疫原性细胞死亡途径。一些天然OVs，包括新城疫病毒（NDVs）、柯萨奇病毒（CVs）、麻疹病毒（MVs）、单纯疱疹病毒（HSVs）、牛痘病毒（VVs）、腺病毒（Ads）、森林塞姆利基病毒（SFVs）和绵羊痘病毒（ORFVs）可以诱导特定模式的免疫原性细胞死亡。NDV、HSV和Ad可以诱导多模式细胞死亡，调节濒死恶性细胞中损伤相关分子模式的暴露，随后招募先天免疫应答者并触发强烈的免疫反应。VV诱导坏死性凋亡，而CV、MV、SFV和ORFV诱导免疫原性凋亡（BioRender.com）。 免疫原性凋亡是OV诱导的细胞死亡的最常见类型。受体，如TRAIL-R、TNF-R和Fas，形成死亡诱导信号复合体（DISC），被病毒感染调节，并调节激活caspase-8，诱导凋亡。这些受体过度表达并触发caspase级联反应，启动外源性凋亡。腺病毒在肿瘤细胞中诱导凋亡，这是其自然特征。表达三聚体肿瘤坏死因子的H5CmTERT-Ad株（H5CmTERT-Ad/TRAIL）在对照组中比天然腺病毒具有更强的肿瘤杀伤效果。HSV也参与凋亡。一种工程化的oHSV-2配备了凋亡激活因子Her2-COL-sFasL，以增强感染细胞中caspase的激活并放大凋亡。坏死代表细胞通过自溶的过早死亡，包括细胞膜完整性的丧失、细胞器的肿胀和细胞死亡产物不受控制地释放到细胞外空间。坏死性凋亡是一种程序性坏死细胞死亡过程，可以诱导或增强抗肿瘤免疫。它经常与由于DNA、ATP、尿酸、核蛋白和HSPs的释放而激活的级联炎症体激活相关，这些物质激活类激酶蛋白（MLKL），随后膜通透性增加并释放DAMPs。OVs还触发目标肿瘤细胞中的多种细胞死亡过程。例如，野生型Ad血清型5诱导自噬、焦亡和坏死性凋亡细胞死亡途径。NDV触发凋亡并被发现激活内在和外在凋亡途径。溶瘤NDV株FMW（NDV/FMW）是肺、黑色素瘤和前列腺癌细胞中的ICD诱导剂，显示HSP70/90和ATP分泌，并在黑色素瘤细胞中触发凋亡、自噬和坏死性凋亡。NDV/Hitchner B1促进胶质瘤细胞中的凋亡和坏死性凋亡。 4.OVs的递送系统  4.1.溶瘤病毒的直接递送  4.1.1.瘤内递送  瘤内给药是临床试验中用于递送OVs的最常用途径。各种试验已经建立了瘤内给药的有效性，并研究了其通过避免循环洪流来保持OVs足够生物利用度的能力。瘤内局部给药方法通过减少病毒失活来利于这一过程。有限的病毒与先天免疫系统的相互作用降低了系统毒性的可能性，并通过对独特给药途径的期望病毒载量进行转移。限制因素包括由于密集的ECM而在肿瘤中达到的非治疗水平，以及由于新生血管生成而导致的瘤内灌注不足。瘤内给药的OVs可以诱导全身反应。肿瘤抗原的产生是对OVs和肿瘤细胞之间相互作用的反应。对T-VEC给药的研究显示，研究的黑色素瘤病变大小都有所减小，无论是注射的还是未注射的。 4.1.2.静脉内递送 静脉给药对于转移性癌症有益，当需要感染不同大小和位置的多种肿瘤时，以及由于肿瘤位置原因无法进行瘤内给药时。这种类型的给药可以确保OVs在肿瘤质量中更好地分布；然而，最佳OV剂量尚不确定。一些OVs在静脉给药时可以刺激更明显的免疫反应。免疫系统可以使用不同策略阻止OVs成功传播到目标组织。OVs可以非特异性地连接到血清蛋白或循环流中的循环细胞，随后被破坏。由于这些机制是先天免疫系统的一部分，它们在未暴露于特定病毒的患者中也有效，暴露史可以通过存在精确而有力的免疫反应通过抗体的存在显著破坏病毒。通过与病毒颗粒结合，抗体可以通过补体作用或被位于不同器官的巨噬细胞破坏而消除。肝脏、脾脏和肺是中和OVs的主要器官。另一个有效静脉给药OVs的障碍是肿瘤ECM和间质流体压力。高间质流体压力限制了进入肿瘤中心的通道，其中由于其周边的流体流动而具有最高值，但它也减少了大分子的通过。 4.2.通过OVs的货物系统递送 在OVs货物递送到肿瘤的领域已经进行了众多且多样的研究，可以分为生物和非生物递送系统。生物载体包括细胞、细胞膜介导的和血清白蛋白介导的OVs载体。非生物载体的OVs包括矿化纳米结构、磁性纳米结构和基于聚合物的纳米载体。 4.2.1.OVs的有机载体 细胞载体 间充质干细胞（MSCs）因其独特的生物学特性、广泛的治疗应用以及对组织工程的影响而在科学研究中受到越来越多的关注。MSCs通过分化成成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞来展示这种能力，并且具有广泛的分泌网络，包括多种介质、细胞因子和信号分子，除了它们显著的自我更新和多能性特征。这种分泌塑造了炎症反应，并控制了组织再生和修复所需的关键渗透过程。MSCs的调节行为是由MSC分子-靶细胞轴内的反馈驱动的。MSCs无法显示共刺激粒子，因此与较低的免疫活性有关，有机会用于肿瘤的基于细胞的免疫疗法。MSCs可能促进体外oAds的病毒复制，通过防止大鼠模型中的病毒特异性免疫反应，使运输和提高病毒的长期存活率成为可能。此外，与体内单独病毒接种相比，CR-MSCs可能减少刺激T细胞合成的IFN的数量，并导致oAds在扩散和存活方面的增加更大。全身给药的MSCs感染了肝细胞癌异种移植标本中的oAds，增强了病毒粒子的积累，并显著抑制了肿瘤增殖。另一项涉及由人类MSCs携带的复制Ad的研究，其中包括由甲胎蛋白启动子调节的E1A基因，显示在正位和皮下肝异种移植癌小鼠模型中显著限制了生长。经过全身给药后，MSCs被oAd污染，在肺和乳腺恶性肿瘤的正位小鼠模型中显示出治疗特性，提高了存活率。在转移性乳腺癌的实验模型中，全身注射工程化的人类MSCs，携带可复制病毒的副本，如Ad5/3.CXCR4和Ad5R6D.CXCR4 Ads，增加了动物的存活率。全身输注感染了HER2重定向溶瘤HSV的MSCs，在实验室模型中将感染传播到乳腺和卵巢癌细胞，随后减少了肺部和大脑的转移。对SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植的研究显示，腹腔内给药的MSCs装载了溶瘤MeVs在SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植可以进入肿瘤病变，并最终在小鼠中传播病毒感染，增加了平均寿命。针对MSCs的CRAd5/F11嵌合oAds显著抑制了结直肠癌细胞的生长。 神经干细胞（NSCs） 一些研究表明，NSCs具有迁移到脑肿瘤细胞的能力，并可能为各种抗癌剂提供运输平台。Ad（CRAd-Survivin (S)-pk7病毒）可以针对NSCs上的CD46受体。感染的NSCs迁移到胶质瘤细胞，从而减少肿瘤生长。NSCs和MSCs被用作载体在胶质瘤模型中运输oAd，观察到NSCs和MSCs都允许病毒复制并减少神经炎症。然而，NSCs释放的Ads数量多于MSCs，并且使用病毒载NSCs在肿瘤携带动物中注射瘤内，存活时间延长，这表明NSC细胞系中CXCR4的高表达是原因。Kim等人报告说，CRAd-S-pk7和NACA的组合提高了NSCs中oAds的复制，从而提高了OV的效率。 细胞膜介导的OVs系统递送 作为载体的某些实体在来自几种细胞类型的细胞外载体的多样化保护伞下共同可用。使用这些载体的好处，由生物模拟技术作为PEG化替代品，包括在环境中的安全性和耐用性，从而克服了药物递送系统的局限性。 整合来自细胞膜的运输者的主要优势在很大程度上是由于保留了它们来源的细胞内的固有功能和信号传导途径。结合这些纳米载体只包含来自单一来源的膜部分，如红细胞、血小板、癌细胞和负责免疫防御的细胞的膜，或者是从几种不同的细胞类型生成的，结果是有价值的载体选择，它们具有靶向肿瘤细胞的能力，是细胞膜的生物工程过程的结果，并且可以携带小分子，如遗传物质、特定药物和疫苗抗原。这些由细胞的基本组成部分生成的囊泡在肿瘤学试验中使用，主要是通过在它们内部运输实体或通过包裹纳米粒子-药物复合物。在所有细胞来源替代品中，红细胞为所讨论的目标提供了一些最有用的特征。可以相当容易地获得这些细胞，它们在血管系统中的平均存活时间很长，并且由于这些细胞缺乏天然细胞器，因此还有潜力封装额外数量的产品。依赖于具有混合涂层的囊泡的新模型，称为红细胞脂质体，由人工成分与红细胞膜的组合生成，对分布有益。随后，在体外和体内检查了肿瘤细胞膜，以评估病毒感染的程度及其破坏性影响。因此产生的颗粒，称为ExtraCRAd，被瘤内给药，并显示出通过clathrin介导的内吞作用的适当吸收，考虑到oAds感染需要表达CAR的需求，这是一个重要的好处。此外，这种设置对于体内抗体识别和灭活是一个重要的限制。 血清白蛋白介导的OVs系统递送 用不同材料包裹OV颗粒是一种保护它们免受免疫系统作用的策略。Ads和血清白蛋白之间的关联阻止了针对OVs的抗体的作用。抗体识别病毒的衣壳蛋白，并通过吞噬作用对它们进行涂层。因此，它们使OVs成为免疫效应细胞的目标；然而，它们也可以在细胞水平上阻止转导。白蛋白是血浆中浓度最高的蛋白质，并且具有长的半衰期。 经过基因工程改造后，白蛋白自然地结合到Ad的表面。形成病毒衣壳的最常见蛋白质具有高变区域，可以促进白蛋白和病毒之间的相互作用，但也是抗OV抗体的主要目标。使用降解ECM的蛋白酶可以增加肿瘤床中的病毒载量。透明质酸是ECM的组成元素之一。它是一种复杂的多糖，在某些癌症中以高浓度存在。透明质酸的积累可能发生在消化道癌症的上皮中，如结肠和胃。在卵巢、乳腺和前列腺癌症的肿瘤基质中，聚集是明显的。有些器官具有富含透明质酸的多层上皮和基质。在这些情况下，变化是可见的，并且与癌症进展相关。在头部、颈部和皮肤的鳞状细胞癌中，透明质酸水平降低，与肿瘤阶段有关。增加的浓度与侵袭性肿瘤和预后不良有关。透明质酸酶降解ECM并降低间质流体压力。因此，抗肿瘤剂对靶细胞的作用增加。透明质酸酶的表达增加了OVs的有效性。Hexon是Ad包膜中发现的一种重要蛋白质。衣壳蛋白与白蛋白的结合域结合。透明质酸酶的蛋白水解作用和基于白蛋白与病毒表面结合的递送机制决定了OVs的溶瘤效力。VCN-11是一种修饰的腺病毒，表达透明质酸酶和白蛋白结合域。目前正在研究其细胞毒性和逃避免疫系统的能力。这些OVs对肿瘤细胞的作用最强，并且细胞毒性是450倍。在体内，含有白蛋白结合域的OVs组中存在高滴度的中和抗体，表明它们没有作用。VCN-01是一种oAd，其透明质酸酶作用于胰腺间质基质。它可以增强化疗药物的效果。HAdV5是最好表征的Ad类型之一，靶向呼吸道上皮细胞。在具有健全免疫系统的个体中，可以轻松控制这种病毒的感染。这种病毒是溶瘤治疗的良好候选者，考虑到其个体性。这种病毒确保有效地转导到感染的细胞中。因此，在感染靶细胞后，遗传物质被转移到细胞核中。在将核酸释放到细胞核后，细胞使用病毒提供的遗传物质产生所需的蛋白质。此外，这种方法用于分裂细胞系和难以接近的细胞，如原代细胞。另一个优点是大规模生产的可能。适应悬浮培养的细胞确保了细胞培养的简便程序，从而提高了安全性并降低了生产成本。通过将白蛋白层适应病毒，可以减少OVs在肝脏中的清除。通过将适配蛋白附加到这个复合物上，可以将遗传物质传递给表达HER2或EGFRs的肿瘤细胞。此外，这种适应减少了免疫介导的清除。免疫中和可以通过阻断特定受体或将其暴露于蛋白酶体降解的抗体发生；这被称为抗体依赖性细胞内中和。先天免疫系统通过IgM抗体和补体系统与OVs相互作用。 细胞外囊泡（EVs） 细胞外囊泡是各种类型细胞释放的膜囊泡，通过携带脂质、蛋白质、RNA、DNA和碳水化合物参与细胞间信号传导，并根据其大小被分类为外泌体、微囊泡、凋亡小体和肿瘤小体。它们通常用于携带抗癌药物，如OVs。Garofalo等人报告说，Ad5D24-CpG和PTX封装在EVs中在体外和体内诱导了肺癌模型中的肿瘤周围炎症，提高了疗效和细胞毒性。来自肿瘤细胞的外泌体通常具有免疫抑制功能；然而，感染OVs的肿瘤细胞的外泌体可能具有免疫刺激功能。Labani-Motlagh等人表明，感染OVs的黑色素瘤细胞，装备有CD40（CD40L）和4-1BB（4-1BBL）配体，增强了树突细胞的激活和TME中的响应。OVs可以包含选择性在肿瘤中积累的外泌体，局部或在远处肿瘤中表达抗肿瘤效应。它们被设计成带有免疫刺激转基因的LOAd溶瘤腺病毒。LOAd感染的肿瘤细胞表达转基因包装到内体区室并作为外泌体释放。此外，mRNA在外泌体中的表达在LOAd700和LOAd703感染的细胞中显著增加。观察到任何感染的细胞都可以表达转基因，即使病毒只在肿瘤细胞中复制。然后未成熟的树突细胞被LOAd病毒感染，并在体外被外泌体激活。OVs用其免疫刺激转基因武装肿瘤衍生的外泌体，这可能部分解释了为什么局部治疗可以导致全身免疫。还证明了感染细胞中外泌体中微小RNA（miRNA）的转运发生了变化。 微粒子（MPs） 另一种用于OVs系统运输的车辆是微粒子（MPs），它们是通过外泌作用从细胞释放的直径最大为1微米的囊泡。微粒子提供免疫保护并延长oAds的释放。封装在微粒子或PLGA中的Ads为oAds提供了免疫保护。使用MPs的总循环系统对oAds的高保护增加了oAds的释放。肿瘤细胞衍生的MPs被用作oAds的货物，被运送到肿瘤细胞的细胞核，并保护Ads免受抗体的影响；由MPs携带的oAds比用游离oAds治疗肿瘤更有效。 4.2.2.无机载体介导的OVs系统递送 包括脂质体、树状分子、金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子和氧化铁纳米粒子在内的各种类型的纳米粒子（NPs）可以与OVs链接。使用NPs递送OVs有两种策略。第一种是屏蔽和表面修饰，第二种是OV-NPs的联合疗法。将NPs递送到肿瘤部位有两种机制，即主动和被动。在被动机制中，EPR效应增加了肿瘤血管的通透性，NPs在肿瘤区域集中。主动递送涉及NPs对目标细胞的选择性结合，目的是在减少副作用的情况下增加治疗剂在肿瘤中的浓度。各种生物配体，如肽、蛋白质、核酸适体和多糖，对肿瘤细胞中的分子或受体表现出亲和力和特异性。 药物递送中的屏蔽 聚乙二醇（PEG）最常用于屏蔽NPs的表面，因为它在极端pH溶液中的生物相容性、稳定性和亲水性。PEG成功地与Ad载体结合，延长了循环时间并减少了肝脏毒性。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）是另一种通过内吞作用进入细胞的配体。阳离子脂质体（DOTAP/DOPE）被报道可以增强病毒基因组在肿瘤细胞中的转移，并增加肿瘤的通透性和优先靶向。 OV-NP联合疗法 金纳米粒子（AuNPs）在溶瘤病毒疗法中广泛使用，有助于DNA进入肿瘤，尽管存在抗体。设计了一种含有Ad的微胶粒包被的粒子，并与紫杉醇结合，显示出对肿瘤的高效性。我们测试了聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）与聚合物微胶粒的结合，携带紫杉醇到特定目标，比紫杉醇诱导了更高的抗肿瘤效应。另一种聚合物，聚半乳糖基-b-agmatyl二嵌段共聚物（Gal32-b-Agm29），涂覆了oAd，对肝肿瘤细胞表面表达的糖蛋白受体表现出非常强的亲和力。oAds也可以与水凝胶系统结合，提供决定恶性细胞细胞毒性影响的保护环境。oAds可以装载在海藻酸盐凝胶中并瘤内给药，与裸oAds相比，在肿瘤异种移植模型中显示出oAds的长效性。Almstätter等人将磁技术与OV递送结合起来，以改善OVs的递送。设计了四种磁性病毒复合模型，被证明可以提高OVs的疗效并减少系统毒性。 5.当前溶瘤病毒治疗策略  5.1.对溶瘤病毒治疗的耐药性  并非所有患者和癌症类型对病毒治疗都有相同的反应。这种治疗方法的局限性和挑战，以及治疗耐药性的存在，已经被描述。宿主对病毒的免疫反应是病毒治疗中的关键挑战。在几项临床前研究中，宿主免疫反应被证明在减少OVs的复制和更快的清除中发挥重要作用，并对降低抗肿瘤效力负责。在这种情况下，涉及OVs的新的治疗策略集中在调节宿主免疫系统以最大化抗病毒反应，从而改善肿瘤破坏[9]。已经描述了不同的耐药机制；这些包括抗病毒免疫、肿瘤细胞介导的、基质细胞和系统反应。对病毒感染的抵抗力可以在四个阶段完成：（i）病毒的进入和结合；（ii）病毒转录和翻译；（iii）细胞存活；（iv）细胞信号传导。包括中和抗体、正常细胞受体和ECM中的蛋白酶在内的多种因素影响病毒的结合和进入。在上皮-间质和间质-上皮转换期间，据报道细胞间连接得到加强，这使得OVs的渗透变得困难。 为了执行其自身基因组的转录和翻译，病毒的下一个关键步骤是适当调节宿主转录和负责将mRNA翻译成蛋白质的机制。例如，肿瘤细胞可以通过表观遗传修饰和表达几种蛋白质（如载脂蛋白B mRNA编辑酶）来影响病毒转录。几种存活蛋白保护肿瘤细胞免受病毒感染。除了表观遗传修饰外，对OVs的耐药性被发现与调节自噬、肿瘤细胞中的凋亡和促进细胞存活有关。Li等人证明了病毒治疗溶瘤活性的增加，其中Ads中的beclin-1活性促进了肿瘤细胞的凋亡。此外，对病毒感染和肿瘤细胞中的增殖的抵抗力与几个细胞存活调节因子（MEK、MAPK、MYCN、MDR1和SMAC）有关。感染的细胞释放可溶性信号，保护周围细胞免受各种病毒感染。此外，通过分泌干扰素在OVs感染的背景下触发肿瘤细胞中的干扰素受体（IFNR）基于Janus激酶（JAK-STAT）途径在抗病毒耐药性中发挥重要作用。基质细胞的抗病毒活性比肿瘤细胞更强，这影响了对OVs的治疗反应。Arwert等人表明CAFs通过干扰素调节转录因子3（IRF3）和干扰素基因刺激因子（STING）阻止病毒感染。类似地，在卵巢和乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞通过分泌IFN促进对OVs的耐药性，从而创造了保护性的抗病毒状态。OVs也可以诱导局部免疫反应，随后将免疫学上“冷”的TME转化为“热”的，被免疫细胞浸润，其中干扰素信号通路发挥重要作用。干扰病毒治疗效力的机制存在于不同的水平，并涉及TME中不同细胞的相互作用。因此，上皮细胞代表了控制肿瘤中病毒传播的物理屏障。此外，肿瘤血管生成是病毒传播和感染的调节组成部分。对oncoviral治疗产生耐药性的另一个因素是肿瘤中存在缺氧区域。缺氧可以减少OVs在肿瘤细胞中的增殖并干扰肿瘤细胞的裂解机制。缺氧诱导因子1（HIF-1α）是缺氧中的主要因素，促进肿瘤细胞的血管生成和转移。除了物理限制外，前列腺素和VEGF与TME中的耐药性有关。使用病毒载体开发新疗法的困难与无效分布、肿瘤中的缺氧、血管屏障、亚优免疫反应和在细胞间水平发生的抗病毒分子机制有关。总而言之，某些机制对病毒治疗施加了一定程度的耐药性，并负责随后杀死肿瘤细胞。尽管如此，这种机制在赋予OVs耐药性方面的作用仍然不清楚。 这些数据表明需要鉴定新的因素，如肿瘤缺氧和表观遗传修饰，这些因素被认为是对溶瘤病毒治疗产生耐药性的组成部分。关于这一机制的额外数据将为研究人员和临床医生提供完美的工具，以合理设计OVs并制定适当的治疗策略。 5.2.当前将溶瘤病毒治疗与其他协同疗法结合在癌症治疗中的现状 如前所述，已经描述了在单药治疗中对OVs产生耐药性的几种因素。已经考虑了联合疗法来克服这个问题。这种方法在临床前和临床环境中的各种类型的肿瘤中证明了其有效性。 5.2.1.与化疗的结合 化疗仍然是传统的抗癌疗法。OVs与化疗在多个层面上协同作用，包括抑制免疫介导的病毒降解和中和。化疗通过多种机制补充病毒治疗，如通过增强肿瘤细胞的免疫原性、直接杀死癌细胞和阻断抗病毒免疫反应（NCT00006106、NCT00634595、NCT01584284）。环磷酰胺是一种烷化剂，可以提高使用不同病毒的病毒治疗的疗效。这种化疗药物触发的免疫调节被认为可以改善病毒的复制、传播和溶解活性。在临床前和I/II期研究（NCT00006106）中取得了有希望的结果，一种工程化的Ad载体，ONYX-015，与5-氟尿嘧啶和顺铂联合用于治疗头颈部或食管鳞状细胞癌的III期试验。联合治疗的患者反应率为79%，而单独接受化疗的患者为40%。此外，当Ad与不同的药物如阿霉素、吉西他滨、紫杉醇、伊立替康和环磷酰胺联合给药时，抗肿瘤效应得到加强。此外，在临床前研究中，对胶质瘤患者测试了替莫唑胺与OV的联合使用，并显示出良好的毒性剖面和提高的存活率。然而，OVs与化疗的结合效果仍然存在争议，需要进一步研究。尽管一些临床试验显示出有希望的结果，但其他涉及大样本的研究报告了这种联合方案的无效性。例如，Eigl等人在用多西他赛和pelarorep联合治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌患者中，中位生存时间为19.1个月，而接受多西他赛治疗的患者为21.1个月（NCT01619813）。 5.2.2.OVs与放疗的结合 一些研究表明，病毒治疗和放疗的结合导致了有希望的治疗结果。尽管存在强有力的临床前数据，但由于缺乏一个完善的机制，这种效应是由于这两种疗法之间的协同活动。这种结合导致了改善的抗癌活性。放疗诱导的细胞修饰可以增加病毒在肿瘤中复制和传播的能力。Pokrovska等人证明，当OV与放疗结合时，通过增加病毒产生诱导了肿瘤特异性细胞毒性。在一项I期试验中，一种突变的HSV（G207）与复发性恶性胶质瘤的放疗结合，显示出临床反应的潜力。在这项研究中，9名患者中有6名显示出部分反应或稳定疾病，这被证明具有协同效应。另一种方法是，病毒治疗可以增加肿瘤对放疗的敏感性。表达p53的Ad诱导感染的p53缺陷肿瘤细胞对辐射诱导的凋亡更敏感，随后比未从放疗中受益的肿瘤细胞的凋亡减少，导致更大的肿瘤抑制。 5.2.3.OVs与免疫治疗的结合 尽管文献中关于免疫治疗和病毒治疗的结合的报告很少，但将针对PD-1和/或细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）的免疫检查点抑制剂与OV结合在癌症治疗中提供了新的视角，特别是在具有免疫抑制微环境的癌症中，其中PD-1/PD-L1抑制剂的单一疗法可能变得无效。这种疗法的溶瘤活性决定了细胞因子和其他分子的释放，这些分子具有将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的效果，这种修改可以改善免疫治疗对易感目标的效果。除了PD-1，一些也表达在TIL上的免疫检查点分子也被证明可以诱导免疫抑制微环境并减少活化的CD8+细胞。这一类包括CTLA-4、TIGIT、TIM-3和LAG-3。OVH-aMPD-1与抗TIGIT协同作用，并在MC38和Hepa 1-6肿瘤模型中显著改善免疫反应。然而，在难治性肺癌中，vvDD单一疗法与抗PD-1和抗TIM-3 mAbs的结合未能显示出治疗优势。重要的是，将超过两种ICIs作为治疗策略结合使用可以产生更好的抗肿瘤结果。T-VEC是一种瘤内疗法，是免疫疗法的领先组合。GM-CSF在这种结合中的作用是增强细胞免疫。T-VEC的作用来自于病毒载体的直接溶瘤效应和免疫反应触发的结合。在将T-VEC与抗CTLA4，ipilimumab联合用于治疗IIIB-IV期黑色素瘤的I期试验中，观察到了客观和持久的反应率的有希望的结果。此外，在一项开放标签的II期试验中，无论是原发性还是转移性肿瘤，与ipilimumab单一疗法相比，T-VEC与ipilimumab联合使用的目标反应率显著增加。在T-VEC与ipilimumab与ipilimumab单独用于晚期黑色素瘤的II期试验中，在5年分析中，联合治疗的中位PFS为13.5个月，ipilimumab为6.4个月，估计的5年OS在联合治疗组为54.7%，ipilimumab组为48.4%（NCT01740297）。Pexastimogene Devacirepvec（Pexa-VEC）是一种溶瘤牛痘病毒，与抗PD-1抑制剂，cepilimumab联合在肾肿瘤患者中在Ib期试验中显示出令人鼓舞的结果。这种联合疗法报告了37.5%的总体反应。腺病毒DNX-2401是一种OV，在接受恶性胶质瘤诊断的患者中进行了剂量递增研究。在那项研究中，单剂量的DNX-2401，瘤内给药，获得了不同的肿瘤反应。目前，这种OV正在与pembrolizumab联合用于胶质母细胞瘤患者的II期试验中进行研究。中期分析显示，48名接受联合治疗的患者中位总生存期为12个月，反应率为47%。将抗PD1/PD-L1与抗CTLA4和OV结合使用的三重疗法的想法最近变得非常吸引人，在其中一项研究中，Ad与抗PD-L1和抗CTLA4的结合在TNBC正位小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长并延长了存活。通过增加CD8+ T和T记忆细胞的比例以及耗尽Tregs和极化为M1表型的肿瘤相关巨噬细胞，增强了抗肿瘤效应的协同增加，调节了TME。这种联合疗法具有很大的潜力，代表了一种有前景的治疗策略，用于改善癌症细胞治疗，应该很快就会可用。考虑到安全性、毒性剖面和有希望的结果，越来越多的ICIs和OVs正在进入临床试验。 5.2.4.激酶抑制剂的作用 药物病毒方法是用来克服对OVs的耐药性的策略之一，它将病毒治疗与针对激酶的分子治疗相结合。在临床前模型中，已经获得了重要的协同结果，明显的表现是在肿瘤组织中OVs的复制和传播显著增加。受体酪氨酸激酶（RTKs），位于细胞表面，控制大多数情况下介导细胞生长和存活的细胞内反应。一些途径，如MAPK级联或PI3K/Akt/mTOR途径，通过受体特异性配体结合在下游激活。RTKs的超激活导致细胞生长不受控制，是一个重要的药物靶标。最近，病毒治疗与RTK抑制剂的结合已经取得了一些有吸引力的效果。肿瘤间质液压力（IFP）高是有效药物递送的障碍，被认为通过阻碍病毒在整个肿瘤微环境中的接触和侵入，限制了OVs的临床效益。肿瘤组织中IFP增加的原因尚有争议。一个被认为对此有贡献的机制是异常的VEGF介导的血管化增强。Kottke等人指出，当将VEGF配体VEGF165与oReoV结合时，OV给药前给予VEGF165可以改变肿瘤血管并改善OV递送到肿瘤组织。两种酪氨酸激酶抑制剂，厄洛替尼和阿西替尼，与oHSV1结合，通过抑制oHSV1血管生成刺激病毒递送，并被报告影响小鼠胰腺肿瘤的肿瘤生长和血管生成。总的来说，这些观察结果证实了与不同的激酶抑制剂结合治疗的合理性，在临床前研究中取得了有希望的结果。此外，临床前研究的结果与药物病毒结合使用OVs与这些分子可以刺激病毒治疗在癌细胞中溶瘤效力的观点一致。 5.2.5.与细胞治疗的结合 嵌合抗原受体（CAR）-T疗法是治疗癌症的一种新颖且有前景的治疗方法，产生了有效和持久的临床反应。合成受体主要重新定向T细胞，消除表达特定靶标抗原的细胞。2017年，FDA批准了针对B细胞恶性肿瘤的抗CD19 CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法存在一些限制，包括主要毒性，限制了其对实体瘤的疗效，抗原逃逸，持久性有限，以及肿瘤渗透性差。这些都导致了新的方法，在这些方法中，CAR-T疗法与其他抗癌治疗相结合，以提高抗肿瘤效力并减少毒性。抗CD19 CAR-T细胞疗法彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗。一些研究表明，CD-19在多种OV感染的肿瘤细胞类型表面表达，携带CD19-T编码基因（OV19T）。因此，CD-19刺激CAR-T细胞并触发肿瘤溶解，刺激来自死亡肿瘤细胞的OV19T的释放，可以激活内源性抗肿瘤免疫。此外，病毒治疗可以与免疫治疗和CAR-T细胞同时结合，增加TME中的免疫细胞数量并改善抗肿瘤反应。例如，可以同时给予表达IL12的Ad和全身HER-2和PD-L1阻断抗体。在临床前肿瘤模型中，这种结合显示出增强或协同效应。此外，抗CTLA4、病毒治疗、抗PD-(L)1抗体和新兴ICI抗体给药的时间是另一个需要进一步观察的重要领域。为了提高疗效并改善肿瘤反应性，需要系统探索免疫治疗在OVs和CAR-T细胞之前、之后和同时给药的效果。 6.结论及展望  溶瘤病毒在破坏肿瘤细胞方面的优势源于其本身的品质，包括直接细胞溶解、针对免疫系统、调节TME和直接特性，如调节肿瘤细胞中的特定途径、抗血管生成作用和调节肿瘤细胞代谢。基因工程在增强细胞溶解作用和肿瘤细胞攻击的多样性方面提供了巨大的优势。将病毒运送到肿瘤细胞的方法仍然是一个挑战，有多种可能性获得表现出更有效作用的OVs。在过去的几年中，许多研究已经使用非生物或生物纳米载体将OVs运送到肿瘤细胞中，并显示出有希望的结果。OVs作为单一药物疗法或与其他治疗策略结合在临床前和临床研究中都已得到证明。OVs具有抗肿瘤潜力；然而，作为一类新的抗癌治疗，它们的发展仍然存在一些特定的障碍。导致溶瘤病毒治疗失败的障碍包括OVs渗透和扩散不足、宿主抗病毒免疫、患者之间的个体差异、溶瘤病毒与病毒耐药或病毒敏感肿瘤细胞的相互作用，以及作为单一药物使用时的低或中等效力。单一OV给药的效力低是因为宿主免疫系统可能将其从血流中清除，病毒可能只在短时间内表达转基因，或者病毒传播可能受到限制。已经在用oHSV或oAds治疗的小鼠中进行了研究，在这些小鼠中，病毒颗粒被迅速清除。此外，oAds在目标组织中的效力有限且持久性低。为了克服这些限制，溶瘤病毒治疗可以与其他抗癌治疗结合使用，如化疗、放疗、靶向治疗或免疫治疗。治疗效果与宿主的抗病毒反应和OV诱导的抗肿瘤免疫之间的平衡有关；然而，影响这种平衡的生物学机制仍然不清楚。各种类型的肿瘤和癌症的不同阶段在选择OVs、运输方式及其与各种系统治疗的结合方面仍然具有挑战性。