Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

摘要：近几十年来，疫苗一直是预防病原体传播和癌症的非凡资源。即使它们可以由单一抗原形成，但添加一个或多个佐剂是增强免疫信号对抗原反应的关键，从而加速并增加保护效果的持续时间和效力。它们的使用对于脆弱人群，如老年人或免疫功能低下的人尤其重要。尽管佐剂非常重要，但只是在过去的四十年里，对新型佐剂的寻找才有所增加，发现了新的免疫增强剂和免疫调节剂类别。由于涉及免疫信号激活的级联反应的复杂性，它们的作用机制仍然不甚了解，即使得益于重组技术和代谢组学，最近已经取得了显著的发现。本综述着重于研究中的佐剂类别、近期作用机制研究，以及纳米输送系统和可以化学操纵以创造新型小分子佐剂的新型佐剂类别。 1.引言 佐剂——根据该词的拉丁语词源（adjuvare，意为“帮助”）——被定义为添加到疫苗中以增强免疫系统对抗原的反应并延长其持续时间的物质。在疫苗开发中使用佐剂利用了这些物质可以提供的许多好处，例如减少每次接种剂量所需的抗原量和加强接种的频率，或通过延长其半衰期改善抗原成分的稳定性，从而增强其免疫原性。佐剂可以根据其作用机制、化学性质或来源（合成、天然、内源性）进行分类。佐剂超级家族包括许多不同的物质，特别是能够激活或增强免疫信号或传递系统的小分子或大分子。免疫增强剂是能够在成人或脆弱人群中激活免疫信号的化合物；其中包括模式识别受体（PRRs）的激动剂，如RIG-I样受体（RLR）、干扰素基因（STING）、Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRs）。传递系统是能够改善和延长疫苗保护的佐剂，如乳液和纳米制剂，类似于脂质体、病毒样颗粒和病毒体。根据所需的免疫反应类型，抗原应与适当的佐剂或佐剂组合正确配制，以获得尽可能少的副作用的最佳反应。到目前为止，已经开发出适当的配方，特别是通过结合不同的佐剂家族，尤其是铝盐与脂质体或乳液。确定适当的佐剂组合可能极为重要，目前许多临床研究正在进行中，以研究它们在不同病理情况下的疗效，特别是在癌症方面。由于佐剂的应用范围从病原体到过敏、自身免疫性疾病和癌症，需要正确理解关键机制，以便只针对特定途径，避免潜在的毒性。即使疫苗试验遵循严格的指导方针，多年来也出现了许多关于其安全性的担忧，特别是在COVID-19疫苗接种活动期间。疫苗的潜在毒性有时归因于所含佐剂。最近还对最成熟和最安全的佐剂，如铝衍生物的潜在毒性表示担忧。即使铝含量在许可的佐剂中每剂从0.8到0.125毫克不等，但近年来出现了关于神经毒性和自闭症的担忧。相比之下，其他研究表明铝的神经毒性是在长期服用后发生的，监管机构将铝在食品中的可容忍周摄入量（TWI）限制在每公斤体重1毫克。有趣的是，有时佐剂由脂质构成，如纳米制剂的脂质体，或其他内源性无风险大分子。EMA和FDA已经批准了47种疫苗，但这些制剂中包含的大多数佐剂是最早的铝佐剂类成员，或脂质体制剂。这种选择可能是由于这些佐剂类的已知耐受性，以及寻找新化合物的相关成本。事实上，近年来发现了不同类别的小分子免疫增强剂；然而，与药物一样，这些化合物需要适当的、耗时的临床前和临床试验来评估它们的疗效和安全性。在最近和最有趣的类别中，报告了几种PRR激动剂，对成人群体具有有希望的结果。最近的研究表明，能够通过线粒体应激途径激活免疫反应的小分子具有通过PRR途径激活免疫反应的效力。本综述着重于作用机制，开发的佐剂类别，特别强调可以针对的新的途径，以创建新的佐剂。 2.佐剂作用机制 尽管佐剂通常用于数十亿剂疫苗的配方中，但其作用机制仍然不甚了解。因此，深入理解作用方式和参与免疫系统对病原体反应的免疫机制是开发新佐剂的关键步骤。最近，人们非常关注更深入地理解疫苗佐剂如何刺激免疫反应。由于最近在免疫学研究方面的进展，已经有可能阐明佐剂作用的一些机制，如储存效应和细胞因子和趋化因子的释放，免疫细胞在注射部位的动员，适应性免疫反应的诱导，增加抗原免疫原性，以及抗原呈递细胞（APCs）的激活。阐明佐剂发挥作用的所有机制将提供关于自适应免疫如何由先天免疫促进的关键信息，并有助于开发新的强效疫苗。可以使用广泛因素对佐剂进行分类，包括它们的物理化学特性、起源和作用模式；最受欢迎的分类方案将疫苗佐剂分为两组，传递系统和免疫刺激剂。另一类佐剂由粘膜佐剂组成，可以作为传递载体或免疫刺激化合物，如壳聚糖及其衍生物（N-三甲基和单-N-羧甲基壳聚糖）、霍乱毒素（CT）和热敏肠毒素（LTK3和LTR72）。表1中报告了新的传递系统佐剂。传统上，传递载体仅作为免疫刺激佐剂的储存库，以激活先天免疫系统的细胞。由于现在有证据表明一些传递机制可以激活先天免疫，这种分类不再准确。事实上，传递载体佐剂既作为抗原载体，又通过激活先天免疫系统引起局部促炎反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这些现象导致先天免疫细胞的激活，导致细胞因子和趋化因子的释放，这是免疫增强剂佐剂利用的相同作用模式。免疫佐剂（表1）是通过直接刺激先天免疫系统来增强抗体产生的免疫增强剂化合物。此外，作为免疫调节剂的佐剂可以刺激特定类型的细胞因子的产生，从而增强免疫系统的反应。例如，铝盐、弗氏佐剂和CpG寡脱氧核苷酸已被报道能够诱导产生和释放一些参与调节先天和适应性免疫的细胞因子，如干扰素（IFNs）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL2和IL12）。已有几种细胞因子被报道作为免疫增强剂佐剂，刺激抗原特异性血清/粘膜抗体和细胞介导的免疫。在这类物质中，最知名的细胞因子佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN、趋化因子和一些白细胞介素（IL-1, IL-2, IL-12-IL-15, IL-18）[15]。此外，免疫刺激剂对于招募免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞（DCs））、激活APCs以及疫苗在注射部位的长期积累非常有用。最近的研究将Toll样受体（TLR）与自身免疫系统联系起来，发现了TLR激活先天免疫系统导致适应性免疫和炎症反应诱导的机制，确保了持久保护。 佐剂可以作为传递系统，捕获、吸附或聚集抗原，并随时间缓慢释放它们。这种被称为"贮存效应"（图1a）的机制发生在注射部位，佐剂通过防止由于肝脏清除导致的抗原移除，增强了疫苗的半衰期，并确保了免疫系统的持续刺激，从而产生高抗体滴度。多年来，许多通过贮存效应发挥作用的佐剂被描述出来，如脂质体、乳液（油包水和水包油）、病毒体，以及脂质或聚合物纳米颗粒（NPs）。其中一些已被开发来模拟病原体膜，以运输、保存和释放抗原，并同时增强其免疫原性功能。几种类型的脂质体，如传统的脂质体、多层囊泡（MLVs）或固体核心脂质体，也通过促进贮存效应发挥作用。油包水乳液，如完全弗氏佐剂（CFA），以及一些NPs也通过确保持久免疫反应的贮存效应发挥作用。 图1. (a) 贮存效应及细胞因子和趋化因子的募集。(b) 免疫细胞的募集和炎症体的激活。 颗粒佐剂可以通过利用几种机制诱导免疫反应，例如上调细胞因子和趋化因子的释放，诱导注射部位的炎症状态，激活炎症级联反应，并招募先天免疫细胞。例如，油包水（o/w）乳液MF59和AS03刺激免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）的募集，这些细胞将抗原和佐剂运输到更接近的淋巴结。免疫细胞在注射部位的募集诱导半胱氨酸蛋白酶的激活，导致进一步释放趋化因子（IL-18、IL-33、IL-1β），吸引其他树突细胞并延长这一现象（图1b）。此外，MF59和AS03在注射部位增加了CCR2、白细胞募集趋化因子（例如CCL2、CCL3和CCL5）以及集落刺激因子3（CSF3）的表达。同样，明矾在注射后诱导局部促炎微环境，引发补体级联反应，导致从血液流中招募免疫细胞。炎症体是先天免疫系统的重要组成部分。它们是针对病原体的有效免疫反应所必需的。当炎症体被激活时，细胞分泌促炎细胞因子，如IL-18、IL-33和IL-1β，这些细胞因子增强适应性免疫反应（图1b）。炎症体是由工作成分组成的细胞质蛋白信号通路，如富含亮氨酸的重复（LRR）C末端或DNA结合域（HIN200）、caspase-1效应物和适配蛋白ASC，这些蛋白激活炎症caspases。粒细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、肝细胞、神经元、小胶质细胞和朗格汉斯细胞都表达炎症体，负责识别病原体并启动先天免疫反应。当炎症体被激活时，它蛋白水解裂解前caspase 1，释放活性形式，将前IL-1β和前IL-18转化为活性物种。ILs从细胞释放后，启动炎症并诱导保护免受病原体侵害的免疫反应。此外，IL-18激活淋巴细胞并刺激T细胞和B细胞的增殖，自然杀伤细胞（NKs）的活性，以及IFN-γ、TNF、IL-1和IL-2的分泌。因此，作为炎症体激活剂的佐剂是增强和维持免疫反应强度的成功策略。这些佐剂通过类似的机制激活炎症体，包括溶酶体降解、cathepsin释放和活性氧（ROS）的形成。在炎症体激活剂中，可以找到如铝盐、壳聚糖、皂素、鞭毛蛋白和合成阳离子聚合物等佐剂。铝盐诱导溶酶体损伤，诱导参与炎症体形成的cathepsin B的产生，特别是NOD样受体蛋白3（NLRP3）；活性炎症体触发caspase-1并刺激细胞因子的释放。壳聚糖和由合成阳离子聚合物制成的纳米颗粒激活NLRP3炎症体，并增强多种白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF）、IFN和IgG滴度的分泌，增强细胞和体液免疫反应。 佐剂可以通过一系列机制增强疫苗的免疫反应，如贮存效应和刺激先天免疫。先天免疫代表了针对病原体的第一道防线。事实上，早期识别病原体是发展适应性免疫反应的关键步骤。佐剂可以通过激活细胞模式识别受体（PRRs），识别PAMPs和损伤相关分子模式（DAMPs），刺激抗原呈递细胞（APCs）。由于在先天免疫系统中的中心作用，PRRs代表了新佐剂的战略目标。在PRRs超家族中，区分为表面和内体受体的Toll样受体（TLRs）是很有前途的佐剂目标，因为它们可以诱导信号通路，从而诱导关键转录因子的产生，如核因子-B（NF-B）。佐剂也可以用于靶向内体PRRs，如寡聚化结构域样受体（NLRs）和视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）（图2a）。定位与它们的性质密切相关；事实上，血浆TLR识别病原体蛋白和脂质，而内体受体则由核酸激活。TLR通过MyD88途径诱导NF-kB，导致促炎细胞因子的释放。基于TLR的佐剂复制了感染期间产生的PAMPs，因此可以非常有效地对抗通常诱导PRRs的病原体或疾病。尽管PRR激动剂具有出色的免疫刺激性效果，但它们作为疫苗佐剂的使用受到高制造成本的限制，这代表了未来临床应用的限制。APCs，如树突细胞（DCs），表达各种PRRs，使它们能够识别多种病原体成分。当PRRs被PAMPs激活时，它们启动复杂的信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，包括干扰素（IFNs），增强抗原呈递能力，以及DCs向淋巴组织的迁移，在那里它们与T细胞和B淋巴细胞相互作用，启动和塑造适应性免疫反应。成熟的DCs也可以刺激naive CD4+ T细胞分化为不同的T辅助（Th）亚群（例如，Th1和Th2细胞），帮助B细胞产生抗体。几种细胞因子调节Th细胞分化；例如，如IL-12、IL-15和IL-27等细胞因子调节naive CD4+ T淋巴细胞向Th1细胞的发展。总之，Th1细胞主要响应于细胞内病原体，如病毒和一些细菌，而Th2细胞主要响应于大型细胞外寄生虫。DCs还能够刺激naive细胞毒性CD8+ T细胞成为活化的CD8+ T细胞。这种现象称为“交叉呈递”，对于诱导针对外源性抗原的强大和持久的细胞免疫，以及有效预防病毒疾病和癌症是必要的。目前尚不清楚外源性抗原是如何在DCs中处理并呈现给MHCI上的CD8+ T淋巴细胞的；然而，已经提出了两种不同的机制。在细胞质途径中，抗原通过内体囊泡进入细胞质，并被蛋白酶体降解。在囊泡途径中，抗原在溶酶体隔室中被降解，独立于蛋白酶体活性。铝、皂素和TLR佐剂可以利用这种机制。 图2. (a) 表面和内体 TLR 激活。(b) 增强抗原呈递。由主要组织相容性复合物（MHC）在抗原呈递细胞（APCs）上呈递的抗原，是激活适应性免疫的关键步骤。许多佐剂，如明矾、乳液和纳米颗粒（NPs），被认为通过"靶向"抗原到APCs，增强MHC的抗原呈递功能。迄今为止，尚不清楚佐剂增加抗原呈递的机制是否有助于适应性免疫系统的发展。例如，明矾已被证明可以增强树突细胞对抗原的摄取，以及延长抗原呈递的持续时间。抗原大小似乎在调节抗原呈递效率方面很重要。在早期内体/吞噬体中发现了大的脂质囊泡，它们增加了抗原呈递，而在晚期溶酶体中发现了较小的囊泡，它们减少了抗原呈递。 3.佐剂类型  3.1.铝盐  基于铝的佐剂（ABA）最早发现于1926年，目前是全球疫苗中最常用的佐剂。最初使用的铝佐剂是硫酸铝钾，通常称为"明矾"，通过将抗原溶液和佐剂与碱直接沉淀制备而成（明矾沉淀疫苗）。今天，抗原被吸附到预先形成的铝盐凝胶上（直接吸附），在商业制剂的标准化和可重复性方面提供了更多的优势。目前，传统使用的明矾几乎完全被类氢氧化铝（Alhydrogel?，Croda，丹麦Frederikssund）和非晶磷酸铝（AdjuPhos?，Croda，丹麦Frederikssund）所取代。两种新型佐剂是硫酸铝羟磷酸盐（AAHS），目前用于某些人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的配方和Imject? Alum（Pierce，Rockford，美国），由非晶碳酸铝和结晶氧化镁组成。在人类疫苗接种中，ABA主要用于针对破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲型和乙型肝炎以及人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗。FDA批准的含有ABA的人类疫苗列表见表2。ABA也在兽医疫苗中广泛应用，用于预防细菌、病毒和寄生虫感染。 尽管使用历史悠久，但关于ABA（铝盐佐剂）免疫刺激特性背后的机制仍需进一步阐明。最初，ABA的佐剂特性首先归因于"贮存效应"。根据这一假设，抗原颗粒从不溶性盐颗粒中缓慢释放到体内，随着时间的推移，允许抗原对免疫系统的长期暴露和强化的免疫刺激，从而产生更高的抗体滴度。然而，最近的发现挑战了这一理论，证明抗原在接种部位的保留并不是免疫反应所必需的，而是接种部位炎症的程度才是佐剂效应的解释。因此，除了作为缓释系统外，ABA对免疫刺激还有其他主要影响，如先天免疫细胞的募集和激活、炎症介质的释放以及通过诱导Th2细胞激活适应性免疫。 给药后，先天炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞（DC）和单核细胞，被招募到注射部位。尽管许多免疫佐剂的活性基于Toll样受体（TLR）信号，但铝盐显然不引起基于TLR的反应。与在细胞损伤后释放到细胞质中的不溶性单体尿酸钠（MSU）晶体的尿酸类似，已经显示ABA的颗粒性质促进了巨噬细胞的吞噬作用和APCs中抗原的摄取。此外，ABA的细胞毒性诱导了热休克蛋白（如hsp70）和其他DAMPs（如MSU形式的尿酸）的分泌。NLR家族含吡啉结构域3（NLRP3）是核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLR）的成员，是一种细胞质模式识别受体（PRR），在调节先天免疫信号中起着至关重要的作用。NLRP3通过钾离子外流激活，作为膜完整性的感应器。当被ATP、石棉、硅石、铝佐剂或MSU等刺激触发时，NLRP3与适配蛋白凋亡相关斑点蛋白含有CARD（ASC）和非活性前caspase-1结合形成NLRP3炎症体多聚体复合物。前caspase-1的自蛋白解剪切为活性caspase-1，将促炎细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33裂解为它们的活性和分泌形式。有假设认为，铝盐可能通过直接方式激活NLRP3炎症体，通过吞噬溶酶体损伤和随后的cathepsin B释放，或者通过MSU的间接释放。除了NLRP3介导的炎症外，哨兵细胞极化为活跃的巨噬细胞和APCs，增加了吞噬体活性氧物种（ROS）的产生，吞噬体酸化干扰和通过低氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）的细胞代谢重编程，是最近揭示的对ABA免疫刺激特性有贡献的其他机制（图3）。 图 3. 基于铝的佐剂（ABA）的效果。 哨兵细胞激活为抗原呈递细胞（APCs）对适应性反应至关重要，从而将先天免疫与适应性免疫联系起来。ABA通过主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子增加活化树突细胞上的抗原呈递。MHCII抗原呈递位点激活CD4+ T细胞，这些细胞分化并激活B细胞，进而主要产生IgG，推动体液免疫。铝盐优先增强抗体介导的免疫反应，通过TFH细胞和IL-4信号，结果产生IgG1并诱导Th2细胞分化，这些细胞通过IgE推动嗜酸性粒细胞炎症反应。与强烈的Th2反应相比，明矾对需要Th1细胞介导保护的感染效果较差。在小鼠研究中，已证明明矾间接抑制Th1反应，原因是IL-4激活。通过Th1反应产生的淋巴因子是补体固定IgG2a抗体的基本诱导因子，因此是巨噬细胞的刺激因子。此外，先天免疫系统的细胞可以发展适应性特性（“训练免疫”），并且铝佐剂可能涉及训练免疫的诱导。然而，NLRP3炎症体和caspase-1在抗体反应诱导中的作用仍然存在争议。经过近一个世纪的使用，铝盐仍然是疫苗佐剂的里程碑，因为它们具有确立的安全性和有效性记录。ABA非常耐受，并且仅报告了一些轻微的局部反应，如注射部位疼痛、肿胀、红斑，以及罕见的肉芽肿和过敏反应，这些反映了它们通过炎症体激活、促炎介质、吞噬细胞积累和抗体产生的作用模式。在一些免疫接种对象中还描述了接触性皮炎的罕见病例，注射后头痛、关节痛和肌痛以及持续性肿胀。有关铝佐剂长期毒性的辩论引起了广泛关注，包括如阿尔茨海默病（AD）、慢性自身免疫和多发性硬化症等影响。由佐剂引起的自身免疫综合征（ASIA）指的是一组不良效应，包括海湾战争综合征、巨噬细胞性肌筋膜炎、硅肺症和与佐剂暴露相关的接种后现象。此外，由于铝离子在AD的发病机制中被牵连，人们对ABA的生物持久性和潜在神经毒性提出了担忧，但这种相关性从未被证明。尽管需要进一步的知识来更新和确认ABA的安全概况，但作为佐剂的铝盐的风险-效益概况仍然极其积极，并确认它们作为疫苗佐剂的黄金标准。 3.2.STING激动剂佐剂 环状GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）途径是先天免疫系统胞质模式识别受体（PRRs）网络的一部分，监测细胞质以感知危险刺激。途径的刺激激活下游的核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3），增加I型干扰素（IFN-1）和其他促炎细胞因子的转录，从而增强抗原呈递和免疫反应。cGAS/STING在免疫调节中的关键作用使其成为免疫疗法的重要靶点，特别是与癌症相关的，并且是使用STING激动剂作为有前途的疫苗佐剂的理由。STING激动剂（图4）主要在肿瘤学和病毒学中应用，包括环状二核苷酸（CDNs）、非核苷小分子（NCDNs）、胞质双链DNA（dsDNA）、锰离子、可电离脂质和聚合物。如20,3-环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）、环状二聚鸟苷酸（c-di-GMP）或环状二聚腺苷酸（c-di-AMP）等环状二核苷酸是途径的天然激动剂，但它们由于高极性和由于外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP1）酶降解导致的短半衰期，其药代动力学（PK）特性较差，大大限制了它们的使用。为了改善环状二核苷酸的PK特性，已经测试了如ADU-S100的磷酸衍生物，ENPP1抑制剂也是一个有前途的新策略。为了选择活性更好的候选物，寻找模仿CDNs和STING结合构象的刚性类似物的研究导致了一类新的激动剂，即大环桥接刺激剂（MBS），如E7766。为了克服环状二核苷酸的PK限制，研究还集中在NCDNs上，如黄酮类5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）和α-芒果苷，以及二聚酰胺苯并咪唑（diABZI）衍生物，这些在肿瘤免疫疗法和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）方面取得了有希望的结果。 图 4. 小分子STING激动剂的二维结构 作为触发STING途径的一种方式，诱导细胞质双链DNA (dsDNA) 释放的策略也被采用，例如使用放疗、基于明矾的佐剂，以及化疗药物，如顺铂或多柔比星。无机锰被发现能激活cGAS，并通过增强第二信使cGAMP的产生，充当STING的间接激动剂。在其他激动剂类别中，我们列举了聚合物，如壳聚糖或PC7A，以及基于纳米粒子的可电离脂质。目前在临床试验中的STING激动剂总结在表3中。 cGAS/STING信号的触发因素是细胞质dsDNA，这是细胞损伤的重要标志。因此，cGAS作为直接的DNA受体，催化dsDNA转化为第二信使cGAMP，这诱导了STING的激活和寡聚化。STING寡聚体激活TANK结合激酶1 (TBK1)，它招募IRF3并通过NF-κB诱导I型干扰素刺激基因的转录。下游自噬的诱导和NLRP3炎症体的激活增加了病原体清除，并在自身免疫和炎症性疾病、衰老以及与肿瘤相关的炎症中具有重要意义。STING激动剂通常与环状二核苷酸有关，如cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们作为各种微生物的代谢产物被发现。 STING途径的激动剂能直接诱导树突细胞的成熟和MHCII分子的上调，增加抗原呈递、T细胞的启动，并通过炎症细胞因子间接促进前述效应。STING激动剂还增强适应性免疫反应，通过IgG1和IgG2的产生、脾脏生发中心的诱导以及记忆B细胞的刺激来增强体液免疫。此外，I型干扰素诱导CD4 T细胞分化为Th1和TFH细胞，显著帮助B细胞的启动，也促进CD8 T细胞的激活和增殖，这对抗击耐药肿瘤细胞很重要。通过STING刺激协调的多种免疫反应使得这一途径成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。尽管cGAS/STING的急性激活无疑对病原体和癌细胞有益处，但慢性激活可能导致由IFN驱动的系统性炎症，引发细胞因子风暴（细胞因子释放综合征），类似于败血症。除了可能诱发系统性炎症反应外，STING过度刺激引起的其他主要问题包括缺乏细胞和组织特异性以及淋巴细胞毒性。这些前提，加上具有挑战性的药代动力学特性，使得STING激动剂的全身给药情况复杂化，它们通常在肿瘤内给药。使用药物载体技术，如纳米粒子、基于脂质的载体和抗体至关重要，以实现更选择性的靶向，结合改善的传递和功效。尽管它们的药代动力学具有挑战性，且全身使用的疗效指数较窄，STING激动剂代表了一个非常有前途的佐剂类别，需要优化它们的制剂以进一步提高其佐剂性。 3.3.TLR配体 3.3.1.Toll样受体 市场上的大多数疫苗主要由单一佐剂组成，但通常保护性免疫反应并未达到有效使用疫苗的标准。因此，显著的Toll样受体（TLR）是先天免疫的关键组成部分，提供防御性炎症反应以抵御入侵的病原体。人类TLR包括10个成员（TLR1-10），可以跨越细胞表面（TLR1、2、4、5、6、10）或定位在内质网膜（TLR3、7、8、9）上，并参与不同PAMPs（表4）的识别。PAMPs的结合诱导TLR同二聚体（TLR3、4、5、7、8、9）或异二聚体（TLR1/2或TLR2/6）的形成，将两个toll/IL-1受体（TIR）结构域聚集在一起，允许适配蛋白MyD88（髓样分化初级反应-88）与复合物结合。TLR3是唯一结合不同适配蛋白的受体，即含有TIR结构域的适配蛋白-诱导干扰素-β（TRIF）蛋白。与其他TLR不同，TLR4信号可以通过涉及MyD88信号适配蛋白或TRIF的两条独立途径进行。一旦激活，TLR将增加免疫细胞的迁移并引发适应性免疫反应。 由于TLRs作为免疫增强剂，它们的激动剂可以用作疫苗佐剂。疫苗产生的免疫反应类型取决于由特定TLR及其适配蛋白激活的信号通路。虽然大多数TLR途径导致Th1免疫反应，TLR2诱导Th0、Th1或Th2反应，TLR3激活NF-κB途径。表1总结了疫苗配方中使用的几种TLR激动剂，TLR激动剂的结构报告在图5中，临床试验中的TLR激动剂在表5中。 3.3.2.TLR2激动剂 TLR2可以识别许多PAMPs，因为它们可以与TLR1和TLR6形成异二聚体。L-pampo是由PAM3CSK4（PAM3）、TLR1/2、聚(I:C)和TLR3构成的复杂系统，是一种有效的佐剂。它在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗中使用，诱导细胞介导的免疫反应，增加CD4+ T细胞水平。目前，它正在作为使用RBD（受体结合域）、S1抗原和RBD-Fc作为病毒抗原的SARS-CoV-2疫苗的佐剂进行研究，已被证明能引发强烈的体液和细胞免疫反应。 TLR2识别细菌脂蛋白，因此，由细菌LPS衍生的合成脂肽作为疫苗佐剂被开发出来。MALP2（巨噬细胞激活脂肽2，图5）来源于支原体发酵，利用TLR2-MyD88信号通路激活免疫细胞。PAM2CSK4和PAM3CSK4是两种作为疫苗佐剂评估的TLR2激动剂，用于对抗利什曼病、疟疾和流感。由于它们的尺寸、化学复杂性和疏水性，TLR2激动剂通常不用于疫苗开发，即使在固相自动肽合成研究可以帮助发现新的更简单的衍生物。 图5.小分子Toll样受体激动剂的2D结构。TLR2激动剂（紫罗兰色上部） 面板）、TLR4 激动剂（青色，中间面板）、TLR 7/8 激动剂（绿色，下面板）。 3.3.3.TLR3激动剂 TLR3是内体受体，能够检测病毒dsRNA。聚(I:C)是一种结构类似于病毒RNA的佐剂。它能够诱导IFN-I和IFN-III的产生，并刺激Th1细胞因子反应。MVS途径（RIG-1和/或MDA5）的激活会导致人类毒性，因此开发了新的聚(I:C)衍生物，聚(ICLC)和聚(IC12U)。 聚(ICLC)是一种聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，能刺激干扰素的产生。它诱导炎症体和补体系统的表达，并在针对恶性疟原虫、HIV和癌症的疫苗候选中使用，显示出引发Th1反应的强能力。由于这种佐剂的高度免疫刺激性和对血清核酸酶的高抗性，设计了聚(IC12U)。这种新物质显示了尿嘧啶和鸟嘌呤残基的错配，导致毒性较低（不与MDA5结合），以及IFN-I的产生减少。 3.3.4. TLR4激动剂 TLR4通过MD-2（髓样分化因子-2）和CD14识别细菌脂多糖。LPS的免疫刺激性活性是由于脂质A区域，并且脂肪酸链的变化反映了不同的生物活性。Eritoran是一种TLR4-MD2激动剂。它是一种由脂质A衍生的合成物，其特点是含有四个脂质链，其中一个含有顺式双键。3-O-去酰基-40'-单磷酸脂质A（MPLA，图5）和葡萄糖基脂质A（GLA）表现出低致热性和强免疫增强特性。LeIF（利什曼原虫真核起始因子）和neoseptins（合成肽模拟化合物，图5）是两种非糖脂配体，它们不像LPS，但能够像天然配体一样激活TLR4。在THP-1细胞中筛选激活NF-κB途径的小分子化合物，发现了一种属于吡啶并吲哚类的特定TLR4激动剂（1Z105，图5）。1Z105被确定为安全的TLR4激动剂，其他研究目前正在进行中。TLR4可以激活一个强大的TRIF介导的细胞反应，其特征是多能CD8+/CD4+ T细胞的存在和对癌症和传染病的CTL活性增强。 3.3.5.TLR5激动剂 TLR5由多种免疫细胞表达，参与细菌鞭毛蛋白的识别。配体与TLR5的结合诱导炎症途径的激活，释放包括TNFα、IL-1β、IL-6和一氧化氮在内的炎症介质，引发Th1和Th2反应。当与抗原一起给予时，鞭毛蛋白诱导粘膜免疫反应，这对于保护免受呼吸和胃肠道感染至关重要。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白已与PR8流感病毒（IPR8）、HA（H5N1）或禽流感病毒（AIV）H5N1抗原配方，证明它能引发强烈的免疫反应，包括IgA的产生。对鞭毛蛋白的修改导致了嵌合鞭毛蛋白或活细菌中的鞭毛蛋白抗原复合物，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠毒素大肠杆菌（ETEC）等，并在动物模型中使用。三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗正在进行临床试验阶段，其中两种针对流感病毒，一种针对鼠疫耶尔森菌。 3.3.6.TLR7/8激动剂 TLR7/8能够诱导Th1免疫反应，并产生高水平的I型干扰素、IL-12、TNF-α和IL-1β。TLR7/8和TLR9激动剂能够激活并促进cDCs（常规树突细胞）和浆细胞样树突细胞（pDCs）的克隆扩展，动员CD14+ CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。Imiquimod（R837，图5）目前已获批准并用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和日光角化病。另一种异喹啉衍生物resiquimod（R848）具有抗病毒和抗癌治疗用途，正在评估用于黑色素瘤治疗。已经开发了不同的结构相关的oxoadenine化合物，尽管需要其他临床前研究来证明它们的疗效。CL075是一种结构相关的杂环化合物，具有融合的喹啉-噻唑环。 3.3.7.TLR9激动剂 TLR9识别细菌DNA基序胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸，通过MyD88途径激活免疫系统。CpG是已被修改以防止蛋白酶降解并用作佐剂的分子基序。CpG-CDNs能在自然杀伤细胞、B细胞和pCCS中引起强烈的趋化因子、细胞因子和抗体产生，并引发强烈的Th1型免疫反应。CpG1018是一种能够引发Th1型免疫反应的寡核苷酸。CpG1018是过去20年中批准的四种新型佐剂之一。即使它的使用最初在Hepliisav-B疫苗中受到限制，但目前正在评估用于对抗黑色素瘤和SARS-CoV-2的疫苗。MGN1703属于TLR9激动剂，是一种包含CG基序并呈现线性结构的小DNA分子。它由中间的双链DNA部分构成，两侧是单链结构。它作为疫苗的佐剂在癌症疫苗中进行了测试，在那里它激活了先天和适应性免疫反应，仅有轻微或暂时的副作用。它目前正在作为免疫调节剂单独或联合用于治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌的I/II期研究中进行评估。 3.4.CLR配体 C型凝集素受体（CLRs）是病原体和受损组织来源脂质的免疫传感器，参与激活先天和获得性免疫。免疫反应可以通过CLRs细胞信号通路和其他PRRs（如TLR）的串扰来引发，导致不同信号通路的激活和特定细胞因子的表达。CLR触发的佐剂包括Curdlan、PGA-45、海藻糖二硬脂酸酯（TDB）和海藻糖二肉豆蔻酸酯（TDM），它们诱导强烈的Th17和Th1反应。 Curdlan在铜绿假单胞菌疫苗中使用，并诱导高水平的IL-17A和CD44+ CD62L-CD69+ CD4+ TRM细胞产生。Curdlan还能够激活树突细胞（DCs）并增强基于DC的抗肿瘤免疫，因此正在评估用于抗肿瘤免疫疗法。由于Curdlan的高度疏水性，开发了部分氧化的Curdlan衍生物β-1,3-聚葡萄糖醛酸，PGA-45聚合物，它能够刺激IKK-β的磷酸化并降低磷酸化Akt的表达，表明PGA-45可以激活多种细胞表面受体，包括TLR4和dectin-1。 海藻糖-6,60-二肉豆蔻酸酯（TDM）及其合成类似物海藻糖-6,60-二硬脂酸酯（TDB），能够通过与C型凝集素受体Mincle结合来激活巨噬细胞和树突细胞。TDB在结核病亚单位疫苗的临床研究中。TDB还可以独立于Mincle发挥作用，通过PLC-γ1/钙/CaMKKβ/AMPK途径诱导小胶质细胞极化为M2表型，使这种佐剂成为治疗神经炎症性疾病的治疗剂。 3.5.RLR配体 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是病毒感染的传感器，诱导产生I型和III型干扰素和炎症细胞因子，激活参与先天和获得性免疫反应的信号通路。RLRs可以检测病毒和宿主RNA，导致抗病毒反应，但如果RLR途径被无控制地激活，也会导致免疫病理。聚(I:C)激活RLRs途径，因为它模仿细胞中的病毒入侵，导致MAVS-IRF3/7级联的激活和IFN-β和ISGs的产生。IFN-β的表达取决于聚(I:C)的长度；短序列在髓样细胞中诱导IFN-β表达，而长序列在成纤维细胞中诱导IFN-β表达。这意味着使用特定激动剂刺激RLR途径将导致细胞特异性IFN-β表达的诱导，特别是在成纤维细胞中，与单核细胞和巨噬细胞相比，可以赋予更强的抗病毒状态。 4.辅助佐剂和佐剂配方  市场上的大多数疫苗只包含一种佐剂，然而，保护性免疫反应通常不足以实现疫苗的有效性。为了增强疫苗的效果，开发了许多佐剂配方。佐剂和抗原可以一起传递，使用两种流行的方法之一，共价偶联或将抗原和佐剂包装在传递机制中。适当的佐剂组合选择可以导致对疫苗免疫反应的补充或协同改善。例如，AS04中的明矾和MPL的联合使用在乙型肝炎病毒（HBV）和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗中显示出比仅使用明矾盐的相同疫苗更好的免疫反应。 4.1.脂质体 脂质体是球形颗粒，可以包裹抗原和免疫刺激性分子，保护它们免受降解并将其传递给APCs。脂质体由可生物降解、生物相容、无毒的磷脂组成，允许灵活的结构修改，以实现可调节的特性，如大小、表面电荷、膜柔韧性和药物装载模式。作为疫苗佐剂传递系统（VADS）的脂质体使用带来了许多优点，如高安全性和强烈的免疫反应。市场上的脂质体配方包括Epaxal和inflixal，分别用于对抗甲型肝炎和季节性流感病毒。另一种基于脂质体的疫苗是GSK（GlaxoSmithKline）开发的Shingrix，已获得FDA批准，用于带状疱疹病毒的老年人预防。 4.2.乳液 作为疫苗佐剂开发的乳液可以分为两种主要形式，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。这两种佐剂都是油包水乳液，具有运输抗原和激活先天免疫系统的能力。CFA由矿物油、乳化剂和热杀死的结核分枝杆菌组成，促进免疫反应的刺激。然而，CFA可能会引起强烈、持久的局部炎症，并有在注射部位形成溃疡的潜力。IFA与CFA的成分相同，但不含有杀死的细菌M. tuberculosis。这种佐剂可以产生比没有它的相同疫苗更强大和持久的抗体反应。然而，IFA在疫苗配方中的使用受到其强烈副作用和毒性的限制，这是由高水平的非生物降解油和质量差引起的。 4.2.1.Montanide Montanide 是一个包括油包水和水包油乳液在内的大型家族，它已被用于兽医和人类疫苗中。MontanideTM 的生物可降解性质减少了与 IFA 类似物理结构的许多细胞毒性特征。在注射部位形成储存库，有助于抗原的逐渐释放，这是这种基于油的佐剂的作用机制的一部分。产生集中并防止恶化的抗原，并促进吞噬作用 。Montanide ISA 51 和 ISA 720 已在涉及癌症、艾滋病、疟疾或自身免疫疾病的疫苗的多项临床试验中使用。Montanide ISA 201 和 ISA 206 则被用于口蹄疫疫苗。 4.2.2.MF59 MF59 是一种水-油乳液佐剂，由角鲨烯组成，角鲨烯是一种生物可降解且与人体兼容的油，是人体的正常成分，在 pH 6.5 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中通过表面活性剂 Tween 80 和 Span 85 稳定，平均粒径小于 200 纳米。它首次在 1997 年在欧洲被批准用于人类疫苗（Fluad），现在已在超过 30 个国家的超过 1 亿人中使用。其作用机制类似于明矾盐，具有在注射部位的储存活性，刺激局部先天免疫反应。肌肉中 MF59 的给药激活了强大的细胞和体液免疫反应，释放 ATP 并上调细胞因子和趋化因子，这反过来促进了白细胞的募集、抗原摄取和迁移到淋巴结以激活 B 细胞和 T 细胞，结果比明矾盐更有效。MF59 具有可接受的安全性和良好的耐受性，自 1997 年以来已施用了数百万剂。 4.3.AS0佐剂系统 AS0 佐剂系统基于经典佐剂分子的组合，如明矾、乳液和脂质体。它们由葛兰素史克公司开发，以实现最大的佐剂效果和可接受的耐受性，结合免疫刺激分子，如 TLR 配体等。这些经典佐剂和免疫刺激剂的各种组合旨在针对目标人群（包括儿童、老年人和免疫功能低下的个体）的病原体个性化适应性免疫反应。 4.3.1.AS04 AS04 由 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL）组成，这是从革兰氏阴性细菌 Salmonella minnesota 分离出的脂多糖（LPS）的去毒形式，吸附在明矾盐上 。MPL 在保持较低毒性的同时，通过 TLR4 激活保留了 LPS 的免疫刺激性，当吸附在明矾上时。TLR4 在先天细胞上的信号传导介导了 AS04 的佐剂作用，与明矾的内在免疫调节特性相结合。我们可以在乙型肝炎病毒（HBV）Fendrix  和人乳头瘤病毒（HPV）Cervarix  疫苗中找到 AS04，与仅用明矾盐佐剂的相同疫苗相比，显示出更好的免疫反应。 4.3.2.AS03 AS03 是一种角鲨烯油包水乳液佐剂，与 MF59 类似，结合了表面活性剂聚山梨醇酯 80 和 α-生育酚（维生素 E），结果具有较低的反应原性并具有更好的安全性。2009 年，欧洲委员会批准了 AS03 佐剂疫苗 Pandemrix 的商业化，2013 年食品药品监督管理局授权了 AS03 佐剂流感 A（H5N1）单价疫苗 。它也用于 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗（CoV2 preS dTM）。α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性与 MF59 相比，促进了免疫增强反应，调节了某些细胞因子和趋化因子的表达，如 CCL2、CCL3、IL-6 和 GM-CSF。此外，AS03 通过刺激 NF-κB 激活免疫系统，这导致肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的释放，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03 可以促进 CD4+ T 细胞特异性免疫反应，这可能导致持久的中和抗体产生和更高水平的记忆 B 细胞 。为了增加其免疫原性，使用两种强效免疫刺激剂，QS-21（来自 Quillaja saponaria 的皂苷）和 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL），产生了 AS02。 4.3.3.AS01 AS01 佐剂是两种强效免疫刺激组分的组合，TLR4 配体也在 AS04 中使用（MPL）和分离纯化的皂苷部分（QS-21），在脂质体中配制。它用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Masquirix 。临床前研究表明，QS-21 作为佐剂增强了抗体以及细胞介导的免疫反应 ，但作为疫苗中的单一组分佐剂，它的耐受性较差。在 AS01 中，脂质体中的胆固醇允许它结合 QS-21 并抑制其反应原性。MPL 通过 TLR4 激活先天免疫系统，而 QS-21 激活引流淋巴结中副皮质窦巨噬细胞（SSMs）中的 caspase 1。两种已建立的佐剂分子的结合引发了先天免疫的协同激活，结果大于独立组分的总和，激活了不是由任一组分单独触发的新途径，增加了表达 IL-2、IFNγ 和 TNF 的多能 CD4+ T 细胞。AS01 作为佐剂在带状疱疹疫苗中的使用已获批准，该疫苗用于老年人，具有高疗效，并在非洲有限的运动中实施的疟疾疫苗。 4.4.免疫刺激复合物 免疫刺激复合物是另一种具有强大佐剂活性的疫苗传递载体。它们是球形的，笼子状的自组装颗粒，大小约为 40 毫米。ISCOMs 由 Quillaja 皂苷、胆固醇、磷脂和抗原组成。没有抗原的颗粒被称为 ISCOM 基质。ISCOM 抗原可以是原生病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或通过极性相互作用含有疏水域的肽 。ISCOMATRIX® 是使用与 ISCOMs 相同的材料开发出来的，但没有抗原，可以在疫苗配方中添加，使得使用更加多样化，并消除了疏水抗原的限制。树突状细胞（DCs）和 ISCOM 相互作用可以改善结合抗原的交叉呈递 。因此，有效地诱导了 CD4+ 和 CD8+ 抗原特异性 T 细胞反应。诱导细胞毒性 T 细胞、平衡的 Th1/Th2 反应和持久的抗体反应都是 ISCOM 疫苗的记录效果 。其他 ISCOM/ISCOMATRIX 疫苗已针对 HIV、HPV 和癌症利用抗原 NY-ESO-1 进行了临床试验。在所有情况下，研究都显示出良好的安全性和耐受性，以及诱导体液和细胞免疫反应。尽管具有这些特点，但由于一些皂苷在高浓度下具有毒性，因此对人类疫苗中使用 ISCOMs 的安全性问题已经阻止了其使用 。 4.5.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是与病毒大小相似的二十面体纳米颗粒（范围在20至800纳米之间），它们具有自我组装衣壳蛋白的能力。它们是非感染性颗粒，因为它们没有遗传物质。VLPs由具有重复表位的外部病毒壳组成，这些表位被免疫系统识别为非自身，并产生快速且持久的免疫反应，即使没有佐剂。它们可以通过使用不同的技术和细胞系统，如大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞或无细胞系统，由各种病毒类型生产。 历史上的VLPs制造方法包括一个称为“先组装后纯化”的多步骤方法。第一步包括衣壳蛋白在表达细胞载体内的自发组装。第二步则提供新形成颗粒的纯化。有时需要将VLPs拆解后再重新组装，以获得纯化的颗粒并提高质量。另一种VLPs的制造方法提供了使用无细胞体外组装，颠覆了传统的自我组装方法。特别是，体外系统被用作一个平台，在衣壳蛋白表达和纯化后诱导其自发组装，无需拆解新形成的VLPs。在市场上，两种重要的佐剂疫苗使用这种类型的纳米颗粒，即乙型肝炎（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。当前的乙型肝炎疫苗是一种利用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA疫苗，包括用于预防乙型肝炎感染的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。这种疫苗已被证明至少可以提供10年的免疫力。 在HPV疫苗中，非包膜HPV病毒颗粒包含双链DNA（dsDNA）。L1和L2蛋白组成衣壳的主要和次要结构蛋白，具有二十面体对称性。酿酒酵母是目前用于表达L1蛋白的载体。VLPs和佐剂（AlP）的结合导致强烈的免疫反应和90%的宫颈癌保护。 4.6.病毒体 病毒体是一种药物传递系统，由病毒包膜和病毒或其他病原体的成分组成。它们由重组流感病毒包膜形成，包含血凝素（HA）、神经酰胺酶（NA）和磷脂，并且像VLPs一样缺乏病毒遗传物质。第一个基于病毒体的疫苗是在1975年开发的，这允许研究这种类型疫苗的有效性。自那以后，有两种疫苗已经上市，用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。 病毒体结构中HA的存在允许保持受体结合能力，增加免疫原性和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，病毒体在结合后不能在细胞中诱导感染。病毒体可以将抗原输送到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞反应，使它们成为完美的传递系统。然而，由于佐剂质量较差，病毒体在激活APCs和鼓励交叉呈递方面效果不佳。使用更强的佐剂可以克服这种固有限制。最近开发了一种基于病毒体的创新流感疫苗，结合了TLR4配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA。病毒体可以诱导强烈的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂相当。由于其极高的耐受性和安全性，这种传递系统已获得FDA批准用于人类。除了针对流感和甲型肝炎的两种基于病毒体的疫苗外，还有几种疫苗正在进行临床试验，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。 5.佐剂设计和开发的新见解 如前所述，在过去20年中，发现了新的免疫激活佐剂类别，能够增强免疫功能低下和老年人等脆弱人群的免疫反应。有几种佐剂类别可用，每种都有其自身的优势和劣势。油包水乳液等传递系统是有效且安全的系统，尽管有可能产生局部或系统性不良效应。最近的研究表明，PRR信号在几个人群中可以改变，降低了疫苗配方的保护效果。例如，防止胎儿排斥的免疫机制以及老年人中TLR途径的失调或遗传多态性的存在。出于所有这些原因，选择适当的佐剂配方对于提高效果而不降低风险-效益比至关重要。从化学角度来看，蛋白质数据银行存储库上有几种与特定配体共晶的蛋白质晶体结构，有助于通过计算机辅助药物设计寻找新化合物。报道的STING和TLR小分子激动剂的大多数结构是杂环化合物，模仿核苷酸。即使在这种情况下，也已经开发了许多具有不同应用的结构相关化合物，包括在癌症疾病中广泛应用的激酶抑制剂和作用机制不太明确的配体或人类辅因子的配体。另一个需要考虑的方面是存在用于合成肽的高通量全自动仪器。最近已经做出了努力来合成复杂的高分子量肽和糖蛋白。此外，已经开发了使用天然成分的新型复杂纳米配方，如来自昆虫的功能化聚合物。所有这些方面都非常有前景，并为佐剂发现的发展开辟了新的场景。 6.结论 佐剂是疫苗配方的关键组成部分的大家族。它们的使用在历史上最重要的疫苗接种活动中至关重要，包括脊髓灰质炎、猪流感和最近的COVID-19大流行。即使已经取得了良好的结果，但还需要更多的努力来增加疫苗对耐药病毒的保护，并减少额外加强针的需要。重组技术、DNA筛选和生物信息学研究已经阐明了新的机制和免疫信号通路的关键参与者。还需要更多的努力来识别更有效的佐剂，以对抗未来的大流行并增加对抗癌症的成功率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

10 povidone iodine solution in this article refers to 10% povidone iodine solution, which means that this solution contains 10% povidone iodine (equivalent to 1% titratable iodine) and is a disinfectant. What are the main uses of 10 povidone iodine solution?   About povidone iodine Povidone iodine is a loose complex formed by combining elemental iodine and a polymer carrier, with povidone acting as a carrier and solubilizer. It is a yellow-brown to brown-red amorphous powder at room temperature. It has a slight odor and is easily soluble in water or ethanol. The aqueous solution is acidic and insoluble in ether, chloroform, acetone, ethane and carbon tetrachloride. Povidone iodine solution does not have the disadvantages of iodine tincture, is lightly colored, easy to wash off, has little irritation to the mucous membrane, does not require ethanol deiodination, has no corrosive effect, and has low toxicity.   10 povidone iodine solution can effectively kill Newcastle disease, bursal disease, avian influenza, mycoplasma, Escherichia coli, salmonella, influenza, blue ear disease, etc. It can also kill parasite eggs of livestock and poultry, and inhibit the breeding of insects such as mosquitoes and flies. It can also be used in fruit trees, crops, fish and shrimp farming.   10 povidone iodine solution is an external disinfectant used for cuts, abrasions, burns and minor skin wounds. Its mechanism of action is that after this product contacts the wound or the affected area, it can depolymerize and release the iodine contained to exert a bactericidal effect. It has the characteristics of low irritation to tissues and is suitable for skin and mucous membrane infections. It is usually used for purulent dermatitis, fungal skin infection, and small-area mild burns and scalds. It is also used to disinfect small-area skin and mucosal wounds. It is also a medical disinfectant used for skin preparation before surgery, or a disinfectant and cleanser for skin preparation before injection.   10 povidone iodine solution is a solution mainly used for skin wound disinfection. It does not need to be diluted when used. The disinfectant is applied directly to the damaged skin. It should be applied within 3-5cm around the lesion and applied twice a day. If necessary, the wound can be covered with sterile gauze to avoid infection.   In summary, 10 povidone iodine solution is the most common topical disinfectant. When you need to treat the wound yourself after an injury to the outside of the body, 10 povidone iodine solution is a good choice.

摘要：疫苗用于控制动物的传染病。与其他类型的疫苗接种（如活疫苗、减毒或灭活疫苗）相比，基于mRNA的疫苗具有显著优势。由于只使用病原体遗传物质的一小部分，且mRNA疫苗的剂量率低，病原体逆转自身的可能性最小。为了传递mRNA疫苗，需要一种载体或运输工具来保护mRNA疫苗免受宿主细胞RNases的侵害。临床试验表明，mRNA疫苗在对抗影响动物的各种传染病（包括病毒性和寄生虫性）方面有效，能够诱导细胞介导的免疫反应和体液免疫反应，这些疾病包括狂犬病、口蹄疫、弓形虫病、寨卡病毒、利什曼病和COVID-19。当前的综述旨在强调mRNA疫苗在动物病毒性和寄生虫性疾病中的应用。 1.引言 疫苗用于控制和预防动物传染病的出现。由于疫苗的广泛使用，一些疾病如天花和小反刍兽疫已从世界中完全根除，许多其他疾病的发病率在全球范围内大幅降低。通过疫苗接种，天花和小反刍兽疫等疾病已从世界中根除，这是疫苗接种成功的故事。传统疫苗开发方法为动物的许多传染病和人畜共患病提供了持久的保护，此类疫苗的例子包括灭活疫苗、活减毒疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗。然而，通过这些传统方法未能预防或充分控制的疾病需要新的方法来开发疫苗，特别是针对那些更能欺骗和逃避宿主适应性免疫反应的病原体。对于病毒疫苗的开发，主要障碍是快速开发和大规模制剂及其部署，而不是传统方法的有效性。同样，传统疫苗开发方法对于非传染病（如癌症）也不适用。由于这个原因，迫切需要开发更有效和广泛适用的疫苗平台。 传统疫苗方法的有希望和有效的替代方法是使用mRNA疫苗。目前，许多技术和研究发明使mRNA疫苗成为预防和控制动物工业中许多病毒和寄生虫疾病的有效工具。使用mRNA疫苗有几个好处，如（i）安全性；感染逆转和插入突变的潜在风险最小，是一种非整合性和非感染性方法。抗原修饰减少了mRNA的免疫原性并增强了其安全性。（ii）有效性；mRNA疫苗的稳定性和翻译可以被修改，从而通过将mRNA分子制剂到载体分子中，可以实现mRNA在宿主细胞质中的快速吸收和表达。由于其最小的遗传物质，mRNA可以避免抗载体免疫，并且可以重复接种。（iii）生产；mRNA疫苗可以快速大规模生产。 细胞质含有RNases（酶），这些酶迅速降解裸露的mRNA。因此，也开发并使用了一种转染试剂用于mRNA疫苗，它保护疫苗遗传物质免受RNases的侵害，并促进mRNA被细胞吸收。一旦进入宿主体内，当mRNA到达细胞质时，核糖体（细胞翻译机制）开始从mRNA产生蛋白质，翻译后，这些新合成的蛋白质经历翻译后修饰，从而产生完全功能性和正确折叠的蛋白质（图1，使用Biorender创建）。这种mRNA药理机制使其对需要跨膜或细胞质蛋白的疫苗和蛋白质替代疗法有利。必须将这些蛋白质正确地输送到其功能位点。完成工作后，这些mRNA被宿主细胞的正常生理机制降解。 图 1. mRNA疫苗（纳米颗粒）在宿主细胞中的呈现和抗原翻译 通过动物中自我复制的纳米颗粒RNA疫苗的免疫接种，可以引起对各种传染病的强烈免疫反应（T细胞和B细胞）。在体内，mRNA的载体包括含有可离子化的氨基脂质的纳米颗粒，这些被认为是此目的的最佳选择。含脂质mRNA疫苗的最佳解剖部位是皮内途径，因为皮肤中存在大量异质免疫细胞。这种含脂质mRNA纳米颗粒疫苗的特性优于其他形式的疫苗。 2.mRNA疫苗引起的免疫反应 在过去疫苗开发过程中，各种形式（灭活或活减毒）疫苗的作用机制是未知的。然而，通过活减毒疫苗在动物、细胞系或不利生长条件下的开发，以及灭活或灭活疫苗在控制动物（牛瘟、猪瘟和马传染性贫血）和人类（麻疹、腮腺炎、天花、脊髓灰质炎和风疹）的传染病方面取得了成功。分子生物学理论和技术的进步导致了对疫苗机制的广泛了解，例如灭活疫苗产生抗原特异性抗体，而活减毒疫苗引起宿主的体液免疫反应，这对根除细胞内病原体是必要的。RNA基非病毒疫苗的免疫接种刺激了滤泡辅助T细胞和生发中心B细胞的产生（图2，使用Biorender创建）。这些疫苗模仿活微生物的疫苗接种或感染。 图2. mRNA疫苗接种引发的先天和适应性免疫反应。(1) 当mRNA疫苗被接种时，RNA感受器识别疫苗颗粒并激活先天免疫反应，导致干扰素和细胞因子的产生。(2) 这些干扰素和细胞因子促进树突状细胞的成熟，这些细胞迁移到淋巴结以呈现感兴趣的抗原。(3) 在淋巴结中，由树突状细胞启动T细胞和B细胞。树突状细胞激活T细胞。辅助性T细胞促进产生抗体的浆细胞的成熟。辅助性T细胞和细胞因子共同促进B细胞分化为记忆B细胞。(4) 细胞免疫和体液免疫被激活，免疫细胞向感染的组织或细胞移动。(5) 被病毒感染的细胞受到抗原特异性T细胞的攻击。(6) 通过抗体中和病毒。 mRNA疫苗引起的免疫反应机制仍需进一步阐述。mRNA疫苗被细胞受体感知和激活细胞受体的过程尚不清楚。细胞内有两种受体参与识别和诱导免疫反应，即内体性Toll样受体（TLRs）和视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）。TLRs进一步细分为TLR-3、TLR-7、TLR-8和TLR-9，它们存在于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中。TLR-3参与识别包括由单链RNA（ssRNA）产生的45个以上碱基对的双链RNA（dsRNA），而富含鸟苷、尿苷或多尿苷的RNA由TLR-7和TLR-8激活。TLR-8只能与ssRNA结合，而TLR-7可以与ssRNA和dsRNA结合，并增强抗原呈递、细胞因子分泌和B细胞免疫反应刺激。内体TLR-9受体参与抗原呈递细胞，并作用于激发宿主的免疫反应。 RIG-I样受体作为模式识别受体，RLR家族的其他成员包括黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和遗传学和生理学实验室2（LGP2）。RIG-1参与识别ssRNA和dsRNA，最终导致干扰素的产生，而MDA5存在于细胞质中，参与识别病毒RNA复制期间产生的长dsRNA。mRNA疫苗刺激了先天免疫。 mRNA疫苗接种激活了先天免疫系统和适应性免疫系统。mRNA疫苗激活宿主适应性免疫反应，增强了细胞因子和干扰素的产生，这些因子参与了免疫防御细胞的招募，即自然杀伤细胞、巨噬细胞和树突状细胞。先天免疫系统损害了抗原的表达，从而降低了疫苗的有效性。有一份报告指出，当IFN拮抗剂与mRNA疫苗一起使用时，观察到疫苗的相当大的效果。因此，为了避免先天免疫系统（例如mRNA的修饰）的过度反应，必须共同给予拮抗剂，以维持疫苗的有效性。 3.动物传染病的mRNA疫苗开发 疫苗被认为是控制和预防人类和动物传染病最成功的预防性和治疗性工具（见表1和表2）。疫苗可以挽救成千上万的动物和人的生命，并节省资金。由于疫苗接种，麻疹、脊髓灰质炎和小天花等严重传染病已被根除或接近根除，许多其他疾病的发病率和死亡率也大幅降低。 3.1.口蹄疫 口蹄疫是一种由口蹄疫病毒（FMDV）引起的有蹄动物的传染性病毒疾病，在发展中国家和不发达国家尤为常见。根据抗原和遗传属性，FMDV有O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3七个血清型。尽管口蹄疫的死亡率很低，但FMD的爆发会导致严重的经济损失，并对活体动物及其产品的国内外贸易产生负面影响。病毒的传播方式是通过气溶胶、直接接触感染动物、通过污染物、人类和其他非敏感动物。无口蹄疫国家通过严格的检疫和限制从口蹄疫流行国家进口敏感动物及其产品来维持这一状态。在控制家畜（牛、水牛、绵羊和山羊）中的FMD方面，最有效的方法是限制感染动物及其产品从其所在地向健康易感动物的流动，屠宰暴露和感染的动物，消毒受污染的地方和设备，以及接种疫苗。 表1：针对传染病的mRNA疫苗 表2：mRNA疫苗对动物和人类传染病的免疫反应 目前用于控制和预防FMD的传统疫苗通过激活先天免疫反应和适应性免疫反应来诱导保护。这些疫苗不提供长期保护，需要多次加强剂量来维持群体中足够的免疫水平。这些传统疫苗也有一些缺点，如基因毒性潜力、较低的细胞免疫、较短的保护期限，以及在接种和感染动物之间难以进行血清学区分。为了克服所有这些问题并在过去十年中开发更安全的下一代FMD疫苗，进行了许多尝试。2010年，进行了一项研究，阐述了在小鼠中由mRNA FMDV（基因工程）诱导的免疫，并证明它可以在实验室动物中引起强烈的免疫反应。这为开发基于mRNA的疫苗提供了可能性，以实现对动物自然感染的长期保护。口蹄疫病毒对干扰素（IFN）敏感。因此，Rodriguez-Pulido及其同事进行了一项研究，表明FMDV的dsRNA可以在IBRS-2（猪肾细胞系）和新生小鼠中引起免疫反应，并且体外转录RNA对预防FMD的有效性。结果表明，3'非编码区的dsRNA在SK-6细胞系中诱导了强大的IFN alpha/beta激活。进一步，这种dsRNA在新生小鼠体内也证实了自然免疫反应的诱导。这认识到dsRNA具有开发针对动物FMDV疫苗的潜力。同一组研究了对应于内部核糖体进入位点的非感染性RNA作为FMD疫苗设计的佐剂的潜力，当它与常规疫苗一起增强了小鼠对FMDV挑战的免疫反应时。此外，Rodriguez-Pulido及其同事分析了合成非感染性RNA在猪中的免疫调节效应。这项研究证明了这些RNA分子与常规疫苗共同给予可以增强针对FMDV的特异性抗体滴度。此外，FDMV能够与宿主细胞发生突变和重组。病毒与宿主细胞的重组可能比单独的非活性病毒引起更强的免疫反应。宿主细胞中存在的酶（RNAses）在它们进入细胞后如果不适当修饰和/或通过封装（加帽）保护，会迅速降解裸露的RNA。同样，在反向遗传过程中，体外合成的RNA也会被酶降解。Semkum及其同事建立了一个DNA载体pKLS3（FMDV的小型基因组），它最小化了RNAses对合成mRNA的降解。它可以用来驱动FMDV感兴趣的基因的转录，因为它包含转录和翻译病毒所需的最小顺式作用组分。用于生产疫苗的mRNA是在体外转录的，编码特定的抗原。pKLS3有潜力用作转录系统，用于表达mRNA，可能在生产基于mRNA的疫苗中有用。对于FMD疫苗（基于mRNA）的开发，现有信息提供了一个有希望的途径。 3.2.狂犬病 狂犬病是由狂犬病病毒引起的病毒性疾病，可以感染所有温血动物，包括人类。它是一种人畜共患病，每年大约有60,000人因狂犬病病毒感染而死亡。超过95%的狂犬病病例是由狂犬动物的咬伤引起的，特别是狂犬狗的咬伤。这是一种严重的病毒性疾病，以急性脑炎为特征，通过狂犬动物的咬伤或通过与狂犬动物的唾液接触粘膜从狂犬动物传播给人类和其他易感动物。病毒通过表面糖蛋白（狂犬病病毒糖蛋白）附着在其细胞受体上，并沿着周围神经传播到大脑。为了预防狂犬病，早期疫苗是在哺乳动物的神经组织中生产的，但后来被胚胎蛋和组织培养中开发的疫苗所取代。全世界都需要一种负担得起且有效的狂犬病疫苗，因为目前可用的疫苗由于某些限制（如生产能力、储存要求、成本和接种时间表）无法满足需求。以前为了开发狂犬病疫苗，使用了多种不同的病毒疫苗生产方法。CureVac®应用的新概念是使用mRNA编码主要的狂犬病病毒抗原狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G）。在研究mRNA疫苗对狂犬病的免疫反应的第一阶段临床试验中，选择了疫苗候选物（CV7201）。CV7201证明可以诱导保护性免疫反应，这受到疫苗剂量和接种途径的影响。阳离子蛋白鱼精蛋白被用作CV7201中编码狂犬病病毒糖蛋白抗原的热稳定mRNA的稳定剂。与传统的商业灭活狂犬病病毒疫苗相比，mRNA疫苗诱导了更好的免疫反应，通过促进合成病毒中和抗体，这些抗体对保护是必要的。在第一阶段试验中，发现需要高剂量的狂犬病mRNA疫苗才能提供显著的抗体滴度以保护。为了降低狂犬病疫苗（CV7201）的剂量率，采用了一种新方法，即使用脂质纳米颗粒（LNPs）包裹mRNA抗原。这项临床试验表明，mRNA疫苗是安全的，其反应原性概况可能是可以接受的，这种技术形式比传统疫苗提供了许多优势。同样，在接种编码RABV-G的mRNA的家猪和老鼠中确认了中和抗体的产生。RABV-G mRNA疫苗诱导了CD4+和CD8+的产生，并提供了对脑内致死性感染挑战的保护。这项研究表明，编码RABV-G的基于mRNA的疫苗在小型和大型动物中是可行的，并且可能是控制动物病原体疾病的有希望的方法。 3.3.利什曼病 利什曼病是由雌性白蛉沙蝇叮咬传播的一种寄生虫性人畜共患病。引起该病的病原体是利什曼属（L.）的原生动物寄生虫。该病有不同形式，最常见的包括由不同种类引起的内脏利什曼病、皮肤利什曼病和粘膜皮肤利什曼病，如L. donovani、L. chagasi、L. infantum、L. braziziliensis、L. maxicana和/或L. archibaldi。狗是宿主，而人类是偶然宿主。第一代和第二代疫苗都是为了预防人类疾病而开发的，但缺乏完全保护。为了更好地提供保护，正在考虑基于mRNA的疫苗。Savar等人设计了两种组合的融合蛋白（LmSTI1-PpSP15和PpSP15-LmSTI1）用于疫苗开发。融合蛋白包括L. major的应激诱导蛋白1（LmSTI1）和来自白蛉沙蝇（PpSP15）的SP15。这种组合还基于alphavirus-derived self-amplifying mRNA以病毒复制子粒子的形式在in silico研究中设计。in silico分析显示了抗原组合的有效性。后来使用基于自复制mRNA（SAM）的疫苗在细胞系Baby Hamster Kidney成纤维细胞（BHK-21细胞）中表达了融合蛋白。结果表明，使用SAM载体的PpSP15-LmSTI1表达水平很高。同样，研究了其他融合重组抗原（LEISH-F2和LEISHF3+）对L. donovani的影响，采用异源主要增强方案进行免疫。C57BL/6和TLR7−/−小鼠接种了表达LEISH-F2抗原的RNA基疫苗，随后接种了亚单位疫苗。结果表明，单独使用RNA基疫苗的免疫（同源免疫）没有提供显著的保护。然而，当小鼠使用异源方案的增强剂免疫时，产生了强大的抗原特异性T细胞反应（CD4和CD8），并对细胞内寄生虫提供了显著的保护。需要进一步研究以识别新抗原并开发有效的针对利什曼病的基于mRNA的疫苗。 3.4.弓形虫病 弓形虫是一种专性细胞内原生动物，负责所有温血动物的弓形虫病。它的复杂生命周期包括在确定宿主（猫科动物）中的性繁殖和在中间宿主（猫和其他温血动物）中的无性繁殖。全球大约有一半的人类被弓形虫感染，但这种感染的流行率在不同国家之间变化，从10%到80%不等。人类可以通过食用未煮熟的肉类中的组织囊肿或污染食物中的卵囊偶然获得这种感染。主要为了保护免受弓形虫感染，免疫依赖于由CD4+和CD8+介导的细胞免疫反应，并最终刺激细胞因子（伽马干扰素）的分泌。除此之外，体液免疫也在限制弓形虫病方面发挥重要作用，通过抗弓形虫抗体抵抗寄生虫的入侵，通过调理作用促进寄生虫的吞噬作用，并最终激活经典补体途径。Chahal等人最近开发了一种完全合成的树突状纳米颗粒疫苗，其中包含封装的mRNA复制子编码抗原，这些抗原能够引发免疫反应并提供对弓形虫感染的保护。这种mRNA复制子同时编码六种抗原，如密集颗粒蛋白6（GRA6）、棘蛋白18（ROP18）、棘蛋白2A（ROP2A）、表面抗原1（SAG1）、顶端膜抗原1（AMA1）和表面抗原2A（SAG2A）。这是一种完全保护性的单剂量mRNA疫苗（mRNA复制子纳米颗粒），用于预防和控制弓形虫。尽管如此，它可能需要时间才能商业化。Luo等人分析了小鼠中针对弓形虫挑战的自复制RNA疫苗的活性，该疫苗编码核苷酸三磷酸水解酶-II（NTPase-II）。进一步，他们评估了疫苗与脂质纳米颗粒的联合效应。小鼠的免疫接种结果产生了强大的免疫反应。细胞和体液免疫反应都被激发，产生了高特异性抗弓形虫抗体和IFN-γ。与对照组相比，接种疫苗的小鼠大脑囊肿减少了62.1%，并显著延长了动物的存活时间。现有信息为生产预防弓形虫病的mRNA疫苗提供了一个有希望的途径。 3.5.寨卡病毒病 寨卡病毒最初是在1947年从乌干达寨卡森林的一只哨兵恒河猴的血液中分离出来的。该病毒通过蚊子（埃及伊蚊）的叮咬传播。它具有人畜共患的重要性，是神经和胎儿异常（如脑钙化、小头症、听力和视力丧失）的罪魁祸首。最初，它与轻微的发热症状相关。然而，它传播到美洲和太平洋岛屿，导致严重的后果，如吉兰-巴雷综合征、先天性寨卡综合征和自然流产。最近，它已成为一种流行病，因此，需要开发一种有效且安全的疫苗。已表明有多种类型的疫苗可以保护非人灵长类动物和小鼠，如灭活疫苗、亚单位疫苗和/或基于腺病毒的疫苗。然而，开发一种针对寨卡病毒的有效且安全疫苗仍然是必要的。Essink及其同事评估了两种先前开发的基于mRNA的疫苗mRNA-1325和mRNA-1893在人类中的安全性和免疫原性。mRNA-1325脂质纳米颗粒包裹是第一代疫苗，编码来自2007年密克罗尼西亚寨卡病毒分离株的前膜（prM）和包膜E结构蛋白，即prME。而mRNA-1893是第二代疫苗，编码来自寨卡病毒（RIO-U1）分离株的相同蛋白prME。RIO-U1寨卡病毒是从巴西感染寨卡病毒的孕妇尿液中分离出来的。mRNA-1325和mRNA-1893疫苗的prME中分别有一个和五个氨基酸残基的差异。在小鼠的临床前研究中，编码prME的修饰mRNA疫苗显示出有希望的结果，并保护小鼠免受寨卡病毒挑战。在成年人类的第一阶段临床试验中，研究了两种mRNA疫苗的不同剂量反应。两种疫苗都被所有健康志愿者很好地耐受，并且没有向疫苗传达严重的不良反应。由于只有一个氨基酸残基，mRNA-1325的寨卡病毒特异性中和抗体（nAb）反应较差。另一方面，由于五个氨基酸残基，mRNA-1893疫苗以较小的剂量引起了强大的nAb反应，与mRNA-1325相比。所获得的结果是有希望的，Essink及其同事向第二阶段临床试验迈进。然而，为了检查疫苗的有效性，将需要第三阶段的临床试验。 3.6.冠状病毒病 许多动物种类，包括人类，都可能被冠状病毒感染。对兽医重要的冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒、牛冠状病毒和禽传染性支气管炎病毒。目前，冠状病毒被认为是一种新兴病原体，负责动物和人类的急性和慢性感染，包括肠道、呼吸和中枢神经系统。2003年，由于严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）在人类中爆发，震惊了世界。2012年至2016年，在阿拉伯半岛，由于名为中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的冠状病毒，人类中报告了几次爆发。该病毒在中东和非洲的骆驼中流行。近年来，全球大流行感染了呼吸系统的冠状病毒病2019（COVID-19），由一种名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的传染性病原体引起，它起源于蝙蝠。世界卫生组织宣布COVID-19是重大的公共卫生紧急情况。对于鸡来说，为了预防由传染性支气管炎病毒引起的传染性支气管炎病，有许可的疫苗可用。然而，对于预防其他动物的冠状病毒病，开发一种安全有效的疫苗是一个未满足的需求。对于COVID-19疫苗的开发，采用了几种方法，如灭活病毒、活减毒、重组蛋白、腺病毒载体、流感病毒载体、DNA和mRNA疫苗。mRNA疫苗方法是COVID-19预防的一场变革。一种编码刺突蛋白的自复制mRNA疫苗在小鼠中提供了针对SARS-CoV-2的保护。编码刺突蛋白三聚体受体结合域的RNA疫苗针对几种SARS-CoV-2变体在恒河猴和小鼠中显示出显著的保护。BioNTech和辉瑞合作开发了一种基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗。BNT162b2编码病毒刺突糖蛋白的全长。这是美国FDA批准的疫苗，在16岁及以上的人中两剂间隔21天的效力为95%，在随后的六个月，其效力变为91.3%。Moderna还开发了一种基于mRNA的疫苗（mRNA-1273），编码病毒融合刺突蛋白的全长。在18岁及以上的个体中，两剂间隔28天的第三阶段临床试验的效力为94.1%。 4.mRNA疫苗的类型 中心法则表明，mRNA在翻译（DNA编码蛋白）和由细胞质中的核糖体合成蛋白之间处于中心位置。目前，有两种主要类型的mRNA用于mRNA疫苗的开发，即自复制mRNA或复制体mRNA疫苗和非复制mRNA或非复制mRNA。在自复制mRNA疫苗开发方法中，mRNA编码抗原以及病毒RNA的复制机制保持不变，这使得mRNA可以在细胞内自我复制，从而实现丰富的蛋白表达。而在非复制mRNA疫苗开发方法中，mRNA仅编码感兴趣的基因，其中包含5'和3'的非翻译区。 4.1.自复制mRNA疫苗 在自复制mRNA疫苗中，感兴趣的抗原取代了阿尔法病毒基因组的结构蛋白，但RNA的复制机制保持不变。通过使用自复制mRNA，可以通过最小剂量的抗原编码RNA翻译，向宿主细胞传递大量的抗原。当自复制mRNA进入细胞质时，它与宿主核糖体结合产生非结构蛋白1（nsP1）、nsP2、nsP3和nsP4。它们是依赖核糖核苷酸的RNA聚合酶的组成部分。病毒蛋白酶（nsP2）进一步将这些蛋白质调节成单个蛋白质。这些蛋白质发挥许多重要作用，例如nsP1在建立RNA复制复合体和质膜复制复合体之间的联系方面的作用，nsP2作为蛋白酶和解旋酶，nsP3介导宿主-病毒与蛋白质的相互作用，nsP4是一种依赖RNA的RNA聚合酶。在编码区域基因组中，生成病毒RNA，表达病毒蛋白，并包装病毒基因组。自复制mRNA疫苗具有许多优点，包括由于能够自我复制而具有高表达水平，缺乏结构病毒蛋白基因，以及能够持续长达两个月。除了它们更大的尺寸和无法耐受各种合成修饰之外，还有一些缺点。 4.2.非复制mRNA疫苗 非复制mRNA疫苗包含编码感兴趣的蛋白，而不是像自复制mRNA疫苗那样需要mRNA复制的蛋白。非复制mRNA的基本结构与天然mRNA相同，包括5'帽子、聚(A)尾部、5'不饱和区、3'不饱和区，以及编码感兴趣基因的区域。5'和3'不饱和区元素在mRNA分子的稳定性和复制中起着至关重要的调节作用。5'是mRNA稳定性的重要元素，促进蛋白合成。聚(A)尾部具有保护功能，防止mRNA分子被RNases外切核糖酸酶降解。非复制mRNA疫苗的优点包括相对较小的尺寸（大约2-3 kb），与自复制mRNA疫苗（10 kb）相比，只携带所需的感兴趣基因，防止了任何其他可能导致宿主内不需要的免疫反应的蛋白表达，并且其构建容易。而缺点包括不稳定、半衰期短和表达水平低。 5.mRNA疫苗的配方和传递 mRNA疫苗的配方和传递系统决定了宿主细胞内抗原的表达效果和持续时间，以及它们引起的免疫反应的效力。mRNA分子的物理化学性质，如负电荷和大尺寸，使它们（裸露的mRNA）难以穿过细胞的质膜。模式识别受体可以轻易识别外源mRNA，并通过干扰素导致裸露mRNA的降解。因此，为了增强mRNA的细胞摄取和它们对核酸酶降解的抵抗力，需要一个传递载体。用于mRNA管理的传递载体包括树突细胞（体外）、电穿孔和基因枪（物理传递）、基于聚合物的传递和基于纳米颗粒的传递工具（LNPs）。LNPs是其中最有效和广泛使用的传递载体。 在体外，转录系统可以用来生产合成mRNA。这个转录系统由编码mRNA的DNA模板、噬菌体RNA聚合酶、RNA和合成帽子类似物组成。在某些情况下，也可以使用来自癌细胞的完整RNA用于疫苗。体外提取的mRNA或从肿瘤细胞获得的mRNA可以裸露或与载体一起管理。mRNA疫苗携带编码抗原的转录物进入宿主细胞，在那里使用宿主的翻译机制来产生抗原，然后刺激宿主的免疫系统。mRNA的细胞内稳定性和翻译效率很大程度上受其结构的影响。合成mRNA的设计基于真核RNA蓝图，在5'端有一个帽子，在3'端有一个聚A尾部。通过添加3'和5'非翻译区，可以进一步增强其稳定性和效力。这些非翻译区包含调节元素。 当mRNA疫苗被配制在脂质纳米颗粒中时，可以增强免疫反应，这也保护了mRNA免受细胞质RNases的侵害。由于其某些好处，如易于准备、毒性较小，以及能够被宿主细胞机制降解，脂质纳米颗粒长期以来被用作药物载体。脂质纳米颗粒有四个组成部分，如阳离子脂质（可离子化）、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇。由于RNA是带负电荷的分子，它与带正电荷的阳离子脂质颗粒形成复合物。脂质颗粒的可离子化特性使复合物无毒，并在宿主生理pH下保持中性或轻微带正电荷的表面。这种特性还通过最小化非特异性细胞表面脂质和蛋白质之间的相互作用，促进mRNA释放到细胞质中。还有许多其他mRNA传递系统，如精蛋白、脂质复合物、多聚体纳米颗粒、胶束复合物纳米颗粒、脂多聚体，以及阳离子纳米乳液。 6.未来展望 在人类中接种mRNA疫苗所取得的成功结果为mRNA基础疫苗在兽医医学中的发展打开了大门。目前，只有少数mRNA疫苗在动物中针对其自然宿主的特定传染病进行了研究。全球寄生虫和病毒感染对动物健康和工业家畜生产构成重大威胁。全球最严重的病毒感染缺乏适当的预防策略，包括牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、口蹄疫病毒（FMDV）、疙瘩皮肤病病毒（LSDV）、牛白血病病毒（BLV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）等。传统疫苗对上述许多疾病安全有效，但仍需要研究以更好地预防疾病。对于传染病疫苗的开发，mRNA有潜力解决疫苗学中出现的许多挑战。在未来，疫苗不仅用于预防措施，还用于预防、控制和治疗动物和人类的癌症和肿瘤。 非洲猪瘟病毒是导致猪的高死亡率和出血的原因。中国是最大的猪肉生产国，由于缺乏有效的策略，这种疾病传播到许多其他国家，导致2019年约有七百万头猪死亡。目前，使用活减毒疫苗进行控制。活减毒疫苗的开发需要猪骨髓细胞或肺泡巨噬细胞，这既耗时又成本高昂。作为这种方法的替代方案，最近通过iVAX（计算疫苗设计平台）识别了非洲猪瘟病毒编码蛋白中的T细胞表位。在细胞免疫反应中，T细胞执行重要功能，参与在识别病毒的T细胞表位后直接杀死病毒感染的细胞。因此，为了充分利用T细胞表位的潜力，需要进一步调查以促进mRNA疫苗（针对T细胞）的开发。 猪繁殖与呼吸综合征病毒是导致母猪繁殖失败和仔猪呼吸道疾病的原因，影响猪农经济。PRRSV有两种抗原上不同的基因型。目前，使用活减毒或灭活疫苗预防性地控制疾病，但这些疫苗仅对同源菌株提供保护，对异源菌株的效力为零或部分。2019年，显示具有PRRSV GP5-Mosaic（糖蛋白5）序列的DNA疫苗候选物是免疫原性的，并对猪的病毒感染提供保护。借助in silico算法，可以组装不同PRRSV菌株的片段，这些片段诱导免疫反应，使用mRNA疫苗平台制作单一疫苗。这样的疫苗可以为两种类型的菌株提供广泛和有效的免疫，无论是同源还是异源菌株。 冠状病毒引起许多新兴大流行疾病，如严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征和新型冠状病毒病，感染了牛、水牛、猫、狗和猪等各种动物。抗体通过与冠状病毒的刺突(S)糖蛋白结合来中和病毒，该蛋白由S1和S2亚基组成。受体结合域(RBD)位于S1亚基中，参与特异性受体结合，而S2亚基参与宿主和病毒细胞膜的融合。随着对动物冠状病毒(猪急性腹泻综合征冠状病毒、牛冠状病毒、传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒)的细胞表面受体和新型受体结合域的研究进展，基于RBD的mRNA疫苗似乎是限制动物冠状病毒疾病出现和再现的有效策略。 在兽医领域经济上重要的 Pestiviruses，如牛病毒性腹泻病毒、经典猪瘟病毒和边缘病病毒。Pestiviruses 编码的三种糖蛋白包括 E1、E2 和 Erns(E 核糖核酸酶)。E2 是中和抗体的主要靶标。用作疫苗的 E2 亚基激活了体液免疫反应和细胞介导的免疫反应，因此基于 E2 的 mRNA 疫苗可以提供有效的保护。需要进一步评估 mRNA 疫苗，以评估在自然动物宿主中疫苗管理后发生的过敏反应。用于动物的疫苗必须是经济实惠且易于获得的，以便兽医可以访问它们。在未来，mRNA 疫苗在动物中的使用似乎是一种非常有效的方法，用于控制各种病原体疾病，由于上述讨论的许多优点。 7.结论 目前，科学家们对基于RNA的方法在疫苗开发中的兴趣日益增加，这些疫苗可用于预防和控制疾病。mRNA疫苗在用于临床前和临床试验的动物模型中激发了安全且持久的免疫反应。它在兽医领域对动物传染病有很强的潜力，并且比其他形式的疫苗具有某些优势，如感染风险消失、无逆转为毒力的风险，并且可以在一种疫苗中组装多种抗原，同时对多种病原体进行免疫，易于准备且处理和储存非常方便。mRNA疫苗为预防传染病提供了显著的保护性免疫来源，这一点已经通过COVID-19疫苗的成功应用得到证实。这一成功为预防一系列传统疫苗方法具有挑战性的传染病开辟了新的可能性。由于疫苗的快速发展，它可能是应对新兴传染病的一个有希望的平台。然而，要充分利用mRNA疫苗在未来的潜力，必须解决某些挑战，如配方、疫苗犹豫和广泛获取。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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