PAR2 inhibitors(Otsuka)

气道上皮细胞(airway epithelial cells,AECs)是分隔呼吸系统内外环境之间的物理屏障,作为呼吸系统的第一道防线对肺部的天然免疫功能至关重要。小气道病变是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的重要早期病理,当AECs长期暴露于有害颗粒或气体后,上皮屏障受损,参与分化、修复和促炎反应的信号通路异常,导致上皮细胞周期停滞从而加速衰老。研究发现,COPD患者的AECs表达高水平的衰老标志物,提示AECs衰老与COPD密切相关。该文讨论了COPD中AECs衰老的潜在机制,AECs衰老对疾病发展和严重程度的影响,并强调了调节AECs衰老作为COPD治疗方法的潜在靶点。 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种异质性肺部状态,以慢性呼吸道症状(呼吸困难、咳嗽、咳痰)为特征,是由于气道异常(支气管炎、细支气管炎)和/或肺泡异常(肺气肿)导致的持续性(常为进展性)气流阻塞,其发病机制尚未能完全阐明,目前的证据指向慢性炎症、氧化应激和蛋白酶-抗蛋白酶失衡均参与了COPD疾病的发生发展。值得注意的是,COPD是公认的加速衰老的肺疾病,细胞衰老标志物(如p21WAF1/CIP1和p16INK4a)与临床参数(如气流阻塞指标)之间具有显著相关性,并且研究发现,与健康的衰老肺相比,COPD患者肺积累了更多的衰老肺成纤维细胞、上皮和内皮细胞,这些衰老细胞的积累导致组织修复和多种炎症蛋白的分泌失调,进而驱动COPD的进展。其中上皮细胞的衰老对肺部的免疫稳态至关重要,作为机体呼吸系统抵御外界环境的第一道防线,气道上皮细胞(airway epithelial cells,AECs)通过屏障防御、先天性免疫、黏液纤毛清除3种方式来维持肺稳态和应对大量外源性刺激,衰老的AECs增加了COPD患者对香烟烟雾(cigarette smoke,CS)引起的炎症和氧化应激的敏感性,并且它仍然保持代谢活跃以此来抵抗凋亡,于是产生许多称为衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)的炎症蛋白,以此向邻近细胞传递炎性因子、削弱修复潜力和放大氧化应激效应,表现为分泌大量细胞外基质,刺激气道黏液分泌,加剧炎症反应,最终使小气道纤维化、气道腔黏液栓塞、气道阻力增加,造成COPD患者的一系列慢性呼吸道症状和持续性的呼吸受限,这表明AECs衰老参与了COPD的病理生理,并且在肺部早衰与疾病进展之间存在很强的关联。一、COPD气道上皮细胞衰老的机制 1.1 DNA损伤与COPD气道上皮细胞衰老 端粒是短的多重复的非转录序列(TTAGGG)及一些结合蛋白组成特殊结构,可以防止染色体末端降解,随着细胞的重复分裂,端粒逐渐变短,当端粒长度缩短至Hayflick极限的临界阈值时触发DNA损伤反应(DNA damage response,DDR),DDR对基因组稳定性和生物体存活至关重要,但DDR也是细胞衰老的最强诱导剂。CS可通过加速端粒侵蚀激活DDR加速小AECs的老化。研究发现COPD患者的小AECs中与端粒相关的DNA损伤病灶增加,倘若破坏端粒保护复合体蛋白1(telomere protection protein 1,TPP1)则促进持续的端粒DNA损伤诱导的小AECs衰老。 AU富集元件因子-1(AU-rich-element factor-1,AUF-1)在细胞老化、基因调控、端粒维持和DNA损伤修复中发挥作用。最近一项研究揭示了AUF-1在AECs衰老和炎症反应中的作用,该研究发现稳定期中度COPD患者的支气管上皮中以及CS刺激的BEAS-2B细胞中AUF-1选择性缺失,导致AUF-1靶基因表达变化,促进了AECs衰老参与COPD中炎症和衰老的传播,同时,该项研究提示鉴定和靶向RNA结合蛋白或许能为COPD提供新的治疗策略。 生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45(growth arrest and DNA damage inducible protein 45,GADD45)属于p53的下游蛋白,涉及多种生物过程,包括炎症和衰老。有研究报道,GADD45B在COPD患者的肺部表达显著增加与肺功能呈负相关,小鼠体内数据表明,GADD45B敲除能够有效改善CS暴露小鼠的肺功能、肺破坏、炎症和支气管上皮衰老;此项研究还发现,GADD45B上调可通过p38的磷酸化直接促进炎症细胞因子的释放,GADD45B也可通过与FOS相互作用促进支气管上皮细胞衰老,这些发现阐明了GADD45B在COPD中AECs衰老的关键作用,并为通过靶向GADD45B开发预防或治疗COPD的策略提供了可行的见解。 作为基因组稳定性的调节因子,层黏连蛋白B1(Lamin B1)参与维持细胞核的稳定、调节基因的表达、DNA修复、细胞周期进程等过程。研究发现,在CSE处理的人支气管上皮细胞、暴露于CS的小鼠肺组织以及COPD患者的AECs中观察到Lamin B1蛋白水平的降低,同时伴有哺乳动物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)激活和AECs衰老加速的现象,展开机制研究发现Lamin B1的减少通过含DEP域的mTOR相互作用(DEP-domain containing mTOR-interacting protein,DEPTOR)蛋白的下调导致mTOR激活,从而加速AECs衰老。总之,这些结果表明,DNA损伤是COPD中AECs衰老的重要因素。CS通过多种途径诱导DNA损伤,这些损伤导致细胞周期停滞、细胞衰老和慢性炎症。 1.2 表观遗传修饰与COPD气道上皮细胞衰老 表观遗传修饰是指对基因表达的调控,通过化学修饰改变染色体上的DNA和蛋白质,从而影响基因的表达。这些变化主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式实现。在COPD的发病机制中,表观遗传修饰已经成为一个关键因素。研究发现蛋白质精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferases,PRMTs)通过向组蛋白和非组蛋白的精氨酸残基添加甲基基团在COPD中AECs的衰老起着关键作用。在萘诱导的小鼠气道上皮损伤模型中敲除CARM1基因导致抗衰老蛋白Sirtuin-1表达的细胞数量减少,同时p21WAF1/CIP1、p16INK4a和β-半乳糖苷酶阳性衰老细胞的数量增加,该项研究表明,CARM1在维持COPD中可通过影响Sirtuin-1调控的AECs衰老,在AECs的修复和再生过程中起着关键作用,CARM1功能障碍可能导致COPD的发展。 1.3 慢性炎症与COPD气道上皮细胞衰老 COPD的特征是肺部持续存在慢性低度炎症,持续性低度炎症的根源是代谢活跃的衰老细胞在抵抗凋亡时产生的SASP炎症蛋白,SASP包含多种促炎细胞因子、生长因子、基质金属蛋白酶、细胞外囊泡或微囊泡等,它能改变周围组织微环境,并以旁分泌和自分泌的方式加速衰老。研究发现,在COPD加重期和急性加重期间患者肺中衰老细胞的增多导致SASP释放增加,加重疾病。其中衰老的AECs作为效应细胞可释放炎性细胞因子,例如CXCL8、G-CSF、LTB4和MCP-1。 研究发现,COPD中AECs衰老与炎症的主要转录调节因子NF-κB信号的激活增加有关,NF-κB信号通路的激活会促使某些炎性细胞因子的持续产生,包括IL-6、IL-8、IL-1α/β、TNF-α和CXCL,SASP主要通过DDR依赖性p21WAF1/CIP1和DDR非依赖性p16INK4a途径激活NF-κB和CCAAT/增强子结合蛋白-β(CCAAT/ enhancer-binding protein-β,C/EBPB)来调节。Zeng等发现,白藜芦醇能剂量依赖性地增加sirtuin-1的表达并减少NF-κB的表达,从而减轻香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的AECs衰老和炎症反应,为COPD的治疗提供了新的思路。 蛋白酶激活受体2(protease activated receptor 2,PAR2)在支气管上皮细胞以及支气管、血管平滑肌和内皮细胞中表达。PAR2的激活可以促进炎症反应,在COPD中,mTOR信号通路的激活导致肺细胞衰老和肺气肿,而PAR2通过mTOR信号通路抑制自噬,进一步加剧炎症。研究发现CSE诱导AECs衰老,并激活PAR2/mTOR通路,PAR2抑制剂安石榴苷预处理可以显著减轻CSE诱导的AECs衰老变化,同时抑制PAR2/mTOR通路。 p53是一种重要的肿瘤抑制蛋白,它通过诱导细胞凋亡、细胞周期停滞和衰老来限制肿瘤的发生。在慢性肺部炎症中,p53在AECs中的表达增加,这导致AECs进入衰老状态。Sagiv等发现,AECs的衰老会增加炎性白细胞的积累,特异性敲除雌性C57BL/6J小鼠肺club细胞中的p53基因可减轻慢性脂多糖暴露后的慢性支气管炎,该项研究表明p53基因是club细胞衰老所必需的,club细胞的衰老促进了慢性肺部炎症的发展,表现为气道壁增厚、杯状细胞数量增加以及气道重塑。此外该项研究还发现通过抑制B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族蛋白,可以显著减少肺上皮细胞的衰老和炎症反应。这表明BCL-2家族蛋白在维持细胞生存和防止细胞凋亡中起重要作用,而其抑制可以促进衰老细胞的清除。以上研究表明,SASP在COPD的AECs衰老中扮演着重要角色。通过促进慢性低度炎症、免疫功能下降和组织修复受损,SASP加剧了COPD的病理进程。 1.4 氧化应激与COPD气道上皮细胞衰老 目前的研究证据表明由活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高和/或抗氧化防御受损引起的氧化应激是COPD的主要驱动机制,氧化应激一方面直接造成细胞的结构和功能的损伤,另一方面还增强了炎症、蛋白酶/抗蛋白酶系统失衡这些致病机制。CS中含有数千种有毒化学物质,包括过量的ROS,AECs作为吸入刺激物的第一个接触点,已成为吸入性损伤的主要目标。 mTOR信号通路在COPD中起着关键作用,它能通过影响自噬、线粒体生物合成和细胞衰老等多种途径,最终导致肺功能的下降。Baker等发现,氧化应激激活了磷酸肌肽3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)-mTOR传导靶点,该信号在COPD中激活导致microRNA-34a增加,从而抑制Sirtuin-1和Sirtuin-6的mRNA和蛋白表达水平,造成AECs的衰老,该通路的激活还会使Sirtuin-1和Sirtuin-6酶活性及表达降低导致NF-κB乙酰化升高,持续驱动COPD炎症。使用微小RNA(microRNAs,miRNA)的特异性抑制剂能逆转小气道上皮细胞衰老和细胞周期停滞。 家族序列相似性13成员A(family with sequence similarity 13 A,FAM13A)是一种众所周知的COPD易感基因且在气道上皮中高表达。Chen等发现,在气道上皮中,较低的FAM13A表达可能导致p21WAF1/CIP1的高表达和线粒体活性氧的大量释放,从而促进AECs衰老,这种机制在COPD的加速肺衰老进程中起重要作用。 核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是参与氧化还原稳态和氧化损伤诱导反应的主要转录因子,在COPD患者衰老支气管上皮细胞中发现Nrf2活性和Nrf2介导的抗氧化基因表达受损,导致炎症、气道黏液分泌和抗蛋白酶失活相关基因表达增加,这是因为在COPD患者衰老的AECs中,Nrf2不能像在正常细胞激活抗氧化基因来响应ROS,这可能由于组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase,HDAC2)活性降低导致Nrf2乙酰化,从而导致抗衰老物质Sirtuin-1和Sirtuin-6表达降低而失去保护作用。氧化应激失衡与COPD中AECs衰老密切相关,对AECs氧化应激引起生物学和代谢变化的认识,将有助于开发新的更有效的抗氧化疗法来延缓AECs的衰老。 1.5 线粒体自噬与COPD气道上皮细胞衰老 细胞自噬是真核生物对细胞内物质进行周转的重要过程,当自噬系统以受损的线粒体为目标,将受损的线粒体传递给溶酶体降解的这种分解代谢过程被称为线粒体自噬。线粒体不断老化和功能受损的时候,线粒体自噬可以通过降解和回收线粒体,维持细胞内线粒体的质量和数量。研究发现暴露在与吸烟相关的醛类物质(例如丙烯醛)会导致呼吸道和肺部细胞中的线粒体能量代谢、生物合成和自噬失调。 磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)是一种对线粒体自噬和线粒体健康至关重要的线粒体靶向激酶,调节线粒体功能,激活线粒体清除,参与线粒体稳态,并且与肺功能密切相关。Parkin又称为PARK2或PRKN,它通过调控蛋白的泛素化过程参与细胞内的多种生理过程,它可共价连接泛素分子与底物,使底物被蛋白酶识别、降解,PINK1-Parki通路常被认为是线粒体自噬的重要调控点。当PINK1-Parkin通路被抑制导致线粒体自噬不充分时,细胞内大量损伤的线粒体堆积,持续产生内源性的ROS,加速细胞衰老(Fig 1)。一项研究发现,与野生型小鼠相比暴露于CS的Parkin敲除小鼠AECs显示出线粒体嵴的破坏及受损线粒体的积累,并且AECs上p21WAF1/CIP1和p16INK4a蛋白水平的显著升高。因此,PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬是AECs衰老的重要原因之一,并通过多种机制调控与COPD之间的关系。 非典型丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成员MAPK15在维持线粒体健康和促进细胞增殖中发挥重要作用。通过调节线粒体自噬的能力,控制线粒体质量参与细胞衰老。研究表明,减少MAPK15的表达会降低原代人类AECs中的线粒体呼吸和ATP生成,增加与老化相关的异染色质聚集,同时增加线粒体ROS水平,增加SASP相关细胞因子的表达。研究表明,MAPK15通过刺激ULK1依赖的Parkin Ser108磷酸化,诱导受损线粒体被自噬小体和溶酶体消融,最终保护细胞免受核DNA损伤和由此引起的AECs衰老。此项研究证明了MAPK15控制线粒体健康进一步保护AECs衰老的关键作用,为COPD提供了新的潜在治疗靶点。 二、治疗与展望 目前的COPD治疗方法无法减缓疾病进展或降低死亡率。DNA损伤、慢性炎症、氧化应激和线粒体自噬都是AECs衰老的关键机制,这为针对细胞衰老途径的治疗提供了方向。如果不将衰老的AECs及时清除,它们便会通过分泌一系列SASP,导致持续的低级别慢性炎症,SASP还通过自分泌和旁分泌的方式促进更多细胞的衰老,形成恶性循环进一步促进COPD的发展。值得欣喜的是,目前在衰老动物模型和其他年龄相关疾病的初步临床研究中,许多抗衰老疗法已初见成效。此外抗衰老药物和抑制细胞衰老的药物联合使用可能是治疗COPD的一种有潜力的新方法,尤其是在肺部损伤的疾病早期开始使用时。目前运用于治疗COPD中AECs衰老的疗法主要包括以下几个方面。 2.1 靶向PI3K-mTOR信号 研究表明,PI3K-mTOR的激活可导致细胞衰老,抑制这一途径可延长动物的寿命并改善与年龄相关的疾病。腺苷酸激酶(AMP kinase,AMPK)是一种主要的内源性mTOR抑制剂,已经开发了几种作为AMPK激活剂的药物,可以减少慢性炎症疾病模型中的细胞衰老和SASP,并延长寿命。AMPK激活剂腺苷类似物5-氨基咪唑-4-羧酰胺核苷在体外可减轻CSE诱导的小气道上皮细胞衰老[26]。广泛用于治疗2型糖尿病的药物二甲双胍也可激活AMPK并减少体外AECs的衰老和SASP反应[27]。 Fig 1 Hypothetical model of Parkin involvement in regulation of mitochondrial autophagy during cigarette smoke stress in COPD airway epithelial cells A feedback loop of PINK1 accumulation and Parkin in the mechanism of COPD airway epithelial cell senescence is associated with Parkin decline with insufficient mitochondrial autophagy (Drawing with Figdraw). Fig 2 Mechanisms of airway epithelial senescence induced by DNA damage,chronic inflammation and oxidative stress in COPD patients (Drawing with Figdraw) 2.2 MicroRNAs miRNA是一种小的非编码单链RNA约含18～22个核苷酸。越来越多的证据表明,miRNA可能通过调控几种参与衰老的调节蛋白包括p16INK4a(miR-24)、p53(miR-885-5p)和sirtuin-1(miR-34a)在衰老过程中发挥关键作用。受PI3K-mTOR信号调控的miR-34a在降低sirtuin1/6中起关键作用,用Antagomir抑制miR-34a可使COPD患者外周气道上皮细胞恢复sirtuin1/6,减少衰老标志物,降低SASP,逆转细胞周期阻滞。另外,MiR-570也参与sirtuin-1表达的调控和AECs衰老,并被p38 MAPK激活。Baker等首次报道miR-570-3p通过抑制sirtuin-1调节AECs衰老和SASP,当使用miR-570-3p抑制剂可使COPD小气道上皮细胞中恢复sirtuin-1并减少p21WAF1/CIP1、p16INK4a的表达。miRNA可通过细胞外囊泡在细胞间转运,外泌体和微囊泡是递送miRNA的良好载体,通过吸入给药确保药物精准递送到衰老的AECs中是COPD中衰老AECs的治疗的一个新视野。 2.3 抗氧化剂 COPD肺部的氧化应激水平显著增加,它是驱动AECs衰老的关键机制,因此抗氧化治疗是一种合乎逻辑的方法。目前可用的抗氧化剂,如N-乙酰半胱氨酸、碳半胱氨酸和二羟多巴胺[31],但它们对COPD患者的效果较差,开发更为安全有效的抗氧化剂是亟待解决的难题。Nrf2是最具潜力的干预靶标,阻止Kelch样ECH相关蛋白1与Nrf2相互作用的抑制剂目前正处于临床开发阶段。当然针对内源性的氧化应激也是一种思路,抑制线粒体ROS或许能攻克COPD患者戒烟后肺部仍有持续氧化应激状态的难题。 2.4 靶向线粒体功能 越来越多的证据表明,COPD中存在线粒体自噬机制受损,导致受损线粒体清除不足,从而导致线粒体来源的ROS对AECs持续造成损害,所以治疗应该通过靶向线粒体的抗氧化剂,降低ROS水平。靶向线粒体的抗氧化剂包括mitoQ、mito-TEMPO、吡咯喹啉醌和SkQ1,这些药物目前正处于治疗其他年龄相关疾病的临床试验中。在体外mito-TEMPO可以抑制由CSE诱导的AECs线粒体功能障碍和线粒体ROS的释放。在慢性氧化应激小鼠模型中,mitoQ治疗可降低气道高反应性、中性粒细胞炎症和肺部炎症介质,可以防止细胞衰老。虽然尚无COPD患者的临床研究报道,但靶向线粒体的抗氧化剂仍是一个值得期待的延缓COPD中AECs衰老的手段。 2.5 Senotherapy 衰老细胞处于细胞周期停滞状态,并且会抵抗细胞凋亡而难以清除。所以选择将衰老细胞推向凋亡程序并随后清理是一种理想的除害方式。一些被称为抗衰老的药物已经被开发出来,它们通过抑制抗凋亡蛋白BCL-2将衰老细胞转变为凋亡细胞,而不会显著影响非衰老细胞的生存能力。强心苷通过抑制Na+/K+ATP酶抑制Bcl-2家族蛋白从而表现出对p16INK4a阳性的AECs选择性的抗衰老。多种抗衰老药物的潜力已经在老年小鼠中得到证实,这些药物可以减少衰老细胞的积累,减少炎症介质,延长寿命,抗衰老疗法的临床研究正在进行中,期待能为COPD中AECs衰老提供新的突破口。三、小结 越来越多的证据表明,COPD中的AECs衰老与DNA损伤、氧化应激、慢性炎症、线粒体自噬受损的机制密切相关(Fig 2)。衰老的AECs渗漏出的SASP介质和线粒体ROS也能够进一步促进邻近细胞的衰老,这也解释了COPD为何是一种加速衰老的疾病。各种针对AECs衰老途径的抗衰老疗法正在开发中,计划通过推动衰老的AECs凋亡来特异清除它的Senotherapy也横空出世。对于复杂的衰老的途径和下游效应,采用细胞外囊泡递送的靶向治疗具有很大的潜能,当然这些疗法的临床试验具有挑战性,因为COPD是具有多种疾病机制的进行性疾病。进一步了解衰老的机制,以及它们的重叠和对COPD发病机制发展的贡献,将有助于开发更多可以逆转疾病过程和预防疾病的新疗法。       贾晓周，毕业于河北医科大学，中西医结合、临床医学双学历，后于辽宁中医药大学附属医院进修，曾就职于辽宁航空航天附属医院，曾受聘于北京至道中医研究院任副院长，重庆慢性呼吸系统病防治中心会诊专家、国家生活方式医学领域专家顾问，传统武式太极拳精英传承人，世界医疗健康管理协会会员，长年从事创新性医药领域及临床诊疗技术应用学术研究工作。    目前主要从事呼吸领域相关疾病临床诊疗进展、儿童生长发育及慢性骨病中西医联合诊疗领域科研工作，国内外先进特色诊疗技术挖掘及整理。曾参加中国咳嗽诊疗指南万里行巡讲，作为“气道炎症专场”特邀专家，2018年发起“中国基层咳嗽诊疗指南万里行”活动，2020年发起“中国基层儿童咳喘病全国巡讲”活动，2021年发起“中国基层慢病规范化诊治”全国巡讲活动，2023年新冠病毒感染及其并发症的临床规范化诊治方案更新，推进基层《新冠感染咳嗽专科门诊》、《呼吸慢病专科门诊》等专科门诊机构的建立，2025年进行关于儿童生长发育及慢性骨病中西医临床最新诊疗模式进展探究，深入研究“疏木六君子汤”“清肺汤等”在呼吸及相关肿瘤领域的应用进展，进一步提升最新生物制剂相关特效雾化治疗方案相关难治性、难愈性呼吸系统疾病治疗，推进基层“气道炎症计”呼出气一氧化氮精准化气道炎症水平测定及指导相关呼吸系统疾病中西医结合治疗方案。立足于目前临床最新医学进展领域：阶梯式治疗方案、呼吸免疫治疗方案、上下气道同治治疗方案、精准化诊治治疗方案、常见病快速评估等及针对中西医结合临床一线指南推荐用药等做全面总结研究，以帮助更多的同仁完成科学、精准、规范的诊治，开展更多医疗领域学术交流会议，推进常见多发病的预防、科学的健康管理新理念。