TC-I

导读：HPV（人乳头瘤病毒）是一组无包膜的小 DNA病毒，属乳头瘤病毒科，只感染人类，不对其他动物致病。HPV根据感染部位不同可分为嗜皮肤组和嗜黏膜组两大类。嗜黏膜组又根据感染后诱变的良恶性不同，可划分为：诱导上皮组织恶性增生的高危型HPV(例如，HPV16，HPV18等)和诱导上皮组织良性增生的低危型HPV(HPV6，HPV11等）。高危型HPV感染与颈部、肛门生殖器和口咽部恶性肿瘤有关。HPV16是迄今为止全球引起浸润性宫颈癌的主要类型。预防性HPV疫苗（例如 Gardasil 和 Cervarix）已被证明可有效预防 HPV感染，但对预先存在的HPV感染和相关病变没有任何治疗效果。当前对HPV相关的高级别癌前病变和早期癌症的治疗仅限于手术切除，同时存在许多并发症。对于晚期癌症，手术、放疗和化疗效果较差。因此，开发有效的HPV治疗性疫苗来抑制HPV相关癌症的进展变得非常迫切。 HPVE6 和E7是病毒癌蛋白，在HPV感染的癌前细胞和恶性细胞中组成型表达，是理想的肿瘤特异性抗原。最近，几种针对E6和E7的HPV治疗性DNA疫苗通过电穿孔给药可以诱导 CIN2/3 患者高级别宫颈病变的完全消退和病毒清除。这些试验表明，诱导全身性多功能CD8 + T细胞反应的程度是组织病理学消退和清除HPV感染的主要决定因素。 2009年，中国医学科学院基础医学研究所许雪梅团队编码修饰E7和人热休克蛋白 70 （mE7/HSP70）的HPV融合DNA疫苗诱导 E7 特异性 CD8+T 细胞反应。2024年5月13日，许雪梅团队在Research Square上传文章：Enhanced the immunity activity of HPV16 DNA vaccine by the combination CpG oligonucleotides adjuvant cloned into plasmid backbone and IL-28B gene adjuvant，他们采用多种策略，包括将CpG寡核苷酸（ODNs）插入疫苗载体骨架、选择细胞因子基因佐剂、将mE6/HSP70和mE7/HSP70的组合、电穿孔疫苗接种，以进一步提高HPV16 DNA疫苗的免疫效果。 01 DNA疫苗佐剂-细胞因子 为增强该HPV DNA疫苗的免疫活性，研究人员想采用细胞因子基因佐剂。先前已有研究证明L-12、IL-15、IL-28B、IFN-γ 和 GM-CSF 等细胞因子的佐剂活性。然而，在不同类型的疫苗或者不同的接种方式背景下，同一细胞因子的佐剂活性往往是不可预测的。IL-15基因佐剂可显著促进HIV DNA疫苗和克氏锥虫DNA疫苗的特异性CD8+T细胞反应。虽然IL-28B基因佐剂能显著增强HIV DNA疫苗、HSV DNA疫苗和流感疫苗的CD8+T细胞免疫反应，但对结核融合蛋白疫苗触发的免疫保护反应没有任何增强作用。GM-CSF基因佐剂显著增强了SARS-CoV-2 DNA疫苗、抗Lewis肺癌DNA疫苗和HPV16 E6/E7 DNA疫苗的免疫活性，但显著抑制了日本脑炎病毒DNA疫苗诱导的抗体水平和保护作用。 许雪梅团队曾经证实过IL-15质粒可增强HPV DNA疫苗触发的CD8+T细胞免疫反应，而在此次研究中首次采用使用IL-28B质粒作为HPV DNA疫苗的佐剂。将质粒 mE7/HSP70 与 IL-28B 质粒或 IL-15 质粒或生理盐水混合，采用电穿孔的方式注射到小鼠的股四头肌中，间隔10天，注射两次。最后一次注射后七天，分离脾细胞并用E749-57肽刺激 40 小时。 IFN-γ ELISpot 测定结果显示，加入 IL-28B 或 IL-15 能够显着增加 E7 特异性 IFN-γ 释放。与IL-15佐剂相比，加入IL-28B佐剂可诱导更高的IFN-γ释放。此外，通过实时荧光定量 PCR 分析特异性颗粒酶 B 的 mRNA 水平。同样，与加入 IL-15 佐剂相比，加入 IL-28B 佐剂导致颗粒酶 B 的 mRNA 水平显著升高。因此，在mE7/HSP70 DNA疫苗中，IL-28B质粒佐剂比IL-15质粒更有效。 02 DNA疫苗佐剂-CpG寡核苷酸 CpG ODN（寡聚核苷酸）是TLR9的激动剂，通过刺激人B细胞和浆细胞样树突状细胞来增强适应性免疫反应。质粒DNA的免疫原性可能因骨架中CpG基序或ODN的存在而受到调节和增强。在人类中，已经确定了四类合成CpG ODN，它们在结构和免疫活性上有所不同，它们是A-、B-、C- 和P型。与A型和B型基序相比，在炭疽DNA疫苗中插入 C 型基序可增强更高的细胞介导和保护性免疫反应，而接种C型 CpG修饰疫苗的小鼠可增强 Th1偏向性 T 细胞反应。 这些研究表明，CpG 基序适合用作 DNA 疫苗中的“内置”佐剂。此外，研究人员发现添加更多的 CpG 基序拷贝会产生更强的佐剂效果。研究人员合成了一个对人免疫细胞表现出良好刺激活性的B型CpG 基序（5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3），将12 个拷贝的串联序列插入 pVAX1EI 的骨架中，以获得 CpG 修饰的载体 pmVAX1EI。 研究人员以 pVAX1EI （无 CpG 基序）和pmVAX1EI（ 插入CpG 基序）分别为骨架，构建编码mE7/HSP70的两种质粒：pmVAX1EI-mE7/HSP70和pVAX1EI-mE7/HSP70。同时，还构建了编码IL-28B的两种质粒：pmVAX1EI-IL-28B和pVAX1EI-IL-28B两种质粒。用上述质粒采用mE7/HSP70+IL-28B组合免疫小鼠，分离脾细胞并用 E749-57肽刺激。与 pVAX1EI （无 CpG 基序）相比，CpG修饰的质粒诱导的E7特异性IFN-γ更高，分泌的特异性颗粒酶 B 的 mRNA 水平也更高。因此，在后续实验中使用了CpG修饰的载体pmVAX1EI。 03 HPV 16 E6/E7 DNA疫苗联合免疫 目前，针对E7或E6癌蛋白的HPV16治疗性疫苗已有报道，而同时针对E6和E7癌蛋白的DNA疫苗相对较少。研究人员想知道在 IL-28B 基因佐剂存在下，E6/E7联合免疫的效果。研究人员发现，与单独接种 mE7/HSP70 或 mE6/HSP70 相比，接种 mE7/HSP70 +mE6/HSP70 诱导的分泌特异性 IFN-γ 的CD8+T 细胞数量显著更高，分泌特异性 IFN-γ 的CD8+T 细胞数量是单独mE6/HSP70或者mE7/HSP70免疫的3.8倍。在联合免疫的基础上，加入IL-28B佐剂更进一步增强分泌特异性 IFN-γ 的CD8+T 细胞数量。从上述结果来看，在IL-28B基因佐剂存在下，接种编码mE7/HSP70+mE6/HSP70的CpG修饰质粒可以诱导最有效的细胞免疫反应。 04 DNA疫苗在小鼠模型中的预防效果 在存在或不存在 IL-28B 基因佐剂的情况下，通过电穿孔对 C57BL/6 小鼠进行 mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫，以仅接种IL-28B基因佐剂质粒作为对照。C57BL/6小鼠（每组6只）通过电穿孔用15μg/质粒肌内注射接种两次，间隔10天。最后一次接种一周后，在右侧皮下注射 7.5×104 个 TC-1 细胞，然后每周监测两次肿瘤生长。在攻毒试验中，不管是否接种L-28B基因佐剂质粒，只要mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫的小鼠体内均没有肿瘤生长。相比之下，仅接种IL-28B质粒的小鼠在TC-1注射后16 天开始出现肿瘤，到第60天肿瘤的平均大小约为387 ± 18 mm2。 05 DNA疫苗在小鼠肿瘤模型中的治疗效果 每只小鼠皮下注射 7.5×104 个 TC-1 细胞在右侧。3天后，如上所述用质粒对小鼠进行免疫。然后每周监测两次肿瘤生长。在TC-1细胞攻击后的第14天，不管是否接种L-28B基因佐剂质粒，50%的mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫的小鼠体内无肿瘤生长。第32天，在IL-28B基因佐剂存在下，mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫小鼠的无瘤率高达100%，而在没有IL-28B基因佐剂的情况下，mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫小鼠的为67%。到第60天，仅接种IL-28B质粒的小鼠全长出现肿瘤生长，肿瘤的平均大小约为433±27mm2。上述结果表明，在IL-28B基因佐剂存在下，mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫对移植肿瘤表现出最强的免疫清除活性。 06 总结 DNA 疫苗在动物模型中已被证明是有效的，而 DNA 疫苗在人体临床研究中常常表现出没有够的免疫原性。因此，我们需要调节和增强DNA疫苗的免疫效果。有许多策略可以用来增加 DNA 疫苗的免疫原性，包括添加佐剂（细胞因子，CpG 基序，脂质体，脂多糖等），密码子优化，电穿孔及异源初免/加强免疫等。 在这项研究中，研究人员采用多种策略来提升HPV16 DNA疫苗的免疫治疗效果：将CpG基序插入质粒载体的骨架中，将mE7/HSP70质粒与mE6/HSP70质粒混合，结合IL-28B基因佐剂，电穿孔接种，可以显著增强CD8+T细胞特异性反应，从而根除C57BL/6小鼠已建立的移植肿瘤。 参考文献  [1] zhou Y, Zhang T, Wang Z, Xu X. Preprint from Research Square, 13 May 2024. https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-4338069/v1. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

侃言 近日，基因泰克在著名期刊Clinical Pharmacology & Therapeutics （医学Q2 | 药学Q1 | IF=6.7 TOP）上刊载了一篇重要综述，对比了过去10年间，FDA批准的肿瘤靶向共价抑制剂（TCIs）和可逆性抑制剂（RIs）临床药理学分析。 分别分析了各自的优势和不足，涉及靶点包括：蛋白酶体、BTK、EGFR、FGFR等。 01 近10年，共价抑制剂药物的复苏     近10年，见证了共价抑制剂药物的复苏。多种减轻随机共价结合相关的不良反应的方法在药物研发中的应用，刺激了共价抑制剂进一步的发展，尤其是在肿瘤治疗领域。 在过去，共价抑制剂最让人头疼的是不加选择地结合可接近的任何亲核残基，导致脱靶等毒副作用；而当前，TCIs使用弱亲电弹头、以及更加优越的设计性骨干支架作为亲和元件，有助于在目标蛋白质活性位点内选择性结合。 因此，增强的选择性减轻了主要脱靶的安全性问题，同时保留了TCIs关键临床优势，如延长药物靶点停留时间。 TCIs甚至应用于靶向集中重要的致癌蛋白，如以前被认为是“不可药物”的蛋白质，KRAS。 截至2023年12月，在肿瘤治疗领域已有12个TCIs获得FDA批准上市，针对6种不同类型的蛋白质靶标：蛋白酶体、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)、表皮生长因子受体(EGFR)、输出蛋白1（exportin 1）、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、和G12C突变的Kirsten大鼠肉瘤病毒蛋白(KRAS G12C)，如下图。 TCIs理论上的优势： 1、延长作用时间：TCIs通过与目标蛋白形成共价键，可能具有比RIs更长的作用时间，这取决于目标蛋白的周转率而非药物的半衰期。 2、更低的治疗剂量：由于TCIs具有更高的药理学效力，因此可能需要更低的剂量来实现治疗效果。 3、降低非特异性结合风险：TCIs设计为高度选择性地与特定氨基酸残基（如半胱氨酸和赖氨酸）反应，理论上减少了非特异性结合和相关不良事件的风险。 4、减少药物-药物相互作用（DDI）：由于高选择性和低剂量，TCIs可能具有较低的DDI风险。 那么，临床上的结果究竟是怎么样的呢？是骡子是马拉出来溜溜！ 基因泰克的研究人员从四个数据库（Disqover、drug@FDA、DrugBank、PubMed）中，对比了TCIs和RIs在以上四种预期的相关临床药理学特性。 02 TCIs与RIs在临床药理学特性的对比     研究人员根据两种方法对FDA批准的肿瘤治疗领域的TCIs和RIs的可用参数进行比较和对比: (i)在所有目标类别中进行汇总分析; (ii)酌情在各自的目标类别中进行分析; 近10年，在肿瘤治疗领域，共有12个TCIs、10个RIs获得FDA批准，如下表。 PK参数对比：吸收、分布、代谢、消除 （a):TCIs、RIs达到最大浓度的时间 （b):血浆中未结合的组分 （c):PK半衰期 （d):血浆总放射性(TRA)半衰期/PK半衰期比 通过以上对比，总体而言，除了PK半衰期、和TRA半衰期/PK半衰期比存在统计学差异外，TCIs和RIs之间的ADME性质基本相似。 未结合AUCss及其临床疗效终点 如下图a，计算了每个靶点类别的未结合曲线下面积（AUCss）和临床疗效终点。其中，为了排除潜在的混杂效应，以下比较中只纳入了7个TCIs和6个RIs。而且在表1中列出了患者的详细信息和给药方案。 通过以上图表的对比，总体而言，TCIs的未结合AUCss显著低于RIs，TCIs的中位ORR（客观有效率）、DoR（反应持续时间）、PFS（无进展生存率）普遍优于RIs。未结合的AUCss和中位DoR均具有统计学意义。 总体安全分析和暴漏-安全关系 如下图b，总结了TCIs和RIs的总体安全性分析、和安全-暴漏（E-F）关系分析图。其中根据每个靶标类别中几个常见不良反应(AE）百分比不低于3进行了安全性分析。 根据上图，7个TCIs中有5个在统计上有显著的E-S信号；6个RIs中也有5个报告了统计上显著的E-S信号。在某些不良反应中，如EGFR抑制剂导致的腹泻和皮疹、FGFR抑制剂导致的高磷血症等，TCIs似乎显示了更高的不良反应。 然而总体而言，不良反应的概率和暴漏-安全关系方面没有明显的差异。 体外酶/转运体抑制以及DDI数据 如下表，总结了TCIs和RIs的体外酶/转运体抑制数据、以及药物-药物相互作用（DDI）数据。在所有治疗靶点类别中，TCIs和RIs体外酶抑制数据未显示有任何显著模式。除dacomitinib外，每种药物的报告IC50或Ki值从低nM到高μM(或μg/ mL)不等，与抑制剂类型(TCI或RI)无关。 总的来说，体外酶/转运体抑制数据和DDI数据对TCIs和RIs没有差异。 03 总结：药代动力学、疗效、安全性对比    药代动力学（PK），包括ADME分析 首先，TCIs和RIs的达到最大浓度的时间（Tmax）范围大体上重叠； 其次，两种抑制剂中具有临床相关食物效应（FE）的药物数量相当； 再者，由于口服吸收后的药物分布可能在一定程度上收到血浆蛋白结合的影响，比较TCIs和RIs的游离组分，均观察到大量血浆蛋白结合（>80%）； 此外，TCIs血浆TRA半衰期比起PK半衰期高出数倍，而RIs的血浆TRA半衰期或多或少与它们的PK半衰期相似。这表明共价弹头可能导致于血浆蛋白的非特异性结合增加。 有效暴露和疗效终点对比 主指标为AUCss、DoR、PFS，次指标为ORR。 TCIs的未结合AUCss显著低于RIs；TCIs的中位ORR（客观有效率）、DoR（反应持续时间）、PFS（无进展生存率）普遍优于RIs。 安全性对比 总的来说，TCIs和RIs之间常见的≥3级AE发生率相似。 但有一个例外，在FGFR类别中，TCI（福替替尼）的≥3级磷血症发生率似乎比RI（培伽替尼和消炎替尼）高得多。 但是总的来说，也没有足够的证据表明由于TCIs脱靶结合减少而得出安全性获益的结论。 就DDI分析而言，也没有足够的证据表明由于共价弹头于CYP酶的非特异性结合，TCIs成为CYP抑制剂的可能性就增加。也就是说，TCIs与RIs在DDI风险上，似乎没有区别。 然而，以上分析仅仅从近10年获得FDA批准的肿瘤治疗领域的TCIs和RIs出发，可能有些限制。 首先，对应的样本量可能比较小； 其次，分析数据仅限于FDA监管文件和公开文献信息； 第三，数据来源的患者群体和药物方案来自不同的研究，可能具有差异性。 然而，也有几点是值得注意的。 如果蛋白质周转率（或PD半衰期）而不是药物PK半衰期确实影响TCIs的临床疗效，那么在未来的TCIs项目中可以评估较少的给药方案。 受体占用指标应继续用于支持TCIs的剂量选择。从目标接触跟踪的角度来看，TCIs比RIs具有优势，因为与蛋白质目标结合的TCIs部分可以很容易地跟踪，例如液相色谱-质谱法。 最后，尽管出现了蛋白质降解剂，但鉴于TICs优越的类药特性，应该仍然具有相关性，值得重点关注。最近越来越多的TCIs批准，也可能会推动进一步推动对TCIs研发的热情和投入。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓