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1.冻干原理近年来，生物制品发展迅速，尤其是抗体药物、抗体偶联药物、疫苗等生物制品非常火热，因其理化性质不稳定，需制剂冻干后保存，从而使得冷冻干燥技术备受关注[1]。冷冻干燥，全称真空冷冻干燥，简称冻干，是指将含有大量水分的物料预先进行降温，冻结成冰点以下的固体，在真空条件下使冰直接升华。从而去除水分得到干燥产品的一种技术。冻干原理见图1，即水的三相图[2]。图1.冻干原理图2.常见的冷冻干燥药物抗体药物：部分抗体药物在溶液状态下存在化学不稳定性和物理不稳定，如降解和氧化等，从而导致其生物活性下降。冻干可以降低抗体制剂中水分含量，从而减少蛋白质降解、提高稳定性、实现无冷藏储存和处理以及显著延长抗体有效期[3]。自1986年首个单克隆抗体（Orthclone）上市，截止2021年2月，已有超过125种抗体药物被FDA批准上市。在所有136个制剂配方中，36个为冻干粉剂型，占比超过25%。全球首个抗PD-1药物Keytruda，首个HER2阳性乳腺癌生物靶向药物Herceptin，首个全人源的肿瘤坏死因子拮抗剂Enbrel等知名重磅药物，均为冻干剂型。图2. 上市抗体制剂处方统计抗体偶联药物（ADC）：冻干可最大限度减少运输和储存过程中的连接细胞毒性药物和抗体的接头的不稳定性，如表1所示，目前除最新获批的Elahere外，其余FDA批准的ADC药物均为冻干制剂[4]；表1.全球批准上市的15款ADC药物（数据来源于phirda.com/artilce）疫苗：其在液体制剂中可能会发生多种物理降解途径（如变性、解折叠、聚集、沉淀和吸附）或化学反应（如氧化、脱酰胺和水解）而不稳定，严重影响疫苗的效力。因此，通过冷冻干燥去除水分可以抑制或干预这些途径来增加减毒病毒、细菌或其他抗原成分的稳定性，以期能延长保质期，提高储备稳定性[2]。3.冻干处方筛选及工艺研究3.1 冻干处方筛选处方是进行冻干工艺研究的基础。在研究冻干工艺之前，需先充分研究处方的原料、辅料等，如尽量选择共熔点较高的冻干保护剂以利于升华阶段的顺利进行，缩短冻干时间；选择合适的抗氧化剂、酸碱调节剂以保证冻干制剂的稳定性等[5]。常用赋形剂的功能性及物理状态见表2。表2.常用赋形剂的功能性及物理状态在冻干过程中，活性成分和赋形剂之间具有复杂的相互影响，不同的浓度，不同的比例，不同的种类等都会引起一些结构状态的变化，从而导致其原本的功能丧失，比如：若海藻糖结晶会导致保护功能的丧失；若甘露醇变为无定形结构，会降低产品的关键温度，并且无定形态具有较差的稳定性，丧失了其作为填充剂的功能；若缓冲液成分结晶，会导致pH值的变化，缓冲功能丧失，蛋白稳定性受到影响。因此研究各个配方组分之间的相互影响作用对确保最终产品的质量具有较大的作用。同时基于平台经验及先验知识，选择合适的冻干处方，确定产品的关键温度（如Tc、Tg’、Te、Tg）[6]，然后进行冻干工艺的开发。3.2 冻干工艺开发冻干工艺主要包括预冻、退火、一次干燥、二次干燥等工艺过程，其中一次干燥为升华干燥，去除自由水，二次干燥为解析干燥，去除部分结合水[7]，典型的冻干曲线及产品变化见图3。图3. 冻干曲线及产品变化图预冻：预冻就是将溶液中的自由水固化，赋予干燥后产品与干燥前相同的形态，防止抽空干燥时起泡、浓缩、材料收缩和溶剂迁移等不可逆变化发生，尽量减少与温度相关的活动，特别是要避免会引起活性丧失的活动[5]。预冻温度的设置，主要是通过检测其结晶温度制定的，结晶温度可以通过DSC、冻干显微镜进行检测，一般预冻温度的设置低于结晶温度10~20℃，时间为1~2h。退火：退火是预冻阶段一个重要的工艺方法，其可以有效的缩短冻干周期和解决一些冻干外形问题。退火是指将冷冻的样品温度降至高于玻璃态转变温度，低于共晶点温度,并维持一段时间。退火工艺最直接的好处就是通过晶型重组，能够改变冰晶的形态和大小分布，原来的小冰晶重组变成了大冰晶，从而在一次干燥阶段促使水快速升华。一次干燥：一次干燥（升华干燥）主要是使样品中冻结的自由水升华逸出。通常情况下，一次干燥温度设置为比冷阱温度高25℃，比塌陷温度低5或者10℃，真空度设置为10~30Pa。当确认所有的冰都去除时，即可终止一次干燥。不充分的一次干燥并较早进入二次干燥会导致产品塌陷或回融，而过长的一次干燥时间则带来不必要的周期延长，因此判断一次干燥的终点是十分重要的。常见的一次干燥终点判断方法有以下三种：1.观察水迹线：在升华干燥结束时，干燥层和冷冻层之间的分界线到达瓶底并消失；2.产品温度和板层温度：通过监测板层和样品的温度曲线来确定，此时产品温度上升到接近板层的温度并趋于稳定。3.压力升法：在实验室和生产规模的冻干机上均可以用皮拉尼压力计来确定一次干燥的终点，表现为皮拉尼压力在一次干燥结束时急剧下降，如图4。图4.一次干燥过程中典型的皮拉尼压力曲线二次干燥：二次干燥主要是去除部分结合水，水分降低至1%左右，二次干燥的温度通常在20~50℃，时长通常为3~24h。二次干燥终点判断的主要方法有压力检测法、温度检测法、称重法和卡尔费休检测法等。4.冻干工艺放大中试放大的核心是让产品在实验室和工业冻干过程中，维持相似的热历史，传输到产品热量和干相物质的阻力要类似[9]。在冻干工艺放大过程中，需要重点考虑研发冻干设备与工业冻干设备的差异点及工作环境不同的影响。在冻干工艺放大时需要重点考虑以下参数[10]：1.工作环境不同：生产环境中存在的颗粒（洁净度的高低）会对冷冻产品的结构产生很大影响，其会作为过冷发生时的晶核，影响产品的过冷温度，形成不同尺寸的晶核，最终影响了干相物质的阻力，需使用洁净的包材及溶剂等以减少该因素的影响。2.实验室与工业冻干的过程规范不同：实验室过程必须和工业类似，需使用相同的包材、API、辅料和溶剂，相似的配液过程和时间，并进行类似的板层设计等来尽量消除该因素带来的影响。3.热辐射的影响不同：不同于实验室，生产规模的冻干机的不锈钢门、较厚的保温层及更小的表面热辐射，会带来较低的边缘瓶效应（受较大热辐射）。4.装载量不同：装量越小，则边缘瓶数量占比越高，且实验室冻干机的保温层薄于生产型冻干机，这都将在实际工艺放大过程中带来巨大影响。5.实验室设备和工业设备不同：需研究两者在类似的工艺条件下的表现，产品有相同的过冷温度是放大的基础，工业冻干机冷阱的捕冰能力也需确定。6.设备工作能力限制不同（升华速率测试）：高升华速率情况下的真空控制是设备工作能力的一个主要指标，升华速率测试以确定冻干机的局限性和能力。总结随着生物技术的不断进步，冻干技术在生物制药行业的应用愈加广泛。伴随着冻干保护机制的研究逐步深入，冻干技术也在不断的完善和进步。对于生物制品例如抗体药物的质量表征和稳定性机制还需要更加深入的研究和认知。而对冻干工艺过程中的某些参数，比如压力、复溶后产品的结构表征和性质是否发生改变等报道甚微，还需要更深一步的了解。尽管冻干技术还有许多问题等待进一步研究和解决，但冻干技术仍是保持生物制品稳定性的最有效方法。将来开发更加优越的冻干保护剂，提高生物产品的质量是冻干技术的研究热点之一。参考文献[1] Ambarish, Shah, Sajal, Manubhai, Patel, Brian, Lobo. Practical Considerations for Freeze-Drying Process Design, Development and Scale-Up[J]. American pharmaceutical review, 2013, 16(6):78-83.[2] K. Tetsuo, N. Norihiro, ANTIBODY-DRUG CONJUGATE PREPARATION AND LYOPHILIZATION FOR SAME, 2021.[3] E. Cho, B. M. Mayhugh, J. M. Srinivasan, G. A. Sacha, S. L. Nail, E. M. Topp. Stability of Antibody Drug Conjugate Formulations Evaluated Using Solid-State Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2021.[4] V. Kett. Freeze Drying of Protein Pharmaceuticals[J]. 2003.[5] R. Bettini. Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products[J]. Journal of Controlled Release, 2000, 68(1):135.[6] 王军志. 生物技术药物研究开发和质量控制[M].生物技术药物研究开发和质量控制, 2007.[7] Wei, Wang. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2000, 203(1-2):1-60.[8] 史迁, 药品冷冻干燥过程的终点判断和残余水分的测量方法简介, 第九届全国冷冻干燥学术交流会, 2008.[9] S. Rambhatla, S. Tchessalov, Michael J Pikal. Heat and Mass Transfer Scale-Up Issues during Freeze-Drying, III: Control and Characterization of Dryer Differences via Operational Qualification Tests[J]. AAPS PharmSciTech, 2006, 7(2):E39.[10] S. U. Sane, C. C. Hsu. Considerations for Successful Lyophilization Process Scale‐Up, Technology Transfer, and Routine Production[M].Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing Biopharmaceuticals, 2010.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。