CD19 CAR-T CELLS(Gaia Science)

同写意20岁庆！第五届全球生物医药前沿技术大会报名开启！“意”同创新，穿越周期。7月中旬，苏州金鸡湖畔，让我们与“新药写意人”一起为中国医药创新“同写意”！5月初，阿斯利康宣布完成对法国基因疗法公司Cellectis高达1.4亿美元的增值投资，再次将Cellectis带到了众人眼前。如果用一条曲线来描绘Cellectis的发展之路，走势可以说是陡峭的。Cellectis成立于1999年，最初专注于基因编辑技术的开发。通过引入曾经风光一时的第二代基因编辑技术TALEN，研究通用型CAR-T疗法受到追捧。但没两年，CRISPR技术横空出世，风靡整个生物界。TALEN迅速被CRISPR光芒掩盖，而将TALEN作为核心技术的Cellectis不出意外地没落了，一度濒临破产。不过，作为通用型CAR-T细胞研发的先行者，Cellectis又神奇地翻过了崎岖的山头。2015年，Cellectis一款通用型CAR-T产品成功救治一名患白血病的1岁小女孩，患儿获得了CR且5年未复发，引起极大关注。Cellectis绝处逢生，并在当年成功登录美国纳斯达克。好景不长，这款救起Cellectis的产品后继无力，曾经看好它们的公司也在不同程度上“撤退”。2022年，Cellectis带着UCART20x22重新进入业界视野。当年8月，它宣布FDA已批准一项IND申请，以启动对复发或难治性非霍奇金淋巴瘤患者的临床试验，2023年披露的数据非常亮眼，但也没能拯救日渐低迷的市值。自上市以来，Cellectis市值蒸发超过90%。截至5月10日收盘，其市值为2.20亿美元。从二级市场的反应来看，大家显然对Cellectis技术和产品的未来有些担忧，毕竟数据再好，没有一款上市产品是个不争的事实，且通用CAR-T暴露出来的极大的安全风险问题，以及CRISPR技术的“碾压”，无疑给Cellectis施加了多重压力。在获得阿斯利康投资前，Cellectis手上的现金流已经难以支撑公司继续走下去。1一眼定余生Cellectis的核心技术是转录激活子样效应子核酸酶——TALEN（transcription activator-like effector nuclease），也称为第二代基因编辑技术，在2011年引入自爱荷华州立大学和明尼苏达大学。图源：Cellectis官网TALEN技术诞生于2009年，彼时，在第一代基因编辑技术锌指核酸酶技术（ZFN）的垄断和技术局限性下，科学家们在基因编辑领域已经困扰多年。该技术基于一类从转录激活因子样效应物（TALEs）衍生的蛋白质，这种用于基因编辑的核酸酶结构是一种融合蛋白，一部分来自转录激活物类似的特殊效应器TALE，另一部分是可以与II型限制性内切酶的核酸酶域相融合的部分，可以定位在特异的DNA序列上。TALENs结构示意图TALEN具有的高精度和设计简便性，一出现便迅速霸榜基因编辑领域，直接取代了ZFN，收获一众“粉丝”。2011年，Nature Methods将TALEN技术列为年度技术，Science紧随其后，2012年将之列入年度十大科技突破，针对该文的评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的美誉。很快，各大生物公司相继推出自己的TALEN产品。Addgene机构出售单个TALEN质粒，Golden Gate拥有TALEN 2.0试剂盒（来自Dan Voytas实验室），Life Technologies可提供定制TALEN——GeneArt Precision TAL。Cellectis的子公司Cellectis Plant Sciences和Cellectis Bioresearch也分别推出了开发农业用途的TALEN，以及出售定制和预制的酶。Cellectis则致力于将TALEN应用到研发通用型CAR-T产品中。但操作繁琐、实用性受限（没有为可能寻找的所有基因序列创造核酸酶，且可能无法做到）和脱靶等问题阻止着TALEN技术的进一步提高，也限制了其应用和推广。更致命的是，CRISPR出现了。拥有诺贝尔奖加成的CRISPR操作简便、周期短、成本低，目前已成为主流的基因编辑工具。被追捧的永远只有第一名，但Cellectis很专一，依然继续在研究TALEN这把“剪刀”。2“通用”难成药去年底，全球首款CRISPR基因编辑疗法Casgevy获得FDA批准治疗镰状细胞病，再次将CRISPR推上流量顶峰。随着CRISPR基因编辑技术的热度越来越高，属于Cellectis的光环也越来越淡。不过Cellectis执着于TALEN的原因也很简单，他看好这项技术在通用型CAR-T中的前景。2015年，在合作产品UCAR-T19（通用CD19 CAR-T）的临床试验中，1岁小女孩Layla Richards被成功救治，Cellectis因此收获了无数鲜花和掌声，也肯定了自己的努力方向。但短暂的流量过后，Cellectis陷入了长久的沉寂。之后的时间里，这家公司的通用型CAR-T频繁爆出严重的安全事件，3年内经历了2次“死亡危机”。2017年，在Cellectis针对母细胞浆样树突状细胞瘤和急性髓细胞性白血病患者开展的I期临床试验中，一名患者在接受UCRAT123治疗的第8天经历了5级CRS和4级CLS（毛细血管渗漏综合征），并在第9天死亡。第二次的死亡事件发生在2020年，另一款通用型CAR-T（UCAR-TCS1A）的临床试验中。一名多发性骨髓瘤患者接输注UCAR-T CS1A出现CRS，并在治疗25天后死于心脏骤停。通用型CAR-T的安全性问题并不是个例，除了Cellectis之外，Allogene、CRISPR Therapeutics等头部通用型CAR-T企业也经历了不同程度的安全性事件。2022年，来自Celyad Oncology的一款同种异体CAR-T疗法CYAD-101-002的Ib期临床试验收到了两起死亡案例报告，决定自愿暂停临床试验。2021年，一位患者在接受Allogene旗下的同种异体CAR-T候选药物ALLO-501A治疗后，出现1级CRS和2级ICANS两种不良反应，在为评估全血细胞减少症而进行的骨髓活检中检测到了染色体异常，这一现象或许会导致患者发生癌症风险。刚声名鹊起的CRISPR Therapeutics也未能幸免。2020年，一位患者在接受其通用型CAR-T细胞疗法CTX110治疗52天后死亡。当然，也不都是坏消息。2022年底，来自Atara的Ebvallo （tabelecleucel）获EC批准在欧盟上市。作为全球唯一一款UCAR-T疗法，Ebvallo还是带给了业界不少信心。3合作焕发新生？Cellectis如今的股价已经跌到地板，阿斯利康增持之前，现金流也已捉襟见肘。与略显窘迫的现状不同的是，这家法国公司也曾是业界眼中的“香饽饽”。在UCART19成功救治白血病女孩的前一年，施维雅（Servier）和辉瑞就对这家法国生物技术公司抛出橄榄枝，分别用1000万美元、8000万美元的预付款开始了一段相伴之路。辉瑞更在后来收购了Cellectis少部分股份，并在2015年初被传闻考虑收购该公司。值得一提的是，与Cellectis合作开发通用型实体瘤的Allogene，在当时也拥有一部分开发和商业化UCART19的独家权利。不过，UCART19的成果表现有限，施维雅更是于2022年直接退出了该项目。在癌症患者中，CAR-T细胞疗法有严重的副作用，可能导致致命的CRS和神经毒性。但在自身免疫性疾病中，这些似乎是可管理的。去年底，Nature报告了CAR-T治疗自身免疫性疾病取得的突破。根据美国血液学会会议上公布的数据，CAR-T疗法让15名患有自身免疫性疾病的患者重获新生。阿斯利康也许正是看中了Cellectis技术在自身免疫性疾病中的可能性。此番布局CAR-T赛道，从Cellectis角度来说，Baird分析师Jack Allen的评价是“交易的完成是积极的”，因为这至少维持Cellectis运营到2026年。Cellectis也不需要使用自己的资金来开发交易中涉及的药物。早在2023年11月，Cellectis就与阿斯利康达成合作协议，得到后者2.45亿美元投资。当时Cellectis的股票大涨约180%。此次阿斯利康的增资之后，Cellectis一共交出了44%的股份，30%的投票权以及两个董事会席位。目前，Cellectis有三个全资拥有的CAR-T候选项目正在针对血癌进行临床开发，预计2024年将分享每个项目的最新数据。Cellectis的目标是确定针对CD22和CD20xCD22的CAR-T细胞疗法的二期推荐剂量，并分享其CD123资产的双剂量数据。Cellectis CAR-T疗法在研管线，图源：Cellectis官网自免之外，Cellectis也在寻找新的化合机会。2021年，Cellectis和Cytovia Therapeutics两次宣布合作，用于开发TALEN基因编辑的iPSC衍生NK细胞（iNK）和CAR-NK细胞，以最大限度地降低脱靶效应的风险并释放NK细胞的全部潜力，进行细胞治疗。这家法国企业成立的时间不短，但一直在大幅的起落之间穿行，前路依然扑朔迷离，期待他的坚守能够换来成功。参考文献：1、AstraZeneca ups stake in Cellectis in latest cell therapy bet；biopharmadive2、阿斯利康“搭救”通用CAR-T先驱；药渡3、基因编辑III TALENs；万悟Ethereal4、基因组编辑三大利器：TALEN、ZFN和CRISPR/Cas；癌图腾5、Nature报告：“一切都消失了！”CAR-T治疗红斑狼疮、重症肌无力等自身免疫性疾病取得突破性效果更多优质内容，欢迎关注↓↓↓

近年来，CAR-T细胞治疗作为一种全新的肿瘤治疗手段，治疗效果优异，但是由于CAR-T治疗的生产成本、价格成本，使得CAR-T无法实现更大范围的供应，这也是CAR-T的销售增长缓慢的一大原因。延伸阅读：CAR-T 2022年大考成绩出炉！为了降低CAR-T生产成本，提高市场竞争力，研发人员进行了大量的工作，包括同种异体CAR-T、CAR-T自动化生产、CAR-T快速制备、体内CAR-T等等。延伸阅读：体内CAR-T细胞的技术路线CAR-T的快速制备，能够缩短生产时间，降低成本，包括生产空间和生产设备，以及人工费用等，能够大幅度缓解传统CAR-T生产所需要的生产资料，可以供给更多批次。CAR-T快速制备的机会当前全球范围内已有多款CAR-T产品获得批准上市，其大致生产制备流程基本相同：单采-分选-激活-转导-扩增-收获-包装和冻存-放行质检-回输。分选纯化：对单采产物进行T细胞分选纯化，获得目标的T细胞亚群，同时去除杂质，例如红细胞、抗凝剂等；激活/活化*：一般采用激活磁珠进行T细胞激活，然后将其放置于二氧化碳培养箱进行激活培养，T细胞激活能够提高CAR的转导率；转导CAR：完成激活的T细胞将进行CAR的转导，一般是通过病毒载体（慢病毒或逆转录病毒等）进行CAR的转导，使得T细胞转化为CAR-T细胞；扩增*：转导后，CAR-T细胞需要在生物反应器当中进行细胞扩增，直到细胞达到收获标准，包括活细胞数、体外效价、T细胞纯度；收获：收获工序包括清洗、去磁珠。包装和冻存：收获工序完成后，将在生物安全柜内完成分装，随后被保存于气相液氮罐中，放行质检合格后通知临床做回输准备。以上工序通常需要10-14天的工作时间，其中以细胞扩增所需的时间较长，为5天左右。延伸阅读：CAR-T生产工艺流程及优化考量在以上六个程序当中，CAR-T快速制备的机会在于激活与扩增这两个环节，通过删减和简化这两个环节，能够实现CAR-T在1-2天内的快速制备。挑战与一些解决方案但是激活与扩增两个环节在CAR-T细胞的生产中也具有重要意义：激活*：细胞激活能够促进CAR转导效率，静止T细胞的转导效率较低。如果要跳过或者优化这个环节，就必须解决静止T细胞的CAR转导效率过低的挑战。在现有的方案当中，对于这个环节有三种解决方式：a.使用具有更高转导效率的CAR基因载体；b.使用白介素等细胞因子进行促进转导效率；c.T细胞选用记忆T细胞，有部分研究显示，在不经活化的所有T细胞亚群中，记忆T细胞对CAR的转导率是最高的。扩增*：现在CAR-T剂量在106左右，通常从肿瘤患者体内采集到的T细胞数量制备成的CAR-T数量不足（主要也是CAR转导率低导致的），为了满足剂量要求达到最优疗效，需要在体外进行细胞扩增。因此快速制备平台还需要保证回输的CAR-T细胞剂量更低的同时，疗效不劣。不过由于快速制备不需要进行T细胞扩增，充分保留了T细胞干性，使得其在体内也可以进行一定的扩增，并且可能可以增强肿瘤细胞的清除效果。如何去考量和解决激活和扩增环节缺失，就成了CAR-T快速制备的关键，也是各家快速制备平台不同。举例：几个不同的快速制备平台（1）诺华 T-charge国际上，以诺华的CAR-T快速制备平台T-charge最为知名。T-charge平台的信息公开不多。根据诺华官网查询，T-charge平台删减了传统CAR-T细胞生产环节中的扩增部分，不需要在生物反应器当中进行CAR-T细胞扩增，而是将该环节置于患者体内。该平台能够保留T细胞干性，从而使得CAR-T产品具有更大的增殖潜力，以及更少的T细胞耗竭。这些特点可能会改善患者的预后，降低严重不良事件的风险。此前，诺华公布了其基于T-charge平台设计的一款靶向CD19的CAR-T细胞YTB323（rapcabtagene autoleucel）的数据，其door-to-door时间大约为10天左右；在DLBCL患者中CR（Month 3）可达到73%。延伸阅读：CAR-T“自卷”：生产周期降50%，剂量降25倍，CR73%（2）亘喜 FasTCAR在国内，亘喜生物的FasTCAR是进行比较早的CAR-T快速制备平台。根据公开资料，亘喜生物FasTCAR平台将传统生产中的激活、转导两个步骤简化和优化成同时进行，并且删减了扩增环节。FasTCAR平台利用专有的XLenti载体，同时激活和转导处于静息状态的T细胞。此外，亘喜生物表示，由于FasTCAR平台的产品具有较高的扩增和肿瘤细胞清除活性，因此可去除CAR-T细胞体外扩增的步骤，可以直接回输给患者。值得注意的是，亘喜生物基于FasTCAR平台开发的GC019F（CD19 CAR-T）和GC012F（BCMA/CD19 CAR-T）均已获得国家药品监督管理局的临床批件。（3）宾大团队 慢病毒转导静止T细胞2022年2月，宾大研究团队发表在期刊Nature Biomedical Engineering上的研究，就是一个经典的CAR-T快速制备方式。在该研究当中，研究人员通过慢病毒载体直接对静止T细胞进行转导，通过IL-7和IL-15等细胞因子的细胞培养基能够解决静止T细胞转导效率低下的问题，提高转导效率。此外，还可以通过工程病毒载体表达IL-7提高静止T细胞转导效率。同时，低浓度的核苷酸和其他限制性因子（如SAMHD1）均可限制静止T细胞逆转录率。小鼠模型中，通过这种方式设计的CD19 CAR-T可以显著地延长小鼠的生存期；与传统生产方式CAR-T相比，具有更优的抗白血病活性。（4）MASTER支架 CAR-T2022年3月，北卡罗来纳州立大学和北卡罗来那大学的研究人员开发了一种名为MASTER的多功能藻酸盐支架，MASTER技术集成了T细胞激活、重编程和体内扩增的步骤，将制造CAR-T的时间缩短到1天。图1 两种方法的路线图。研究人员从患者体内分离出T细胞，与CAR基因病毒载体混合，然后将混合物和藻酸盐支架（支架有激活T细胞的抗体以及促进增殖的白介素）混合后植入小鼠体内，CAR转导将发生在患者体内。在小鼠淋巴瘤异种移植模型中，这种基于MASTER支架在体内生成的CAR-T细胞，能够进入血液循环并控制远处肿瘤的生长。延伸阅读：120万的一针的CAR-T实现体内一天生产，期待成本下降 ！以上仅是举例，并不全面，如有缺漏，欢迎在留言区进行评论讨论。总结总结来说，CAR-T的快速制备平台关键在于激活，保证T细胞在静止状态下能够被转导成CAR-T，且具有高效率。不过目前来看，CAR-T快速制备还处于比较早期的状态，产品基本处于1期临床或以前。参考资料：1.https://ash.confex.com/ash/2022/webprogram/Paper162520.html2.https://www.novartis.com/research-development/technology-platforms/cell-therapy/charging-towards-next-generation-car-t3.亘喜生物官网：https://cn.gracellbio.com/4.Ghassemi, S., Durgin, J.S., Nunez-Cruz, S. et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nat Biomed Eng 6, 118–128 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-021-00842-65.Agarwalla, P., Ogunnaike, E.A., Ahn, S. et al. Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells. Nat Biotechnol 40, 1250–1258 (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01245-x········