引用本文
胡睿智，郑晨，韦芳莉，等. 次苷酸查尔酮抑制三阴性乳腺癌并诱导自噬的作用及其可能机制研究［J］. 中国癌症杂志, 2026, 36 (8): 731-742.
通信作者简介
王绪敏，现任烟台大学教授、博士生导师，国家基因组科学数据中心海洋生物基因组分中心主任，烟台大学“拔尖人才”，烟台市“双百人才”计划入选者，烟台大学青年创新人才协会理事长，烟台市青年科技志愿者服务队队长，烟台大学学术委员会委员。入选山东省教育系统优秀人才创新工作室，入选全国高校“双带头人”教师党支部书记“强国行”专项行动团队。
兼任中国生物信息学会数据资源委员会委员、中国遗传学会教育教学委员会委员、中国中西医结合学会分子生药学专业委员会委员、山东省生物化学与分子生物学学会副理事长。
主要从事基因组学与生物信息学、生命科学大数据及合成生物学等领域的研究工作。曾参与中国人类基因组计划（中国卷）和水稻基因组计划，主持鲤鱼基因组计划、人参基因组计划等多项大型基因组项目。承担国家重点研发计划、国家自然科学基金、863计划等多项国家级科研项目。已发表SCI论文100余篇，获得授权国家发明专利120余项。荣获国家海洋局海洋创新成果奖二等奖、教育部科学技术进步奖一等奖、国家专利奖优秀奖、第三届合格评定科学技术奖二等奖、中国分析测试协会科学技术奖（CAIA奖）一等奖多项省部级奖励。指导学生在山东省实验大赛中屡获佳绩。
作者解读
▲ 胡睿智 作者
次苷酸查尔酮抑制三阴性乳腺癌并诱导自噬的作用及其可能机制研究
胡睿智1，2，郑晨2，韦芳莉3，王绪敏1，刘文婷2
1. 烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264006；
2. 复旦大学附属肿瘤医院肿瘤内科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；
3. 贵州大学医学院，贵州 贵阳 550004
［摘要］ 背景与目的：三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）具有极强的侵袭性、高复发率及患者预后差等特点，由于缺乏有效的靶向治疗手段，临床上亟待寻找新型高效的治疗药物。补骨脂（Psoralea corylifolia L.）是传统中药，其活性成分次苷酸查尔酮（corylifol A，CA）已被证实具有抗炎及抗氧化等多种生物学活性，本研究旨在深入探讨CA在TNBC生长中的作用及其机制。方法：采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）检测不同浓度CA对多种乳腺癌细胞活力的影响；通过克隆形成实验评估CA对TNBC细胞长期增殖能力的影响；利用流式细胞术定量分析CA诱导细胞凋亡的情况。建立4T1细胞小鼠皮下移植瘤模型，评估CA在体内的抗肿瘤功效及安全性，并利用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）观察肿瘤组织病理损伤。采用荧光探针及免疫荧光染色观察溶酶体功能及自噬体形成，联用自噬抑制剂氯喹（chloroquine，CQ），通过克隆形成实验和蛋白印迹分析明确CA诱发的自噬在肿瘤细胞存活中的功能角色；最后，利用蛋白质印迹法（Western blot）检测自噬标志物、蛋白酪氨酸磷酸酶N1（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1，PTPN1）表达水平及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号转导通路的磷酸化水平，采用SwissTargetPrediction平台预测CA的潜在作用靶点，并通过分子对接模拟分析CA与PTPN1的潜在结合模式。本研究动物实验经过复旦大学附属肿瘤医院实验中心动物科学部动物实验项目伦理审查批准（批准号：FUSCC-IACUC-2026226）。结果：CA抑制TNBC细胞的生长，其中对SUM-149和MDA-MB-231的抑制作用最强，IC50约为10 μmol/L；同时经过流式细胞术鉴定发现CA处理可引起浓度依赖性凋亡（P<0.05）。体内实验显示，CA（20 mg/kg）能减缓小鼠移植瘤的生长速度（P<0.01），导致肿瘤组织出现大面积坏死的同时不影响小鼠体重。机制研究发现，CA处理导致TNBC细胞内LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高（P<0.01），p62蛋白表达水平降低（P<0.01），并伴随LC3荧光斑点增多（P<0.01），提示CA可能促进自噬流。溶酶体染色实验结果显示CA可引起溶酶体荧光减弱（P<0.01），提示溶酶体酸性状态或功能可能发生改变。功能逆转实验表明，联用CQ后会进一步阻断自噬反应，对TNBC的抑制作用进一步增强。分子对接结果提示CA可能与PTPN1蛋白形成较稳定的结合构象，Western blot显示CA下调PTPN1蛋白表达（P<0.01）并降低mTOR信号转导通路的磷酸化水平（P<0.05）。结论：CA可抑制TNBC细胞生长并促进细胞凋亡。其抗肿瘤作用可能与调控PTPN1/mTOR信号转导通路及诱导具有保护性倾向的自噬反应有关。
［关键词］ 次苷酸查尔酮；三阴性乳腺癌；自噬；PTPN1；细胞凋亡
［Abstract］ Background and purpose: Triple-negative breast cancer (TNBC) is characterized by strong invasiveness, high recurrence rate, and poor prognosis. Due to the lack of effective targeted therapies, there is an urgent need to find new, efficient therapeutic drugs in clinical practice. Psoralea corylifolia L. is a traditional Chinese medicine, and its active component corylifol A (CA) has been proven to have various biological activities such as anti-inflammatory and antioxidant effects. This study aimed to further investigate the role of CA in TNBC growth and its underlying mechanisms. Methods： The cell counting kit-8 (CCK-8) was used to detect the effects of different concentrations of CA on the viability of various breast cancer cells. Evaluation of the impact of CA on the long-term proliferation capacity of TNBC cells through cloning experiments. Flow cytometry was used to quantitatively analyze CA-induced apoptosis. A 4T1 cell mouse subcutaneous transplant tumor model was established to evaluate the antitumor efficacy and safety of CA in vivo, and tumor tissue pathological damage was observed using hematoxylin-eosin staining (HE). Lysosomal function and autophagosome formation were observed using fluorescent probes and immunofluorescence staining, combined with the autophagy inhibitor chloroquine (CQ). Cloning experiments and Western blot analysis clarified the functional role of CA-induced autophagy in tumor cell survival. Finally, Western blot was used to detect the expression levels of autophagy markers, protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1 (PTPN1), and phosphorylation levels of the mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway, and the SwissTargetPrediction platform was used to predict potential CA targets. Molecular docking simulations were used to analyze the potential binding patterns between CA and PTPN1. The animal experiments in this study were approved by the Animal Experiment Project Ethics Review of the Animal Science Department, Experimental Center, Fudan University Shanghai Cancer Center (Approval No. FUSCC-IACUC-2026226). Results： CA inhibits the growth of TNBC cells, with the strongest inhibitory effects on SUM149 and MDA-MB-231, with an IC50 of approximately 10 μmol/L; meanwhile, flow cytometry analysis showed that CA treatment induces concentration-dependent apoptosis (P<0.05). In vivo experiments showed that CA (20 mg/kg) can slow the growth rate of mouse syngeneic tumor (P<0.01), leading to extensive necrosis in tumor tissues without affecting mouse body weight. Mechanistic studies found that CA treatment significantly increased the LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio in TNBC cells (P<0.01), reduced the expression level of p62 protein (P<0.01), and was accompanied by increased LC3 fluorescence (P<0.01), suggesting that CA may promote autophagic flux. Lysosome staining experiments indicated that CA can cause a decrease in lysosomal fluorescence (P<0.01), suggesting that the acidic state or function of lysosomes may be altered. Functional reversal experiments showed that co-treatment with CQ further blocks autophagic response, enhancing the inhibitory effect on TNBC. Molecular docking results suggest that CA may form a relatively stable binding conformation with the PTPN1 protein, and Western blot showed that CA could downregulate PTPN1 protein expression (P<0.01) and reduce the phosphorylation level of the mTOR signaling pathway (P<0.05). Conclusion： CA can inhibit the growth of TNBC cells and promote cell apoptosis. Its anti-tumor effect may be related to the regulation of the PTPN1/mTOR signaling pathway and the induction of an autophagic response with protective tendencies.
［Key words］ Corylifol A; Triple-negative breast cancer; Autophagy; PTPN1; Apoptosis
乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症相关死亡的主要原因之一［1-3］。早期检测和治疗水平的提升有助于降低乳腺癌患者的死亡率。近年来，随着乳腺癌筛查、早期诊断及综合治疗水平的提高，部分高收入国家乳腺癌死亡率已呈下降趋势；但在部分中低收入国家和地区，受筛查覆盖不足、诊断分期较晚、规范化治疗可及性有限及人口老龄化等因素影响，乳腺癌死亡负担仍然较重［2］。尽管乳腺癌有常规化疗、放疗和手术治疗多种常规治疗方案可供选择，但因乳腺癌的异质性和复杂性，长期药物治疗后往往会出现耐药，从而导致治疗效果下降，给乳腺癌治疗带来挑战［4-6］。根据分析标志物，通过雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）这三类标志物，将乳腺癌分为三大亚型：激素受体（hormone receptor，HR）阳性、HER2阳性和三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）。TNBC在乳腺癌中占15%~20%［7］。与HR阳性型乳腺癌相比，TNBC患者预后更差，超过50%的患者在确诊后3~5年内复发［8］。并且由于缺少相关受体标志物，TNBC患者从靶向治疗获益有限［9］。因此，晚期TNBC的标准治疗选择主要仍是非特异性化疗，同时也有少数小分子抑制剂在TNBC中展示出疗效，但在肿瘤发展过程中，最终出现肿瘤耐药［10］。
补骨脂（Psoralea corylifolia L.）是传统中药［11-12］。研究［11，13-15］表明，补骨脂对感染性疾病、炎症性疾病、肿瘤和抑郁具有疗效。次苷酸查尔酮（corylifol A，CA）是中药补骨脂中的一种异黄酮类活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗骨质疏松的特性［16-17］。研究［16］表明其与胰腺癌、肿瘤恶病质和肌肉萎缩等肿瘤相关疾病的治疗相关。这启发我们探究CA对乳腺癌是否具有抑制作用。研究［18］结果显示，蛋白酪氨酸磷酸酶N1（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1，PTPN1）也会参与自噬流调控，使细胞切换到分泌自噬途径，提示PTPN1可能是连接哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号与自噬调控的关键节点分子。本研究旨在探索CA通过靶向PTPN1对mTOR/自噬信号转导通路的影响，为CA在TNBC治疗中的临床应用提供实验依据。
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资料和方法
1.1 细胞与试剂
乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、SUM-149、BT-549、MCF-7和SK-BR-3购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；A5256701）、杜氏改良Eagle最低必需培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）高糖培养基和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，通用型抗体稀释液（WB500D）、青霉素-链霉素（100×；C100C5）、胰酶（C100C1）和细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自苏州新赛美生物科技有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒（P0012）、异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin Ⅴ-FITC/PI）凋亡检测试剂盒（C1062S）、Lyso-Tracker Red溶酶体红色荧光探针（C1046）、AF488标记山羊抗兔IgG（H+L）（A0423）、脱脂奶粉（P0216-1500g）、Triton X-100、苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）试剂盒和结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术股份有限公司，放射免疫沉淀分析（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（20101ES60）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，甘氨酸、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷、4%多聚甲醛、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；BL105B）和磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS；BL302A）购自北京兰杰柯科技有限公司，预染蛋白Marker（WJ103L）购自雅酶生物医药科技有限公司，Quick-P梯度凝胶快制试剂盒（PWQ002）购自上海磐超生物科技有限公司，增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（YK379092）和DMSO（D2650）购自美国Thermo Fisher Scientific公司。3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；HY-19312）、氯喹（chloroquine，CQ；HY-17589A）、CA（HY-N0897）购自美国MedChemExpress公司。CA以DMSO溶解，配制成50 mmol/L母液，-20 ℃保存，使用时以培养基稀释至工作浓度。LC3多克隆抗体（ab192890）、P62多克隆抗体（ab109012）、mTOR多克隆抗体（ab32028）和p-mTOR（ab109268）多克隆抗体购自英国Abcam公司，PTPN1多克隆抗体（F319302）购自美国Selleck Chemicals公司，HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG（H+L）（RGAM001）、HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L）（RGAR001）、β-actin单克隆抗体（66009-1-Ig）购自武汉三鹰生物技术有限公司，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；A1933-25G）购自美国Sigma公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF；ISEQ00010）膜购自德国Merck公司。本动物实验方案经复旦大学附属肿瘤医院实验中心动物福利伦理委员会审批通过（审批号：FUSCC-IACUC-2026226），实验过程遵循《实验动物护理和使用指南》（NIH Publication No.85-23，revised 1996）及《动物研究：体内实验报告》（ARRIVE指南2.0）相关要求。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、SUM-149、BT-549、MCF-7使用含10%FBS和1%青霉素-链霉素的完全DMEM高糖培养基培养，SK-BR-3乳腺癌细胞系使用含10%FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640完全培养基，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养，密度达到80%后用0.25%胰酶消化传代。
1.2.2 CCK-8法检测细胞活力
在每个96孔中接种5×103个细胞，加入100 μL完全培养基，置于37 ℃培养箱中温育24 h，用指定浓度化合物处理细胞，并在培养箱中继续培养48 h。最后，提前将CCK-8试剂与DMEM按1∶10预混，每孔加入100 μL预混溶液，随后在37 ℃培养1 h。温育后检测450 nm波长处的吸光度（D）值。
1.2.3 克隆形成实验
在每个24孔中接种2×102个细胞，使用含10%FBS的DMEM完全培养基进行培养。24 h后，用指定浓度化合物处理细胞，持续培养10 d。培养结束后使用4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤孔板2次，再用结晶紫染色15 min，最后使用PBS洗涤2次，晾干后拍照统计。
1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡
在6孔板中每孔接种2×105个细胞，培养24 h后用指定浓度化合物处理48 h。收集细胞，用预冷PBS洗涤2次，然后按照Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI，室温避光温育15 min。立即用流式细胞仪检测，并使用软件分析凋亡细胞比例，本实验使用BD FACSCalibur流式细胞仪完成检测。
1.2.5 小鼠同种移植瘤模型建立与药物处理
4T1细胞是小鼠来源的高转移性TNBC细胞系，其皮下移植瘤模型可模拟人类TNBC的增殖特性；BALB/c小鼠是一种免疫功能完整的近交系小鼠，遗传背景稳定、个体差异较小，本研究建立的是4T1细胞BALB/c小鼠皮下同种移植瘤模型。由于其具有完整的T淋巴细胞、B淋巴细胞及天然免疫功能，该模型可用于评估抗肿瘤药物在免疫完整机体内的疗效及其对肿瘤微环境的影响。根据预实验结果，设定效应量d=1.5，α=0.05，检验效能（1-β）=0.80，采用G*Power 3.1软件计算每组至少需要4只小鼠，考虑10%的脱落率，最终确定每组5只。纳入标准：6周龄雌性BALB/c小鼠，体重18~22 g，健康状况良好。排除标准：接种后7 d内肿瘤体积<50 mm3或>300 mm3者、体重下降超过初始体重20%者、出现严重感染或自发性死亡者。数据分析时排除不符合上述标准的动物数据。BALB/c小鼠购自江苏集萃药康公司［生产许可证号：SCXK（苏）2023-0009］，SPF级，健康状态良好，无特定病原体感染（质量合格证编号：B202511250679），用于本研究前未参与其他实验。动物饲养于复旦大学附属肿瘤医院SPF级屏障环境动物实验室［使用许可证号：SYXK（沪）2025-0006］，温度22±2 ℃，湿度50%~60%，12 h光照/12 h黑暗循环，自由摄食标准鼠粮及灭菌饮水，笼具内放置垫料及啃咬玩具以丰富环境。BALB /c小鼠（6周龄，雌性，n=5/组，体重18~22 g）适应性饲养1周后，将1×106个4T1细胞接种于小鼠右侧腋窝皮下，4T1细胞以PBS重悬至1×107个/mL，每鼠接种0.1 mL。细胞接种前以异氟烷吸入麻醉（诱导浓度3%，维持浓度1.5%），术后观察至完全清醒。实验期间每日观察动物精神状态、摄食饮水及活动情况，记录体重变化。若体重下降超过初始体重20%或出现严重痛苦表现（如弓背、蜷缩、呼吸急促），则提前安乐死并记录为不良事件。7 d后，测量各小鼠肿瘤体积。将符合纳入标准的小鼠按体重及肿瘤体积接近原则进行编号，编号为1~10。由不参与后续给药及肿瘤测量的研究人员使用随机数字表法进行分组：从随机数字表中任一行、任一列开始，按固定方向依次读取随机数字，遇到与小鼠编号1~10相对应的数字即记录，重复数字或超出编号范围的数字予以舍弃，直至获得5个不重复编号，将其分入CA治疗组（n=5）；其余5只小鼠分入DMSO溶剂对照组（n=5）。CA组每日腹腔注射CA（20 mg/kg），CA以含10%DMSO+40%PEG300+5%Tween-80的生理盐水配制，对照组注射等体积溶剂。每2 d测量肿瘤体积并记录小鼠体重。治疗21 d后，以CO2窒息法安乐死小鼠，迅速剥离肿瘤组织称重，部分组织用于后续HE染色和免疫组织化学检测分析。肿瘤体积（mm3）=长径×短径²/2。预设人道终点：肿瘤体积>2 000 mm3、体重下降>20%、出现溃疡或感染、严重行为异常。达到任一终点即提前安乐死。安乐死方法：CO2窒息法，确认无呼吸反射后行颈椎脱臼。
1.2.6 HE染色及免疫组织化学染色
取4%多聚甲醛固定的肿瘤组织，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，石蜡包埋，切成4 μm厚连续切片。切片于65 ℃烤片1 h，常规脱蜡复水。切片入苏木精染色液染色5 min，流水冲洗返蓝，1%盐酸乙醇分化2 s，流水冲洗后入伊红染色液染色2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，于光学显微镜下观察并采集图像。取4%多聚甲醛固定的肿瘤组织，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，石蜡包埋，切成4 μm厚连续切片。切片于65 ℃烤片1 h，常规脱蜡复水。浸入抗原修复液中100 ℃ 30 min，自然冷却，使用封闭剂封闭10 min，PBS清洗，一抗37 ℃ 1 h温育，加入增强液37 ℃ 20 min，清洗后加入二抗室温温育20 min，清洗后加入DAB显色，苏木精复染1 min，自来水返蓝，分化液进行分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。Ki-67增殖指数以Image J软件计数阳性细胞数/总细胞数×100%计算。
1.2.7 溶酶体荧光染色
在6孔板中每孔接种2×105个SUM149和MDA-MB-231细胞，培养24 h。分别用不同浓度CA处理24 h。弃去培养基，加入含50 nmol/L Lyso-Tracker Red的预热DMEM，于37 ℃培养箱避光温育30 min。弃去染料工作液，用预热PBS轻柔洗涤2次，立即使用激光共聚焦显微镜观察并拍照。激发波长577 nm，发射波长590 nm。使用Image J软件分析每个细胞的平均荧光强度，每组至少分析30个细胞。
1.2.8 蛋白质印迹法（Western blot）检测
细胞经指定处理后，加入RIPA裂解液，转移至1.5 mL Eppendorf试管中冰上裂解5 min，4 ℃、13 500×g离心10 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。将等量蛋白加入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶中，电泳完成后转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，随后使用TBST洗涤3遍。分别与相应一抗4 ℃温育过夜（LC3、P62、p-mTOR、mTOR 1∶2 000稀释；PTPN1 1∶1 000稀释），次日将膜用TBST洗涤3遍，用HRP标记的二抗室温温育1 h。最后，使用ECL化学发光检测试剂可视化条带，并利用Tanon 5200T化学发光仪进行成像，随后使用Image J软件进行图像分析。
1.2.9 免疫荧光染色
将细胞玻片置于24孔板中，在每个孔中接种5×104个细胞，培养24 h后用指定浓度化合物处理。弃去培养基，PBS洗涤2次，4%多聚甲醛室温固定15 min后，PBS洗涤3次，0.5%Triton X-100溶液室温通透10 min。用3%的BSA室温封闭1 h后，加入LC3一抗4 ℃温育过夜。次日PBS洗涤3次，加入荧光标记二抗室温避光温育1 h，PBS洗涤后，DAPI复染细胞核5 min。用抗荧光淬灭封固剂将爬片封于载玻片上，于共聚焦显微镜下观察拍照。LC3表达量以平均光密度表示，每组随机选取3个视野。使用Leica TCS SP8共聚焦显微镜拍摄图像。
1.2.10 潜在作用靶点预测
采用SwissTargetPrediction在线平台对CA的潜在作用靶点进行预测。从PubChem数据库获取CA的二维化学结构及简化分子输入线性规范信息（CID：25056407），将其导入SwissTargetPrediction平台，并选择人（Homo sapiens）作为预测物种。根据平台输出的预测概率（probability）对潜在作用靶点进行排序。根据预测结果，选取PTPN1作为候选靶点，进行后续分子对接分析及蛋白表达水平验证。
1.2.11 分子对接分析
从AlphaFold数据库获取人PTPN1的三维结构预测模型（UniProt：P18031）。采用SwissDock在线平台进行CA与PTP1B的分子对接分析。将CA的简化分子输入线性表示规范信息导入平台，同时上传PTP1B的PDB格式结构文件，由平台完成配体和受体结构的预处理。采用Attracting Cavities 2.0算法进行分子对接。根据蛋白结构设置对接搜索区域，Box center设为（15，-9，11），Box size设为30 Å×30Å×30Å；sampling exhaustivity设为medium，随机初始条件（random initial condition，RIC）设为1，cavity prioritization设为buried。对接完成后，根据AC Score对同一配体与同一蛋白的候选结合构象进行排序，并结合候选构象的空间位置及其与周围氨基酸残基的相互作用，筛选较优结合模式。采用SwissDock平台内置三维可视化工具观察CA与PTP1B的潜在结合构象及相互作用。
1.3 统计学处理
为降低动物测量偏倚，肿瘤体积测量由不知分组情况的独立研究人员完成；给药操作由同一研究人员按标准化流程执行；笼具在饲养架上的位置随机轮换；图像分析采用盲法由ImageJ 1.54g软件自动完成。使用GraphPad Prism 10.1.2进行统计分析。所有定量数据均来源于至少3次独立生物学重复实验，并以x̄±s表示。两组间比较采用非配对双侧Student t检验；3组及以上多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并结合Tukey或Dunnett事后检验进行组间比较。对于不同处理组在多个时间点的肿瘤体积变化，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行分析。所有统计检验均采用双侧检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
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结 果
2.1 CA抑制TNBC细胞生长
本研究首先采用不同浓度的CA处理多种乳腺癌细胞系，并通过CCK-8法检测细胞活力。结果显示，CA对测试的5种乳腺癌细胞系均表现出不同程度的增殖抑制作用，其中对TNBC细胞系SUM-149和MDA-MB-231的抑制作用尤为显著，半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）约为10 μmol/L。结果表明TNBC细胞对CA的细胞毒性更为敏感，故后续机制研究选取SUM-149和MDA-MB-231细胞系进行深入探讨（图1A、B）。细胞克隆形成实验结果表明，经过不同浓度的CA处理后，SUM-149和MDA-MB-231细胞的集落形成数量显著减少，在10 μmol/L时抑制作用达到最大。该结果进一步从长期效应证实了CA能有效削弱TNBC细胞的增殖与克隆形成潜能（图1C）。诱导凋亡是化疗药物杀伤肿瘤细胞的经典途径。流式细胞术结果显示，Annexin Ⅴ可与早期凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸特异性结合，而PI可进入晚期凋亡及坏死细胞并染色。随着CA处理浓度的升高，SUM-149和MDA-MB-231细胞中早期及晚期凋亡细胞的比例均呈浓度依赖性升高，表明CA能够有效地诱导TNBC细胞发生凋亡（图1D）。
图1 CA对乳腺癌的体内外抗肿瘤作用
Fig. 1 The in vitro and in vivo anti-tumor effects of CA on breast cancer
A: Chemical structure of CA. B: Viability of different breast cancer cell lines after treatment with gradient concentrations of CA (n=6 in each group). C: Concentration-dependent inhibition of colony formation in breast cancer cells treated with CA (n=3 in each group). D: Flow cytometry analysis of CA-induced cell apoptosis using Annexin Ⅴ/PI double staining (n=3 in each group). E: In vivo experimental model diagram. F: Representative images of excised syngeneic tumors from each group. G: Tumor growth curves showing changes in tumor volume (n=5 in each group). H: Body weight changes of the mice during the treatment period (n=5 in each group). I: Tumor weights of the excised tumors from each group (n=5 in each group). J: Representative HE staining images of tumor and adjacent normal tissues. Scale bars, 100 μm. K: Ki-67 proliferation index in the tumor tissues. Scale bars, 30 μm. DMSO: Dimethyl sulfoxide. CA: Corylifol A.
为验证CA在体内的抗肿瘤效果，本研究构建了4T1细胞小鼠皮下移植瘤模型，采用随机数字表法将10只小鼠随机分为对照组（n=5）和CA治疗组（n=5）。实验过程中，对照组和CA组均无小鼠死亡或剔除，最终每组5只小鼠全部纳入统计分析。实验中每2 d通过卡尺对肿瘤进行测量统计，结果显示，与溶剂对照组（DMSO）相比，CA给药组小鼠的肿瘤体积生长受到显著抑制（t=6.566，P<0.01）；在实验终点，CA组的肿瘤体积与整体瘤重均小于对照组。此外，给药期间小鼠的体重曲线未见显著波动，2组均未观察到明显注射部位红肿、脱毛、腹泻或严重行为异常，提示CA在体内具有较好的生物安全性（图1E~I）。上述数据证实了CA在体内具备良好的抗肿瘤活性。HE染色结果显示，对照组肿瘤细胞排列致密，核质比大，表现出肿瘤恶性生长特征；而CA治疗组肿瘤组织中，细胞排列呈现弥漫性松散，并观察到核碎裂及大面积的肿瘤坏死灶（图1J）。免疫组织化学染色结果显示，经CA处理后肿瘤Ki-67增殖指数降低，表明CA可在体内抑制肿瘤增殖能力（图1K）。
2.2 CA激活TNBC细胞中的自噬流
溶酶体特异性荧光探针检测结果显示，与对照组相比，CA处理组细胞内的红色溶酶体荧光强度显著减弱，提示CA可能影响溶酶体酸性环境、功能性溶酶体数量或溶酶体稳态。同时为明确CA对自噬流的调控作用，研究首先通过Western blot检测自噬标志蛋白的表达变化。结果显示（图2A、B），随着CA处理浓度的升高，SUM149和MDA-MB-231细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值呈浓度依赖性升高，同时自噬底物蛋白p62的水平随浓度升高而下降。这是自噬流被激活的典型标志，上述结果提示CA可诱导自噬体形成，并可能促进自噬底物降解，说明CA处理后自噬流在一定程度上被激活。因此，CA可能使细胞处于自噬激活与溶酶体系统负荷增加并存的状态。
免疫荧光染色检测结果显示，LC3斑点（punctate）的数量反映自噬体的聚集程度。随着CA浓度的升高，LC3斑点的数量和荧光强度均逐渐增加，提示细胞内自噬体的大量形成与聚集。同时在小鼠肿瘤中进行免疫组织化学染色进一步验证LC3变化，结果显示经过CA处理的组织LC3表达量高于非处理组（图2C、D）。该形态学证据与蛋白水平结果一致，证实了CA对自噬过程的强烈诱导作用。
图2 CA在乳腺癌细胞中诱导细胞自噬
Fig. 2 CA induces autophagy in breast cancer cells
A: Representative images of lysosomal staining in cells treated with CA (n=3 in each group). B: Western blot analysis of the expression levels of autophagy-related proteins LC3 and p62 following treatment with gradient concentrations of CA (n=3 in each group). C: Immunofluorescence staining showing the subcellular localization and semi-quantification of LC3 in cells treated with gradient concentrations of CA (DAPI, blue; LC3, green; n=3 in each group). Scale bars, 10 μm. D: Immunohistochemistry staining analysis of LC3 expression in tumor tissues from each group. Scale bars, 30 μm.
2.3 CA诱导的自噬流可能参与其抗肿瘤效应调控
CQ干预自噬的研究结果显示，CQ单药处理显著增加了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和p62蛋白水平，表明溶酶体降解功能被成功阻断。CA单药处理则呈现LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高、p62水平下降的典型自噬激活特征。经CA与CQ联合处理，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值虽较对照组升高，但低于CQ单药组；而p62蛋白水平与CQ单药组相比无显著差异，维持在高水平。该结果表明CA处理下的自噬底物成功进入了溶酶体，CA并未阻断自噬体向溶酶体的运输过程；同时，CA+CQ组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值低于CQ单药组，结合前文中CA导致溶酶体数量减少的结果，提示CA可能通过消耗功能性溶酶体储备，降低了CQ的阻断效率。接下来联合使用自噬不同阶段的抑制剂处理乳腺癌细胞后检测LC3的转化，3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）阻断自噬早期生成后，与对照相比，LC3转化的水平明显降低（图3A、B）。克隆形成实验结果显示，CQ单药处理对SUM149和MDA-MB-231细胞的集落形成能力无明显影响；CA单药处理显著减少集落形成数量；而CA与CQ联合处理后，集落形成数量较CA单药组进一步减少。上述结果提示，在CA处理背景下，阻断自噬流晚期降解可进一步增强CA对乳腺癌细胞的抑制作用，说明CA诱导的自噬反应可能具有一定的保护性倾向，部分缓冲CA的细胞毒效应（图3C）。
图3 自噬抑制剂验证CA诱导的细胞自噬通路及其功能
Fig. 3 Pharmacological inhibition of autophagy verifies the CA-induced autophagy pathway and its function
A: Western blot analysis of LC3 and p62 protein expression levels following treatment with CA alone or in combination with CQ (n=3 in each group). B: Western blot analysis of LC3 and p62 protein expression levels following treatment with CA alone or in combination with 3-MA (n=3 in each group). C: Colony formation assay assessing the effect of CA and CQ co-treatment on the colony-forming ability of breast cancer cells (n=3 in each group). CQ: Chloroquine; 3-MA: 3-methyladenine.
2.4 CA可能通过影响PTPN1及其相关mTOR信号转导通路调控自噬
SwissTargetPrediction平台虚拟筛选结果显示，蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN1可能是CA的潜在作用靶点之一（图4A）。同时在SwissDock在线平台进行分子对接模拟，结果显示，CA可能与PTPN1蛋白形成较稳定的结合构象，提示其可能通过直接结合抑制PTPN1的酶活性。Western blot检测结果显示，CA以浓度依赖的方式显著下调SUM-149和MDA-MB-231细胞中PTPN1的蛋白水平，证实了CA对PTPN1的调控作用（图4B、C）。
本研究通过Western blot进一步检测了mTOR的活性变化，结果显示，CA处理同样浓度依赖性地降低了磷酸化mTOR的水平，而总mTOR蛋白仅略微降低，但p-mTOR/mTOR比值降低更为明显，表明CA抑制了mTOR信号转导通路的激活（图4D）。
图4 CA潜在作用靶点的预测及下游信号转导通路的验证
Fig. 4 Prediction of potential targets for CA and validation of the downstream signaling pathway
A: Virtual screening results of potential targets for CA using the SwissTargetPrediction platform. B: Schematic diagram showing the molecular docking simulation between CA and its predicted target PTPN1. C: Western blot analysis of PTPN1 protein expression levels in cells treated with gradient concentrations of CA (n=3 in each group). D: Western blot analysis of phosphorylated mTOR protein expression levels following treatment with gradient concentrations of CA (n=3 in each group). PTPN1: Protein tyrosine phosphatase N1.
3
讨 论
研究［13，15］显示，补骨脂对乳腺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤和人脑胶质瘤等恶性肿瘤细胞有较强的抑制作用，显示出良好的抗肿瘤应用前景。CA是中药补骨脂中的一种异黄酮类活性成分，研究［19-22］结果显示，异黄酮类化合物与多种肿瘤，尤其是乳腺癌的预防密切相关。此外，有研究［23-24］表明，异黄酮类化合物主要通过调节细胞通路发挥抗肿瘤作用。
自噬作为细胞稳态的关键调节者，它的发生与mTOR信号转导通路密切相关［25］。mTOR是自噬的主要负调控因子，在营养充足条件下被激活磷酸化并抑制自噬启动；反之，当mTOR活性受抑时，对自噬的负调控被解除，诱导自噬发生［26］。PTPN1是一种非受体型酪氨酸磷酸酶，近年研究证实其在乳腺癌中异常高表达，并作为促癌基因促进乳腺癌细胞的增殖与存活［27-28］。研究［29-30］显示，PTPN1可通过调控多条信号转导通路影响肿瘤进展，其中PTPN1对mTOR信号转导通路的正调控作用备受关注。
本研究证实，源自中药补骨脂的异黄酮类成分CA在体内外均展现出强烈的抗TNBC效应。机制研究表明，CA结合并下调蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN1的表达，进而使mTOR信号转导通路失活，触发了强烈的自噬流激活。这一发现不仅拓宽了补骨脂抗肿瘤活性成分的生化谱系，也为以PTPN1为核心靶点的TNBC干预提供了全新的实验依据。在传统的抗肿瘤研究中，补骨脂的活性探索多集中于补骨脂素和异补骨脂素等香豆素类成分［31］。近年来异黄酮类化合物在乳腺癌防治中的流行病学和分子机制研究正受到重视［16］。本研究体外结果显示，CA在微摩尔级别即可显著抑制SUM149和MDA-MB-231等TNBC细胞系的增殖与克隆形成，并呈剂量依赖性地诱导Annexin Ⅴ/PI双染细胞凋亡。这一体外杀伤效能比经典的大豆异黄酮更强［32］。在体内实验中，20 mg/kg的CA能显著抑制4T1移植瘤的体积生长与瘤重（t=6.566，P<0.01），且组织学HE与免疫组织化学染色直观证实了肿瘤大面积坏死及细胞增殖标志物Ki-67增殖指数的下调。此外，按体表面积换算系数（小鼠/人=12.3）计算，小鼠20 mg/kg剂量约相当于人类1.6 mg/kg（60 kg成人约96 mg/d），该剂量在现有异黄酮类化合物临床试验的安全范围内。但CA口服生物利用度及人体药代动力学尚不明确，未来需开展毒理学及Ⅰ期临床试验。此外，鉴于CA诱导保护性自噬的特征，联合自噬抑制剂可能是提高临床疗效的潜在策略。
本研究通过SwissTargetPrediction及SwissDock分子对接技术预测，并经Western blot检测证实，基于目前的靶点预测、分子对接和蛋白表达结果，尚不能充分证明CA与PTPN1之间存在直接靶向关系，其具体分子机制仍有待进一步实验验证，但目前这一发现为CA诱导的自噬激活提供了上游分子机制的解释。研究［23］指出，PTPN1在乳腺癌组织中呈异常高表达。本研究结果显示，CA能以浓度依赖性方式显著下调TNBC细胞中PTPN1的蛋白表达。这一潜在的直接靶向特征与同属异黄酮类的芒柄花苷截然不同，后者抑制TNBC主要通过间接阻断上游表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号转导通路发挥作用；而CA则可能锚定于PTPN1的催化活性口袋中，呈现出更直接的磷酸酶抑制效应。目前，以PTPN1为靶点的小分子抑制剂在研项目包括trodusquemine（MSI-1436）在乳腺癌中的Ⅰ期临床试验，以及多项异黄酮类化合物在肿瘤中的临床前研究。补骨脂相关成分尚无注册的临床试验，本研究结果为后续临床转化奠定了前期基础。
进一步的下游通路探索深入揭示了CA介导细胞死亡的动态调控网络。作为调控细胞稳态的经典轴线，PTPN1的失活常伴随其下游信号的级联反应。本研究发现，CA处理后不仅PTPN1下调，下游核心负调控开关mTOR的磷酸化激活水平同样受到抑制，从而解除了mTOR对自噬起始的束缚。在自噬流的定量与形态学评估中，CA干预引发了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的浓度依赖性升高、p62底物的加速降解以及细胞内/肿瘤组织中LC3荧光斑点的大量积聚。然而，LysoTracker探针结果却显示红色功能性溶酶体荧光显著减弱，提示CA在激活自噬的同时，可能对溶酶体的酸性环境或储备造成了过载。本研究引入了自噬早期抑制剂3-MA和晚期阻断剂CQ，结果表明，CA与CQ联合干预后，不仅p62维持在高水平，且联合组对TNBC细胞克隆形成的抑制效应较CA单药组得到了放大。需要指出的是，鉴于目前证据主要来源于CQ药理学干预及克隆形成实验，尚不能完全证明CA诱导的自噬即为保护性自噬，其具体功能属性仍需进一步实验验证。在肿瘤药物应激研究中，TNBC细胞在面对BET抑制剂或代谢应激时，常通过激活自噬来逃避凋亡并产生获得性耐药。因此，CA诱导的保护性自噬实际上是TNBC细胞在药物压力下的自我防御机制。这意味着，CA联合自噬抑制剂在未来的转化医学研究中，可作为提高TNBC临床化疗敏感性的潜在创新策略。
本研究对实验全过程中的潜在偏倚进行了严格控制。在动物分组中采用随机数字表法以减少选择性偏倚；在肿瘤体积测量及相关蛋白、病理学图像定量分析中，均由未参与给药的独立实验人员进行盲法评估，并结合计算机软件自动分析，最大程度避免了测量与评价偏倚，确保了实验数据的客观性与真实性。同时本研究存在部分局限性：动物实验样本量较小（n=5/组），统计效能有限；仅使用4T1单一细胞系，缺乏其他TNBC模型（如MDA-MB-231异种移植瘤或PDX模型）的验证；未设置阳性化疗药物对照组，无法直接比较CA与标准治疗的疗效；自噬抑制剂CQ仅用于体外验证，未在体内验证自噬阻断对CA疗效的增强作用；4T1为小鼠同种移植瘤模型，其免疫微环境与人类TNBC存在差异，结果向临床转化需谨慎解读。
综上所述，本研究阐明了CA通过“PTPN1/mTOR/自噬轴”发挥抗TNBC作用的机制。这一发现不仅为补骨脂活性成分的临床应用提供了实验证据，也为针对PTPN1靶点及自噬通路开发新型TNBC治疗方案奠定了理论基础，具有重要的学术价值和潜在的临床意义。
共同第一作者：
胡睿智，硕士研究生在读。郑晨，博士研究生在读。
通信作者：
王绪敏，博士，教授，博士研究生导师；刘文婷，博士，副研究员。
作者贡献声明：
胡睿智：完成实验，处理数据，撰写并修改文章；郑晨：实验指导，修改文章；韦芳莉：文献调研与整理，实验指导；王绪敏：提出研究方案和设计思路，撰写和修改论文；刘文婷：提出研究方案，审核论文，论文最终版修订。
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编辑：莫颖
审核：王琳辉 李广涛
