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中文摘要 脂质纳米颗粒是由1个或多个磷脂双分子层组成的球形囊泡结构，是目前临床研究和应用中最有效的非病毒递送载体，主要用于化学药物和核酸分子的递送。2019年新型冠状病毒感染暴发后，mRNA疫苗凭借其设计与制造的简便性、低免疫原性、快速量产等优点脱颖而出。研究表明，脂质纳米颗粒作为新型冠状病毒mRNA疫苗的重要组成部分，对其有效性和稳定性有着重要作用。此文综述目前应用较多的脂质纳米颗粒的结构、特性、应用及质量控制等方面的相关研究，以期增加对mRNA疫苗递送系统的认识，从而进一步促进mRNA疫苗和药物的快速发展。 正文 脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）是由多种脂质成分组成的封闭微球，其结构类似生物膜，通常由阳离子脂质、胆固醇、中性脂质以及聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）衍生物PEG-脂质组成 。LNP作为用途极为广泛的纳米载体平台，可以运输疏水性或亲水性分子，包括小分子、蛋白质和核酸等。1995年，首款由LNP递送的小分子药物Doxil获得FDA批准上市。Doxil的获批是脂质体药物递送系统的重要里程碑。2018年，LNP-小干扰RNA药物Onpattro获FDA批准上市，证实了LNP递送系统的有效性和安全性，巩固了LNP在药物递送领域的地位。2021年，2款新型冠状病毒mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273获批上市，使LNP成为了目前研究最热门、临床应用最广泛的mRNA 疫苗递送系统。该递送系统不但解决了mRNA不易通过细胞膜以及在体内易被核酸酶降解的问题，而且对mRNA疫苗发挥稳定性和有效性也起到了关键作用 。 1 LNP的组成结构及作用 经典的LNP载体通常包含4种成分：阳离子脂质、PEG-脂质、胆固醇、中性脂质。 1.1 阳离子脂质 阳离子脂质是LNP中的核心成分，具有充分包裹mRNA分子和促进细胞吸收的作用，是LNP逃逸内涵体的关键成分。阳离子脂质由3个部分组成，分别为亲水性头部基团、连接键和疏水性尾部。 阳离子脂质的亲水性头部基团可以增加mRNA的稳定性，同时增加入胞率。亲水性头部基团通常带有正电荷，可以与带负电的mRNA结合，形成mRNA-LNP复合物，保护mRNA免受核酸酶的攻击。另外，带正电的头部基团可以与带负电的细胞膜相融合，增加入胞率。第1代阳离子脂质的头部为季铵盐，永久性携带正电荷。该阳离子脂质体能与细胞膜上的磷脂双分子层相互作用，导致膜结构的改变甚至破裂，引起细胞内容物的泄露，最终导致细胞死亡，对细胞毒性较大；另外，带正电荷的头部容易与血液中带负电荷的蛋白质（如免疫球蛋白、补体蛋白和载脂蛋白）结合，使其在体内循环时易被单核吞噬细胞系统清除。第2代和第3代阳离子脂质是可电离脂质，头部是可离子化的基团。可电离脂质可发生pH依赖性的离子化，在生理pH值（约7.4）下呈现中性或带微弱的正电荷，使其在体内循环时表面电荷较弱，减少了与血液成分的非特异性相互作用，降低了免疫原性和细胞毒性；而在内涵体（pH5.5）中带正电荷，可破坏内涵体膜的完整性，使mRNA从内涵体逃逸至细胞质进行翻译。临床上使用的可离子化脂质如DLin-MC3-DMA、SM-102和ALC-0315都包含可离子化的叔胺头部，可发生pH依赖性的离子化，SM-102和ALC-0315的头部基团还含有1个末端羟基，可以减少头部基团的水化作用，提高与核酸氢键的相互作用，从而增强转染能力。另外，一些含有伯胺和仲胺的阳离子头部可以通过质子海绵效应促进内涵体逃逸等过程，即通过纳米载体在溶酶体内吸收质子，最终导致溶酶体破裂并释放药物，以此增强药物的细胞内递送效率。然而，可以在细胞质中作为蛋白质翻译的模板mRNA分子仍然不多，仅占 1%~4%，内涵体逃逸效率仍然较低，还需开发新型的脂质材料以提高核酸分子利用率。 连接键会影响LNP的生物降解性、细胞毒性和转染效率。连接键分为不可生物降解（如醚类和氨基甲酸酯类）和可生物降解（如酯类和酰胺类）2类，其中以不可生物降解的醚键作为连接键的脂质分子虽具有较高的转染效率，但醚键过于稳定，增加了脂质的细胞毒性；而可生物降解的连接键通常可在体内快速清除，能多次使用且不良反应较轻，例如以酰胺键作为连接键的阳离子脂质具有更好的生物降解性和更低的细胞毒性，DLin-MC3-DMA、ALC-0315和SM-102都含有酯键连接片段，其中通过对SM-102酯基周围基团进行化学修饰可以影响LNP的清除、配方稳定性和转染效率。 疏水尾部会影响LNP的亲脂性和转染效率。常见的疏水尾部主要有脂肪烃链和胆固醇环。脂肪烃链的碳原子数通常为12~18个，在生理温度下既能为磷脂双分子层提供足够的流动性，又能使磷脂双分子层维持一定的刚性，为脂质体在体内的脂质融合创造条件。对以脂肪链为尾部的阳离子脂质，碳链加长会导致转染效率降低，而通过在链内引入不饱和键可提高转染效率。在基因递送方面，对于大多数以脂肪烃类为尾部的经典阳离子脂质，单尾的脂质分子比双尾的脂质分子毒性大且转染效率低。将胆固醇用作疏水尾部，效果常常优于脂肪链，这是因为胆固醇参与形成的双分子层结构更稳定。由于大部分胆固醇类衍生脂质分子都是蛋白激酶C的抑制剂，具有较大的细胞毒性，因此需要对胆固醇进行改造来降低细胞毒性。Kawakami等合成的半乳糖化的胆固醇衍生物在人肝细胞癌上皮细胞株HepG2中表现出较低的细胞毒性，说明通过独特的设计可以有效降低胆固醇衍生物的细胞毒性。 以 1987年被发明的1，2-双十八烯氧基-3-三甲基胺基丙烷氯盐〔1，2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane （chloride salt） ，DOTMA〕作为开端，常用的阳离子脂质（1，2-二油酰基丙基）三甲基氯化铵〔（1，2-dioleoyloxy-propyl）-trimethylammonium-chloride，DOTAP〕和O-〔（N，N-二甲基氨基乙基）氨基甲酰基〕胆固醇盐酸盐均是在DOTMA的结构基础上进行变化而成。早在1989年，研究者就发现DOTMA可以应用于多种类型细胞的mRNA递送，并且与中性脂质1，2-二油酰-Sn-甘油-3-磷酰乙醇胺（1，2-dioleoyl-Sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE）混合制备成商业化的转染试剂Lipofectin。使用DOTMA递送核酸，极大地提高了核酸的装载及递送效率。DOTAP是DOTMA的1种可生物降解类似物，也被用于mRNA递送，是基因治疗中研究最多的1种载体。目前DOTAP较为成功的应用案例是递送小分子化学治疗药物，如紫杉醇阳离子脂质EndoTAG-1以及喜树碱药物的阳离子脂质EndoTAG-2。如果适应证为癌症，阳离子脂质能够选择性吸附于带负电荷的新生肿瘤血管内皮细胞上，抗癌效果更好。而后，可离子化脂质被开发，常用的可离子化脂质有Lin-MC3-DMA、ALC-0315和SM102；被FDA批准的全球首款小干扰RNA药物Onpattro的LNP制剂中就使用了可离子化脂质Lin-MC3-DMA；全球首批生产的新型冠状病毒mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273的LNP制剂中分别使用了新型可离子化脂质ALC-0315和SM102。上述阳离子脂质结构见图1。 1.2 PEG-脂质 PEG-脂质是1种功能性脂质，在LNP中含量最少，位于LNP表面，是LNP中调控半衰期和保持粒径均一性的1个重要组成部分。PEG-脂质由亲水性的PEG连接1种疏水性的锚定脂质构成，2种物质均会影响LNP的大小、脂膜通透性以及免疫应答，主要作用为减少聚集和免疫细胞的非特异性摄取。PEG的相对分子质量在350~3 000，锚定脂质的尾长度一般为10~18个碳，这两者决定了LNP在体内的循环时间和被免疫细胞结合摄取的能力，相对分子质量和长度越大，在体内的半衰期越久，越不易被巨噬细胞非特异性摄取。PEG-脂质链在LNP的外壳上形成外部聚合层，虽可以降低LNP与血浆蛋白的相互作用，使静脉注射的LNP不易被单核吞噬系统识别，延长体内循环时间，但同时PEG的保护作用会影响LNP的细胞内吞及核酸在细胞质的释放，进而降低mRNA的蛋白翻译。另外，PEG链的空间位阻效应使其能够在脂质体表面形成水化膜，降低了LNP粒子间的相互作用，可以使产品在制备和储存过程中保持粒径均一的稳定状态。常用的PEG-脂质有ALC-0159和PEG2000-DMG。小干扰RNA药物Onpattro和新型冠状病毒mRNA疫苗mRNA-1273的LNP组分采用的均是PEG2000-DMG，结构见图2。 1.3 胆固醇及其衍生物 胆固醇常作为LNP配方的结构脂质，具有膜融合性，是构成LNP的基本组成部分。胆固醇的主要作用是增加LNP脂膜的刚性和稳定性，并协助脂质体与内涵体细胞膜融合。胆固醇作为天然脂质，可通过多种方式调节生物膜的双分子层结构，进而改变脂质双层膜的流动性。在LNP制剂中，胆固醇通过填充LNP间的空隙来增加其稳定性，并且有助于LNP与内体膜的融合，促进其被细胞摄取。也有研究者认为胆固醇是LNP肝靶向的原因，Paunovska等的研究表明，经氧化修饰后的胆固醇制成的LNP可将mRNA靶向性递送到肝脏微环境。因为胆固醇主要存在于LNP的外壳，所以通过对固醇结构进行修饰可能会引起LNP表面的组织变化。此外，当接触载脂蛋白E时，胆固醇会从LNP核心转移到脂质外壳上。这些结果表明，与可离子化脂质相比，虽然胆固醇相对惰性，但胆固醇及其衍生物可能影响细胞识别途径。由于近年来的研究表明，胆固醇摄入过多可能导致患高脂血症和肿瘤等疾病的风险增加，且在储存过程中可受光、热、自由基、氧气等影响，产生具有细胞毒性、致突变、致癌和致动脉粥样硬化的胆固醇氧化产物；因此选用胆固醇结构类似物代替胆固醇制备LNP可以减少胆固醇摄入。关于LNP配方中胆固醇的修饰，还需要进一步的研究与探索。 1.4 中性脂质 中性脂质通常作为LNP配方的结构脂质，可提高阳离子脂质的相变温度，支持脂质双层结构的形成并稳定其结构排列，有助于促进其与内涵体细胞膜融合，且可影响靶器官特异性。LNP制剂中最佳辅助磷脂的选择取决于RNA类型，尾部结构饱和的中性脂质，如二硬脂酰磷脂酰胆碱（1，2-distearoyl-Sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC），更利于递送短的小干扰RNA，见图3；尾部结构不饱和的中性脂质，如DOPE，则更利于递送较长的mRNA。但新型冠状病毒mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273均使用了DSPC作为辅助磷脂，可能是由于其搭配可离子化脂质后，DSPC的表现要优于DOPE，且DSPC是FDA唯一批准的LNP制剂的组成成分。DSPC由磷脂酰胆碱头部基团和2个饱和的18碳尾部组成，2个尾巴形成紧密堆积的脂质双层，其硬脂酸为饱和脂肪酸，相变温度较高（55 ℃），在室温及人体温度条件下可以保持LNP脂膜的刚性和稳定性，提高与细胞的融合性。 2 LNP的制备方法 LNP的制备主要依赖于脂质分子之间的疏水作用以及范德华力等自组装形成纳米颗粒，当其负载基因药物进行递送时，脂质分子的均一性以及对核酸分子的包封能力是影响LNP粒径大小、Zeta电位和稳定性的关键因素。目前，LNP的制备方法主要有薄膜水化法、脂质体挤出法、纳米沉淀法、微流控芯片技术以及可用于大规模生产的冲击射流式混合法等。利用微流控芯片技术制备LNP是目前最为流行的方法，由该技术制备得到的LNP不仅具有均一的粒径大小，而且能够通过改变有机相与水相之间的混合速度，简单有效地控制粒子的尺寸和包封率。 微流控芯片技术基于微流体力学理论，将反应空间缩小在微米级别的管线中进行，对于负载mRNA的LNP来说，其制备过程利用纳米药物制备系统推动溶解了脂质材料的有机相溶液与含有mRNA的水相溶液通过特制芯片通道，混合于通道中的两相溶液在微流体力学的作用下实现纳米颗粒的形成。为了解决应用微流控芯片技术制备LNP规模小的问题，研究者发现，应用冲击射流式混合法制备LNP可有效实现大批量生产。该方法通过利用高压泵使有机相和水相形成2股对冲射流，使两相溶液中的各个组分在高压射流的冲击下充分混合，形成包裹mRNA的纳米粒子。微流控芯片技术以及冲击射流式混合法可以用来制备mRNA LNP，新型冠状病毒疫苗BNT162b2采用的制备技术就是冲击式射流混合法。 3 LNP作为mRNA疫苗载体的应用 脂质体被广泛运用在各种疾病治疗领域，随着mRNA技术的迅速发展，当前最受关注的脂质体药物是以LNP为载体的mRNA疫苗。目前已有诸多相关产品获批上市，如获得FDA和欧洲药品管理局批准的BNT162b2和mRNA-1273，二者使用的LNP配方核心成分及比例近似，具体成分如表1所示。 可离子化脂质是LNP的关键成分，BNT162b2和mRNA-1273使用的可离子化脂质分别为ALC-0315和SM-102，均是可生物降解的第3代阳离子脂质，化学结构中都含有可质子化的氮原子和特定的酯键，两者之间虽具有很强的化学相似性，但在递送效率、免疫应答和稳定性等方面存在细微的差别。 在递送效率方面，Zhang等通过肌内注射SM-102 mRNA-LNP和ALC-0315 mRNA-LNP发现，SM-102比ALC-0315的递送效率更高，这是由于SM-102的pKa值（6.68）比ALC-0315（6.09）高，使其具有更有效的内体逃逸。在免疫应答方面，Escalona-Rayo等的研究发现，SM-102在促进mRNA体外转染和翻译方面虽比ALC-0315效果好，但ALC-0315和SM-102在斑马鱼胚胎体内实验中的蛋白质表达相似，且在小鼠体内产生的IFN-γ和IL-2 CD8＋ T细胞的百分比相当。这可能是由于ALC-0315比SM-102具有略高的表面负电荷，使SM-102在体外转染中产生更强的免疫效果。在稳定性方面，Zhang等的研究发现，SM-102 mRNA-LNP和ALC-0315 mRNA-LNP在-80 ℃条件下没有产生聚集现象，均具有稳定性，可以长期保存。在4 °C条件下两者均不能长期保存，增加了疫苗在储存与运输等方面的时间与成本。另外，在SM-102和ALC-0315包封mRNA时，均使用了含有蔗糖的缓冲液，数据证实蔗糖是1种冷冻保护剂，当LNP储存在4 °C时，可以增加mRNA在肌肉内的递送效率。 在保护效率和长期安全性方面，Teo对BNT162b2和mRNA-1273的临床研究结果进行了总结。结果显示，疫苗组与安慰剂组相比，COVID-19病例数显著降低，证明了BNT162b2在预防COVID-19方面有95%的有效性。不良事件总体上是短暂和轻微的，包括局部疼痛、疲劳和头痛，且在疫苗组和安慰剂组严重不良事件的发生率相似。mRNA-1273的动物实验显示，2次肌内注射mRNA-1273可产生强大的中和抗体应答，并在鼻腔和肺部提供保护，且无免疫病理学迹象，保护效果随剂量增加而增强。Ⅲ期临床研究COVE最终证实了mRNA-1273的有效性为94.5%，并且免疫原性数据扩展至≥119 d。 BNT162b2和mRNA-1273使用的PEG-脂质也不同，分别为ALC-0159和PEG-2000-DMG。ALC-0159和PEG-2000-DMG虽都对LNP的稳定性和递送效率有重要影响，延长了LNP的体内循环时间，但作用方式不同。ALC-0159作为阳离子脂质，直接参与mRNA的包封和细胞内递送过程，其电荷性质对mRNA的保护和释放至关重要；而PEG-2000-DMG则主要通过提供物理屏障，减少免疫识别，来保护LNP免受清除。 LNP作为mRNA疫苗的关键组成部分，在研发和生产过程中需严格控制其关键质量属性以确保疫苗的安全性和有效性。LNP的形态可通过透射电子显微镜和冷冻透射电子显微镜观察，前者适用于固定和干燥样品的高分辨率成像，后者则可在接近生理条件下观察LNP的自然状态。LNP的粒径及其分布直接影响生物分布和细胞摄取，进而影响免疫原性。研究表明，粒径在60~150 nm的LNP在非人灵长类动物中均能产生强大免疫应答。多分散性指数越小，表明粒径分布越均一，可通过激光粒度仪检测。包封率是LNP质量控制的关键指标之一，表示mRNA被包裹的比例，可通过RiboGreen法测定。最后，LNP的表观pKa决定了其电荷状态，影响稳定性、效力和毒性，常用酸碱滴定法和2-（对甲苯胺基）-6-萘磺酸荧光法测定，以确保LNP在最佳pH范围内具有良好的内体逃逸能力。在LNP合成过程中，脂质是必不可少的辅料成分。研究表明， 各脂质成分比例的细微差异都可能会影响LNP的物理化学属性，应监测脂质摩尔比或阳离子脂质与mRNA比例（如氮磷比）的变化情况，这也是确定产品一致性和稳定性的重要指标。这些质量控制措施共同确保了LNP在递送mRNA时的高效性和安全性。 4 展望 LNP作为可高度个性化设计的核酸递送载体，在mRNA疫苗递送中显示出巨大潜力，经过长久的技术积累，目前LNP包裹核酸的体系已广泛用于传染性疾病的预防和各种新型治疗药物的研发。LNP可将mRNA包裹在内部空腔中，这种结构可以提高mRNA在体内的稳定性，有利于mRNA发挥作用。然而，制剂中的LNP载体是药物注射后疼痛与炎症等不良反应的重要诱因。mRNA-LNP制剂还具有不稳定性的问题，由于在温度升高时mRNA具有从LNP中解离的倾向，因此mRNA技术产品需要在低温条件下保存，这使得运输成本与运输难度增加，限制了该剂型在全球范围内的广泛使用。此外，目前常用的LNP中最为关键的阳离子脂质几乎都受到了发达国家专利保护，这也限制了LNP的更广泛应用。LNP载体的脂质组分以及各脂质组分间的配比还需优化，以提高脂质体药物和疫苗的稳定性和安全性。LNP作为药物递送系统的核心技术，其未来的研究方向和创新点将主要聚焦于提升靶向递送的精准度方面，通过在LNP表面修饰特定配体，实现对特定细胞或组织的高度选择性递送，如肿瘤细胞、免疫细胞等，从而提高治疗效果并减少不良反应。随着对LNP研究的不断深入，新技术、新理论的形成，将为基于纳米技术的疾病诊断和治疗开辟新的方向，进一步改善人类疾病诊断、预防与治疗的科学进程。 作者 王红玉  彭沁桦  李玉华  曹守春 中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室， 北京  102926 通信作者：曹守春， Email：caosc@nifdc.org.cn 引用本文：王红玉, 彭沁桦, 李玉华, 等. 脂质纳米颗粒用于mRNA疫苗递送系统的研究进展[J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 48(1): 60-66.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240428-00020 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。