前言
2024.11.28，韩国公司InnoPharmaScreen公开了一篇非常有意思的专利WO2024241248：KRAS G12D分子胶降解剂IPS-06061（如下图）。
有意思的点在于：
最关键的自然是分子是怎么来的：专利声明其通过模拟先天KRAS G12D与CRBN的PPI。并通过在PPI界面处生成合适的药效团，De novo synthesis策略生成分子胶。这一技术可能可能有助于发现更多靶点更多靶点的分子胶降解剂。
不同于以往采用戊二酰亚胺/琥珀酰亚胺的基于CRBN的分子胶降解剂，IPS-06061具有完全不同的结构模块。
IPS-06061选择性降解KRAS G12D（专利中申明也可以降解G12V，但缺乏数据），DC50 = 230 nM，Dmax > 90%。同时对KRAS WT具有选择性。体内药效尚可。
下面对专利主要内容进行一一梳理，并写一点个人看法。
KRAS G12D分子胶的发现
专利中最关键的部分。不得不说这家公司也是个大善人，细节都给出来了。
1. 使用正构方法进行分子胶的计算机设计
使用专有软件和开源软件的组合来实现成功设计新型分子胶降解器的目标。此类软件的示例包括 Maestro（Schrodinger 专有）、Autodock Vina 和 NAMD。我们的 MG 降解剂策略主要涉及两种主要方法：正构方法和变构方法。
设计新型MG降解剂的正位方法主要依赖于两种蛋白质——E3连接酶和我们的POI之间的先天蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。静电相互作用和几何因素会影响此类 PPI，即使我们的 POI 不是我们选择的 E3 的真实基材，它们之间也会存在一定程度的 PPI。这样的 PPI 不会很稳定，是一种会自然解离的“亚稳定”复合物。我们的目标是设计一种小分子配体，通过将其自身插入 PPI 界面，理想地诱导、增强或介导所选 E3 与我们的 POI 之间的相互作用，从而将亚稳定复合物转化为稳定的蛋白质复合物。通过这样做，我们的目标是使我们的 POI 成为我们选择的 E3 的“新基底”。
2. 结构文件的准备
由于我们的策略是建立在MG降解剂的计算机模拟发现的基础上的，因此所涉及的蛋白质的结构的准确表示是至关重要的。一般来说，所有结构均作为 X 射线衍射晶体学数据从蛋白质数据库 (PDB) 获得。我们的第一个 MG 降解剂发现过程重点关注 Cereblon（CRBN，PDB ID：6H0F）和 KRAS G12D（PDB ID：6GJ7）。使用 Maestro 中的蛋白质制备工具下载并预处理结构。将蛋白质的热态调节至 pH 7.0-7.3 以反映细胞内条件。氢键被优化，并通过将重原子收敛到 RMSD 0.3A 来执行约束最小化，以生成能量景观全局最小值处的蛋白质结构。
3. 模拟先天PPI
如前所述，我们的正位策略依赖于E3和POI之间的先天PPI来形成亚稳定复合物。为了在计算机中模拟这种复合物的形成，我们使用了 Maestro 中的蛋白质-蛋白质对接工具。由于我们对 POI 和 E3 之间的任何 PPI 的先验信息为零，因此我们选择在蛋白质-蛋白质对接过程中不给予任何限制。通过探测 70,000 次 KRAS 旋转，我们生成了 20 个最佳姿势，并根据相互作用的自由能进行排名。如果最佳评分 PPI 的解离常数 Kd 大于微摩尔尺度（毫摩尔尺度 Kd 的任何 PPI 都是非相互作用的），则拒绝姿势，并且对生成的姿势进行目视检查，我们删除了任何“异常” ' 姿势，使用排名最好的姿势作为参考。这里，异常姿态表示与参考姿态相比，POI 在完全不同的位置对接 E3。去除异常后，使用玻尔兹曼加权来选择代表性姿势，参数为相互作用的自由能。加权代表性姿势最有可能反映由实际先天 PPI 创建的亚稳定复合体的结构。
4. 药物片段生成
然后，我们使用Maestro中的药效团工具以便在如上所述的蛋白质-蛋白质界面处产生合适的药效团假设。然后，我们根据药效团分析建议合适的片段“种子”。此类片段用于从头合成。
5. 从头合成
将每个上述过程产生的片段用于我们的MG降解剂的从头合成。使用 LEA3D 服务器和我们的手工编码算法，我们利用生成遗传算法来寻找命中分子。我们将算法的搜索空间限制在由两种蛋白质之间的先天 PPI 创建的狭窄区域内。使用片段种子并使用利平斯基规则作为过滤器，生成算法从初始分子生成随机突变分子以形成群体。种群中的每个成员都对接到我们模拟复合体的 PPI 接口，并且最佳对接结构得以保留。现在最好的结构成为新的初始结构，整个过程循环直到达到收敛。对于 KRAS 和 CRBN 之间的复合体，使用 PPI 接口质心处 15 A 的搜索空间。每个群体的大小设置为 50 个分子，算法最多执行 40 代。然而，我们在一些试验中观察到早在 16 代时就出现了收敛。我们的潜在候选 MG 分子是根据其理化性质和合成可及性从大量试验中选出的。
6.分析
然后将用上述过程生成的分子导入Maestro以进行进一步分析。初步分析涉及基本理化性质的计算，例如log P（辛醇/水分配系数）、溶解度、TPSA（拓扑极性表面积）等。这些数据单独存储，以备将来计算或模拟急用时使用。尽管计算机对接是与遗传算法一起进行的，但我们选择将生成的结构重新对接到模拟的 PPI 复合体中。使用 Autodock Vina 和 Glide，以 XP（超精密）模式将分子对接至 PPI 复合物界面。通过这种重新对接方案，我们希望使 POI、E3 和潜在 MG 候选物之间的蛋白质-配体三元复合物的模拟结构尽可能地反映现实。计算结合能并用于评估我们的配体在三元复合物中的结合稳定性。
由于这种静态分析没有产生关于三元络合物的动态稳定性的信息，因此我们利用广泛的分子动力学(MD)模拟。使用 Desmond 作为主要 MD 软件，我们将三元络合物溶解在水中（SPC 水模型），我们的络合物位于立方晶胞的中心。将系统最小化并平衡至 340 K（67 ℃）的温度。我们使用异常高的温度来加速蛋白质复合物的热解离——复合物在如此恶劣的条件下的存活将保证在较低温度下的稳定性。生产运行平均运行 10 ns（最少 5 ns）。然后目视检查生产运行的轨迹。获取并分析 RMSD 数据。将三元复合物的 MD 模拟与作为阴性对照的二元复合物（无配体）的 MD 模拟进行比较。
结果分析，机制论证
使用正构方法进行分子胶的计算机设计
已经生成了KRAS G12D突变体的一些潜在候选分子，其中CRBN作为选择的E3。分子动力学结果表明，所设计的这些分子（下图）能够有效增强POI和E3连接酶之间的相互作用，有效诱导POI与E3连接酶的接近，从而成功泛素化。
专利中给出了部分化合物的合成路线。但仅有对IPS-06061(即Cpd.7)作进一步评价。这些化合物结构也较为简单易合成，感兴趣的可以合成出来评价一下。
此外，降解性泛素化通常发生在 KRAS 的 C 端赖氨酸残基处。C端位于KRAS-CRBN相互作用界面的另一侧，表明降解泛素化不受阻碍。
在具有和不具有设计的分子胶候选物的情况下，分析了在生理条件下10ns模拟之后复合物的RMSD(均方根偏差)。当引入设计的分子时，与没有MG的情况相比，三元复合物的峰值RMSD显著降低。表明通过设计的分子胶结构诱导了三元复合物稳定性。
SPR 分析系统进行 PPI 三元复合物测定
当 CRBN 和 KRAS G12D 蛋白用 IPS-06001 处理时，检测到三元复合物（CRBN-KRAS G12D-IPS06001 复合物）的传感图，IPS-06001 是一种以剂量依赖性方式特异性针对 KRAS G12D 的新型分子胶（MG）。
然而，CRBN-KRAS WT-IPS06001 的传感图没有增加，这一结果表明 IPS-06001 是一种针对 KRAS G12D 而不是 KRAS WT 的新型 MG 降解剂
IPS06001的体外降解活性
开头也简要提到过了。IPS-06061 显示 AsPC-1 胰腺癌细胞中 KRAS G12D 的降解呈时间依赖性，KRAS G12D 的 DC50 <500 nM 和 Dmax >90%，而对 Caco-2 细胞中 KRAS WT 的降解没有影响。这些数据表明，由于 IPS -06061 诱导的蛋白质泛素化，KRAS GI2D 被成功降解。
IPS-06061的体内药效
采用植入AsPC-1胰腺癌细胞的异种移植小鼠模型，每周两次口服IPS-06061，持续28天。与空白对照相比，高剂量(80mpk)治疗组中的平均肿瘤生长显着减少（TGI接近100%），且显着降低了肿瘤重量。此外，通过测量体重、食物摄入量、全血细胞计数和生化血液化学来评估毒性，IPS-06061组未观察到明显变化。
总而言之，这些数据表明 IPS-06061 通过 CRBN-KRAS G12D-IPS-06061 三元复合物形成诱导 KRAS G12D 泛素化而显示出良好的抗癌活性。
后话
1.关于KRAS G12D分子胶与PROTAC
InnoPharmaScreen成立于2009年，也算是历史比较久的公司，但从管线上看其研发能力并不突出，目前仅有IPS-07004（NLRP3抑制剂）一款药物进入临床，其余均在早期R&D阶段。本专利中给出了一个显然FIC、结构新颖的KRAS G12D-CRBN分子胶，倒显得与这家公司有点格格不入。
另外，从公司管线看，其肿瘤领域有一个IPS-06060是分子胶降解剂。本专利中的IPS-06061很可能便是该管线的衍生。
另外，从Seed Therapeutics官网上看，其也有一条针对KRAS G12D分子胶管线。猜测应该也是分子胶降解剂，可能也是招募CRBN。至于Seed的G12D分子胶具体结构，只能等后续专利公开了。
提到分子胶自然免不了与PROTAC作对比。PROTAC既有的缺陷便是分子量导致的成药性问题，以及关键“hook effect”现象限制其药效。而分子胶相较于PROTAC具有理论上的优势。此前提到的安斯泰来的KRAS G12D PROTAC的临床数据有点不尽如人意，算是给PROTAC领域泼了一盆凉水。
本专利的数据也表明了，KRAS G12D与CRBN也存在较弱的PPI，通过分子胶稳定PPI，实现了降解KRAS G12D的目的。当然目前看来IPS-06061的体内外药效并不出色（DC50活性一般，TGI接近100%，尚无法达到肿瘤消退），且成药性应该也有较大提升空间。基于这一结构进行进一步的成药性优化，可能会发现药效更为出色的G12D分子胶降解剂。至于基于这一骨架的G12D分子胶未来是否能够进入临床，值得期待。
提到G12D分子胶自然免不了与RMC-9805作对比。RMC-9805(非降解型分子胶)通过招募伴侣蛋白CypA与RAS G12D形成三元复合物阻断其功能，初步临床结果表现出色。这类分子胶的发现也是基于发现了KRAS与CypA存在弱PPI。这也成为了一个降解型分子胶与非降解型分子胶同台PK的有趣案例。
2. 全新骨架的CRBN分子胶此前也多次介绍过Monte Rosa的分子胶发现策略【分子胶的理性设计(3)：Monte Rosa教你如何“调教”CRBN】、【22.5亿美元！诺华青睐的VAV1分子胶长啥样？市场前景如何？】。Monte Rosa的策略是基于分子表面模拟发现POI，通过在戊二酰亚胺骨架上衍生基团招募POI对其降解。这其实也是目前大部分分子胶研发公司的通用策略。
而本专利则截然不同，通过计算化学，模拟CRBN与KRAS的PPI，片段生成，从头合成的一系列步骤，发现了完全不依赖戊二酰亚胺的全新CRBN骨架。遗憾的一点是专利中图片较为模糊，未给出PDB，无法清楚知道分子形成的三元复合物的具体构象。
但这一策略也给分子胶发现带来新的启发：目前看这套策略可能具有普适性，基于这套策略，未来能否发现更多基于新靶点的新骨架的CRBN分子胶，甚至未来拓展到CRBN之外新的E3连接酶，解锁分子胶技术更多的潜能。
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