摘要
本研究采用泰勒弥散分析（TDA）与动态光散射（DLS），系统表征了两种药物ABD-0001和ABD-0171在脂质纳米乳（LNE）中的包封情况。DLS结果显示，两种制剂在平均粒径、PDI及表面电荷等胶体性质上高度一致，难以区分其包封差异。
相比之下，TDA展现出更高的分辨能力，清晰揭示了两种药物在包封效率上的显著不同。ABD-0171在LNE中表现出均一的粒径分布，显示其被高效包封；而ABD-0001 则检测到游离药物和胶束形态，表明其包封效率不足。
本研究表明，TDA在解析脂质纳米乳中药物包封状态方面明显优于DLS，是优化脂质纳米递送体系和提升制剂质量的重要表征工具。
引言
基于纳米颗粒的制剂能够实现药物的高效装载与可控释放，在降低给药剂量的同时提高治疗效果并减少副作用。其中，脂质纳米药物在2018年Onpattro®获得FDA与欧盟批准，以及新冠疫情期间基于脂质纳米颗粒的mRNA疫苗成功应用后，已成为药物递送领域的重要技术平台。
脂质纳米乳（LNE）是一类典型的脂质纳米体系，由脂质核心和表面活性剂组成，可有效包载疏水性药物并提升其生物利用度。LNE的粒径是影响药代动力学、体内分布及细胞摄取行为的关键参数。然而，仅依赖粒径信息已无法满足当前制剂开发需求，药物是否被充分包封、是否以游离态存在，正成为决定疗效与安全性的核心问题。
目前尚缺乏能够可靠区分游离药物与包封药物的分析方法。动态光散射（DLS）虽广泛用于粒径表征，但在解析复杂纳米体系中的药物包封情况方面存在明显局限。
本研究引入分辨率更高的泰勒弥散分析技术（TDA），用于评估LNE中两种结构相似但亲脂性不同的小分子药物的包封行为。结果表明，TDA不仅可准确测量纳米颗粒粒径，还能区分游离药物、胶束态与真正包封于LNE中的药物形式。研究进一步显示，较高的包封效率对应更低的药物释放速率和更好的化学稳定性，凸显了TDA在脂质纳米制剂开发与优化中的重要价值。
材料与方法
脂质纳米乳（LNE）配方制备
脂质纳米乳配方通过相反转温度法（phase inversion temperature, PIT）制备。简要流程如下：将构成纳米乳油相核心的中链甘油三酯（MCT）与两种不同的表面活性剂（一种两性表面活性剂和一种疏水性表面活性剂）在搅拌下混合。在保持适当搅拌的情况下，对混合物进行三次60°C至85°C的热循环，以诱导水包油（W/O）与油包水（O/W）乳液的相互转化。在最后一次相反转时，加入冷水稀释混合物以稳定最终的油包水纳米乳。在药物包封配方中，药物直接溶解于MCT油相中，然后进行相同的制备工艺。
动态光散射（DLS）粒径测量
使用Zetasizer Nano ZS（Malvern Panalytical, UK）通过动态光散射测定颗粒粒径及多分散指数（PDI）。每个配方在MilliQ 水中稀释100倍后进行测量。折射率设为1.14，吸收设为0，温度设为25°C。测量前在173°背散射角下进行120秒的平衡。固定位置为1.45 mm，固定衰减器为7。每个样品进行5次测量，每次测量包含20 次10秒扫描。数据使用多窄模式（multiple narrow mode）分析，以提供Z平均粒径（nm）及粒径分布的PDI。
泰勒弥散分析（TDA）粒径测量
SD-TDA实验在Nanoscale Metrix（法国图卢兹）TaylorSizer分析仪上进行，使用二极管阵列检测器。紫外检测波长为206、240和270 nm。所有实验均使用裸熔融石英毛细管（内径50 µm，总长60 cm，到检测窗口长度49.5 cm）。毛细管区域温度设为25°C。数据处理由TaylorSoft软件完成（见图1），其中包含专利算法，可通过TDA确定粒径分布。对于ABD-3001和ABD-3171样品，测量在药物特定波长（分别为270 nm和240 nm）进行，从而实现对溶液中物质的相对和特异性定量，因为在这些波长下，不含药物的LNE不吸光。
体外释放实验
通过透析法评估配方中药物释放情况。将纤维素膜预先水化后，向3 mL的透析盒（分子量截断10 kDa）中加入3 mL样品，纳米乳被保留在透析盒内，而游离小分子可通过膜扩散。装样后，透析盒竖直浮于400 mL 0.9% NaCl透析浴中，轻轻搅拌。分别在2小时、6小时和 24小时取样，通过高效液相色谱（HPLC）测定透析液中药物释放量。
稳定性研究
在37°C、室温和4°C条件下研究制剂稳定性。每个制剂储存在玻璃瓶中，在预定时间点，通过DLS测定制剂的物理化学特性（胶体稳定性），并通过HPLC测定药物降解情况（化学稳定性）。
结果与讨论
脂质纳米乳（LNE）的制备与表征
LNE制剂是为包封两种不同的药物而制备的。两种分子的理化特性总结如下表1所示。两种化合物在结构上具有相似性，包括硫酯基、胺基和三键，但ABD-0171化合物具有额外的疏水链，从而导致其分子量增加并且log P值升高。这一结构差异及相关的理化特性表明，ABD-0171化合物更适合作为高效包封于脂质制剂（如LNE）的候选药物。
最终的LNE配方通过动态光散射（DLS）进行表征，以测量所得纳米颗粒的平均直径和Zeta电位，并通过高效液相色谱（HPLC）定量配方中的总药物含量。需要注意的是，这些配方在制备后未经过纯化，因此药物的测定未区分已包封与未包封的药物，所测得的数值对应于最终制备中药物的总量。下表2展示了所制备配方的具体特性。
两种包封药物的LNE制剂显示出相似的胶体特性，平均粒径介于45–50 nm之间，PDI非常低（<0.05），表面电荷接近中性。与不含药物的对照制剂（ABD-3000）相比，药物的存在并未对LNE的理化性质产生显著影响。
可以观察到，现有的表征技术无法区分不同的LNE制剂，因此也无法揭示两种化合物在包封效率上的差异，尽管从理化性质角度来看，ABD-0171相较于ABD-0001理应具有更高的包封能力。
体外释放与稳定性研究
ABD-0001和ABD-0171分别从其LNE制剂ABD-3001和ABD-3171中的体外释放曲线如图2所示。可以清楚地观察到，ABD-0001分子在其制剂ABD-3001中被大量释放，而ABD-0171即使在透析24小时后几乎未检测到释放。然而，这些曲线无法区分释放的药物是来自最初未包封的游离药物（可自由通过透析膜扩散），还是来自LNE内真正释放的包封药物。这一信息在体内（in vivo）应用时具有重要意义，例如：
1. 游离扩散的药物可能在到达治疗部位前被代谢，并可能引起副作用；
2. 包封药物的突释现象，根据期望的治疗曲线，可能是期望的，也可能是不期望的，因此需要加以控制；
3. 能够调控药物释放曲线有助于增强治疗效果。
因此，将药物释放曲线数据与游离药物与包封药物的量结合起来，将为进一步优化基于纳米颗粒的配方提供重要信息。
有趣的是，对ABD-3001和ABD-3171 LNE制剂的稳定性研究显示，ABD-0001化合物相比ABD-0171化合物在储存过程中发生的水解化学降解更为显著。这表明ABD-0001分子在储存期间会释放到周围的水性介质中，从而限制了该配方的保质期。然而，与药物体外释放曲线数据类似，目前仍无法判断ABD-0001分子是在制备过程中未被有效包封，还是已经被包封后又从LNE配方中释放出来，这限制了进一步的配方优化。
总体而言，非常需要一种表征技术，以便更好地理解药物在LNE配方中的包封情况，并指导后续的配方开发。
使用SD-TDA(Size Distribution – Taylor Dispersion Analysis)进行粒径表征
ABD-0001和ABD-0171两种游离药物通过SD-TDA获得的粒径分布如图3所示。每种药物均配制为5 mg/mL，ABD-0001溶于水/异丙醇混合液（体积比50/50），而ABD-0171溶于纯异丙醇中。
SD-TDA分析显示，ABD-0001和ABD-0171两种物质的水动力学直径大约相同，约为1 nm，并且重复性良好（见表3）。这进一步表明，SD-TDA是一种强大的技术，可以用于测定超小纳米颗粒（最低0.1 nm）的水动力学半径，无论其制备介质为何（水相、有机相或溶剂/水混合）。
对先前描述的每一种制剂，随后都使用SD-TDA进行了表征。在每次分析之前，毛细管先用制剂的制备介质（0.9% NaCl）进行填充。在测量步骤中，同样使用该介质作为流动介质。图4a和4b展示了未含药的对照制剂（ABD-3000）通过SD-TDA获得的Taylor图和粒径分布。
对ABD-3000配方的分析显示，主要颗粒群的水动力直径约为35 nm（相对定量97%，相对标准偏差RSD=1.8%，样本数N=3）。同时，还检测到一个次要颗粒群，直径约为6 nm（相对定量3%），PDI为4%。这些结果与之前通过DLS测得的数值一致（见表2）。
含药的两种LNE制剂（ABD-0001和 ABD-0171）通过SD-TDA进行了表征。图5和图6分别展示了ABD-3001制剂和ABD-3171制剂的Taylor图（a）以及粒径分布图（b）。各颗粒群在粒径分布图上的尺寸及相对定量在表4（ABD-3001制剂）和表5（ABD-3171制剂）中有详细说明。
通过SD-TDA对ABD-3001制剂的粒径分布图观察到三个颗粒群：一个在1.2 nm，对应于未封装的游离药物；一个在12.4 nm，对应于类似胶束的纳米结构，这类结构常见于LNE型制剂中；还有一个在65.0 nm，对应于含药的LNE。各颗粒群的相对定量显示，该药物在LNE中未被完全封装，其中相当大一部分以游离形式存在（58%），另一部分以胶束形式存在（25%）。这些分析表明，ABD-0001在LNE中的包封效率仅为17%，包封效果不佳。
与ABD-3001制剂不同，ABD-3171制剂的SD-TDA粒径分布图仅显示两个颗粒群，水动力直径分别约为30 nm和10 nm。未观察到游离分子的存在。各颗粒群的相对定量显示，该药物被高效包封，其中约95%的药物位于30 nm的LNE颗粒群中，实现了良好的包封效率。
总体而言，SD-TDA揭示了两种制剂在药物包封上的差异，而DLS由于分辨率不足且样品中较大纳米颗粒的存在会带来偏差，因此无法识别这种差异。
结论
本研究展示了利用尺寸分布-泰勒弥散分析（SD-TDA）有效表征两种药物ABD-0001和 ABD-0171在脂质纳米乳（LNE）制剂中封装效率的应用。这两种药物在结构上具有相似性，但脂溶性不同。尽管通过动态光散射（DLS）测得的LNE制剂的胶体特性（如平均粒径、多分散指数和表面电荷）相似，SD-TDA分析却揭示了显著的包封效率差异。SD-TDA显示 ABD-0171在LNE中被均匀且高效地包封，其水动力直径约为30 nm。相比之下，ABD-0001的粒径分布更为复杂，包括游离药物分子和胶束型纳米颗粒，表明其包封效果不佳。两种分子包封差异与其药物释放行为和稳定性差异一致，为进一步的制剂优化提供了依据。
本研究凸显了DLS在分辨和定量制剂中不同药物形态方面的局限性，并强调了使用像SD-TDA这样的先进分析技术以深入了解药物包封、优化脂质制剂的重要性。将SD-TDA分析作为纳米制剂的表征工具，可以更好地评估和改进药物递送系统，确保最大化包封效率，并根据特定治疗需求调控药物释放曲线。
Advanced BioDesign是一家临床阶段的生物技术公司，成立于2010年，致力于开发新型抗癌药物，特别聚焦于通过靶向ALDH（醛脱氢酶）这一创新治疗策略，用于治疗急性髓性白血病及其他未满足医疗需求较高的癌症。这一开创性策略旨在克服肿瘤的化疗耐药性，同时恢复或激活癌细胞的内源性凋亡机制。
泰勒弥散分析（Taylor Dispersion Analysis，TDA）是一种基于溶质在层流条件下的弥散行为，仅需约10纳升的原生状态样品，即可测定分子的扩散系数，并通过斯托克斯–爱因斯坦方程将其转换为水动力学直径。
TDA是一种绝对测量技术，无需校准，能够同时对样品中游离分子与偶联药物或纳米颗粒进行定量分析，适用于RNA、蛋白质、抗体及其片段、肽、寡核苷酸、小分子化合物、偶联类药物、聚集体等生物分子的高分辨率尺寸分布与稳定性研究。
SD-TDA如同一台高分辨率雷达，为生物药和纳米递送系统在早期研发与工艺开发与优化、制剂稳定性研究中，实现对样品异质性的早期识别和前瞻性评估，使研发决策风险从被动确认变为主动管控。
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