Accumulating evidence suggests that phenotype switching of cancer cells is essential for therapeutic resistance. However, the immunological characteristics of drug-induced phenotype-switching melanoma cells (PSMCs) are unknown. We investigated PSMC elimination by host immunity using hyperdifferentiated melanoma model cells derived from murine B16F10 melanoma cells. Exposure of B16F10 cells to staurosporine induced a hyperdifferentiated phenotype associated with transient drug tolerance. Staurosporine-induced hyperdifferentiated B16F10 (sB16F10) cells expressed calreticulin on their surface and were phagocytosed efficiently. Furthermore, the inoculation of mice with sB16F10 cells induced immune responses against tumor-derived antigens. Despite the immunogenicity of sB16F10 cells, they activated the PD-1/PD-L1 immune checkpoint system and strongly resisted T cell-mediated tumor destruction. However, in vivo treatment with immune checkpoint inhibitors successfully eliminated the tumor. Thus, hyperdifferentiated melanoma cells have conflicting immunological properties - enhanced immunogenicity and immune evasion. Inhibiting the ability of PSMCs to evade T cell-mediated elimination might lead to complete melanoma eradication.

2025-01-01·INTERNATIONAL ENDODONTIC JOURNAL

Multiple cell death modalities and immune response in pulpitis

Article

作者: Huang, Weiying ; Wang, Ben ; Li, Jiaqi ; Li, Wenwen ; Wei, Xi ; Shi, Songtao ; Li, Xuemeng ; Mao, Xueli

Abstract:

Aim:

To investigate the level and distribution of apoptosis, pyroptosis, necroptosis, and NETosis in pulpitis with or without necrosis on a basis of histological classification. Additionally, to examine the effect of pulpitis with necrosis (PWN) on the number and activation of peripheral and bone marrow (BM) neutrophils, as well as spleen lymphocytes, in a mouse model of pulpitis.

Methodology:

The material comprised 20 permanent teeth, with or without caries, which were classified into three histological categories based on the distribution of inflammatory cells and the presence or absence of necrosis: (i) healthy pulp (HP), (ii) pulpitis without necrosis (PWON), and (iii) PWN. The levels of the four regulated cell death (RCD) pathways were detected by immunohistochemical and immunofluorescent staining with specific markers: apoptosis (caspase‐8, cleaved caspase‐3), pyroptosis (cleaved caspase‐1, membrane‐binding gasdermin D), necroptosis (receptor‐interacting kinase 3, phosphorylated MLKL), and NETosis (myeloperoxidase, citrullinated histone H3). Acute pulpitis was induced in C57BL/6J mice via pulp exposure, and the mice were divided into four groups: (i) control (no tooth preparation, n = 6), (ii) Day 1 (sacrificed at 1 day after pulp exposure, n = 3), (iii) Day 3 (n = 3), and (iv) Day 5 (n = 7). The control and Day 5 groups were used for further immunofluorescent analysis to assess the levels of RCD and flow cytometry to monitor the changes in peripheral and BM neutrophils, as well as spleen lymphocytes. Human dental pulp stem cells (hDPSCs) were isolated and cultured from extracted healthy third molars. Apoptosis and necroptosis in hDPSCs were induced by staurosporine, whilst pyroptosis was induced by lipopolysaccharide and nigericin. One‐way analysis of variance (ANOVA) with Tukey's test, Welch's ANOVA with Tamhane's test, and Student's t‐tests were used to compare immunohistochemical labelling and flow cytometric data amongst groups (p < .05).

Results:

The pulpal tissue of PWN can be divided into the abscess core (PWN‐AC) and fibrous tissue (PWN‐FT). The ratio of total necrotic cells (TUNEL‐positive) in PWN‐AC was significantly higher than in PWN‐FT and PWON (both p < .01). Compared with HP, the expression levels of markers for apoptosis and pyroptosis were increased in PWON, whilst the expression levels of markers for apoptosis, pyroptosis, and NETosis were elevated in PWN, primarily detected in PWN‐AC. Interestingly, myeloperoxidase (MPO) was exclusively observed in PWN‐AC, with minimal detection in PWN‐FT and PWON. Additionally, the frequency of MPO+ cells was significantly higher than that of MB‐GSDMD+ cells and Cl‐cas3+ cells in PWN‐AC (both p < .01). Histological observation and TUNEL staining showed abundant necrotic cells in mouse pulpal tissue after pulp exposure, indicating a simulation of human PWN. In mouse pulpitis tissue, markers of apoptosis, pyroptosis, and NETosis were detected. In vitro, various cell deaths including apoptosis, pyroptosis, and necroptosis were also triggered in hDPSCs under various cell death treatments. Furthermore, in terms of systemic changes, pulp exposure‐induced pulpitis could increase the number (p < .05) and cellular activity (p < .01) of neutrophils from BM in a mouse model. No significant changes in peripheral blood neutrophils, spleen T cells, B cells, or the CD4/CD8 ratio were detected between the control and pulpitis mice.

Conclusions:

Our findings uncover distinct patterns of mixed cell death at different histological stages of human pulpitis and the impact of pulpitis on the number and activity of BM neutrophils. Notably, NETosis occurs specifically and predominates in the abscess area of pulpitis, suggesting a potential effect of neutrophil extracellular traps (NETs) on pulpitis progression and NETs‐targeted diagnostic strategy may play a role in decision making for vital pulp therapy.

2024-12-01·Advanced Science

PPM1G Inhibits Epithelial–Mesenchymal Transition in Cholangiocarcinoma by Catalyzing TET1 Dephosphorylation for Destabilization to Impair Its Targeted Demethylation of the CLDN3 Promoter

Article

作者: Wang, Da ; Huang, Wenhua ; Wang, Bing ; Chen, Junsheng ; Xiong, Fei ; Liu, Wenzheng ; Chen, Yongjun ; Wang, Qi ; Kuai, Yiyang ; Qi, Yongqiang ; Wu, Guanhua

Abstract:

Ten–eleven translocation protein 1 (TET1) functions as an epigenetic regulatory molecule, mediating the majority of DNA demethylation, and plays a role in the development of different types of cancers by regulating the expression of proto‐oncogenes and oncogenes. Here it is found that TET1 is highly expressed in cholangiocarcinoma (CCA) and is associated with a poor prognosis. In addition, TET1 promotes claudin‐3 (CLDN3) transcription by targeting the CLDN3 promoter region between −16 and 512 for demethylation. PPM1G functions as a protein dephosphorylase, catalyzing the dephosphorylation of TET1. This results in the destabilization of the TET1 protein, thereby impairing the targeting of the CLDN3 promoter for demethylation. Two phosphatase inhibitors, staurosporine and AZD0156, inhibit epithelial‐to‐mesenchymal transition (EMT) in cholangiocarcinoma cells by suppressing TET1 expression. In conclusion, it is also demonstrated that PPM1G can be employed as a therapeutic target to impede the progression of CCA by catalyzing the dephosphorylation of TET1, which diminishes the capacity of TET1 to target the CLDN3 promoter to activate transcription and inhibit EMT in CCA.

项与 Staurosporine 相关的新闻（医药）

2024-12-15

·精准药物

Nat. Rev. Drug Discov. | 长文综述：激酶药物的深度解析-精读024

自2001年imatinib（伊马替尼，商品名：格列卫）获批以来，小分子激酶抑制剂（SMKI）已发展成为癌症治疗的一类主要靶向疗法。公开资料显示，过去的二十年里，已超过100个SMKI获得了美国食品药品监督管理局(FDA)（约80个）和中国国家药品监督管理局(NMPA)（22个）的批准，为人类健康带来了显著效益。然而，SMKI存在一个不可忽视的“短板”：即患者会发展出耐药性。这种情况通常在临床治疗大约1-2年后出现，导致需要更换治疗方案，不得不采用其他替代治疗策略或使用更新一代的激酶抑制剂。本文以Nature Reviews Drug Discovery（2024年影响因子122.7）的一篇综述为蓝本，讨论激酶抑制剂的定义（划分标准）及设计趋势，包括变构和共价抑制剂、双功能抑制剂和化学降解剂的开发。文末链接可跳转原文 2021年8月5日Uppsala University（瑞典乌普萨拉大学）的Helgi B. Schiöth课题组在Nat. Rev. Drug Discov.以“Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design”为题发表综述。全文内容两万余字，详尽阐述了激酶类药物的各方面信息，仅供学术交流。目录 1 Introduction / 2 已上市的激酶抑制剂 2.1 激酶家族和靶标中已批准的药物 2.2 肿瘤适应症的激酶抑制剂 2.3 肿瘤适应症之外的激酶抑制剂 2.4 药物分类 3 激酶抑制剂设计的趋势 3.1 激酶催化结构域的结构特征 3.2 理性设计抑制剂的策略 3.3 激酶抑制剂的化学结构趋势 3.4 变构抑制剂 3.5 共价抑制剂 3.6 大环化合物 3.7 双功能抑制剂 4 研究性药物的发展趋势 4.1 激酶抑制剂临床试验的成功率 4.2 激酶家族的在研药物靶标 4.3 新型靶点肿瘤学的激酶抑制剂 4.4 新型靶点肿瘤学以外的激酶抑制剂 4.5 已停止开发抑制剂的激酶 5 展望 / 1. Introduction 由激酶和磷酸酶介导的可逆蛋白质磷酸化在调节细胞功能（例如细胞增殖、凋亡、亚细胞易位、炎症和代谢）方面具有关键作用。人类激酶组由约560种蛋白激酶组成，其中包括约500种真核蛋白激酶(ePK)，分为八个主要组，例如酪氨酸激酶，以及约60种非典型蛋白激酶，例如具有保守激酶的脂质激酶与ePK类似，但与ePK的其他高度保守的序列基序不同。自20世纪80年代以来，蛋白激酶已被认为是潜在的药物靶点，特别是基于对癌症的分子理解的进展，包括SRC等癌基因的发现。然而，由于细胞中ATP浓度高、对激酶活性调节和保守的ATP结合口袋了解甚少，开发与ATP位点结合的蛋白激酶抑制剂最初被视为难以克服的挑战。尽管如此，天然化合物staurosporine因其强大的激酶抑制活性而受到人们追捧，尽管选择性较差。到20世纪80年代末，这为识别并优化针对ATP结合位点、具有合适药物性质、选择性和效力的合成小分子激酶抑制剂（SMKIs）铺平了道路。在上世纪90年代此类努力下，两种激酶抑制剂获得了监管部门的批准。Fasudil（法舒地尔）是一种Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK1和ROCK2）抑制剂，于1995年在日本被批准用于治疗脑血管痉挛，但Fasudil的ROCK抑制活性直到1997年才被描述。Sirolimus（西罗莫司）是一种天然产物，在雷帕霉素机制靶点(mTOR)的发现中发挥了关键作用，于1999年成为第一个在美国上市的激酶抑制剂。FDA批准用于预防器官排斥，现在回想起来，它也是第一个变构激酶抑制剂。鉴于这两种药物的开发经验，伊马替尼（CGP 57148、STI571）于1992年在Ciba-Geigy实验室发现，并于2001年获得FDA批准，被视作激酶抑制剂开发中的一项关键里程碑。伊马替尼可有效抑制多种酪氨酸激酶，包括BCR-ABL和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，最初被批准用于治疗BCR-ABL驱动的慢性粒细胞性白血病(CML)，随后用于其他适应症，例如治疗KIT驱动的胃肠道肿瘤(GIST)。其显著的临床效果成为肿瘤学领域分子靶向治疗活动激增的催化剂，过去的二十年里，激酶抑制剂在这一领域一直占据着重要地位。近期对激酶抑制剂的综述描述了激酶药物发现的重要方面，包括靶向途径和蛋白质家族，仅FDA批准的SMKI，相关疾病适应症或结构方面。然而，据我们所知，还没有发表过关于临床试验中激酶抑制剂和激酶靶点的综合分析，由此我们单独撰文（有关数据集和分析的来源的详细信息，参阅正文Box 1）。我们介绍了FDA批准的激酶抑制剂和药物在临床试验中的趋势，这些趋势可以扩大治疗靶向的激酶组的比例。考虑到这些机会，我们还讨论了激酶抑制剂设计的趋势和策略。2. 已上市的激酶抑制剂自1995年Fasudil获批以来，全球获批的激酶抑制剂数量已增至98种药物[该文发表于2021年，故与笔者在推文开始时的数据有出入]，其中71种为已获得FDA批准的SMKI（截至2021年5月）。值得注意的是，过去5年批准的SMKI数量增加了一倍以上，FDA批准了37个药物，SMKI约占2016-2021年FDA批准的所有新药的15%。FDA还批准了10种靶向受体酪氨酸激酶(RTKs)的单克隆抗体(mAbs)。另外16种SMKI和一种mAb已获得其他监管机构的批准（详见下表）。 2.1 激酶家族和靶标中已批准的药物 FDA批准的71个SMKI靶向21个激酶家族，约占激酶组的20%，这与之前对蛋白激酶靶点覆盖范围的估计相对应。已获得FDA批准的药物靶向的激酶（通常被认为是通过行业标准进行临床验证的）包括八个主要ePK组中五个家族的成员（TK、TKL、STE、CMGC和AGC），其中一个家族属于非典型蛋白激酶组(PIKK)和脂质激酶中的一个家族（PI3K；磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶）。具体来说，这71个SMKI主要抑制这些组中的大约42个蛋白质，其中大多数（49个SMKI）主要针对TK组中15个家族成员的30个蛋白质（图2）。尽管TK组是利用最多的激酶组，但只有大约30%是有针对性的，这表明仍有很大的进一步探索空间。 RTK的HER家族(HER1-4)成员是最具针对性的，有8种FDA批准的SMKI和8种FDA批准的mAb专门针对这些蛋白质。RTK的血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族也受到了广泛的研究，其中有7种SMKI和一种mAb已获得FDA批准，尽管所有SMKI都是非选择性抑制剂，也与其他RTK相互作用。Janus激酶(JAK)的抑制是另一种流行的治疗策略，迄今为止，针对该家族的五种SMKI已获得FDA批准。 2.2 肿瘤适应症的激酶抑制剂有大量临床证据支持激酶在癌症中的驱动作用，因为它们通过易位或激活突变而异常激活。染色体易位产生定位异常的融合蛋白，可能具有潜在致癌性。这些疾病驱动因素的识别和表征促进了分子引导癌症疗法的设计和批准，首先是伊马替尼治疗由BCR-ABL易位驱动的慢性粒细胞白血病（CML）的开创性例子，这种易位导致蛋白的酪氨酸激酶活性升高。大多数FDA批准的SMKI（61个；89%）和所有FDA批准的靶向激酶的mAb（10种mAb）均具有肿瘤学适应症。继伊马替尼之后，迄今为止还有四种针对ABL的SMKI已获得批准：尼洛替尼、达沙替尼、博舒替尼和帕纳替尼（有关ABL抑制剂开发的详细信息，参见Box 2）。值得注意的是，SMKI治疗CML已被证明是持久的，并且相当大比例的慢性期CML患者(高达40%)在停止治疗后没有复发。在我们集中处理已批准药物数据中，超过20%（19种SMKI和2种mAb）被批准用于非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗。考虑到肺癌是男性和女性中最主要的癌症死亡原因，并且80-85%的肺癌病例是非小细胞肺癌，这一点非常重要。对于NSCLC的批准药物说明了激酶抑制剂在肿瘤学领域的总体发展趋势：识别肿瘤的分子特征能够促进第一代SMKI的研发及应用，并指导进一步的药物研发以克服耐药性的出现。事实上，针对获得性耐药的下一代抑制剂占到了针对七个主要激酶基因家族（NTRK、ABL、ALK、BTK、FLT3、KIT和MET）的药物的70%。新一代测序（Next-generation sequencing）已经成为非小细胞肺癌中肿瘤测序的金标准，用以检测驱动突变并促进在一个单一检测中全面测试多个基因靶标。这有助于识别EGFR、ALK、ROS1、NTRK和MET等基因中的驱动变异，这些变异现在已成为FDA批准的药物的目标。在2000年代初期首批被批准用于NSCLC治疗的SMKI是吉非替尼和厄洛替尼，其基于表皮生长因子受体（EGFR）在肿瘤生长和进展中的重要作用而设计的。然而，针对EGFR的SMKI常常会遇到由突变引起的药物耐药性问题。特别是，T790M看门人突变会在接受EGFR抑制剂治疗的患者中高达50%的比例出现。外显子21中的单点替换突变（L858R）和外显子19的缺失，通常被称为“经典”的EGFR激活突变，因为它们占EGFR激酶域突变的85-90%，这些突变被认为是与不同临床病理特征相关的敏化突变。外显子20的插入也是激活突变；然而，它们本身对EGFR抑制剂并不敏感，并且与较差的患者预后相关联。包括阿法替尼和达可替尼在内的下一代共价SMKI已被FDA批准，这些药物对诸如T790M之类的突变有效。此外，第三代抑制剂奥希替尼也被批准，它能特异性地靶向激活突变以及T790M耐药突变。 ALK（间变性淋巴瘤激酶）的重排会产生异常的ALK蛋白，促进细胞增殖和迁移，在大约5%的非小细胞肺癌（NSCLC）病例中被识别。首个ALK抑制剂克唑替尼于2011年获得批准。与ALK密切相关的是ROS1，它同样可以被ALK抑制剂靶向。ROS1的重排在NSCLC中的发生率约为1-2%。此外，在克唑替尼耐药的患者中，获得性ROS1耐药突变的发生率可达60%。为了改进克唑替尼的治疗特性并克服耐药突变，已经开发出了第二代和第三代化合物。自从克唑替尼之后，又有四种额外的SMKI被FDA批准用于ALK或ROS1易位的治疗：色瑞替尼、艾乐替尼、布加替尼和劳拉替尼。最近，又有四种额外的SMKI被批准用于治疗与特定激酶相关的突变引起的NSCLC：塞培利替尼和普拉塞替尼用于RET融合阳性的NSCLC治疗；卡马替尼和特泊替尼用于MET突变阳性的NSCLC治疗。针对肿瘤血管生成是重要的抗癌策略之一，许多已获批准的激酶抑制剂成功地针对了由VEGFR（血管内皮生长因子受体）、PDGFR（血小板衍生生长因子受体）、KIT、成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）和MET驱动的血管生成途径。例如，有五种被FDA批准的SMKI用于肾细胞癌的治疗，这些药物可以抑制VEGFR以及其他受体酪氨酸激酶（RTKs），还有两种获批的雷帕霉素类似物抑制剂，即替西罗莫司和依维莫司，它们靶向mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白），这是VEGFR信号传导途径下游的一个关键分子。转移性结直肠癌（CRC）也通过使用FDA批准的mAb雷莫芦单抗和在中国获批的SMKI呋喹替尼来抑制VEGFR。髓样甲状腺癌则通过VEGFR抑制剂vandetanib、cabozantinib和lenvantinib以及上述提到的RET抑制剂pralsetinib和selpercatinib来进行治疗。 PDGFR和KIT由伊马替尼抑制，并且这种活性促成了其在2002年获得FDA批准用于治疗胃肠道间质瘤（GISTs）。与其他癌症一样，为了提高疗效和/或解决对第一代药物的耐药性问题，进一步开发了更多的SMKI。其中两种药物avapritinib和ripretinib在2020年获得批准，它们靶向特定的PDGFR和KIT激活环突变，这些突变导致高达85%-90%的GISTs患者复发。最近，FGFR途径的血管生成抑制已被证实是一种有效的治疗策略，这体现在2019年erdafitinib获得FDA批准用于治疗携带FGFR改变的晚期尿路上皮癌，以及2020年pemigatinib获得FDA批准，这是首个针对胆管癌的靶向治疗药物，胆管癌是一种以FGFR驱动突变为特征的侵袭性肿瘤。其他RTK蛋白家族已被批准的激酶抑制剂用于多种癌症适应症。其中最突出的是针对HER2治疗乳腺癌的药物，这些药物包括已批准的9种激酶靶向药物。1998年批准的针对HER2的单克隆抗体trastuzumab，这是使用RTK靶向药物由伴生诊断指导的先驱案例，以及最近批准的针对HER2的单克隆抗体margetuximab，以及四种SMKIs：lapatinib、neratinib、tucatinib和pyrotinib（在中国批准），这些药物也用于治疗HER2+乳腺癌患者。我们的数据也包含了两种靶向HER2的抗体药物偶联物：曲妥珠单抗-艾美汀辛（trastuzumab-emtansine）和曲妥珠单抗-德鲁克斯替坎（trastuzumab-deruxtecan）。尽管细胞毒性载荷是这些抗体-药物偶联物抗癌活性的关键驱动因素，而不是仅抑制HER2的活性，但我们将其包含在内以完整说明。各种细胞内激酶也已被批准的SMKIs所靶向。针对在细胞分裂中起重要作用的CDK4和CDK6的靶向治疗非常成功，现在有三种SMKIs：palbociclib、ribociclib和abemaciclib，已成为特定乳腺癌治疗的标准方案。2021年批准的一种CDK4/CDK6抑制剂trilaciclib用于小细胞肺癌的髓细胞保存疗法。转移性黑色素瘤是一种难以治疗的疾病，常见的BRAF突变使其特别具有侵略性。六种SMKIs已被批准用于此适应症：三种是BRAF抑制剂（vemurafenib、dabrafenib和encorafenib），三种是MEK抑制剂（trametinib、cobimetinib和binimetinib）。此外，2018年FDA批准了dabrafenib联合trametinib的MEK/BRAF组合疗法。此外，此外，证据表明，将SMKIs（特别是MEK和BRAF抑制剂）与免疫疗法联合使用，可以实现持久响应，并且具有更好的治疗效果 PI3K-AKT-mTOR途径涉及细胞存活、代谢和细胞生长的调节。在许多癌症中，该途径的失调导致了对它的组分进行靶向的广泛研究。这些研究导致了仅有的批准的激酶抑制剂，这些抑制剂靶向脂质激酶，始于2014年FDA批准idelalisib（针对PI3K δ的第一类SMKI），用于治疗各种淋巴瘤。此后，2017年批准了PI3K α/β双重抑制剂copanlisib用于滤泡性淋巴瘤，2018年批准了PI3K δ/γ双重抑制剂duvelisib用于多种淋巴瘤适应症，以及2019年批准了PI3K α选择性抑制剂alpelisib用于治疗乳腺癌。已经批准了三种靶向mTOR的SMKIs（见上文），包括sirolimus（最早期的激酶抑制剂之一），已被批准用于多种适应症，包括肿瘤性和非肿瘤性适应症。通过靶向激酶治疗其他血液恶性肿瘤已经取得了实质性进展。值得注意的是，套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病正在通过FDA批准的三种布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂来治疗：ibrutinib、acalabrutinib和zanubrutinib。值得注意的是，这三种药物均通过共价作用机制发挥作用，而ibrutinib（伊布替尼）的成功在很大程度上催化了重新评估共价抑制作为药物设计策略的重要性（见下文），与阿法替尼（见上文）一起推动了这一领域的进展。最后，激酶抑制剂也在引领利用肿瘤的分子特征而非组织来源来开发抗癌药物的先驱努力。在发现NTRK1作为结直肠癌（CRC）中致癌融合基因产物的一部分后的三十年，以及随后发现了NTRK2和NTRK3之后，泛TRK抑制剂larotrectinib成为了仅有的第二种组织无关型疗法进入市场（继pembrolizumab之后），在2018年获得FDA批准用于治疗携带NTRK基因融合的实体瘤患者。自此以后，多激酶抑制剂entrectinib也加入进来，它同样被批准用于携带NTRK基因融合的实体瘤患者的治疗。其他激酶抑制剂也在无组织特异性的开发项目中进行研究，其中包括已获批的RET抑制剂pralsetinib和selpercatinib。 [Box 2的部分内容*] BCR-ABL激酶抑制剂的发展揭示了一些激酶药物发现的一般性教训。首先，别构激酶抑制剂可以非常具有选择性；asciminib是合成选择性激酶抑制剂（SMKIs）中最具选择性的抑制剂之一。其次，寻找激酶抑制剂的生化筛选实验最好使用天然且全长的蛋白质进行，如果可能的话，这样可以获得多样化的调控相互作用的信息。第三，理解激酶抑制剂的作用机制需要投入大量的时间和劳动密集型工作至药物化学、药理学、生物化学、生物物理学、细胞生物学和结构生物学等领域。从伊马替尼获得批准到asciminib进入一期临床试验，历经了13年的时间。最后，了解激酶抑制剂所治疗的疾病是非常重要的。伊马替尼和其他靶向ABL治疗慢性粒细胞白血病（CML）的抑制剂，在疗效方面仍然非常突出，相比过去二十年为其他癌症开发的许多激酶抑制剂而言，它们的疗效前所未有。这可能反映出伊马替尼和其他BCR-ABL抑制剂在概念上更接近预防癌症，即防止CML的急性期（爆裂危象）而非仅仅治疗癌症，后者往往在较晚阶段才被诊断。实际上，慢性粒细胞白血病的慢性期，尤其是在早期阶段，更像是一种骨髓增生性疾病而非癌症。许多骨髓增生性疾病是由酪氨酸激酶驱动的，例如真性红细胞增多症（JAK2）、慢性粒单核细胞白血病（PDGFR）和嗜酸性粒细胞增多综合征（PDGFR），尽管它们很少转变为癌症，与CML不同。 2.3 肿瘤适应症之外的激酶抑制剂许多激酶参与免疫反应的调节。例如，JAK是辅助性T细胞（TH1、TH2和TH17）免疫反应的关键成分，因为它们是许多细胞因子（包括干扰素和白细胞介素）的辅助信使。11种SMKI（占已获批SMKI的13%以上）已被批准用于免疫系统相关适应症，主要是自身免疫性疾病和炎症性疾病。第一个在肿瘤学之外获得批准的激酶抑制剂是ruxolitinib，这是一种JAK1和JAK2抑制剂，在认识到JAK2中的激活突变导致一组骨髓增生性肿瘤后，于2011年被FDA批准用于治疗中度或高危骨髓纤维化患者。JAK2抑制剂fedratinib也于2019年被批准用于此类疾病。类风湿性关节炎是获批SMKI最多的自身免疫性疾病（总共5种，FDA批准了3种）。所有五种SMKI都选择性地靶向JAK的亚型，包括第一个被批准用于类风湿性关节炎的SMKI：2012年的托法替布（其次是baricitinib、upadacitinib、peficitinib和filgotinib）。Peficitinib主要抑制JAK3，并于2019年获得日本药品和医疗器械管理局（PMDA）的批准。Filgotinib是一种选择性JAK1抑制剂，已获得EMA和PMDA的批准；但是，出于安全原因，FDA推迟了对其新药申请的决定。JAK激酶抑制剂也正在研究其他免疫疾病，而delgocitinib是一种泛JAK 抑制剂，于2020年获得PMDA批准，是第一个被批准用于皮肤病特应性皮炎的激酶抑制剂。激酶SYK参与先天性和适应性免疫反应，与过敏和自身免疫性疾病以及血液系统恶性肿瘤的发展有关。Fostamitinib是一种一流的SYK抑制剂，由于其能够减少抗体介导的血小板破坏，于2018年被FDA批准用于治疗慢性免疫性血小板减少症。器官移植的排斥反应预防和移植物抗宿主病也是适合激酶抑制的免疫相关问题。两种药物已被批准用于这些疾病中的每一种：依鲁替尼和芦可替尼。另外，几种SMKI已被批准用于肿瘤学和免疫学以外的疾病。其中包括用于脑血管痉挛的 ROCK1和ROCK2抑制剂法舒地尔（如上所述）、用于结节性硬化症复合物相关部分性癫痫发作的mTOR抑制剂依维莫司、用于特发性肺纤维化的VEGFR抑制剂尼达尼布、用于晚期系统性肥大细胞增多症的FLT3抑制剂米哚妥林和另一种ROCK1/ROCK2抑制剂奈他舒地尔，用于青光眼和高眼压症。 2.4 药物分类几乎所有FDA批准的SMKI都针对激酶ATP结合位点（63个SMKI），除了3种雷帕霉素类、4种MEK抑制剂和靶向肽底物位点的双重SRC和微管蛋白聚合抑制剂tirbanibulin（结合模式的进一步讨论见下文）。ATP结合位点在人类激酶组中的保守性意味着“ATP模拟物”经常与许多其他不同的激酶发生交叉反应，从而产生具有混杂特征的化合物。达沙替尼或舒尼替尼等混杂化合物被称为多激酶抑制剂，可能具有一些毒理学问题。然而，这种交叉反应也可能是潜在的优势。例如，伊马替尼对多种激酶的活性使其能够应用于多种适应症，例如BCR-ABL易位驱动的CML、KIT驱动的GIST和PDGFR α失调驱动的嗜酸性粒细胞增多综合征。通过阻断两种或多种激酶来抑制细胞网络中的多个节点也可以产生可能具有临床有用的协同作用；例如，用前面提到的达拉非尼加曲美替尼的组合靶向BRAF和MEK通路。 RTK的细胞表面位置已被10种FDA批准的mAb成功用于治疗乳腺癌、CRC、NSCLC、软组织肉瘤和肝细胞癌。此类药物的作用机制比SMKI抑制激酶活性更复杂，可能包括阻断配体结合（从而阻止激酶激活）、促进受体内化和抗体依赖性细胞毒性3. 激酶抑制剂设计的趋势通过了解其结合位点的结构，SMKI的鉴定已大大推进。迄今为止已发表5500多种催化结构域结构，涵盖104个家族的约300种激酶。在本节中，我们概述了与基于结构的药物设计相关的主要特征以及不同类型SMKI开发的趋势。 3.1激酶催化结构域的结构特征蛋白激酶折叠结构的架构最早是由Knighton等人在1991年描述的，他们报道了蛋白激酶A(PKA)与ATP-Mg2+及抑制性肽结合的结构。这一结构揭示了一个双叶状的排列，包括一个较小的N端叶，其中含有一个五条链组成的反平行β-层状结构(β1至β5)、保守的调控α-C螺旋、两个额外的螺旋片段，以及一个主要由α螺旋构成的较大的C端叶（下图a）。 ATP辅助因子夹在两个叶之间，并在腺嘌呤环和铰链区之间形成氢键，从而建立了连接叶的骨架。这些氢键代表了ATP模拟抑制剂设计的重要锚点，并定义了碱性激酶抑制剂支架。ATP也由富含甘氨酸的环 [G-loop，也称为磷酸盐结合环(P-loop)]协调。这是一个高度灵活的区域，存在于β折叠结构β1和β2中，共有序列基序GXGXφG，其中φ代表疏水残基。第二个关键序列基序（V）AxK位于β3中。活跃态激酶的一个标志性结构特征是，在(V)AxK基序中的赖氨酸残基与位于α-C螺旋中的保守谷氨酸之间形成的一个保守盐桥，该盐桥将α-C螺旋定位（“α C-in”构象）。α-C螺旋具有重要的调控作用，因为(V)AxK盐桥有助于ATP磷酸基团的配位。在非活跃态激酶中，α-C螺旋从其在活跃状态下的位置向外移动（“α C-out”构象），并且通常还会使中心的保守谷氨酸旋转远离ATP结合位点。在α C-in状态下，α C螺旋的C末端通过与保守的三肽Asp-Phe-Gly (DFG)基序相互作用而得到进一步稳定，后者还锚定了激活段的N末端。在其活跃的“DFG-in”构象中，DFG天冬氨酸残基指向ATP的磷酸基团，协调一个对催化非常重要的Mg2+。在非活跃态激酶中，DFG处于可动状态，使苯丙氨酸残基移位。这种所谓的“DFG-out”构象开启了一个深且主要是疏水性的结合口袋（见下文）。DFG-out运动也会导致激活段的无序化，这是一个长度和序列可变的可动结构元件，包含DFG基序、激活环（A-loop）并在末端以螺旋状的APE (Ala-Pro-Glu)基序结束。A-loop还包含调控激酶活化的磷酸化位点，对于非组成性活跃的激酶来说，可通过自身磷酸化或跨磷酸化来进行调控。最后，催化环包含一个高度保守的Y/HRD (Tyr/His-Arg-Asp)基序，其中严格保守的天冬氨酸是催化所必需的。 ePKs (可被调节的蛋白激酶) 的三维结构高度保守，包括一组结构上重要的疏水性残基。这些残基形成了两条脊柱，在活跃状态下连接并正确对齐两个激酶叶，并定位关键的序列基序以利于催化过程。一条脊柱被称为催化脊柱(C-spine)，它由辅因子ATP的腺嘌呤环系统补充，并连接激酶域铰链侧的结构元件。另一条疏水性脊柱被称为调控脊柱(R-spine)，在活跃状态下感知β4片层、α C螺旋、DFG基序和下叶α E螺旋的正确排列（上图b）。在非活跃状态下，R-spine残基的移位会导致R-spine断裂。通过突变研究实验验证了脊柱残基的功能重要性，这些研究表明脊柱残基的疏水接触对于适当的催化功能是必需的。由于它们靠近ATP结合位点，许多激酶抑制剂会与脊柱残基相互作用，甚至插入或改变脊柱的相互作用。称为“守门人”残基（gatekeeper，也可译为门控残基）连接着C-spine和R-spine（在PKA中为M120），位于铰链区域的N末端。守门人残基对于药物开发的重要性很早就被认识到。虽然不常见，但如果存在像苏氨酸这样的小型守门人残基，则能够设计出针对其他激酶具有选择性的抑制剂，因为它使得后口袋对小分子开放；这意味着与该口袋结合的抑制剂无法与其他在守门人位置拥有大型疏水性残基的激酶结合。人类激酶中守门人位置不存在甘氨酸残基，这促使人们设计出了特异性靶向激酶守门人突变体的大体积ATP类似物。然而，转变为体积更大的残基从而在空间上排除抑制剂的守门人突变是激酶药物耐药性的常见原因。[译者注：这句话比较拗口，推测作者的意思是：守门人残基（gatekeeper）通常不会出现甘氨酸这样的小体积残基。因为甘氨酸作为最小的氨基酸，它的侧链仅有一个氢原子，这使得它能够适应各种空间环境；当它缺少时能为设计特异性更强的抑制剂提供了一种契机。然而，当守门人位置发生突变，变成了体积更大的残基时，这些突变可能会阻止原本有效的抑制剂与激酶结合，从而导致药物耐药性。强调守门人残基的特性对于激酶抑制剂设计的重要性。] 3.2 理性设计抑制剂的策略蛋白激酶结构的高度动态特性允许设计识别活性或多种非活性构象的抑制剂。激酶的失活状态在结构上特别多样化，并在药物开发中得到了广泛的探索。已对激酶催化结构域中存在的80多个可能的配体结合位点进行了编目和描述。对该领域的详细描述超出了本综述的范围，因此我们的描述仅限于现代激酶药物发现中已经确立的主要结合模式。 1型抑制剂（Type 1）针对激酶的活跃状态。抑制剂中的中心嘌呤部分模仿了ATP在铰链区形成的氢键结合，同时α C螺旋和DFG基序均处于它们的活跃“in”位置。然而，在这一结构中，G-loop并未形成活跃构象与嘌呤环和Y253形成芳香性堆积相互作用。芳香族氨基酸经常出现在G-loop的末端。在ATP结合的活跃状态下，这些残基朝向远离ATP结合位点的方向排列。有趣的是，在许多激酶抑制剂复合物中观察到了所谓的“折叠P-loop构象”，并且这种构象被认为与有利的抑制剂选择性相关联。 2型抑制剂（Type 2）结合到非活跃态的激酶，其特征是DFG-out构象。DFG基序向外移动形成了一个大的疏水性口袋，这一口袋被该抑制剂中的三氟甲基苯基部分靶向。α C螺旋保持其活跃状态下的α C-in位置，这一点通过(V)AxK K271与保守的α C谷氨酸E286之间形成的经典盐桥得以体现，而G-loop则维持其折叠构象。在经典的Type 1和Type 2之间的结合模式之间存在许多中间状态，一些作者引入了类型1.5（Type 1.5）的结合模式。然而，在激酶文献中，类型1.5抑制剂的定义并不明确。严格来说，类型1.5抑制剂可以定义为破坏R-spine的抑制剂，但这个词也被用来描述那些结合后导致任何偏离理想活跃构象的结构偏差的抑制剂，包括异常的G-loop构象和激活段的自我抑制构象。由于这些结构元素高度可动，并且它们的构象可能取决于晶体堆积，我们认为将这种结合模式限定为破坏R-spine而不靶向经典Type 2特有的DFG-out口袋的抑制剂更为有用。在BRAF-dabrafenib复合物中，α C螺旋向外移动，导致R-spine断裂和(V)AxK (K483)与α C谷氨酸(E591)之间的盐桥断裂，而DFG基序仍保持在DFG-in位置。上图为3型抑制剂（Type 3）结合模式在激酶MEK1中的示例。抑制剂占据了一个由α C-out移动和激活段的非活跃螺旋构象共同形成的口袋（虚线圈）。辅因子ATP-Mg2+以球棍模型表示，结合到ATP结合位点，而DFG基序处于DFG-in构象。非经典结合模式代表了吸引人的设计策略，因为这类化合物通常比经典的Type 1和Type 2抑制剂具有更高的选择性和更长的目标驻留时间。例如，EGFR抑制剂拉帕替尼结合到DFG-in构象，但它诱导了显著的结构重排，这解释了它对EGFR的高度选择性。同样，蛋白激酶R (PKR)-样内质网激酶(PERK)抑制剂GSK2606414和MET抑制剂SGX523靶向激活段的一种非活跃构象。ERK1/ERK2抑制剂SCH772984特异性地与由α C-out和折叠P-loop构象共同形成的独特结合口袋相互作用。Kinase-Ligand Interaction Fingerprints and Structures (KLIFS)数据库为研究配体相互作用和整个激酶组中不同结合模式的分布提供了一个宝贵的资源。近期的研究也探讨了水在配体设计中的作用。早期的模型仅从简单的熵增观点考虑了配体置换结合位点水分子的情况。现在，更加精细的计算工具能够详细分析结构模型中观察到的每个水分子，以评估水在配体效力、构象变化和配体解离速率中的作用。 3.3 激酶抑制剂的化学结构趋势 ATP结合位点是已批准的SMKI靶向的主要位点，占FDA批准的71种药物中的63种。与ATP腺嘌呤环类似，ATP模拟物抑制剂通过氢键锚定到激酶铰链骨架上。已经开发了几种充当铰链粘合剂的支架。融合的六元环体系（Fused six-membered ring systems）：如（异）喹啉和喹唑啉，首先在法舒地尔的开发中建立，随后是吉非替尼和厄洛替尼，是最常用的ATP模拟物，有18个获批SMKI。用于伊马替尼的氨基嘧啶和密切相关的氨基吡啶部分也仍然是经常使用的铰链结合剂，有17种SMKI获得批准（下图，氢键供体和受体用红色箭头表示）。译者注：在药物小分子的开发中，由于Lipinski等类药经验规则的因素，常需要考量一个化学结构中的“氢键供体”、“氢键受体”数量，以便更好的成药。这里的供体很好找，但氢键受体不能简单的将N、O原子加和。氢键通常发生在含孤对电子的原子与氢原子之间，因此，即使在一个化学结构中有多个杂原子，也不一定所有这些杂原子都能充当有效的氢键受体。例如，在某些杂环化合物中，氮原子如果参与了环的共轭体系，可能就不太容易作为氢键受体，因为其孤对电子参与了π电子体系，没有多余的孤对电子去形成氢键。所以上图中红色箭头只标注了特定的一些杂原子。图源：《Drug-Like Properties》 Li Di, Edward H. Kerns. 第三类铰链结合基团是融合的五元和六元环系统，例如吡咯并嘧啶、吡咯并吡啶、嘌呤、氧吲哚和吡咯或咪唑三嗪。从结构上看，吡唑并氨基嘧啶和咪唑并氨基吡嗪也与这一类铰链结合基团相关，但根据它们的铰链结合模式，应将其视为氨基嘧啶的衍生物。非芳香性铰链结合基团由酰胺代表。共有17种SMKIs含有多种铰链结合支架，但在开发三分之二已批准的SMKIs的过程中探索的化学空间之狭窄令人惊讶。 3.4 变构抑制剂大多数信号激酶以非活性状态表达，该状态被许多不同的机制激活，例如由翻译后修饰或通过与支架蛋白或侧翼调节结构域的相互作用诱导的结构变化。因此，激酶调节细胞信号传导的关键作用需要高度的催化结构域可塑性。通过开发阻止激酶激活的变构抑制剂，这一特性得到了广泛的探索。变构激酶抑制剂在它们阻止的激活机制上有所不同，因此仅根据其结合位置对它们进行分类。3型抑制剂（Type 3）在α C-out构象诱导的口袋中与ATP结合位点附近结合，在某些情况下由A-loop的非活性构象诱导。所有四种临床批准的MEK1/MEK2抑制剂都是与变构后口袋结合的3型抑制剂的例子。DFG处于活性的“in”构象中，允许3型抑制剂和ATP同时结合。一些3型抑制剂还与ATP的磷酸骨架形成极性相互作用，导致ATP非竞争性作用模式。然而，越来越多的3型抑制剂与经典后袋结合，但稳定了DFG-out构象。示例包括靶向FAK、TRKA、PAK1和IGF1R的变构抑制剂。值得注意的是，这些抑制剂对密切相关的家族成员显示出亚型选择性。 4型抑制剂（Type 4）结合到远离ATP结合位点的别构位点（下图中展示了不同结合类型的示意表示）。4型抑制剂的例子是ABL抑制剂GNF-2，它结合到C末端激酶叶上的一个诱导性口袋，这个口袋也是诸如肉豆蔻酸酯等脂质的结合位点。这种4型抑制剂利用了ABL激酶独特的激活机制：在非活跃态的ABL激酶中，ABL N末端的一个肉豆蔻酰化残基结合到C叶的结合口袋，这导致了一个闭合的非活跃构象的稳定。在致癌融合蛋白BCR-ABL中，由于存在N末端融合伙伴BCR，这种失活机制丧失，导致ABL持续活跃。GNF-2和正在研究中的4型抑制剂asciminib (ABL001)模仿了肉豆蔻酸的结合，并诱导了一个类似于非活跃野生型蛋白的非活跃状态。有趣的是，将肉豆蔻酸模拟的ABL类型4抑制剂与传统的ATP竞争性药物联合使用可以降低产生药物耐药性突变的风险。其他几种4型抑制剂已进入临床试验，包括变构AKT1抑制剂MK-2206，它在AKT催化结构域和普列克底物蛋白同源性（PH）结构域之间的界面结合。当激酶被MK-2206靶向和结合时，激酶被锁定在无活性构象中。这也阻止了AKT1募集到质膜，质膜是AKT1激活所需的重新定位事件。现已报道了多种靶向不同结合位点的临床前变构抑制剂，例如PDK1相互作用片段（PIF）口袋。变构抑制剂还允许选择性靶向突变，如EAI045所示，它靶向EGFR耐药突变体EGFR-L858R/T790M和EGFR-L858R/T790M/C797S，同时在很大程度上保留野生型EGFR。蛋白激酶的变构靶向提供了以高度特异性方式模拟自然调节机制的机会。这些激酶活性调节剂的治疗潜力是巨大的，激酶领域才刚刚开始在临床环境中探索这种靶向策略。译者注：类型结合特征结合模型 Type 1 结合到激酶的活跃状态，以DFG-in构象为标志 Type 1.5 介于Type 1和Type 2之间，定义不清晰。通常指破坏R-spine但不针对DFG-out口袋 Type 2 结合到激酶的非活跃状态，以DFG-out构象为标志 Type 3 结合到靠近ATP位点的变构位点。由α C-out构象和激活段的非活跃构象共形成口袋 Type 4 结合到远离ATP位点的变构位点 3.5 共价抑制剂自2013年共价EGFR抑制剂阿法替尼和BTK抑制剂伊布替尼被FDA率先批准以来，几种共价激酶抑制剂陆续被批准（见上文）。最近又批准了7种靶向EGFR突变体或BTK的SMKI（补充表1）。除acalabrutinib外，所有目前批准的共价激酶抑制剂都使用丙烯酰胺基团作为共价键形成的亲电试剂。用吸电子基团（如氰基）取代丙烯酰胺中的α位置，允许设计可逆的共价抑制剂。这已在几种具有延长靶标停留时间的高选择性工具分子的开发中进行了探索。使用共价靶向设计高选择性激酶抑制剂的潜力是巨大的，但这种设计策略仍未得到广泛探索。 3.6 大环化合物大环类结构已成为提高抑制剂效力和选择性以及药代动力学特性的最新策略。例如，劳拉替尼就是基于其非环化模板克唑替尼开发的。大环化锁定了克唑替尼的生物活性构象，从而显著提高了对ALK和ROS的效力，以及出色的中枢神经系统渗透性。此外，劳拉替尼对第一代和第二代ALK抑制剂的耐药突变有效，并且与其母体化合物相比，它具有更好的药理学特性。另一个成功的大环化的有趣例子是EGFR抑制剂BI-4020，它被设计为靶向三代EGFR耐药突变，例如在NSCLC152中出现的EGFR-L858R、EGFR-T790M和EGFR-C797S。 3.7 双功能抑制剂最近出现了大量其他类别的抑制剂，包括双底物和二价抑制剂，以及通过与蛋白质界面结合诱导新蛋白质相互作用的分子胶。这些药物连接与不同结合位点相互作用的抑制剂；例如，具有SH2结构域配体或底物竞争性抑制剂的ATP模拟抑制剂。这种抑制剂在一些出版物中被称为5型抑制剂（Type 5）。然而，由于这些抑制剂是通过化学接头将1型抑制剂与靶向远程二级结合位点的化合物结合的复合抑制剂，因此我们认为这类不同的抑制剂引入新名称在概念上没有优势。它们的大分子量使得在临床上开发这些抑制剂具有挑战性，但通常观察到的这些双重抑制剂选择性的增加可能为靶点验证和功能研究提供有趣的化学工具。化学降解剂，如蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)也属于双功能抑制剂类别。由于PROTACs能够催化性地降解目标分子，并且通常具有增强的亚型和突变体选择性，因此近年来受到了广泛关注。这是通过将传统激酶抑制剂与结合E3泛素连接酶的配体相连实现的。蛋白激酶似乎非常适合于降解。最近的一项研究报道了使用泛激酶抑制剂为大约200种ePKs开发的PROTAC先导化合物。已经为重要的激酶药物靶标开发了选择性的PROTACs，包括BRAF、EGFR-L858R/T790M致癌突变体、JAK、BTK、ALK、AKT、CDK6、CDK9、TBK1、Aurora激酶A、TRKA、FAK等。与一般的双功能抑制剂一样，将这些分子开发用于临床应用的药理学挑战比传统的小分子更大，但首批化合物现在已经进入了临床试验阶段。在不久的将来，预计会有更多的PROTACs进入临床开发阶段，令人期待的是，与传统抑制剂相比，PROTACs在临床研究中的表现将会如何。 PROTAC的一个有吸引力的变体是分子胶，它与两种蛋白质的界面结合，从而形成复合物。在激酶领域，很早就发现了调节激酶功能的分子胶。大环内酯类雷帕霉素及其相关雷帕洛酯通过诱导FKBP12（FK506（他克莫司）结合蛋白）、雷帕霉素和mTOR174之间形成三元复合物来变构抑制mTOR。分子胶可以通过将新型底物募集到E3泛素连接酶，在泛素系统中用作选择性降解剂。自从将E3连接酶cereblon鉴定为沙利度胺的靶标以来，已将几种转录因子鉴定为新底物，包括C2H2锌指蛋白 SALL4，这是沙利度胺致畸性的关键因子。这解释了沙利度胺的致畸机制以及它通过降解机制的免疫调节功能。激酶CK1α也被鉴定为新底物，有助于沙利度胺衍生物来那度胺治疗多发性骨髓瘤和5q-缺失相关骨髓增生异常综合征的临床疗效。含有表面暴露部分的常规激酶抑制剂也可诱导选择性降解。最近，CDK抑制剂CR8-a已被证明可将cullin 4衔接蛋白 DDB1（DNA损伤结合蛋白1）募集到CDK12-细胞周期蛋白K复合物中，在那里它充当该激酶的分子胶和选择性降解剂。由于其低分子量，分子胶可以成为具有非常特定作用方式的药物开发的有吸引力的先导化合物。然而，大多数分子胶是偶然发现的，或者是基于天然产物开发的，目前缺乏合理的鉴定策略。 4. 研究性药物的发展趋势我们对ClinicalTrials.gov网站的分析确定了近600种在临床试验中注册的激酶靶向药物，其中包括475个新型SMKI（包括其他监管机构批准并可能寻求FDA批准的药物，但不包括71个已经获得FDA批准的SMKI）和124个生物制剂。与之前的类似分析相比，在过去5年中，进入临床开发的SMKI数量增加了200%以上，2014年有177家SMKI达到这一阶段，2010年有149家达到这一阶段。在临床试验中注册的475种SMKI中，其中近一半（253个）目前正在开发中，要么正在进行试验，要么正在开始新的试验，而222种被确定为没有积极开发。临床试验中大约40%（194个）的激酶抑制剂靶向45个新型激酶家族，这些激酶家族包含215种蛋白质（占激酶组的40%），尽管我们确定其中大约110种是激酶抑制剂的主要靶点，因此更准确的估计是，除了已批准药物验证的靶点之外，20%的激酶组正在使用临床开发中的药物进行研究。这表明与其它主要靶标家族相比，新型激酶领域的探索十分稳健；例如，在一项类似的近期分析中，使用临床试验中的药物对新型G蛋白偶联受体(GPCR)进行研究的比例仅为16%。 4.1 激酶抑制剂临床试验的成功率使用来自3700多项临床试验中475种研究药物的数据并推断71种已批准药物的试验完成信息，我们估计激酶抑制剂从I期到II期的过渡概率为72%，从II期到III期的66%，从III期到批准和上市的86%。通过概率是使用Hay等人的描述计算的，这些描述基于DiMasi和Grabowski研究。通过成功率的分析在方法和数据上是异质的，直接比较可能很困难；然而，调查药物先导适应症成功率的里程碑式研究通常引用了与我们相当的比率，例如I至II期为67-71%，II期至III期为40-45%，III期为64-68%到新药申请（NDA）/生物许可申请（BLA）。我们的估计远高于FDA对一般药物临床研究阶段成功率的估计，I期至II期约为70%，II期至III期约为33%，III期至下一阶段高达30%。有趣的是，我们的结果与Walker和Newell十多年前对激酶抑制剂的估计相当，后者分别计算了80%、69%和85%，并表明激酶抑制剂继续降低了总体损耗率，并在从II期到III期的高风险过渡中继续取得成功。在II期临床试验期间，无论是小分子还是大分子疗法，对于各种适应症而言，候选药物的阶段过渡概率下降是普遍存在的现象，并且之前已经进行了分析。Morgan等人的重要发现指出缺乏临床疗效是主要原因，这可以通过解决候选药物生存的三个药理支柱来缓解：在靶点部位的暴露、靶点结合以及药理活性的表达。既往对激酶抑制剂的分析以及我们的研究都表明，在后期发展阶段，候选药物的淘汰率低于FDA对一般药物的整体估计。这可能是由于反复针对已经充分理解的激酶信号传导途径以及开发出更具有选择性的抑制剂，这些抑制剂能够在疾病中有效地抑制激酶信号传导。我们还注意到激酶抑制剂从I期到获得批准的整体成功率相似，我们估计目前约为41%。这略低于之前对激酶抑制剂的评估，该评估整体成功率为约47%。然而，我们的研究包含了额外十年的数据以及大约三倍多的药物（546种相比于137种）。此外，确定不再活跃的候选药物的方法差异可能会影响分析结果。 4.2 激酶家族的在研药物靶标已建立的激酶家族和靶标继续通过新型候选药物在临床试验中进行积极研究。大约12%（599种中的73种）的临床试验候选药物针对HER家族中的激酶以治疗各种癌症，其中包括26种新型SMKIs和47种新型生物制剂。VEGFRs也继续作为抗癌靶标进行研究，有30种新型SMKIs和9种新型生物制剂针对这些RTKs在临床试验中。此外，有54种PI3K或PI3K-mTOR途径抑制剂在临床试验中，其中有6种在III期临床试验中用于治疗一系列适应症，如淋巴瘤（buparlisib）、激活的PI3K δ综合征（leniolisib）和骨髓纤维化（parsaclisib）。PI3K和mTOR抑制剂也可能具有治疗罕见遗传性过度生长综合症的潜力，如PTEN错构瘤、结节性硬化症和PIK3CA相关的过度生长谱系。在肿瘤学之外，目前有12种靶向JAK的SMKI处于各种免疫炎症性疾病的临床试验中，其中7种处于III期试验中。特别令人感兴趣的是III期JAK3抑制剂ritlecitinib（PF-06651600），它在II期试验中显示出前景后，于2018年获得了脱发的突破性疗法认定，以及一种肠道选择性pan-JAK抑制剂（TD-1473），在早期临床试验中显示出有希望的结果，目前正在进行多项II/III期试验。 BTK抑制剂在治疗B细胞相关血癌方面非常成功（见上文），B细胞在自身免疫性疾病中的作用也导致BTK抑制剂被研究用于治疗此类疾病。7种BTK抑制剂正在系统性红斑狼疮的II期试验中进行研究，两种BTK抑制剂（evobrutinib和SAR442168）正在进行多发性硬化症的II期和III期试验，evobrutinib在之前的一项试验中显示出边际疗效且毒性有限如上所述，临床试验中至少有45种不同的新型激酶家族成为靶标，其中包括110多种被确定为主要靶标的不同激酶。在临床开发中，几个家族已成为大量药物的目标，抑制剂的化学类型和目标适应症发生了变化。有趣的是，与其他主要激酶组相比，TK组中的新家族的靶向性较低。在CMGC（CDK、MAPK、GSK3和CLK家族）组中，近50种药物进入了针对已在临床试验中长期研究的成员的试验，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38家族、ERK家族和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）家族的成员。超过20种药物靶向Aurora激酶家族，而在AGC组中，17种抑制剂靶向AKT（蛋白激酶 B，PKB）家族。所有目标家族的更多详细信息见补充图1。下面讨论新家族的选定示例，细分为正在研究肿瘤适应症的家族和正在研究肿瘤学以外的适应症的家族。下图总结了临床试验中激酶靶向药物的疾病适应症。临床试验中激酶靶向剂的疾病适应症 4.3 新型靶点肿瘤学的激酶抑制剂 Aurora激酶家族（Aurora kinase A、Aurora kinase B 和 Aurora kinase C）是尚未批准药物的最具针对性的激酶家族，已有22种药物进入临床试验。长期以来，这些激酶在细胞分裂中的作用及其在广泛的人类肿瘤中的过表达激发了人们对其作为治疗靶点的潜力的兴趣，但超过80%已进入临床试验的Aurora激酶抑制剂的开发已停止。第一代Aurora激酶抑制剂在实体瘤中进行了测试，但试验结果表明疗效有限且毒性高，这可能是因为实体瘤中的细胞增殖相对较慢，并且需要通过多个细胞周期的药物暴露才能诱导最大的肿瘤抗增殖作用。这些临床失望带来了策略的变化，正在研究第二代亚型选择性Aurora激酶抑制剂用于血液系统恶性肿瘤，其基本原理是它们相对于实体瘤具有更高的同质性和更高的增殖率。目前，四种Aurora激酶抑制剂正在作为单一疗法或联合疗法在白血病（如急性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病）以及实体瘤中进行试验。 CDK家族包括20个成员，在功能上可分为控制细胞周期转换（包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK5和CDK6）和调节转录（包括CDK8、CDK9、CDK11和CDK20）的家族，尽管这两种活性都存在于CDK7等多个家族成员中。基于它们在控制细胞分裂中的作用以及癌症表现出细胞周期失调，CDK已成为20年的治疗靶点。第一代CDK抑制剂，例如针对大多数CDK的广泛研究的黄酮吡啶醇（alvocidib），显示出疗效不足和显著毒性。新一代抑制剂的开发于2015年成功验证了选择性靶向CDK4和CDK6治疗乳腺癌的验证，FDA批准了palbociclib，随后于2017年批准了abemaciclib和ribociclib（见上文）。CDK家族成员继续在临床试验中接受深入研究，其中5种新型SMKI在临床试验中靶向CDK4家族，另外12种靶向 CDK7、CDK8/CDK19以及CDK2和CDK9的SMKI选择性或与目前处于I期和II期试验中的其他药物联合使用。已知肿瘤细胞通过DNA损伤反应（DDR）对许多癌症疗法产生耐药性，DDR支持DNA修复。几种专门开发的SMKI通过靶向参与DDR的激酶来对抗这种耐药机制，包括共济失调-毛细血管扩张症和Rad3相关（ATR）、DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PK）和检查点激酶1（CHK1）。目前，四种靶向ATR、DNA-PK或CHK1的SMKI正在进行20项针对不同类型恶性肿瘤的II期试验。 4.4 新型靶点肿瘤学以外的激酶抑制剂目前，有40多种激酶抑制剂正在进行针对类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、多发性硬化症和斑秃等免疫系统疾病的临床试验，其中12种药物处于III期试验中。如上所述，其中一些药物抑制已建立的靶点，例如JAK，但也有一些针对炎症性疾病的新型激酶靶点，包括IL-1受体相关激酶4（IRAK4）、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）、肿瘤进展位点2（TPL2）和酪氨酸激酶2（TYK2）。目前有16种SMKI正在进行类风湿性关节炎的临床试验。III期试验中的所有三种药物都已确定靶点，但II期试验中的一种SMKI具有一种新的作用方式：PF-06650833靶向IRAK4，从而抑制IL-1的信号传导，IL-1是一种有效的促炎细胞因子，参与各种自身免疫性疾病的发病机制。 RIPK1在另一种有效的促炎细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）介导炎症中很重要，RIPK1活性增加与神经炎症和细胞坏死性凋亡有关。第一个靶向RIPK1的药物于2015年进入临床试验，现在有三个RIPK1 SMKI在临床试验中。其中进度最快的是GSK2982772，它已经完成了治疗各种自身免疫性疾病的八项I期和II期临床试验，并且正在进行中度至重度银屑病的I期试验。越来越多的证据描述了TPL2参与炎症的多方面方式，包括MEK1/MEK2的正调节激活ERK1/ERK2信号传导和中性粒细胞中p38α和p38δ的正调节。因此，据推测，抑制其活性可能有益于治疗类风湿性关节炎和银屑病等炎症性疾病以及多发性硬化症。一种TPL2抑制剂GS-4875已进入临床试验，目前正在进行治疗溃疡性结肠炎的II期研究。总体而言，有15种药物正在进行临床试验，通过抑制除RIPK1之外的几种激酶（包括JAK1、TYK2、IRAK4和ROCK2）来治疗银屑病。有趣的是，JAK激酶（JAK1-3和TYK2）包含两个激酶结构域：一个具有催化活性的JH1结构域和假激酶结构域JH2，后者在TYK2激活中起重要作用。所有临床批准的JAK抑制剂都是JH1抑制剂，在JH1结构域内显示出中等选择性，这一特性与严重的副作用有关。然而，TYK2的假激酶结构域显示出一些已探索用于抑制剂开发的结构特征。该领域的主要药物是两种TYK2 JH2抑制剂deucravacitinib（BMS-986165）和BMS-986202。这些药物都已被证明可以有效阻止TYK2激活，对其他JAK家族成员和激酶组具有显著的选择性，目前正在进行III期试验。deucravacitinib的不良事件已报道，包括意外眼损伤、头晕和原位恶性黑色素瘤，但如果这些药物在当前的III期试验中被证明足够安全并保持相同的疗效，它们很可能在不久的将来获得批准，从而成为第一个靶向失活假激酶结构域的抑制剂。 CDC样激酶2（CLK2）和双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（DYRK1A）是Wnt信号传导、软骨形成和炎症的调节因子，抑制这些激酶已证明对骨关节炎具有潜在的疾病缓解作用。小分子双激酶抑制剂lorecivivint通过诱导软骨细胞分化、软骨再生和保护以及提高关节健康评分显示出有希望的骨关节炎治疗效果。它目前正在进行三项治疗膝骨关节炎的III期试验，II期试验的结果证明了lorecivivint的疾病缓解能力及其作为同类首创药物的潜力。 p38 MAP激酶最初在1990年代被发现为炎性细胞因子生物合成的关键调节因子，此后它们被广泛用于治疗类风湿性关节炎等炎症性疾病，迄今为止尚未批准任何针对这些激酶的抑制剂。至少有20种此类药物已进入临床试验，但其中16种（80%）药物的开发似乎已停止。第一代SMKI靶向p38α和p38β，但脱靶效应、效力问题、代偿途径和毒性限制了其临床开发。开发了第二代抑制剂，例如慢关断速率抑制剂BIRB 796，但也没有成功。然而，最近的一篇综述指出，p38研究转向关注更急性的炎症性疾病，包括慢性阻塞性肺病或哮喘。此外，p38激酶功能与多种神经和精神疾病有关，尤其是与神经炎症反应相关。neflamapimod（VX-745）是最近进入临床试验的P38 SMKI之一，属于一类新型p38抑制剂，其中包含双环杂环核心，对p38α的选择性高于p38β。Neflamapimod在II期试验中显示出阿尔茨海默病患者的认知改善具有统计学意义，目前正在进行三项II期试验，用于治疗亨廷顿病（NCT03980938）、阿尔茨海默病（NCT03435861）和路易体痴呆（NCT04001517）。激酶抑制剂在神经系统疾病中的探索尚处于早期阶段，尚无获批的抑制剂，大多数药物仍处于I期或II期试验中。除neflamapimod 外，几种药物正在进行临床试验，针对促炎细胞因子产生和免疫反应的各个方面，基于炎症在阿尔茨海默病等疾病中的重要性的证据。DNL747抑制RIPK1，依迪克替尼（JNJ-40346527）靶向集落刺激因子1受体（CSF1R），马赛替尼与KIT和其他RTK结合。2020年12月，据报道，在一项II/III期试验中，与安慰剂相比，马赛替尼作为胆碱酯酶抑制剂的附加疗法可提供临床益处，验证性试验应很快启动。另一种有趣的药物是saracatinib（AZD0530），它抑制Src家族的成员Fyn激酶。这可能是阿尔茨海默病治疗的一个有前途的策略，因为其下游途径被认为是β淀粉样蛋白毒性的基础，淀粉样蛋白是该疾病的一个标志。有趣的是，在II期试验（NCT02955186）中，萨拉卡替尼也被分析为酒精使用障碍的潜在治疗候选者，因为Fyn信号与饮酒行为有关。神经系统疾病的另一个有趣的激酶靶点是富含亮氨酸的重复激酶2（LRRK2），因为LRRK2中的激活突变是遗传性帕金森病最常见的常染色体显性遗传原因。三种LRRK2抑制剂现已进入治疗帕金森病的I期试验：两种SMKI（DNL201 和 DNL151）和一种反义寡核苷酸（ION-859）。到目前为止，DNL201的结果表明，它的耐受性良好，DNL151计划在临床试验中取得进展。ION-859的试验目前正在招募患者。衔接蛋白相关激酶1（AAK1）作为治疗神经性疼痛的靶点而受到广泛关注，这可能为一类新型镇痛药提供基础。动物模型研究表明，AAK1的抑制在机制上与α2肾上腺素能信号有关，而不是与阿片受体有关，以减轻疼痛反应。一种新型AAK1抑制剂已进入试验阶段;小分子LX9211目前正处于神经痛和糖尿病性神经病变的两项II期试验中，最近获得了FDA的快速通道资格。 4.5 已停止开发抑制剂的激酶至少有11个激酶家族和大约20个激酶靶标的抑制剂开发似乎已经停滞或被放弃，因为没有药物在积极试验中，并且这些药物的许多最新状态报告来自5年多前。补充表4提供了我们数据集中已停用的药物和激酶靶标，我们在此处简要讨论了选定的示例。一个重要的家族是Jun N末端激酶（JNK）家族，它们是MAP激酶，参与调节细胞存活和增殖，以响应与癌症、免疫疾病和神经退行性疾病等一系列疾病有关的细胞因子和生长因子。四种JNK抑制剂于2005年进入临床试验，用于治疗髓系白血病（CC-401；I期）、2011年纤维化疾病（CC-930；II期）、2012年（PGL5001；II期）子宫内膜异位症和2008年（AM-111；2017年完成的III期试验），但尚未取得进一步进展。激酶抑制剂的常见局限性，包括毒性和缺乏激酶特异性，已被列为可能的原因。临床试验中药物开发似乎暂停的新型激酶靶标的最新例子是单极纺锤体1（MPS1）激酶，它在细胞分裂中起重要作用。两种ATP竞争性激酶抑制剂BAY1161909和BAY1217389在临床前模型中作为单一药物显示出中等疗效，但与紫杉醇联合使用并进入I期试验与紫杉醇联合使用时具有协同效应。虽然作为战略决策终止了BAY1161909的开发，但BAY1217389 完成了试验并显示出良好的耐受性、可控的不良反应和疗效的初步证据，但其开发似乎最近已停止。5. 展望尽管激酶药物发现领域已经取得了重大进展，但仍有许多挑战和机遇。在肿瘤学领域，激酶抑制剂已成为过去二十年来癌症治疗的基石之一，自从伊马替尼获批以来。为了长期有效性，对抗药物耐药性是迫切需要的，为此正在开发几种策略。设计针对常见的和罕见的激酶驱动突变的药物是其中之一，正如上述NSCLC中多代激酶抑制剂的发展所展示的那样。联合用药方案是另一种方法，例如在黑色素瘤治疗中使用BRAF和MEK抑制剂的组合。此外，随着多种激酶抑制剂的组合用于创建有效的、持久的治疗方法，理性开发单一分子以抑制多个相关激酶可能是另一种雄心勃勃的方法。还有许多功能性挑战，例如癌症激酶组中遗传变异的表征，以及真正驱动肿瘤发展的基因的识别。对激酶的生物学途径及其与细胞生物学和治疗干预的关系进行仔细分析至关重要，因为一个激酶在非恶性细胞中可能是肿瘤抑制因子，而在恶性细胞中却可能介导肿瘤生存。例如，长期以来人们就知道ATR-ATM途径在DNA损伤后启动凋亡，而其功能障碍会导致肿瘤的发生。然而，后来发现这一途径也被肿瘤细胞利用来抵抗DNA损伤性癌症治疗的影响，这导致了ATR、DNA-PK和CHK1等激酶抑制剂的开发，这些抑制剂目前正处于临床试验阶段。我们的分析表明，至少70%（约400种激酶）的激酶组在药物开发中仍未被探索，因为这些激酶被视为主要靶标的药物尚未进入临床试验。几个指标可以提供激酶家族成员的相对探索水平的一些指示，包括文献输出、数据库Chembl中抑制每种激酶的化合物数量以及蛋白质数据库中可用解析结构的数量。一项整合此类知识的持续计划是NIH Illuminating the Druggable Genome（IDG）项目，该项目整理来自多个领域的证据，以绘制围绕潜在药物靶点的知识差距，并促进对研究不足但可能可成药的蛋白质的调查。IDG在用户界面Pharos中提供了信息，并突出显示了有趣的未被充分研究的目标。IDG根据不同的靶标发育水平对635种蛋白激酶进行了分类，他们估计3%（21种激酶，Tdark）的特征是“暗”的，其中对这些激酶几乎一无所知，大约30%（188种激酶；Tbio）没有已知的药物或小分子活性超过其特定活性阈值，其中包括来自文本挖掘文献的分数和Gene Reference Into Function注释。有趣的是，研究不足的蛋白质，包括在Tdark和Tbio类别中鉴定的蛋白质，可能在不同类型的癌症中经常发生改变，这表明它们对以前未表征的肿瘤细胞表型具有潜在的功能重要性。此外，在最近一项评估三阴性乳腺癌肿瘤转录改变的临床研究中，发现Tdark和Tbio研究不足的蛋白都存在转录改变，表明它们与其他已被更多研究的激酶（例如，已批准药物靶向的激酶）共同转录调控，这说明了识别和进一步开发这些研究不足的激酶的潜在治疗重要性。总体而言，激酶研究的现状表明，公开可用的知识很强，结构覆盖面广，并且有大量化学探针可用于研究激酶组。结构基因组学联盟（Structural Genomics Consortium）在很大程度上促进了这些阐明激酶结构、探针和靶标表征以及药物发现的许多其他方面的工作，该联盟是一个由科学家和制药公司组成的开放式合作网络，专注于为科学界提供可用的研究成果。为了继续扩大激酶药物发现，需要进一步开发和改进高效的化合物筛选和分析技术。特别是，需要解决可以识别新化学物质（包括天然化合物）的方法。此外，在获得靶标选择性以减少脱靶毒性方面也存在挑战。具有不同类型结合模式的抑制剂（如变构和共价抑制剂）和靶向降解剂（如PROTAC和分子胶）的开发，可能在未来二十年的激酶药物发现中发挥关键作用。作者信息：可点击左下角链接-阅读原文（此文旨在学术交流，内容以出版物原文为准）

临床研究

2024-11-28

·GlobeNewswire-Health Care

SELLAS Announces Positive Data from Preclinical Studies Indicating ASXL1 Mutations as Predictor of Response to SLS009 in Solid Cancers

- Preselection Method for Cancers Responding to SLS009: High Efficacy of SLS009 Observed in 67% of ASXL1 Mutated Solid Cancers vs 0% in Non-ASXL1 Mutated Cancers – - ASXL1 Mutations Predictably Identified in Colorectal Cancer (CRC MSI-H) and Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) in Addition to Hematologic Malignancies - - Existing Clinical Data Demonstrating SLS009 Efficacy in ASXL1 mutated AML and Safety Across Multiple Cancer Types Lay Foundation for Targeted SLS009 Clinical Trial in Selected Solid Cancers - Nov. 27, 2024 -- SELLAS Life Sciences Group, Inc. (NASDAQ: SLS) (“SELLAS’’ or the “Company”), a late-stage clinical biopharmaceutical company focused on the development of novel therapies for a broad range of cancer indications, today announced data from preclinical studies identifying ASXL1 mutation as key predictor of SLS009, a highly selective CDK9 inhibitor, response in solid cancers. Based on elucidated biology of ASXL1 mutations, results from SELLAS’ clinical trials in acute myeloid leukemia (AML), and reports of common occurrence of ASXL1 mutations in some solid cancers, the Company performed experiments and analyses to explore the following: The frequency of ASXL1 mutations in certain solid cancers, including colorectal carcinomas (CRC) with high level microsatellite instability (MSI-H) and non-small cell lung cancer (NSCLC) Whether ASXL1 mutations in solid cancers may predict as high SLS009 efficacy as the efficacy exhibited in AML where ASXL1 and similar mutations demonstrated high response rates in SELLAS’ clinical trials SELLAS performed experiments in patient derived cell lines (PDCs) exposing them to SLS009 at various concentrations and determining the inhibitory concentration (IC50) for each cell line. All cell lines were analyzed for presence of ASXL1 mutations and other genetic markers. High efficacy was prespecified as IC50 Negative controls consisted of untreated cell lines, while active negative control varying concentrations of revumenib (drug used in hematologic malignancies). Positive controls involved cell lines treated with staurosporine at different concentrations (staurosporine is a standard control compound for kinase inhibitors due to its high broad-spectrum potency in inhibiting most protein kinases at sub-micromolar concentrations). The results were as follows: In CRC MSI-H, ASXL1 mutations were observed in 7/12 (58%) of PDCs, aligning with predicted frequency of ~55% In NSCLC, ASXL1 mutations occurred in 2/6 (33%) studied cell lines, higher than predicted 2.6% Overall, in 18 studied solid cancer cell lines, ASXL1 mutations were recorded in 9 cell lines and no ASXL1 mutations were recorded in 9 cell lines which were designated as control In ASXL1 mutated cell lines, high SLS009 efficacy (IC50 In CRC MSI-H, high efficacy (IC50 In NSCLC, high efficacy (IC50 No activity was observed in any of the studied cell lines with revumenib (negative control) at any concentration Staurosporine activity was confirmed, but interestingly and importantly, SLS009 outperformed positive control staurosporine in 5/9 cell lines “These findings are incredibly encouraging and validate our approach to developing a targeted solid tumor therapy. We are excited that our hypotheses were confirmed, marking, to the best of our knowledge, the first study to advance the identification of ASXL1 mutations as a potential biomarker for a drug response in solid cancers,” said Dr. Dragan Cicic, Senior Vice President, Chief Development Officer at SELLAS. “Our experiments show that SLS009 demonstrates high efficacy with low IC50 values and with 67% of mutated cell lines responding positively, compared to no response in non-mutated cell lines. In addition, SLS009 outperformed positive control in 5 out of 9 cell lines, establishing itself as a highly effective therapeutic candidate. These critical findings are the missing pieces, complementing our existing safety and efficacy data in AML, and positions us strongly with SLS009 in solid cancers.” SELLAS has filed for provisional patent protection for the use of ASXL1 mutations as predictive diagnostic for selection of cancer patients likely to benefit based on clinical data and biology. SELLAS is a late-stage clinical biopharmaceutical company focused on the development of novel therapeutics for a broad range of cancer indications. SELLAS’ lead product candidate, GPS, is licensed from Memorial Sloan Kettering Cancer Center and targets the WT1 protein, which is present in an array of tumor types. GPS has the potential as a monotherapy and combination with other therapies to address a broad spectrum of hematologic malignancies and solid tumor indications. The Company is also developing SLS009 (formerly GFH009) - potentially the first and best-in-class differentiated small molecule CDK9 inhibitor with reduced toxicity and increased potency compared to other CDK9 inhibitors. Data suggests that SLS009 demonstrated a high response rate in AML patients with unfavorable prognostic factors including ASXL1 mutation, commonly associated with poor prognosis in various myeloid diseases. For more information on SELLAS, please visit www.sellaslifesciences.com. 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临床结果临床研究

2024-09-29

·生物制品圈

艾滋病病毒基因治疗最新进展

摘要：早期的基因治疗研究对于遗传性疾病的治愈抱有巨大希望，但各种基因毒性事件的发生导致临床试验暂停，对进展采取了更加谨慎的态度。遗传工程技术的最新进展重新点燃了人们的兴趣，导致2017年首个针对遗传突变的基因治疗产品获得批准。基因治疗（GT）可以在体内或体外进行。体外基因治疗方法具有优势，因为它允许在患者使用前对基因修饰细胞进行表征，并选择所需的特性。在此过程中还可以使用自体细胞，这消除了免疫排斥的可能性。本综述重点介绍了体外基因治疗的各个阶段、当前研究进展，这些进展提高了这一过程的效率和安全性，以及对人类免疫缺陷病毒（HIV）基因治疗研究的全面总结，其中大多数采用了体外方法。 1.引言人类基因组的成功测序加深了我们对遗传性疾病和导致慢性及暂时性疾病状况的病理过程的理解。目前有超过5000种基因治疗产品正在针对各种遗传性、慢性和传染性疾病进行试验（https://clinicaltrials.gov/, 访问日期为2023年10月30日）。在开发基因治疗候选药物时，考虑一种有效的递送方法很重要，这将允许感兴趣的基因进行准确处理，在特定作用部位有足够表达，并持续预期的治疗效果，随后降解递送载体而不引起任何不良影响。由于存在引起严重不良反应的潜在危险，如肿瘤形成甚至基因修饰的生殖系传递，开发基因治疗产品（GTP）的过程非常严格，比其他治疗剂需要更长的时间。补充表S1总结了不同监管机构迄今为止批准的基因和细胞产品。最近发表了一篇综述，讨论了其中一些产品的发展。递送感兴趣基因的方法有两种：体内和体外（图1）。体内方法涉及将遗传物质直接递送到患者体内，可以是裸露的基因或封装在颗粒中。另一方面，体外方法涉及从患者或正常供体分离感兴趣的细胞，对它们进行遗传修饰，在某些情况下进行扩增，然后将它们给患者。因此，患者没有直接接触到转移载体。选择，即确保修饰的细胞相对于自然发生的缺陷细胞更优先植入患者体内，可以在给患者施用感兴趣基因之前或之后进行。最近发表了一些综述，强调了基因治疗在各个领域的应用：使用造血干/祖细胞（HSPCs）治疗造血障碍、遗传性皮肤病、神经系统疾病或中枢神经系统遗传性疾病和骨科疾病等。图1. 体外递送感兴趣基因。使用Biorender.com创建。2.HIV基因治疗的治愈方法由于存在对当前治疗有抵抗力的潜伏病毒库，因此获得HIV的治愈一直具有挑战性。这些病毒在转录上是不活跃的，但很大一部分具有复制能力。抗逆转录病毒治疗(ART)可能在潜伏病毒藏身的组织中吸收相对较差，如肠相关淋巴组织(GALT)和中枢神经系统(CNS)，这可能有助于这些部位病毒的持续存在。在停止ART后的几周到几个月内观察到病毒反弹。治愈的另一个挑战是HIV对免疫系统的影响：对HIV的体液反应差，中和抗体的产生不足，这通常在感染几个月后才会发生。此外，也有重建HIV特异性CD4+ T细胞的相对失败，这反过来又导致CD8+细胞毒性T细胞功能的降低。因此，可以合理假设有效的治愈将旨在使潜伏病毒失活或移除，并重建免疫系统。基因修饰的细胞也应该能够抵抗持续的感染，治疗本身不应该引起严重的不良事件。为了重建或增强免疫系统的功能，已经在B细胞和T细胞的遗传工程方面取得了几项进展，包括嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗。图2提供了HIV治愈策略的总结。国际艾滋病学会的多方利益相关者协商就HIV治愈目标产品的最低标准达成一致。临床疗效定义如下：维持病毒载量低于传播阈值(<200 HIV RNA拷贝/mL)，在研究的20%或更多人群中有效，平均每年复发率低于10%，缓解期超过2年，并且严重不良事件的可能性极小，如果有的话，即研究人群的不到1%。可能的治愈也可能需要结合不同的方法。图2. HIV治愈策略。CRISPR—成簇规则间隔短回文重复序列；ZFN—锌指核酸酶；TALEN—转录激活因子样效应子核酸酶。使用Biorender创建。为了实现对HIV的可能治愈，已经采用了四种策略。第一种方法是干细胞移植，到目前为止已经治愈了六名患者：柏林患者、伦敦患者、纽约患者、“希望之城患者”、杜塞尔多夫患者和日内瓦患者。这些患者接受了造血干细胞移植以治疗恶性肿瘤。除了日内瓦患者外，所有患者都接受了与人类白细胞抗原（HLA）匹配的供体的干细胞移植，这些供体对于CCR5等位基因中的32个碱基对缺失（CCR5∆32）是纯合子。由于治疗的侵袭性、成本、发病率和死亡率，以及缺乏具有CCR5∆32的匹配无关供体，这种方法无法扩大到更广泛的人群，因此作为一种普遍适用的方法是不可行的。第二种方法旨在从细胞库中移除所有活性潜伏病毒，实现无需ART即可检测到的血浆载量，因此提供一种无菌治愈。这种策略被称为“休克和杀死”方法，并已在早期阶段试验中进行了广泛研究。尽管目前这种治愈方法的形式并未采用基因治疗，但它已被包括在本综述中，以涵盖所有当前的HIV治愈方法。“休克和杀死”旨在使用潜伏期逆转剂激活潜伏病毒库中的病毒，这些逆转剂激活病毒转录，通过使用并行的ART阻止新细胞的感染，然后通过诱导凋亡、CD8+介导的溶解或通过体液免疫反应来根除感染的细胞。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）细胞也可以被用来增强杀死感染细胞。第三种策略旨在通过基因编辑根除整合病毒，使用基于核酸酶的工具或工程重组酶。基于核酸酶的工具包括CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）、TALEN（转录激活因子样效应子核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）。也可以使用这些基于核酸酶的工具针对CCR5，使CD4+细胞对感染产生抵抗力，以及使用短干扰或短发夹RNA（siRNA或shRNA）沉默CCR5。基因编辑也可以通过工程重组酶进行，特别是针对HIV特异性长末端重复序列（LTR）的重组酶酶（TRE）重组酶。这是一种工程形式的Cre重组酶，针对5′LTR内的34个碱基对区域（称为loxLTR），从而在表达这种酶的感染细胞中去除整合的前病毒DNA。第四种策略是“阻断和锁定”方法，旨在实现功能性治愈，即在不根除潜伏病毒的情况下保持其处于非活动状态，使血浆病毒载量保持在可检测水平以下。这是通过使用潜伏期促进剂永久沉默或编辑潜伏病毒库来实现的，这些潜伏期促进剂通过病毒启动子的抑制性表观遗传修饰“阻断”病毒转录并“锁定”病毒处于潜伏状态。大多数HIV基因治疗研究使用体外方法。本综述将重点介绍体外基因治疗的各个阶段，并提供当前采用体外或体内基因治疗方法的HIV临床试验的总结。 3.体外基因治疗在体外基因治疗研究中需要考虑的一个重要因素是将被修改以纠正特定疾病状况或遗传疾病的细胞来源。这些细胞可以是自体的，从患者自身获得，或同种异体的，从匹配的供体获得。自体来源是有利的，因为没有移植物抗宿主病的危险；然而，这可能不适合老年患者或严重疾病状况（例如，HIV，因为细胞可能是新感染的来源）。由于其自我更新和分化成几个谱系的能力，同种异体干细胞来源最近引起了更大的兴趣，尽管它们的使用存在局限性，如排斥、移植物抗宿主病和长期免疫缺陷。在临床前基因治疗研究中，可以从出生组织中获得干细胞，例如脐带血和胎盘。也可以从胚胎组织中获得干细胞，尽管这引发了伦理问题，或从诱导多能干细胞中获得。在临床研究中，可以根据患者的疾病状况从个体患者中获得细胞，或从与患者组织免疫兼容的供体中获得，或从其他细胞来源中获得，这些来源的细胞不太可能引发免疫反应，如由于缺乏或低表达HLA类I和II抗原而具有低免疫原性的胎盘细胞。体外基因治疗的过程包括获得这些感兴趣的细胞，对它们进行修改，并将它们给患者。为了确保修改后的细胞的有效和优先植入，使用各种调节和选择方法。 3.1.造血干细胞的来源造血干细胞在单基因疾病和免疫系统疾病的基因治疗中很有用。造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）负责产生成人血细胞，并以特定标记为特征（图3）。CD34抗原，一种细胞表面粘附跨膜糖蛋白分子，长期以来一直被用作HSCs的标记，以及其他功能，如增强细胞增殖、阻止分化、改善HSCs和HPCs的迁移以及促进淋巴细胞在淋巴组织中与血管内皮的粘附。这些细胞能够分化成各种谱系的功能性血细胞，并且具有自我更新的能力；即，它们可以在不分化的情况下产生女儿HSCs（图1）。图3. 造血干细胞发展的层级结构。NK-自然杀伤细胞；DC-树突细胞。使用BioRender.com创建。3.1.1.骨髓来源的造血干细胞基因治疗应用中常用的造血干细胞(HSCs)来源包括骨髓、脐带血、外周血，以及最近的胎盘。在骨髓中，成骨细胞影响造血的平衡。原始人类成骨细胞对骨髓来源的CD34+ HSCs的存活至关重要，因为成骨细胞恒定地表达粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。同样，HSCs调节成骨细胞分泌IL-6、巨噬细胞炎症蛋白-1α和其他因素，以创造有利于造血的环境。基质衍生因子-1(SDF-1)及其受体C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)是建立骨髓的重要决定因素。Tie2，一种受体酪氨酸激酶，也被发现在维持成年骨髓中的HSCs方面不可或缺。CD34抗原具有多个磷酸化位点，其中有两处是蛋白激酶C的位点，一处是酪氨酸磷酸化位点。 Panch等人的文章总结了从骨髓、外周血和脐带血中采集HSCs的方法。简而言之，从骨髓中采集HSCs通常在全身麻醉下进行，大约每公斤体重收集20 mL，且不超过1.5 L的骨髓抽吸液，从髂后或髂前缘收集。在进行该程序之前，可能会从患者身上采集血液，以便在抽吸过程中失去的血液可以重新注入。 3.1.2.外周血来源的造血干细胞从外周血采集造血干细胞的过程需要几天时间。早期动员方案使用了细胞毒性药物，如环磷酰胺、伊达比星、依托泊苷、铂类和表柔比星；然而，这些药物的使用现在仅限于接受移植治疗恶性肿瘤的患者。目前，在移植患者中，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）用于将CD34+细胞动员到外周血中，剂量为5-10 mg/kg/天，持续5至7天，目标是通过白细胞去除术采集至少2×106 CD34+细胞/kg体重。在G-CSF给药期间，血液中HSCs的浓度在3天后增加，大约在第5或6天达到峰值，然后在7天后开始下降。G-CSF的剂量由外周白细胞计数决定，外周CD34+计数是HSCs产量的良好预测指标。产量还取决于年龄、性别、基础条件和G-CSF剂量。G-CSF治疗并非没有挑战，患者可能会经历包括骨痛、头痛、疲劳、肌痛在内的副作用，以及在高风险个体中可能出现心肌梗塞和脑缺血。为了增强G-CSF的动员效果，可以使用AMD3100（Plerixafor，一种可逆的CXCR4拮抗剂）。CXCR4是基质衍生因子1（SDF-1）的受体，具有包括使HSC长期维持静止状态在内的多种功能。Plerixafor以240 µg/kg的剂量给药，在白细胞去除术前4至6小时，发现它可以改善CD34+细胞的采集，尤其是与G-CSF联合使用时。其他HSC动员剂目前正在开发中。 3.1.3.脐带血来源的造血干细胞从脐带采集细胞涉及切断的脐带静脉穿刺，将血液排入含有抗凝剂的无菌袋中。通常，在过程中收集大约80至160 mL的脐带血（UCB）。CD34+细胞的产量范围为2至7×106/mL UCB，可能受到出生顺序（第一胎>第二胎>第三胎等）、出生体重甚至早期夹闭的影响。这种相对较低的产量限制了它们的应用。 3.1.4.胎盘来源的造血干细胞人类胎盘最近作为干细胞来源而受到欢迎，因为胎盘干细胞抗原性低，没有伦理限制，并且是多能的。人类胎盘是生殖过程中首先发育的器官，有两个组成部分，胎儿部分（羊膜和绒毛膜）和母体部分（蜕膜）。从受精后6-7天出现到足月的胎盘发育已被详细描述。胎盘的作用是为发育中的胎儿提供营养物质并排除废物，具有各种分泌和免疫调节作用。它可以被划分为以下四个区域：羊膜上皮、羊膜间充质、绒毛间充质和绒毛滋养外胚层。胎盘有多种类型的干细胞，可以分化为造血和间充质组织（脂肪生成、软骨生成、成骨、肝脏、胰腺、肌肉、血管生成和神经生成），表达各种细胞标记，包括OCT4、SOX2和c-KIT等，这些标记也存在于胚胎干细胞中。胎盘HSCs缺乏或表达非常低的HLA类I抗原（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和没有HLA类II抗原（HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR），这使它们适用于再生医学以及自体和同种异体移植。与骨髓细胞相比，这些细胞的免疫排斥机会较低，对凋亡有抵抗力，具有增强的细胞增殖和伤口愈合特性，并抑制如TGFβ等促纤维化因子。人类胎盘HSCs是胎儿来源（非母体），并且是CD34+和CD45-dim。用AMD3100（Plerixafor）以300 ug/L的浓度灌注人类胎盘，结果在灌注液中采集到的HSCs数量增加了六倍以上，这些细胞具有集落形成特性，缺乏内皮标记。间充质基质细胞是骨髓造血环境的重要组成部分，与HSCs共培养已被发现可以增强HSCs的增殖，特别是原始的CD34+和CD38-。已使用脐带血和胎盘来源干细胞的混合物进行造血干细胞移植。已开发出各种协议来分离羊膜上皮细胞、间充质基质细胞和造血干细胞。所有协议都必须克服的一个主要障碍是生产大量具有所需细胞群高度纯度的细胞。 3.2.造血干细胞的分离、纯化和富集为了确保基因校正细胞的优先植入，重要的是要富集具有构建体的细胞群，并对其进行纯化，以避免在培养过程中使用的蛋白质或其他分子的污染。已使用几种方法来富集HSCs。目前最常见的柱分离技术是德国科隆Milteny Biotech的磁激活细胞分选（MACS®）微珠分离技术（https://www.miltenyibiotec.com/ 于2023年6月4日访问）。在这种封闭系统技术中，微珠（超顺磁性氧化铁纳米颗粒）与CD34抗体偶联，用于磁性标记表达CD34+的细胞。将无菌细胞悬浮液装入MACS®（铁磁性）分离柱中，该柱放置在MACS®分离器的磁场中。在正选择技术中，标记的细胞被保留在柱中，而其他细胞则流过。然后可以从柱中洗脱CD34+细胞，一旦它被从由分离器产生的磁场中移除，就可以用于任何下游应用。也有用于分离CD133+细胞群和CD34+和CD38−细胞的微珠。Baldwin及其同事使用免疫磁珠富集CD34+细胞，然后用荧光激活细胞分选（FACS）对其进行分馏，以富集CD34+和CD38−细胞；另一方面，Radtke及其同事使用FACS分离CD34+、CD90+和CD45RA−细胞，发现这组细胞在表型上是HSC基因治疗的最明确目标，因为这些细胞推动了短期和长期的多谱系植入。他们使用GMP（良好生产规范）级流分选协议来分离这些细胞。这大大增加了所需的复杂性、成本和专业知识。在其他体外研究中，Kays及其同事使用MACS对细胞进行排序，这些细胞除了表达CD34+外，还表达CD105，即转化生长因子-β（TGF-β）受体复合体的组成部分，发现这些细胞富集了具有高植入和重聚能力的早期HSCs，即使在慢病毒转导后也是如此。Laje及其同事用信号淋巴细胞激活分子（SLAM）家族受体分子富集了注定要进行慢病毒转导的HSCs，发现这些细胞被有效转导并且与非转导细胞相比是稳定的。研究表明，培养造血干细胞(HSCs)超过48小时会降低它们长期植入的能力，建议培养时间不应超过36小时，24小时是一个安全的时间段。Chen及其同事的一项研究发现，使用细胞因子（SCF、TPO和Flt3L）进行体外培养会导致线粒体氧化应激，从而导致丧失干细胞特性，并且CD34+/CD133+中的粘附GPCR G1阳性（ADGRG1+）群体可以在体外培养期间的氧化应激下富集功能性HSCs。还努力减少培养过程中可能的污染源。重组人血清白蛋白（HSA），是从酵母中产生并用作GMP级组织培养基的组分，可能是其他不直接与白蛋白相互作用的蛋白质甚至色素和小分子的污染源。Wilkinson及其同事最近使用体外和体内小鼠模型发现，聚乙烯醇（PVA）可以作为HSA在培养小鼠和人类HSCs中的替代品，因为它支持HSCs的存活和生长，同时保持表型HSCs特征。PVA培养基中分泌因子的浓度较低，衰老相关基因表达较少，尽管PVA用于人类基因治疗的效果还有待评估。 3.3.使用感兴趣基因修饰造血干细胞在考虑适当的载体进行基因传递时，需要检查要转导的细胞的特性和载体的特性；是否需要短暂或稳定表达基因修饰；以及在传递到组织时可能导致的“脱靶”效应。这些脱靶效应可能包括宿主-免疫反应和载体本身引起的免疫反应。用感兴趣基因修饰目标细胞可能面临各种挑战。例如，腺相关病毒载体由于阻碍核输入、解壳和第二链合成，因此不能有效转导HSCs。用VSV-G包膜伪装的慢病毒载体具有广泛的细胞嗜性，尽管由于缺乏或表达不足的LDLR受体（它通过该受体进入细胞），原始人类静息T细胞和CD34+细胞不能有效转导。另一方面，T细胞的激活提高了转导效率。在体内使用病毒载体进行基因治疗的情况下，对病毒的预先存在的免疫力可能导致基因修饰细胞数量的减少，这反过来又会限制体内重新填充的速率。转导和重新给药基因修饰细胞之间的时间间隔也至关重要，特别是对于可能分化并限制返回目标部位的干细胞。为了保护它们的基因组结构，真核细胞具有防御机制，导致外来可移动元素或逆转录病毒的沉默，因此存在诱导沉默机制的可能性，这可能由于缺乏表达而使治疗基因失效。 4.通过病毒载体进行HIV基因治疗传递用于体外基因传递的最常见病毒载体是慢病毒载体，因为它能够转导分裂和不分裂的细胞。最初，γ-逆转录病毒载体被用于基因传递；然而，它们靠近原癌基因整合并引起插入性突变的潜力变得明显。从那时起，已经多次尝试使病毒载体更安全、更有效地进行基因传递。选择病毒载体由要转导的细胞类型、病毒载体特性、感兴趣基因（转基因）的大小和期望的效果决定。下表1总结了不同病毒载体的载货量（插入大小）。 4.1.在HIV基因治疗中使用γ-逆转录病毒载体：并发症和提高安全性的方法 γ-逆转录病毒载体是最早用于有效基因治疗的病毒载体之一。这些载体以依赖细胞周期的方式转导活跃分裂的细胞，因此不转导静止的细胞。逆转录病毒最初是首选的载体，因为它们的使用导致转基因稳定地整合到宿主基因组中。然而，这一好处受到大约10%的患者观察到的一系列基因毒性事件的限制，表现为各种形式的白血病。例如小鼠白血病病毒，γ-逆转录病毒更倾向于靠近强增强子区域、转录起始位点、CpG岛和DNase-I高敏位点整合，并可能在靠近原癌基因时引起插入性突变。这些安全问题导致这些临床试验的暂停，因此，已经尝试提高它们的安全档案。现在已知，在逆转录病毒生命周期中，前整合复合体（PIC）与各种宿主转录因子相互作用，特别是溴结构域和外部末端家族蛋白（BET蛋白）和整合酶，导致整合到宿主基因组中。BET蛋白通过将病毒PIC系在宿主染色质上发挥作用，因此，开发不依赖BET的载体可以改变它们的整合档案。事实上，几个小组已经在细胞系和小鼠模型中证明了这种方法的有效性。另一种方法可能是修改整合酶，使其远离靠近原癌基因的整合。与慢病毒载体相比，创建自失活的RV载体的尝试不太成功，因为它们仍然保留着激活癌基因的能力。 4.2.慢病毒载体用于稳定基因表达：挑战和减轻这些挑战的策略慢病毒是一类逆转录病毒，除了结构基因env、pol和gag外，还有辅助基因，如vpr、vpu、nef和vif，以及调节基因，如tat和rev。最著名的慢病毒是人类免疫缺陷病毒（HIV）。工程化的慢病毒被认为是适合基因转移的，因为它们可以稳定地转导分裂和不分裂的细胞。与其他逆转录病毒的不同之处在于，大多数逆转录病毒的PIC需要核膜的破裂（在有丝分裂期间），以便允许进入细胞核，而慢病毒PIC通过核孔蛋白和importins的主动运输进入细胞核。PIC是病毒cDNA的组装，一些来自逆转录复合体的病毒蛋白和宿主细胞蛋白。逆转录后病毒DNA的整合是由整合酶和PIC介导的。一项研究发现，PIC更倾向于靶向靠近核孔的开放染色质区域，排除核内部区域和核纤层的周边区域。核周边的转录活跃基因与核孔复合体（NPC）相关，这影响了HIV-1基因表达。慢病毒更倾向于与积极转录的基因整合，整合模式得到目标细胞转录程序的支持。宿主细胞蛋白，晶状体上皮衍生生长因子（LEDGF/p75）直接与病毒整合酶相互作用，没有它，整合酶无法进入细胞核。现在已知LEDGF/p75将整合酶连接到染色质上。 4.2.1.慢病毒载体的演变自从作为基因治疗载体被发现以来，慢病毒载体(LVs)经历了几次修改（见图4）。第一代LVs包括转基因构建、包膜构建和一个包含gag、pol和所有调节和辅助基因的包装构建。从HIV env改为VSV-G env或任何其他合适的病毒包膜（称为伪型化），允许有效转导多种细胞，尽管VSV-G导致静息淋巴细胞和HSCs的转导效率低下。第二代LVs包括转基因构建、表达VSV-G的包膜构建，以及包含gag、pol和调节基因tat和rev的包装构建。移除了所有辅助基因。第三代LVs在转基因构建中的病毒启动子中进行了修改，其中U3区域通过删除-418至-18的序列部分进行了修改，仅留下18 bp（移除了400 bp），因此创建了自失活(SIN)载体。因此，5′LTR具有18 bp U3、R和U5区域和一个PolyA尾。这使得载体仍然能够携带转基因盒，同时保持转录不活跃。U3被删除的部分被异源启动子替换，通常是巨细胞病毒（CMV）启动子或细胞启动子，如延伸因子1α（EF1α）。3′ LTR、U3区域也被删除，以防止在转染293T细胞过程中通过同源重组与5′LTR重组成完整病毒。载体构建还包含非编码域cPPT（中央多嘌呤区），这提高了RNA被包装进衣壳的效率，以及WPRE（Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件），这增强了转基因的转录后处理。包装构建被分割成gag-pol构建和rev构建，删除了tat，因为它的转录激活环已从5′LTR中移除。因此，第三代系统由四个质粒构建组成，如图4所示。三个单独的包装构建降低了在质粒扩增和病毒载体生产过程中形成复制能力慢病毒的重组机会，并减少了启动子干扰相关问题的机会。第三代慢病毒构建通过修改携带转基因的质粒进一步重新设计，可以被认为是第四代慢病毒载体。在这个系统中，称为LTR1或PBS1（引物结合位点1），5′LTR已被移除，RNA信号（PBS-Y-RRE）被放置在3′LTR的下游。因此，这些信号在载体生产过程中存在，但在逆转录过程中丢失，并且不与转导的转基因一起复制，从而进一步提高了安全性。图4. 慢病毒载体生成的进步。第一代构建包括转基因构建、伪型包膜（通常是VSV-G）和包含gag、pol和所有调节及辅助基因的包装构建。第二代载体与第一代载体类似，只是去除了辅助基因。第三代载体是自失活慢病毒载体，在U3区域有400 bp的缺失。第四代慢病毒载体去除了5' LTR，并将RNA信号(PBS-Y-RRE)放置在3' LTR的下游。RRE：Rev反应元件；PM：细胞来源或其他启动子；cPPT：中央多嘌呤区；VSV-G：泡状口炎病毒G型；WPRE：Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件；Y：包装信号。Ch5'：嵌合5' LTR；PAS：引物激活信号。 4.2.2.优化慢病毒转导有效的慢病毒转导人类细胞可能受到人类细胞产生的限制因子的限制，这些限制因子限制了慢病毒感染，如三部分基序蛋白5α(TRIM5α)、tetherin和载脂蛋白B信使RNA编辑酶催化多肽样3(APOBEC3)。其中一个被证明导致慢病毒基因传递到静息记忆T细胞效率低下的因素是限制因子SAMHD1（含α motif和组氨酸-天冬氨酸(HD)结构域蛋白1）。SAMHD1是一种细胞脱氧核苷酸三磷酸水解酶，阻止逆转录。HIV-2编码的vpx基因被发现可以抵消SAMHD1的限制能力。事实上，一项研究发现vpx在他们测试的所有条件下都增加了基因治疗传递，但当基因治疗针对逆转录前的步骤时效果最大。优化体外培养条件是提高基因转移速率的有用方法。使用Polybrene、鱼精蛋白硫酸盐、Retronectin、热带增敏受体增强子、如Lenti-X accelerator的磁珠、Vectofusin-1、LentiBOOST和Staurosporine等试剂已被发现可以增强转导过程。使用胎牛血清(FBS)在用慢病毒载体转导CD34细胞时并不令人满意，因为它导致祖细胞的转导增加，但HSCs的转导减少。此外，由于对其异种成分产生抗体，存在免疫风险的担忧。已经开发了各种无血清培养基，适用于不同类型干细胞的转导，例如，加拿大温哥华干细胞技术公司的StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)。将敲除血清替代品(KSR)培养基添加到StemSpan培养基中，已被发现可以提高原代CD34+细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)的转导效率。 4.2.3.慢病毒载体沉默像γ-逆转录病毒载体一样，尽管程度较轻，慢病毒载体也容易受到转基因沉默和转基因效率变异的影响，这是由于转基因与宿主基因组（染色体位置效应）中其直接基因组邻域的相互作用。一些宿主和载体特征被假设可以引起这种效应，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，包括由多梳家族蛋白介导的修饰。可以隔离转基因免受沉默的策略包括使用更强的增强子启动子、脚手架/基质附着区域(S/MARS)，这些可以保护增强子免受DNA甲基化，和染色质域隔离子，这些可以抑制抑制性位置效应。 4.2.4.减少插入性突变的策略已经尝试了各种方法来减少插入性突变的机会。一种策略是将整合导向远离原癌基因的“安全基因组港湾位点”。Schenkwein等人使用I-PpoI，一种来自黏菌Physarum polycephalum的二聚体18-20 KDa同源性内切核酸酶，将整合导向一个高度保守的位点，28S核糖体RNA。这是通过识别该区域的15 bp位点来实现的。另一种策略是通过改变整合酶核心结构域(D64、D116和E152)的催化三联体来生产非整合慢病毒载体。虽然消除了插入性突变的风险，但这些载体只能用于瞬时基因表达。基因表达也低于整合慢病毒载体。修改LEDGF/p75的功能，其功能是指导慢病毒整合，可以允许整合到更安全的区域或更随机的整合，从而减少靠近原癌基因的整合机会。 4.3.腺相关病毒载体(AAVs)：限制其使用的挑战重组腺相关病毒是在临床应用中首选的载体，当需要短暂表达转基因（根据感染细胞的周转时间，从几个月到几年不等）时。这些载体不含病毒DNA，而是基于蛋白质的纳米颗粒，被设计为穿越细胞膜并将DNA送入细胞核。这些载体非常稳定，能够承受操作过程中出现的物理或化学挑战。病毒基因组也容易操纵，并且具有良好的安全档案。AAVs可以携带高达4.5 kb的转基因盒。然而，AAVs的主要挑战是它们在自然界中广泛存在，因此抗AAV免疫很高，12种已知血清型的中和抗体的流行率在某些人群中从20%到100%不等。这些载体的给药也可能引发治疗后的体液反应。正在应用各种策略来克服衣壳免疫、补体固定和AAV基因组感知。一种策略是通过合理设计、随机突变和衣壳重组来工程化衣壳，以防止衣壳中和。另一种策略是免疫抑制，即阻断涉及B细胞激活的经典途径，从而抑制体液反应，尽管体外基因治疗的体液反应可能有限。为了减少AAV基因组感知，可以通过耗尽载体基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR信号传导。腺相关载体可以用来转导多种细胞，包括间充质基质细胞、神经细胞等，尽管它们不适合造血细胞。许多研究小组正在研究使用AAVs将广泛中和抗体送入骨骼肌，以提供针对HIV的持久效果，无论是作为预防还是治疗，或两者兼有。最近一篇综述文章分析了它们在HIV感染中的使用，以及当前挑战和可以采用的策略来克服其有效性的障碍。 4.4.体外细胞选择和扩增根据转导的细胞类型、载体类型、感染倍增性(MOI)和使用的转导技术，转导的细胞数量通常低于理论上的预期。因此，转导过程不是100%有效。然而，有几种方法可以最大化转导效率。除了第4.2.2节中提供的例子外，使用高MOI可以产生更高的载体拷贝数(VCN)，尽管这增加了异常剪接事件的风险。通过色谱法纯化载体颗粒也可以增加转导效率。转导后，选择携带转基因的细胞并扩增这些细胞以增强它们在体内的植入是有益的。这可以通过细胞表面标记或设计载体表达抗生素抗性基因来实现，然后在应用适当的抗生素时，将允许优先选择携带转基因的细胞。转导HSC的扩增目标是在保留“干细胞特性”的同时增加数量。通常支持分化为成熟谱系的传统培养基导致自我更新能力的丧失。体外基因治疗的体液反应可能有限。为了限制污染的可能性，最好使用无血清培养基进行HSC扩增。Tajer等人最近的文章总结了添加到培养基中以增强扩增的因素。已经使用了几种细胞因子和生长因子，包括SCF、FLt3配体、TPO（血小板生成素）、IL-3和IL-6，尽管由于IL-3刺激祖细胞的扩增而不是HSCs，它并不包括在某些培养基中。还发现其他化合物也很有用。这些包括前列腺素E2 (PGE2)，它通过改善HSCs的归巢和自我更新能力来增强HSCs的植入，和Stem Regenin 1 (SR1)，一种芳香烃受体拮抗剂，用于扩增人类和小鼠CD34+，尽管它也被发现更有利于多能祖细胞而不是长期重聚干细胞。这与UM171形成对比，UM171是一种嘧啶哌啶衍生物，它支持干细胞的扩增而不是多能祖细胞。因此，它们可以组合使用，以促进两种谱系的扩增。其他使用小鼠模型的研究表明，可以调节调节干细胞归巢和分化的信号通路。这些包括Notch信号通路、Homeobox基因、Wnt等。锌指转录因子Sall4的过表达导致HSCs（CD34+细胞）在体外和小鼠模型中迅速有效扩增（增加50倍）。 5.基因修饰造血干细胞的给药：增强基因修饰细胞的优先植入 HSC输注后造血重建的第一阶段（最多6个月）是由于承诺的祖细胞（短期HSCs），它们具有有限的自我更新能力。大约6个月后，CD34+克隆减少，第一波克隆重建耗尽，长期HSC逐渐接管重建，它们能够自我更新，其效果甚至在基因治疗后3年仍然存在。因此，短期HSC在早期阶段活跃，而长期HSC在这一阶段进入静止状态，并在短期HSC耗尽时激活。 5.1.清空造血干细胞壁龛的调理方案在用于造血障碍的自体基因治疗中，目标是用宿主细胞替代有特定遗传缺陷的细胞。在HIV基因治疗中，目标是用有抗性的细胞替代易感染的细胞，或能够对抗病毒的细胞。干细胞壁龛允许维持干细胞并调节其功能；HSC壁龛位于骨髓和脾脏的血管周围。清除用于转导HSCs吸收和消除未转导细胞的壁龛的过程，也称为调理，传统上一直使用化疗和放疗进行，这对目标器官没有特异性。进行调理是为了耗尽壁龛中的造血干和祖细胞，以减少同种异体移植的免疫排斥机会，在恶性疾病的病例中治疗任何恶性肿瘤。调理方案可以分为清髓性调理（MAC）、非清髓性调理（NMA）和减低强度调理（RIC）。清髓性方案由烷化剂组成，有或没有全身照射（TBI），导致全血细胞减少症和1-3周内造血耗尽，不允许自体血液学恢复。因此，为了生存，需要干细胞支持。MAC方案与毒性有关，有时甚至死亡，特别是如果植入出现问题。毒性迹象包括器官衰竭、粘膜炎、骨髓抑制、继发性恶性肿瘤、肌肉骨骼疾病和心脏、肺、生殖和内分泌异常。接受MAC治疗的人群的长期死亡率也高于普通人群。由于这些不希望的副作用，开发了较低强度的方案。较低的强度意味着可逆的骨髓毒性，与MAC诱导的不可逆骨髓毒性相比。这些方案是NMA和RIC。非清髓性方案引起最小的细胞减少症，不需要干细胞支持。另一方面，减量调理涉及将MAC方案的剂量至少减少30%，虽然它不会导致干细胞的消融，但仍然需要干细胞支持才能在临床上实用。这些调理方案的细节已经回顾过。尽管RIC毒性较小，但发现它对基因治疗的效率较低，因为它导致外周血细胞中基因标记较少，这可能是由于壁龛清除效率低下或对转基因的免疫耐受性诱导不充分。在基因治疗中，辐射或化疗药物的剂量由正在治疗的疾病状况和患者特征决定，包括年龄和性别。欧洲骨髓移植组（EMBT）风险评分是一个用于评估癌症患者移植风险的工具，也可以扩展到任何需要移植的患者。它基于五个因素：患者年龄、疾病阶段、诊断到移植的时间间隔、供体类型（就HLA分型而言）和供体-受体性别组合。通常，30岁以后使用MAC方案死亡率增加，50岁以后不推荐使用。如果供体和受体不是同一性别，也有更高的排斥风险。 5.2.基因修正造血干细胞的体内选择为了改进携带转基因细胞的选择，在动物模型的体内研究中采用了体内化学选择技术。使用药物抗性基因进行体内选择转基因需要药物抗性基因在转导细胞中高度表达，在非转导HSCs中根本不表达或表达水平低；选择药物应该耗尽大多数非转导细胞，对非造血毒性很小，并且在非恶性条件下不具有遗传毒性。在动物模型中用于选择的基因，特别是在小鼠中，包括多药抗性基因(MDR1)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、乙醛脱氢酶(ALDH)、胞嘧啶脱氨酶(CDD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。一项研究使用了O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的突变体，这是一种DNA烷基化修复酶。突变体MGMTP140K在非人灵长类动物中显示出稳定和有效的HSCs选择，尽管使用(Carmustine-BCNU，例如)的烷基化剂的致癌性质是一个缺点。另一项研究使用短发夹RNA(shRNA)敲除次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，在这些小鼠模型暴露于6-硫鸟嘌呤(6 TG)时实现HSCs的选择。使用这种方法很有吸引力，因为它允许转导的HSCs自我更新、增殖和分化，该方法用于清除壁龛并使携带转基因的细胞优先植入。诱导药物抗性的shRNA仅长48 bp，用于化学选择的6 TG量低，尽管6 TG可能诱发白血性。该组使用MOI为1，在两轮连续病毒暴露后，未用生长因子预刺激以保持“干细胞特性”，实现了20-30%的慢病毒转导效率。 5.3.清除壁龛的最新发展提高壁龛清除和促进转导细胞植入的最新发展是使用与能够清除壁龛的药物结合的单克隆抗体。这些方法允许针对性地清除HSC壁龛，因此减少了上述调理方案非特异性相关的副作用，并使携带转基因的细胞优先植入。例如，为了改进HSCs的选择，最初的小鼠研究使用了CD45-抗体药物偶联物(CD45-ADCs)，但很快意识到这些对HSCs并不特定，并导致淋巴细胞耗尽，因为CD45也存在于淋巴细胞和其他白细胞表面。使用CD117-抗体药物偶联物(CD117-ADC)，可以更具体地针对HSCs，在小鼠模型中使内源性HSCs耗尽超过99%。2019年报道这种技术效果的第一组使用链霉亲和素连接子将CD117与毒蛋白连接起来，并测试了其对NOD SCID Gamma(NSG)小鼠和非人灵长类动物的效果。另一组使用了抗人CD117 IgG1单克隆抗体偶联物AMG 191，发现其在非人灵长类动物中有效，目前正在进行1/2期临床试验。另一组将CD117+与鹅膏毒素(MGTA-117)偶联，发现其在患有急性髓细胞性白血病(AML)的小鼠模型中非常有效（耗尽了超过95%的HSPCs）。CD117在AML细胞中高度表达，这种方案被发现可以减少这些小鼠的肿瘤负担。 6.基于体外HIV基因治疗的临床试验如前所述，HIV的基因治疗努力集中在使免疫系统更擅长履行其功能，或旨在沉默或编辑整合的原病毒，使其复制能力不足或使细胞对感染有抵抗力。已经进行了几项临床试验，旨在检查HIV基因和细胞治疗产品的效用和安全性。 6.1.基于细胞治疗的HIV临床试验最早的细胞治疗研究之一创建了嵌合T细胞受体：CD4-Zeta基因修饰T细胞。这项早期临床研究（NCT01013415）的结果发现，尽管病毒库在各组之间没有差异，但在接受了基因修饰细胞的组中，HIV负担从基线有所下降，并且复发性病毒血症的患者趋势减少。AGT103-T是一种产品，可以恢复慢性HIV病患者的gag特异性CD4+ T细胞反应。最初的1期临床试验结果（NCT03215004）显示了一些有希望的结果。对参加研究的患者进行了白细胞去除术。一旦细胞被基因修饰并通过了质量控制测试，患者在基因治疗产品输注前一周用环磷酰胺进行了非清髓性调理，剂量为1 g/m2。AGT103-T修饰细胞以每公斤体重2到2100万细胞的剂量输注。即使在基因治疗产品输注后6个月，也可以观察到细胞的基因标记。没有记录到严重不良事件。 SB-728是一种锌指核酸酶(ZFN)介导的，CCR5修饰的，自体CD4+ T细胞产品。这项研究的各种版本发现，即使在重复剂量给药后，也没有发现严重不良事件。当使用环磷酰胺进行调理时，植入效果更好。其中一项研究发现，尽管病毒反弹有延迟，并且CD8+ T细胞反应改善了6个月以上，但对潜伏病毒库没有长期影响。另一项研究，NCT03617198，将CAR-T细胞治疗与ZFN CCR5修饰相结合，作为一种双重治疗方法，确保CD4+细胞对感染有抵抗力，并且同时能够检测和清除HIV感染的细胞。最后，NCT04648046使用了编码双特异性抗gp120 CAR分子的慢病毒载体(LVgp120duoCAR-T)来针对表达HIV gp-120的细胞。 6.2.基于通过逆转录病毒载体进行基因传递的临床试验早期直接针对HIV的研究使用了逆转录病毒载体来传递抗HIV基因。在一项研究中，使用了同种基因T细胞（来自同卵双胞胎），使用逆转录病毒载体传递了细菌基因NeoR（NCT00001353）。这项研究的目的是证明，通过基因转导的同种基因细胞实际上可以通过成熟细胞的分裂，而不是前胸腺干细胞的分裂，持续数周至数月。在涉及双胞胎的一项研究中（NCT00001535），从血清阴性的双胞胎中获得了同种基因CD4+淋巴细胞，并用携带反义TAR或反义Tat/Rev RNA，反式优势Rev蛋白或两者结合的逆转录病毒载体转导。临床前研究表明，所有使用的抗HIV载体都抑制了HIV，反式优势Rev蛋白显示出更大的抑制作用。尚未发布临床试验的结果。涉及双胞胎的所有研究的长期随访（Gemini Study—NCT04799483）目前正在进行中。另一项使用逆转录病毒载体的研究，NCT00002221，从计划进行自体骨髓移植的非霍奇金淋巴瘤HIV阳性患者中获得了外周血CD34+细胞，并将这些细胞分成三个池。一个细胞池用含有两个核糖酶序列“L-TR/Tat-neo”的逆转录病毒载体转导，第二个池用对照载体‘LN’转导，第三个池保持未修饰细胞。然后将这些细胞重新输注回患者体内。尚未发布这项研究的结果。除了逆转录病毒载体观察到的插入性突变风险外，这项后续研究的成功也可能因携带治疗基因的细胞比例低而受到阻碍。 RevM10是HIV-1 Rev基因的优势负性突变体。使用逆转录病毒载体将这个基因转导入CD4+ T细胞，结果抑制了HIV复制，并持续了6个月。尚未发布在造血干细胞中研究RevM10的结果（NCT00003942）。逆转录病毒载体也用于传递MazF，一种Tat依赖性内切核酸酶基因，在1期研究中评估其安全性、耐受性和免疫原性。MazF源自大肠杆菌，选择性地切割mRNA中的ACA序列，这些序列在HIV中很常见。这项研究发现，单次静脉注射用MazF转导的自体CD4+ T细胞导致CD4+和CD8+细胞增加，这种效果至少持续了6个月。核酸酶是催化RNA分子，可以针对任何具有NUX切割位点的RNA序列，其中N是任何核苷酸，X是A、C或U中的任何一个。在一项概念验证的1期研究中，Rz2，一种针对tat基因起始密码子附近GUA序列的核酸酶，通过逆转录病毒载体传递到同种基因外周血单个核细胞(PBMCs)中，这些细胞是从血清阴性双胞胎的基因修饰细胞中获得的，然后输注到血清阳性双胞胎体内。共有4名患者参加了这项研究，该研究表明基因标记细胞的持续存在，无论是短期（24周）还是长期（44个月），在此期间没有观察到严重副作用。在一项相关的2期基因治疗试验中，通过逆转录病毒载体将一种抗HIV核酸酶转导到自体CD34+细胞中，患者接受了tat–vpr–特异性抗HIV核酸酶（OZ1）或安慰剂。没有与OZ1相关的不良事件。尽管在主要终点（大约48周）时OZ1和安慰剂组之间的病毒载量没有统计学上的显著差异，但在40周时观察到了显著差异，并且直到100周，OZ1组的CD4+ T细胞高于安慰剂组。在长期随访研究中，NCT01177059，最初入组的68人中有18人完成了研究，其中7人有严重不良事件，包括各种类型的肿瘤（例如，基底细胞癌、霍奇金病、卡波西肉瘤、乳头状甲状腺癌、皮肤癌），这些最有可能是由逆转录病毒载体引起的。 6.3.基于慢病毒载体的HIV研究在VRX496（Lexgenleucel-T）研究中，使用携带针对HIV包膜的抗HIV反义基因的基于HIV的慢病毒载体修饰自体T细胞。安全性和耐受性研究，NCT00295477，发现血液中的植入半衰期为5周。一些患者的基因标记细胞甚至在5年后还存在。这项研究表明，基因修饰细胞可以对HIV施加遗传压力。另一项使用慢病毒载体传递抗HIV基因的研究结合了针对CCR5的短发夹RNA（shRNA），它阻止病毒进入，人/恒河猴嵌合TRIM5α，一种在进入细胞质时破坏病毒衣壳解壳的天然分子，因此抑制HIV感染，以及转录激活反应（TAR）诱饵，它通过结合病毒Tat并将其隔离，因此阻止其介导前病毒DNA的有效转录。这项临床试验的结果尚未发布。在一组研究中，接受自体移植治疗淋巴瘤的患者被输注了用含有tat-rev shRNA、TAR诱饵和CCR5核糖酶（LV Rhiv7-shITAR-CCR5RZ）的慢病毒构建体修饰的CD34+造血干细胞。四名患者的早期结果表明，基因修饰细胞在输注后第11天植入，并且即使在24个月时，载体仍然存在，并且在病毒血症后选择基因修饰细胞。尚未发布各个研究的结果。 Cal-1是一种双重抗HIV基因转移慢病毒构建体，它传递一种沉默CCR5的shRNA（sh5），并在不同的启动子下，编码一种小肽抑制剂的序列，这种抑制剂可以防止HIV包膜与宿主CD4+细胞的融合（C46）。已在不同地点对Cal-1进行了几项研究。在NCT01734850中，对13名患者进行了Cal-1治疗，并评估了该治疗的安全性。Cal-1的临床前研究表明，该治疗有效且安全。在临床试验中，使用白消安调理来清除壁龛，以允许基因修饰细胞的植入。在两个接受白消安调理的治疗组中观察到严重和危及生命的不良事件，与单剂量白消安相比，双剂量白消安的副作用更严重。未接受调理的组没有严重不良事件。患者目前正在进行长期随访研究（NCT02390297）。与调理相关的毒性是成功传递基因治疗的常见挑战，因此开发更安全、更有效的方法来清除壁龛，以实现成功和稳定的植入是值得的。这些临床研究表明，在实现足够植入的足够清除壁龛、使基因修饰细胞的生产和由于调理导致的骨髓毒性之间存在微妙的平衡。为了帮助推进HIV治愈方法的临床前研究，例如使用si/shRNA的“阻断和锁定”方法的研究报告，解决这些挑战至关重要。这组临床前小鼠研究已经报告了通过si/shRNA成功沉默HIV，尤其是shPromA，它针对病毒启动子中的串联NF-KB转录因子位点，以诱导下游病毒基因表达的转录基因沉默和抑制性表观遗传修饰（见图2）。结合含有CCR5 shRNA的Cal-1载体，目前正在研究针对启动子的si/shRNA PromA，以开发针对宿主CCR5和病毒启动子靶标的组合HIV基因治疗。 7.基于体内传递的HIV基因治疗临床试验采用体内方法治疗HIV的研究主要处于临床前阶段。体内方法涉及直接将基因治疗产品通过病毒载体（如腺病毒载体、腺相关病毒载体或非整合慢病毒载体）或非病毒方法（如纳米粒子）引入患者体内。体内方法可能无法提供持久的治愈，因为没有转基因与宿主遗传物质的稳定整合，并且需要优化特定细胞的传递，以减少脱靶效应的机会。通过重组酶或核酸酶系统的基因编辑，或使用RNA干扰或可能的CRISPR干扰的沉默机制，可以使用体内方法。目前的临床试验包括使用leronlimab的研究，leronlimab是一种抗CCR5人源化IgG4抗体，通过与CCR5相同的附着位点（细胞外环2和N-末端结构域）结合，竞争性地抑制HIV env附着到CCR5。这种药物通过皮下给药，该组目前正在使用合成AAV载体进行传递。这项研究的几个版本—NCT00642707、NCT02175680、NCT02355184、NCT02483078、NCT02990858、NCT03902522、NCT02859961和NCT05271370—证明了产品的安全性和有效性，患者大多经历了轻微的副作用，并且在较高剂量的525 mg和700 mg时观察到效果。 CRISPR-Cas9技术用于HIV治愈 CRISPR及其CRISPR相关核酸酶9（Cas9）系统是一种基因编辑系统，通过导向RNA介导的基因组区域的双链断裂，然后通过非同源末端连接途径进行修复。最近发表了几篇描述HIV临床前研究的综述文章[222,223]。最近使用CRISPR-Cas9治疗HIV的临床试验是NCT03164135，该试验使用这项技术在进行异体干细胞移植治疗血液恶性肿瘤的患者中敲除HSCs中的CCR5基因。一名急性淋巴细胞性白血病患者的初步结果显示，完全供体嵌合体的缓解，并且敲除CCR5的供体细胞持续了19个月，没有基因编辑不良事件。然而，携带修改的淋巴细胞的百分比仅为5%，团队正在研究如何使过程更有效。另一种基于CRISPR-Cas9的HIV基因治疗产品是EBT-101（NCT05144386）。这种基因治疗作为单次静脉注射给药，并通过使用两个导向RNA靶向整合原病毒的三个位置的AAV传递。最近有三名患者参加了1期临床试验，该公司（Excision Bio Therapeutics, San Francisco, CA, USA）在2023年10月的欧洲基因和细胞治疗年会上提出的初步结果显示，没有剂量限制毒性或严重不良事件。 CRISPR-Cas 9可以用来靶向HIV-5′LTR，这是启动子区域，因此可以阻止潜伏病毒的复制或激活；CCR5或CXCR4区域，使细胞对感染有抵抗力；或促进HIV复制的限制因子，阻断它们的活性。虽然目前还没有CRISPR-Cas9基因治疗被批准作为HIV治愈方法，但FDA最近批准了第一种用于镰状细胞病的基于CRISPR-Cas9的细胞基因治疗方法，Casgevy（https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-gene-therapies-treat-patients-sickle-cell-disease, 访问日期为2024年1月27日），突显了基因治疗的创新进步和CRISPR-Cas9作为HIV治愈方法的潜力。 8.结论长期或永久表达抗HIV基因和修改CD4+和CD34+细胞以使它们对感染有抵抗力或允许破坏HIV生命周期是实现HIV治愈的重要策略。尽管联合抗逆转录病毒治疗的出现大大改善了患者的治疗结果和HIV感染者的生活质量，但治愈是可取的，特别是对于已经对当前方案产生耐药性的患者。至少提供功能性治愈的产品可能需要多重治疗剂与不同作用模式的组合，以最小化耐药性的机会，并且是长效的，或理想情况下需要单次给药。因此，至关重要的是要利用当前生物技术的进步来增强基因治疗方法，并使基因治疗产品更安全、更经济、更持久。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

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