Beta-Alanine

摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）是一类用于治疗癌症的靶向治疗剂。ADC开发是一个迅速扩展的研究领域，目前有超过80个ADC处于临床开发阶段，并且已有11个ADC（其中9个含有小分子有效载荷，2个含有生物毒素）获得FDA批准使用。与传统的小分子方法相比，ADCs提供了增强的癌细胞靶向能力以及减少的毒副作用，使它们在肿瘤学领域成为一个有吸引力的前景。为此，本教程综述旨在作为ADCs的参考材料，为读者提供对ADCs的全面理解；它分别探讨并解释了每个ADC组成部分（单克隆抗体、连接体和细胞毒性有效载荷），通过案例研究突出了几个EMA和FDA批准的ADC，并提供了ADC研究领域的简要未来展望。 1.引言 细胞毒素药物通常作为传统化疗方案的一部分用于治疗不同癌症。虽然这些方案对某些类型的癌症，如睾丸癌和霍奇金淋巴瘤，可能是有效的，但细胞毒素药物的非特异性作用意味着快速分裂的健康细胞也会受到攻击，导致化疗常见的副作用，如脱发、恶心和疲劳。靶向治疗领域旨在通过利用正常细胞和癌细胞之间的微妙差异，寻找更安全、更有效的治疗剂，抗体-药物偶联物（ADCs）就是这种方法的一个例子。ADCs由三个组成部分组成——单克隆抗体、连接体和细胞毒素药物——它们是迄今为止开发的最复杂的药物之一，结合了专门抗体的癌症靶向能力与细胞毒素药物的杀癌能力，选择性地杀死癌细胞。德国化学家保罗·埃尔利希广泛被认为是“化学疗法”一词的创造者，意思是使用化学物质治疗疾病。基于他与抗体的工作，埃尔利希构想了一种魔法子弹（zauberkugel），它将允许选择性地靶向病原体微生物而不伤害人体。1983年，几乎八十年后，这个概念被用来实现ADC疗法的第一次人体试验。抗体、连接体和有效载荷技术的后续进步推动了进一步ADCs的开发，这些ADCs具有提高的效力和血清半衰期，减少的免疫原性和与早期努力相比对癌细胞的改进特异性。今天，FDA批准了九种ADCs用于临床使用（图1），ADC开发领域正在迅速扩展，预示着新一代改进的抗癌治疗剂。 图 1. ADC疗法的演变。根据Perez等人的工作重新绘制的图表。 2.抗体-药物偶联物组成部分 2.1.抗体 2.1.1.抗体基础 抗体，也称为免疫球蛋白，是大型的Y形糖蛋白，作为人类身体对包括细菌和病毒在内的感染病原体的保护者。由浆细胞（从激活的B淋巴细胞发展而来的免疫细胞）产生，抗体能够选择性地结合特定的抗原（病原体外表面的结构），并直接靶向病原体（通过抑制对病原体生存至关重要的抗原的功能）或通过标记病原体供免疫系统的其他组成部分攻击。虽然人体中发现的抗体是多克隆的（由不同的浆细胞谱系产生，识别各种不同的抗原），但在治疗应用中常用的抗体是单克隆的（由相同的浆细胞的相同副本产生的克隆，针对单一抗原）以提供更有针对性的效果，术语“单克隆抗体”通常缩写为mAb。这种对给定目标抗原的特异性推动了mAbs在ADCs中的使用，其中通过连接体将细胞毒素剂共价连接到mAb上，导致将细胞毒素剂输送到目标细胞，并与单独的细胞毒素剂相比减少了毒性。 2.1.2.抗体结构 所有抗体共享一个共同的核心结构（图2），由两个重多肽链（蓝色）和两个轻链（橙色）组成。这些链由各种区域组成，要么是恒定的（C），要么是可变的（V），并通过多个链间和链内二硫键以及各种非共价相互作用组装成Y形结构。附着在重多肽链上的短糖链增加了抗体的水溶性，而抗体中间的灵活“铰链”区域允许它适应目标细胞表面上抗原的不同排列。 图 2. 一般抗体结构（价数 2）。 抗体的两个片段抗原结合（Fab）区域每个由一个轻链的全部（VL和CL区域）和一部分重链（VH和CH1区域）组成。VH和VL域形成每个Fab区域的尖端，每对都包含一个互补位点（抗原结合位点）。互补位点选择性地结合到目标抗原上的一个特定位置，称为表位（抗原决定簇），赋予抗体对该抗原的结合特异性。抗体中互补位点的位置以及可能产生的不同Y尖端结构的多样性，解释了不同已知抗体在抗原结合上观察到的巨大变化。相比之下，抗体的可结晶片段（Fc）区域，由成对的相同CH2和CH3区域组成，与细胞表面Fc受体（FcRs，在各种细胞类型中发现，包括巨噬细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞）结合，并允许抗体在威胁响应中激活免疫系统。 血清中发现的抗体可以根据其重链恒定区域（CH1、CH2和CH3）的氨基酸序列细分为五种同种型（类别）——免疫球蛋白M（IgM）、IgD、IgG、IgE和IgA。IgM抗体有重链称为μ链，IgD有δ链，IgG有γ链，IgE有ε链，IgA有α链。人类抗体还有两种类型的轻链，称为κ-和λ-链；抗体可以由任何单一重链类型和任何单一轻链类型形成。不同的同种型在价数（抗体结合抗原的“臂”的数量）上也有所不同；例如，IgM抗体可以通过五个单独抗体的Fc域的连接形成五聚体结构，每个结构有十个互补位点。IgG同种型，最常用于癌症免疫治疗，可以根据差异进一步细分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，包括铰链和上CH2区域的氨基酸序列的变化。这些Fc区域差异赋予亚类不同的效应功能。 2.1.3.抗体功能 一些用于癌症免疫治疗的单克隆抗体展示了直接细胞毒性效果。例如，人源化抗 HER2 IgG1 单克隆抗体曲妥珠单抗（赫赛汀）阻断了与细胞功能和增殖相关的肿瘤抗原的信号传导。关于间接单克隆抗体细胞毒性机制，不同的抗体同种型促进不同类型的免疫反应。这些间接作用机制可以广泛地分类为（i）抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，（ii）补体依赖性细胞毒性，（iii）补体依赖性细胞介导的细胞毒性，以及（iv）促进自然抗肿瘤免疫反应机制。作为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的一个例子，免疫效应细胞如巨噬细胞和自然杀伤细胞结合到 IgG 单克隆抗体的 CH3 区域，通过吞噬作用（巨噬细胞）或释放有毒颗粒（自然杀伤细胞）触发肿瘤细胞死亡。相比之下，补体依赖机制反而指的是通过抗原-抗体（IgG1、IgG3、IgM）结合激活经典途径。经典途径是触发补体系统的一种途径。补体系统，也称为补体级联，是一个涉及超过 20 种血浆蛋白的免疫学酶级联，这些蛋白在肝脏中合成，触发吞噬作用、炎症和目标细胞的溶解。最后一种效果是通过形成膜攻击复合物（MAC）实现的，它在目标细胞的膜上形成孔洞。与 IgG1 和 IgG3 作为经典途径的强大激活者不同，IgG2 和 IgG4 是效率较低的触发器，而是诱导更多情况依赖性、微妙的反应。关于抗体结构和功能的更详细讨论超出了本综述的范围，可以在其他地方找到。 2.1.4.用抗体靶向癌细胞 使用小分子治疗剂作为抗癌化疗药物的一个关键问题是脱靶毒性，因为这些药物无法有效地区分肿瘤细胞和正常的健康人类细胞。ADC 在这方面具有优势，因为将细胞毒素剂连接到靶向肿瘤的抗体上允许更有针对性的治疗。为了将细胞毒素药物输送到正确的细胞，相关的抗体需要对其目标抗原具有足够的结合亲和力和特异性。从历史上看，这种靶向是困难的，因为正常人类细胞和肿瘤细胞之间的固有相似性——与例如细菌细胞相比——以及结果缺乏细胞表面抗原来靶向。然而，1970 年代末，Lloyd J. Old 及其同事发现了第一种肿瘤特异性抗原（仅在癌细胞上而不在正常人类细胞上发现的细胞表面抗原），这表明选择性靶向肿瘤细胞确实可能。 在设计ADC时，选择目标肿瘤特异性抗原是一个重要的决定。常见的肿瘤特异性抗原类型包括糖蛋白、细胞外基质蛋白和细胞表面蛋白。一些肿瘤特异性细胞表面蛋白的例子包括HER2（乳腺癌）、CD30（淋巴瘤）和CD33（急性髓细胞白血病）。由于大约90-95%的急性髓细胞白血病患者在其白血病髓系前体细胞表面表达CD33蛋白，因此它是抗体治疗的理想肿瘤特异性靶标。然而，值得注意的是，（i）具有高抗原亲和力的ADC并不具有高实体瘤穿透性，（ii）细胞表面目标抗原表达的分布决定了ADC的治疗窗口，以及（iii）肿瘤中高抗原表达水平并不一定保证ADC将非常有效。Polson等人提出，肿瘤抗原密度与ADC效力之间的相关性取决于肿瘤细胞的类型，因为每种抗原在与ADC形成复合物后的内化速率不同。 含有单克隆抗体的治疗可能遇到的一个潜在问题是它们大尺寸对药代动力学特性的影响。在ADC中，单克隆抗体相对于其载荷细胞毒素的大小意味着单克隆抗体占任何给定ADC质量的90%以上。然而，虽然这确实导致其在健康组织中的分布减少，包括代谢和排泄器官（例如，肝脏、肠道、肌肉、皮肤），但肿瘤特有的渗漏血管意味着在分布到肿瘤部位时不会遇到这样的问题。以这种方式，基于单克隆抗体的治疗享有更长的半衰期和对肿瘤细胞的更大选择性。 2.1.5.单克隆抗体的类型 用于基于抗体治疗的四种主要不同类型的单克隆抗体是小鼠、嵌合、人源化和人类单克隆抗体。这些在表1中进行了总结。 历史上，来自高度免疫动物的抗血清被用来治疗白喉等疾病。因此，最初实现ADC化合物的努力是使用小鼠来源的抗体。然而，随后发现了小鼠抗体固有的问题（高免疫原性、在人类中效果差、血清半衰期短），以及1975年Georges Kohler和Cesar Milstein发现的杂交瘤技术，导致了从小鼠抗体向嵌合抗体（具有人类恒定区和小鼠可变区的抗体）的转变。杂交瘤技术涉及将抗原注射到小鼠体内，引起免疫反应，从而释放B细胞，然后将这些B细胞与骨髓瘤（癌变的B细胞）融合，创建出称为杂交瘤的杂交细胞系。将B细胞的抗体产生能力与骨髓瘤的增加寿命和繁殖力结合起来，杂交瘤可以在培养中生长，并且它们产生的mAbs可以被纯化。然而，尽管减少了小鼠来源的抗体区域，嵌合抗体也被发现在人类中遭受与小鼠抗体类似的免疫原性问题。为了解决这个问题，开发了人源化抗体，其中小鼠来源的区域被限制在可变区末端的补体决定区（CDR）环，这些环控制着抗原结合的特异性。最后，包括在大肠杆菌中表达编码人类可变链区域的基因以及通过噬菌体展示技术表达和随后纯化人类可变域的技术里程碑，使得完全人类抗体（抗体的所有组成部分都来自人类）得以实现。目前大多数获批用于临床使用或正在开发的ADCs使用人源化或人类单克隆抗体。人源化和人类mAbs现在被认为是首选，因为它们的使用确保了足够的抗原亲和力和特异性、长的血清半衰期和最小的免疫原性。然而，这一规则也有例外；Brentuximab vedotin（Adcetris®, FDA和EMA批准用于复发/难治性霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤）就是一个使用嵌合mAb的ADC的例子。 2.1.6.影响ADCs中单克隆抗体选择的因素 就ADC疗法而言，mAb最重要的属性是高目标抗原特异性，因为如果ADC与非目标抗原（即健康细胞）形成非特异性结合，其后果可能是不可预测的，可能包括脱靶毒性和由于免疫原性导致的过早从循环中清除，导致有限的目标暴露、降低治疗效果和不良副作用。其他重要特性包括对目标抗原的高结合亲和力、最小的免疫原性和能够实现抗肿瘤活性所需目标暴露的半衰期。 IgG同种型在ADC开发方面仍然是最受欢迎的，尽管对目前批准的ADC疗法（表2）和处于临床开发阶段的ADCs的分析显示，这几乎完全限于IgG1亚类。这可以通过考虑IgG1亚类和其他IgG亚类的属性来解释。IgG1抗体在血清中的稳定性与IgG2和IgG4抗体相似（21天），但它们更能激活经典补体途径，并且对IgG结合Fc-γ受体（FcγRs）的结合亲和力更高，这意味着IgG1抗体在触发所需的免疫反应方面更有效。IgG2抗体，作为补体的触发因素效果较差，也因为它们能够形成共价二聚体而受到不利影响，尽管这被认为可以改善效应功能的触发并帮助mAbs结合到细菌抗原，但也可能引起聚集并使ADC失效。IgG3抗体相对于其他IgG亚类有较短的半衰期，这意味着它们不适用于治疗用途，尽管它们是有效的溶细胞剂。IgG4抗体也不优选，因为它们可以通过与其他IgG4抗体交换一对轻链和重链形成新的杂交、双特异性mAbs（具有两个Fab区域中非相同互补位点的抗体，从而能够结合到同一抗原或不同抗原的两个不同表位），尽管这可以通过用IgG1 mAb的CH3结构域替换IgG4 CH3结构域来克服。与IgG2抗体类似，它们也是效应功能差激活剂。 然而，选择mAb是否根据上述标准直接相关于改进的ADCs仍有待最终确定。例如，Drachman和Senter认为，人类mAbs与其嵌合和人源化对应物相比的较低免疫原性尚未在临床试验中得到证明，因为晚期癌症患者无法发展出以前对小鼠和嵌合mAb治疗反应中观察到的mAb靶向抗体。此外，Goldmacher和Kovtun提出，最初认为ADC目标亲和力与细胞毒性之间存在正相关是错误的，因为具有高目标亲和力的ADC可能迅速与肿瘤周围的血管结合，而不是均匀地结合到所有存在的肿瘤细胞上。因此，设计一个用于ADCs的优化mAb仍然是一个具有挑战性的任务。 2.2.连接体 ADCs开发中最大的挑战之一是选择合适的连接体，将细胞毒素载荷与mAb共轭。连接体化学影响ADC的各种属性，包括毒性、特异性、稳定性和效力，因此已经研究了广泛的可能连接体结构。连接体可以广泛地分类为可裂解的（载荷能够在肿瘤部位从mAb分离）或不可裂解的（载荷和mAb保持结合在一起，在内吞后mAb被降解），这反过来又影响个别ADCs的作用模式。 2.2.1.可裂解连接体 可裂解连接体的关键思想在于选择性裂解的概念；连接体需要在血液中保持完整，只有在肿瘤部位裂解以释放细胞毒素载荷。过早的连接体裂解可能导致所谓的旁观者杀伤现象，其中载荷可以扩散到肿瘤部位附近的靶抗原阴性细胞和/或逃逸到系统循环中。有趣的是，虽然如果健康细胞受到影响，这可能是不利的，但旁观者杀伤也可以让载荷扩散到抗原阴性的肿瘤细胞（缺乏ADC目标抗原的肿瘤细胞），这些细胞否则不会被ADC靶向，从而有助于完全根除肿瘤。由于需要穿过细胞膜，旁观者杀伤只有在释放的载荷是非极性的和电荷中性时才会观察到。 选择性裂解是通过利用肿瘤细胞环境的独特属性实现的，例如癌症细胞细胞质中存在的某些酶或不同细胞间室之间pH值的变化。在ADCs中常用的三种可裂解连接体是腙、二硫键和肽连接体（图3）。腙连接体在血液中的中性pH条件下稳定，但一旦进入癌细胞的内体和溶酶体间室就更容易水解。相比之下，二硫键连接体通过谷胱甘肽还原以实现载荷释放，并利用肿瘤细胞中较高的谷胱甘肽浓度（1-10毫摩尔/升）与血液（5微摩尔/升）相比。二肽连接体，也称为酶可裂解连接体，确保ADC在循环中保持稳定，并且只有在癌细胞细胞内溶酶体环境中通过溶酶体蛋白酶，如在几种癌细胞类型中过度表达的组织蛋白酶B，才发生裂解。例子包括缬氨酸-瓜氨酸（Val–Cit，在Adcetris®[30]中发现），缬氨酸-丙氨酸（Val–Ala，在ADC Therapeutics的loncastuximab tesirine中发现）和丙氨酸-丙氨酸（Ala–Ala，在ImmunoGen的IMGN632中发现）二肽连接体。这些通常与对氨基苄氧羰基（PABC）间隔单元一起使用，该间隔单元将二肽和载荷部分分开，并允许组织蛋白酶B更好地接触裂解位点。与腙和二硫键连接体类型相比，基于肽的连接体在稳定性和特异性方面得到了改善，因为它们对血清蛋白酶的敏感性降低，相对pH不敏感，并且选择性地被低pH活性蛋白酶裂解。 图 3. ADCs中使用的不同连接体结构。(a) 可裂解的腙连接体和二硫化物触发器，如在Mylotarg®中使用；(b) MC–Val–Cit–PABC连接体，结合了不可裂解的MC和可裂解的二肽Val–Cit连接体以及PABC间隔单元，如在Adcetris®中使用；(c) 不可裂解的MCC连接体，如在Kadcyla®中使用。 2.2.2.不可裂解连接体 虽然可裂解连接体经历水解或酶促裂解，但不可裂解连接体不断裂，并且在抗原特异性内吞后，只有在mAb完全溶酶体降解后才释放细胞毒素载荷。不可裂解连接体相对于其可裂解竞争对手的关键优势是，不可裂解连接体赋予ADCs更长的血浆半衰期，减少的脱靶毒性，并且通常更宽的治疗窗口。在ADCs中使用的常见不可裂解连接体是基于马来酰亚胺型结构的，如马来酰亚胺己酰（MC，在AbbVie的depatuxizumab mafodotin中发现）和4-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸盐（MCC，在Kadcyla®中发现）连接体（图3）。特别是MC连接体已经看到不同的用途，单独作为不可裂解ADC的一部分使用（例如，AbbVie的depatuxizumab mafodotin）或作为将mAb和可裂解二肽连接体序列分开的间隔单元（例如，Adcetris®），所有市场销售的含有单甲基auristatin E（MMAE）或单甲基auristatin F（MMAF）弹头的ADCs都使用这种连接体。 2.2.3.药物-抗体比率和均质性 ADC效力的重要决定因素包括连接体稳定性和ADC内吞作用；因此，为了实现足够的细胞毒性，需要在每个mAb上附加一定数量的连接体-药物单元。每个抗体平均药物分子数通常称为药物-抗体比率（DAR）。Hamblett等人研究了MMAE载荷和抗CD30 mAb的不同DAR，并得出结论，最佳DAR在两个到四个之间；增加DAR与体外效力和血浆清除率的增加正相关，但与小鼠最大耐受剂量的减少负相关。高DAR也与增加的ADC聚集相关——这是不可取的，因为这可能导致改变ADC器官更新和清除机制——这可能解释了Hamblett等人的发现，即DAR为四个和八个在体内具有可比的抗肿瘤活性。 除了实现一致的DAR外，ADC设计的另一个目标是均质性（个体mAb之间连接点的一致性）。这两种属性在技术上都具有挑战性，因此第一个临床批准的ADCs高度异质，具有不同的载荷-连接体/抗体比率范围。ADC均质性与连接体与mAb的结合方法内在相关。结合通常通过抗体半胱氨酸（硫醇）或赖氨酸（ε-氨基）残基侧链实现；而赖氨酸侧链通常未修饰，半胱氨酸残基的硫醇基团几乎完全以二硫键形式存在，因此在结合之前需要选择性还原。例如，人类IgG1具有4个链间和12个链内二硫键；选择性还原前者（对mAb的结构完整性不重要）可以产生多达八个硫醇用于连接体结合。相比之下，mAb中的赖氨酸残基数量远远超过这个数字，这意味着虽然可能实现更高的DAR，但与半胱氨酸结合的ADCs相比，异质性更大。然而，Yoder等人的案例研究评估了CX–DM1连接体-载荷到人源化mAb的不同结合模式，得出的结论是等效半胱氨酸和赖氨酸结合的ADCs之间的差异可能是高度案例依赖性的——在他们的情况下，赖氨酸结合的形式在效力方面略优于半胱氨酸结合的，并且他们主张研究不同的结合方法以优化任何给定的ADC疗法。ADC均质性和DAR一致性的话题仍然是活跃的研究领域，并且在其他地方进行了更详细的审查。 2.2.4.连接体技术的最新进展 新的连接体类别。Kern及其同事研究了ADCs作为实现系统性糖皮质激素治疗（一种结合糖皮质激素受体以介导炎症的皮质类固醇激素亚类）的方法，而无需观察到mAb导向靶向时观察到的众多副作用。作为这项工作的一部分，他们报告了一种新型焦磷酸二酯连接体，它结合了高血浆稳定性和水溶性以及通过酶促裂解的快速溶酶体释放。另外，Bargh等人报告了一对新型硫酸酶可裂解的芳基硫酸酯连接体，与Val–Ala和Val–Cit二肽连接体相比，具有更优越的小鼠血浆稳定性；使用芳基硫酸酯连接体将MMAE结合到曲妥珠单抗上，得到的ADCs对HER2阳性细胞有效。 位点特异性连接体。正如前面所提到的，通过使用位点特异性连接体可以提高ADC均质性，例如那些选择性地将载荷分子连接到mAb的保守N-糖基化残基（通过一个氮原子连接一个或多个糖分子的氨基酸，通常是天冬酰胺的侧链酰胺氮）上。Faridoon及其同事最近报告了两种这样的连接体，2-氨基苯胺氧化酶和巯基乙基吡唑啉，他们使用这些连接体在几乎中性pH和无催化剂的条件下，在水溶液中将Val–Cit–PABC–MMAE基团连接到醛基功能化的N-糖基化位点。实现结合位点特异性的其他方法包括在mAb结构中包含遗传编码的非天然氨基酸，添加在预定mAb位置上的半胱氨酸残基用于半胱氨酸选择性结合和酪氨酸选择性点击类结合反应。 三肽可裂解连接体。缬氨酸-瓜氨酸二肽连接体在人类血浆中稳定，但在小鼠血浆中不那么稳定，导致在小鼠循环中过早释放载荷。为了解决这个问题，Anami等人开发了谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸（EVCit）三肽连接体，该连接体在小鼠和人类血浆中展示了改善的稳定性，同时也保留了其前体对蛋白酶敏感的特性。使用EVCit–PABC连接体构建的抗HER2 ADC在体内展示了优越的长期稳定性，并在HER2阳性乳腺癌的异种移植小鼠模型中与含Val–Cit的对照相比，展示了改善的治疗效果。Poudel及其同事随后将EVCit三肽单元与间酰胺对氨基苄氧羰基（MA–PABC）基团结合，进一步提高了小鼠血清稳定性。 连接体亲水性。连接体亲水性很重要；如果载荷和连接体都是疏水性的，那么产生的ADCs可能会聚集，导致通过网状内皮系统从血液中清除和肝毒性。Zhao等人研究了是否可以通过使用亲水性连接体，如包含带负电荷的磺酸基团或聚乙二醇（PEG）基团的连接体，在抗体-美登素ADCs中避免这种情况，并得出结论，这样的连接体允许实现比传统不可裂解连接体更有效的ADCs，并且DAR更高，同时还保持了目标抗原的亲和力。 生物正交连接体裂解。通过使用可以进行生物正交裂解（通过一种不干扰生物体生化过程的化学反应进行裂解）的连接体，也研究了ADC载荷的靶向递送。Stenton及其同事开发了一种硫醚丙炔基碳酸酯连接体，该连接体在室温下选择性地通过钯金属复合物Pd(COD)Cl2介导的裂解。通过连接体将多柔比星结合到抗HER2抗体片段上，得到的ADC在体外也实现了完全载荷释放。然而，尽管裂解反应所需的钯复合物的非毒性量很低，但未复合的钯的毒性以及Pd(COD)Cl2催化剂缺乏细胞选择性意味着需要进一步的工作才能使这种方法在临床上可行。 2.3.载荷 ADCs中使用的载荷往往是细胞毒素化合物，其毒性太大，无法单独用作抗癌药物。这是因为单独的mAb可以容纳相对较少的载荷分子（见药物-抗体比率和均质性），并且可能只有一小部分的给药ADC治疗会到达肿瘤部位。ADC载荷通常比用作小分子化疗药物的化合物强100-1000倍，并且具有亚纳摩尔活性，然而——由于Sedlacek等人估计，注射剂量的ADC不到0.01%会到达每个克肿瘤——细胞毒素效力在皮摩尔范围内并不罕见。其他理想属性包括有利于对癌细胞毒性的机制（例如，抗有丝分裂剂），并且，如果不需要旁观者杀伤，释放的细胞毒素中存在可电离功能团（例如，羧酸）以帮助防止细胞毒素穿过生物膜。 载荷类别ADCs中可用的载荷类别相对较少，它们要么是微管抑制剂，要么是与DNA相互作用的药剂。目前市场上的ADCs包含属于三类主要细胞毒素的载荷；卡利奇霉素（例如，在Mylotarg®中发现的卡利奇霉素γ1衍生物）、auristatins（例如，在Adcetris®中的单甲基auristatin E (MMAE)）和美登木素（例如，在Kadcyla®中的DM1）。最近，人们有兴趣使用其他类别的高度有效的抗有丝分裂化合物作为ADC载荷，如duocarmycins、amanitins和pyrrolobenzodiazepines 。下面更详细地讨论了这些类别（图4）。 图 4. ADCs中使用的各种载荷类别的代表性成员的结构。 Amanitins。阿马托辛是一组天然存在的双环八肽，它们的名字来源于它们所在的蘑菇属（Amanita spp.）。它们结合并抑制RNA聚合酶II的作用，破坏转录和蛋白质合成。在阿马托辛中，α-amanitin和β-amanitin作为ADC载荷的应用已经得到了最好的研究；两者的吸引力都包括高效力和血浆稳定性、亲水性、扰乱代谢的靶点、容忍连接体而不丧失细胞毒性，最重要的是，能够杀死休眠的肿瘤细胞以及分裂的细胞。使用amanitin型载荷的最先进ADC是Heidelberg Pharma的HDP-101，这是一个临床前候选药物，它通过一个可裂解的缬氨酸-丙氨酸二肽连接体将B细胞成熟抗原靶向mAb与α-amanitin结合起来。 Auristatins。最初已知的auristatins，dolastatins 1和2，最初是从楔形海兔Dolabella auricularia中分离出来的。这种微管抑制细胞毒素家族结合在微管长春碱结合域，导致细胞在中期停滞。dolastatin 10的结构被用作衍生物单甲基auristatin E (MMAE)和单甲基auristatin F (MMAF)的基础，它们都具有N-末端次级胺（而不是dolastatin 10中的三级胺），允许直接连接连接体。由于其C-末端羧酸基团，MMAF比MMAE更不能穿过细胞膜，但MMAF也更亲水，聚集倾向较小，并且比MMAE显示出更低的系统毒性。市场上的ADCs Adcetris®, Padcev®和Polivy®都包含MMAE载荷。 Calicheamicins。最初由Lederle实验室的科学家在1980年代从Gram阳性细菌Micromonospora echinospora subsp. calichensis中分离出来，卡利奇霉素是一类具有强大活性的enediyne抗肿瘤抗生素，对Gram阳性和Gram阴性细菌以及人类癌细胞系都有强大的活性。这些药剂是与DNA相互作用的；释放自mAb后，游离的卡利奇霉素被谷胱甘肽还原，触发分子内迈克尔加成和Bergman环化，形成双自由基物种。这结合在DNA双螺旋的小沟中，导致双链DNA断裂和细胞死亡。市场上的ADCs Mylotarg®和Besponsa®都包含卡利奇霉素载荷。 Duocarmycins。Duocarmycins是一类次要沟槽结合，DNA烷基化的天然产物，它们在1970年代首次从链霉菌细菌中分离出来，形成与腺嘌呤碱基的N3位置的共价键，并诱导凋亡。第一代CC-1065在白血病L1210细胞中显示出皮摩尔活性，但受到肝毒性的阻碍；然而，它的衍生物却取得了更大的成功。Byondis的曲妥珠单抗duocarmazine，一种目前正在进行3期临床试验的HER2靶向ADC，使用这样的衍生物，seco-DUBA作为其载荷。 Maytansinoids。在Kadcyla®中使用的治疗性载荷美登木素（也称为DM1），是1972年Kupchan及其同事从植物Maytenus serrata中提取的天然产物美登木素的衍生物。美登木素及其衍生物美登木素通过在长春碱结合位点结合微管来诱导有丝分裂停滞，以抑制微管聚合，尽管美登木素本身由于治疗窗口狭窄而不适合用作化疗药物。目前，拥有美登木素载荷的ADCs，包括batansine（Bio-Thera Solutions的BAT8001）、DM1（ImmunoGen的lorvotuzumab mertansine）和DM4（ImmunoGen的SAR566658），正在进行2期或3期临床评估。 Pyrrolobenzodiazepines。Pyrrolobenzodiazepine (PBD)家族的DNA相互作用抗癌药剂最初是在1965年首次报道的，当时从Streptomyces refuineus sbsp. thermotolerans中分离出第一代anthramycin，并由Leimgruber及其同事进行了表征。PBDs是次要沟槽结合化合物，通过亲核攻击亲电的亚胺功能团与鸟嘌呤碱基的C2氨基形成共价键。自从它们被发现以来，已经描述了各种天然和合成的anthramycin类似物，包括PBD单体和二聚体（两个PBD通过它们的C8位置连接在一起），瑞士生物技术公司ADC Therapeutics S.A.目前有几种含有PBD二聚体的ADCs（camidanlumab tesirine, loncastuximab tesirine, epratuzumab-cys-tesirine, Vadastuximab talirine）在不同阶段的临床评估中。 3.临床中的抗体-药物偶联物  3.1.目前市场上的抗体-药物偶联物  迄今为止已有九种ADCs获得批准用于临床使用。它们在表2中简要总结。 3.2.一般作用机制 给药后，ADC的mAb组分识别并与靶肿瘤细胞表面的抗原结合。抗原结合后是内吞作用，其中ADC-抗原复合物在癌细胞内被内吞。接下来，需要从mAb中释放载荷细胞毒素以介导细胞死亡；对于不可裂解的连接体，内吞复合物通过溶酶体中的蛋白酶分解，释放细胞内的细胞毒素载荷，而对于具有可裂解连接体的ADCs，载荷释放的机制根据所使用的特定连接体而变化。在所有情况下，释放的载荷随后与其靶标结合，通过凋亡导致细胞死亡。 3.3.抗体-药物偶联物案例研究 3.3.1.辉瑞公司的Mylotarg® (Gemtuzumab Ozogamicin) 辉瑞公司以Mylotarg®品牌销售的Gemtuzumab Ozogamicin由一个抗CD33人源化IgG4κ单克隆抗体通过一个可裂解的腙连接体连接到卡利奇霉素γ1衍生物载荷（图5）。它优先与表达CD33表面抗原的细胞结合，导致Gemtuzumab Ozogamicin-CD33复合物内吞和溶酶体低pH环境中通过酸水解的连接体裂解，随后游离的卡利奇霉素被谷胱甘肽还原并诱导双链DNA断裂，导致细胞死亡。 图 5. gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg，上）和trastuzumab emtansine（Kadcyla，下）的结构。 Gemtuzumab Ozogamicin是第一个进入临床的ADC，于2000年获得FDA加速批准，用于治疗复发或难治性CD33阳性AML，适用于无法接受其他细胞毒性化疗治疗的60岁以上患者。然而，加速批准要求进行市场后试验以确认治疗效果；多个这样的研究的负面结果（NCT00085709和ISRCTN17161961），以及与可能致命的肝静脉闭塞病等疾病的关联，促使辉瑞在2010年自愿撤回Gemtuzumab Ozogamicin。然而，基于随后试验（NCT00927498和NCT00091234）的积极结果，这些试验使用了分数剂量策略，Gemtuzumab Ozogamicin于2017年9月再次获得FDA批准，用于治疗新诊断的CD33阳性AML成人患者，以及治疗复发或难治性CD33阳性AML的2岁以上患者。 3.3.2.基因泰克公司的Kadcyla® (Trastuzumab Emtansine) 基因泰克公司以Kadcyla®品牌销售的Trastuzumab Emtansine由一个抗HER2人源化IgG1单克隆抗体通过一个不可裂解的MCC连接体连接到DM1载荷（图5）。Trastuzumab也以Herceptin®为商品名由基因泰克公司销售，作为治疗HER2阳性转移性乳腺癌的裸人源化单克隆抗体。与Gemtuzumab Ozogamicin不同，Trastuzumab Emtansine中的不可裂解连接体意味着，在ADC通过受体介导的内吞作用进入HER2阳性癌细胞后，需要在溶酶体内部发生mAb蛋白分解以释放游离的DM1载荷。DM1从溶酶体释放后，结合到微管的长春碱结合位点以抑制微管聚合，诱导有丝分裂停滞和细胞死亡。Trastuzumab Emtansine于2013年2月获得FDA批准，作为治疗先前接受过Trastuzumab和紫杉醇治疗的HER2阳性转移性乳腺癌患者的单药治疗；2019年5月，这一适应症扩展到包括在新辅助紫杉醇类化疗和基于Trastuzumab的治疗后仍有残留浸润性疾病的HER2阳性早期乳腺癌患者。 4.结论和未来展望  截至撰写本文时，已有9种ADC疗法获得FDA批准用于临床，并且至少还有84种正在进行临床评估，ADCs显然已经稳固地存在。考虑到它们相对于传统的小分子化疗药物在肿瘤细胞选择性和脱靶毒性方面的优势，这并不令人意外。然而，虽然本文讨论的大多数ADCs都与肿瘤学相关，但ADC概念在其他一些不相关的领域也有潜在的应用。这一点由基因泰克公司的ADC DSTA4637S为例，它是一种通过可裂解的缬氨酸-瓜氨酸二肽连接体与利福霉素衍生物共轭的工程化IgG1 mAb，目前正在进行1期临床试验，用于治疗MRSA感染。Lehar及其同事报告说，DSTA4637S能够根除对万古霉素有抗性的金黄色葡萄球菌感染，在小鼠感染模型中优于万古霉素，这是一个重要的发现，考虑到当前全球抗菌素耐药性问题。在抗炎领域，Kern及其同事寻求应用ADC概念，以实现一种系统性糖皮质激素药物，而不会有纯小分子方法可能带来的副作用。因此，我们期待着ADC方法在肿瘤学领域内外的进一步新颖应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。