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摘要：冷冻 - 解冻是生物制药生产过程中的一个关键单元操作。相当一部分生物制品药物物质是冷冻储存的。虽然冷冻药物产品的数量少于药物物质，但在生物制品开发的早期阶段，冷冻药物产品提供了一种前进的方向。生物制品的模式越来越多样化，包括细胞、基于 DNA/RNA 的治疗药物、蛋白质、疫苗和病毒。已有几篇关于冷冻的基本特性、由此产生的应力及其对许多模式（主要是蛋白质）稳定性的影响的详细评论文章。本章概述了冷冻的基本方面以及由此产生的应力对蛋白质稳定性的后果。本章还讨论了用于研究冷冻相关过程和诱导损伤的实验和建模方法的最新进展。最后，评论总结了生物制品药物产品（单克隆抗体及更广泛领域）开发中的关键配方和工艺考虑因素（最佳实践），以及在填补冷冻和蛋白质稳定化知识空白方面存在的未来机会。 1.冷冻过程中的应力 1.1.冷冻诱导应力的当前理解 生物制品在溶液状态下容易因水解、脱酰胺、聚集等原因发生化学和/或物理降解。冷冻干燥技术常用于提高生物制品药物产品在固态下的长期稳定性，从而缓解商业分销和储存中遇到的挑战。然而，冷冻干燥过程本身会对生物制品引入应力。已经研究和回顾了冷冻应力的各个贡献及其对蛋白质稳定性的影响。简而言之，冷冻步骤从溶液过冷开始，首先是冰核形成，然后是冰晶生长，直到系统达到平衡冰点。当进一步冷却至低于称为冻浓缩溶液的玻璃化转变温度的温度时，系统达到其最大冻浓缩状态。冷冻产生的三种主要应力包括冷变性、冰晶形成和冻浓缩。蛋白质还可能吸附在生长冰晶与冻浓缩液之间的界面上，可能导致对蛋白质稳定性不利的构象变化。冰核形成温度、冷却速率、退火和等温保持被认为会影响冰晶尺寸。冰晶尺寸越大，比表面积越小，因此蛋白质稳定性越好。近年来，开发了控制冰核形成的技术（ControLyo 和冰雾），从而增加冰晶尺寸，提高干燥速率，在某些情况下提高蛋白质稳定性。特别是，通过同步一批次内所有小瓶的冰核形成，有望实现产品质量的批次均一性。当这种新兴技术在未来不久在制药生产中常规实施时，将实现更简单的放大和显著提高的产品均一性。在冻浓缩状态下，配方中溶质的浓度增加，导致不希望的缓冲液/盐结晶、液 - 液相分离、离子强度变化等。常用二糖（蔗糖、海藻糖）和多元醇作为冷冻保护剂，以稳定蛋白质免受冷冻诱导应力的影响。在一个例子中，通过改变冷冻条件（包括冰核形成温度和搁板升温速率）来研究聚复合物颗粒的稳定性。在该研究中，从冰核形成开始到温度降低至 Tg’（达到最大冻浓缩）的时间被定义为 “停留时间”。理论上，在这段时间内有两种相反的作用。延长停留时间可以让冰晶生长得更大，可能减少吸附诱导降解在冰/冻浓缩界面处。同时，在冻浓缩状态下停留时间越长，聚集越明显。在冻浓缩状态下，当粘度保持较低时，聚复合物颗粒的聚集被发现直接与停留时间有关。在最近的一项研究中，证明了在冻浓缩溶液中停留时间的增加直接影响了重组人血清白蛋白（rHSA）制剂的聚集。根据蛋白质制剂在冷冻过程中的降解机制，可以通过改变冷冻条件和/或优化配方组成来采用适当的稳定化方法。  1.2.冷冻诱导应力的最新见解 1.2.1.溶解气体 在冷冻过程中，氮气和氧气以气态形式存在于冻浓缩溶液中。由于在较低温度下溶解度增加，溶解气体的浓度增加。对于容易被氧化的分子，由于在冷冻过程中氧气水平增加，药物产品的质量属性可能会受到负面影响。或者，研究表明，在冷冻过程中，随着溶质浓度增加，溶解气体的溶解度降低（见图 1），因此，气泡可能会在冻浓缩液中形成。这可能会增加蛋白质在气液界面处降解的风险。之前通过光学显微镜和小角中子散射观察到了气泡的存在。在最近的一项研究中，发现在 “冰山区域” 的气泡会导致 IgG 制剂的聚集速率更高。  图 1 冷冻浓缩物中的蔗糖浓度和冷冻浓缩物中的氧气溶解度 1.2.2.机械应力 在冷冻过程中，由于冰的密度低于水，冷冻溶液的体积会膨胀。由于冷冻过程中体积膨胀而产生的压力可能导致容器变形、某些溶质的结晶行为发生变化以及蛋白质不稳定。之前曾全面评估过冷冻过程中压力增加的幅度，包括理论估算和实验测量。在药学相关配方中，冷冻诱导压力估计每过冷一度约为 1.2 MPa，对应于 120–180 bar 的压力（过冷 10–15 °C）。根据理论估算，虽然压力诱导的展开通常是可逆的，但在冻浓缩溶液中高局部蛋白质浓度会增加蛋白质 - 蛋白质相互作用的概率，如果蛋白质发生展开，则可能导致聚集。为了验证冷冻诱导压力在蛋白质不稳定化中的作用这一假设，需要具有微米空间分辨率的静水压力升高方面的实验和计算机建模数据。目前此类数据尚缺。  除了静水压力和由于体积膨胀引起的机械应力外，在冷冻（液体流向冰晶表面以支持冰晶生长）和解冻过程中还存在由于液体流动而产生的应力。这种液体流动会导致剪切应力，可能会对蛋白质稳定化产生贡献。迄今为止，我们尚未了解到在药学相关系统中进行的任何关于冷冻 - 解冻过程中剪切率和剪切应力方面的实验或计算研究。因此，尚待观察冷冻诱导的剪切应力是否会对蛋白质不稳定化产生贡献。  2.新型模式 2.1.疫苗 如今，疫苗是控制传染病传播的最有效方法之一。疫苗的有效性取决于抗原稳定性，并且会受到文献中已发表的多种因素的影响。减毒活病毒疫苗是预防病毒性疾病最有前途的方法之一，在水溶液中极不稳定，因此，大多数需要作为冷冻液体在 -60 °C 以下储存，或者如果进行冷冻干燥，则在冷藏条件下储存。Hansen 等人描述了病毒内冰晶形成、渗透压变化、pH 值变化以及病毒包膜蛋白和病毒脂质膜受到的影响等病毒在冷冻过程中可能经历的一些相关应力。在含有磷酸盐缓冲液（PBS）的配方中，与 HEPES 缓冲液相比，由于在冷冻过程中二钠磷酸盐的选择性沉淀导致 pH 值降低，观察到流感亚单位病毒的血凝素（HA）糖蛋白的二级和三级结构发生了显著变化。由于在快速冷冻过程中 HA 在 PBS 中的停留时间比慢速冷冻短，因此 HA 在快速冷冻后发生了较小的酸诱导构象变化 。在 PBS 配方中冷冻是否会导致 pH 值变化，从而导致酸诱导的构象变化？  在搁板上慢速冷冻和在 4 °C 下慢速解冻被发现对单纯疱疹病毒（一种脂质包膜病毒）的稳定性不利，而与之相反的是通过浸入液氮快速冷冻和在 37 °C 下快速解冻。Zhai 等人还研究了冷冻速率对冻干单纯疱疹病毒 2 型（HSV2）的恢复情况的影响。使用液化丙烷的最快冷却速率被发现对 HSV2 的稳定性最不利，其次是搁板冷却和浸入液氮。使用液化丙烷淬火样品会导致形成非常细小的冰晶，这些冰晶可能在升温至进行主要干燥的温度时重结晶，从而破坏病毒，最终导致病毒失去感染力。冰晶如何在主要干燥过程中重结晶？是否可能在升温至主要干燥过程中发生了重结晶？  含有铝盐佐剂的疫苗对冷冻敏感，建议在 2–8 °C 下储存。然而，在这种疫苗的冷链运输过程中，频繁意外暴露于冷冻（零下）温度是非常常见且有详细记录的。虽然并非所有暴露于零下温度（-4 °C 或更高）的情况都会导致疫苗实际发生物理冷冻，但即使单次暴露于 -10 °C 的乙型肝炎疫苗也会导致疫苗配方冷冻，从而导致佐剂 - 抗原聚集和在小鼠中免疫原性降低。此外，还观察到冷暴露的持续时间也会影响疫苗的效力。这些结果被归因于由于冷冻导致佐剂抗原颗粒表面电荷变化而引起的抗原三级结构变化和胶体稳定性变化。 COVID-19 大流行促使人们开发了含有脂质纳米颗粒的基于 mRNA 的冷冻疫苗；在已发表的文献中，关于这些新剂型的冻融稳定性信息有限。 2.2.DNA/RNA 脂质类似纳米颗粒（LLNs）被广泛用于体外和体内递送 mRNA。在含有编码萤火虫荧光素酶的 mRNA 的 LLNs 中，添加无定形冷冻保护剂（如 5% 蔗糖和海藻糖）可改善其冻融稳定性，而添加可结晶辅料（如甘露醇，含量为 5% 或 10%）则会使荧光素酶表达量降低 60%。  邵等人系统地研究了多次冻融循环对基因组 DNA 稳定性的影响，研究了 DNA 浓度和 DNA 尺寸对稳定性的作用。浓度为 100 μg/mL 的较高 DNA 浓度似乎比浓度为 10 μg/mL 的较低浓度更能抵抗冻融相关应激。还观察到冻融不稳定性也取决于 DNA 尺寸，尺寸大于 100 kb 的 DNA 对应激最为敏感。  在冻融后，添加中性非还原糖（如果糖）对于保持阳离子脂质 / DNA 复合物（脂质体）在低离子强度缓冲液中的体外转染效率至关重要。仅在水或生理盐水中冻融一次后，脂质体的转染效率会降至 30%。  与快速冻融相比，慢速冻融循环会导致脂质 / DNA 复合物聚集，表现为转染效率降低和粒径增加。在存在蔗糖的情况下，可以防止这种转染效率的损失。提出了两种冷冻保护机制：（a）糖与脂质的极性基团直接相互作用，从而防止膜融合；（b）糖分子的依数性效应减少冰的形成以及随后脂质体的冷冻浓缩，而这种冷冻浓缩会促进聚集。 2.3.基因治疗 基因治疗是当今探索最为广泛的新型剂型之一。目前，已有三种产品——Glybera、IMLYGIC 和 Luxturna——作为冷冻药品上市。无论使用病毒载体还是非病毒载体，基因治疗的成功都真正取决于将遗传物质高效、可靠且安全地递送至靶细胞（转导）。载体的物理和化学稳定性在将遗传物质转导至靶细胞方面发挥着非常重要的作用。  研究了一种基于磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的配方，用于病毒和腺相关病毒载体（AAV）。观察到 AAV 和腺病毒配方的稳定性取决于冷冻溶液的 pH 值与初始 pH 值的比较。虽然腺病毒配方在 pH 值下降 4 个单位时滴度降低了 1 个数量级，但 AAV 配方对 pH 值下降较为不敏感，滴度仅降低了 0.5 个数量级。Wright 等人也观察到，即使仅经过一次冻融，AAV2 的稳定性也会受到类似的影响。最近，使用缩小模型进行研究时发现，与快速解冻相比，采用磷酸盐缓冲液配方的重组 AAV2 药品在慢速解冻时衣壳滴度降低了 50% - 75%。未观察到冷冻速率的影响。尽管这些观察结果是在较小规模上得出的，但在大规模冻融操作中可能并不成立。在这种情况下，使用能够代表大规模冻融速率的缩小模型对于彻底分析至关重要。在冻融实验中，用 Tris 缓冲液代替磷酸盐缓冲液时，观察到冻融研究后衣壳滴度保持一致。 2.4.细胞 细胞冷冻保存是一个研究得非常透彻的主题。现有文献描述，细胞冷冻损伤可能是由于细胞内冰晶的直接机械损伤，或者是由于细胞内外液体成分的改变（称为“溶液效应”）造成的间接损伤。冰的成核和晶体生长由冷却速率决定，这会影响细胞内部或外部的冰形成。Mazur 解释说，在较慢的冷却速率下，细胞周围的水会结冰，但由于细胞膜起到屏障作用，细胞内的水仍保持未冻结状态。随着外部溶质浓度增加，细胞内未冻结的水有足够的时间顺着化学梯度流出细胞，导致细胞收缩。或者，在冷却速率较高且水没有足够的时间穿过细胞膜时，细胞内会有更多的过冷水，这些水在进一步冷却时会结冰。细胞内冰的形成会导致细胞死亡。对于每种细胞类型，都需要确定溶质浓度效应和细胞内冰之间的最佳平衡。  Lovelock 强调，红细胞冷冻后的溶血程度取决于冷冻过程中氯化钠的冷冻浓缩程度。除了冰晶的形成外，细胞内其他溶质（如氯化钠）的共晶结晶也被观察到对细胞有害。Han 等人评估了 AT - 1 大鼠前列腺肿瘤细胞的解冻后活性，并报告了与细胞周围溶质的共晶结晶相关的冷冻损伤机制。细胞损伤被认为是由共晶形成对细胞膜的机械效应引起的，或者是由于细胞内共晶形成，这与冰晶形成的机制非常相似。此外，还报告了细胞损伤程度因细胞浓度以及冷却和解冻速率的不同而存在差异。Pegg 等人观察到，当血细胞比容超过 50% 时，2.5 M 甘油中的红细胞悬浮液的溶血程度强烈依赖于血细胞比容。在较高的血细胞比容值下，随着甘油浓度的增加，甘油作为冷冻保护剂的效果增强。在 2 M 甘油浓度下，当冷却速率小于 1000 °C/min 时，溶血程度与解冻速率呈反比，而在较高的冷却速率下，溶血程度则与冷却速率直接相关。 3.建模方法的进步 生物制药的开发传统上依赖于一系列系统性的生化和生物物理表征研究，旨在量化药物物质 / 产品（DS/DP）在不同制造单元操作以及货架期储存过程中的稳定性行为。一般来说，这些方法是数十年工业界和学术界在制剂和工艺开发方面的研究成果，从而为单克隆抗体（mAbs）等成熟剂型开发出了所谓的平台制剂。 开发基于平台剂型的 DP 已经是一项成本高昂且风险较高的事业，需要进行数百次实验室、中试和大规模实验以对产品和工艺进行表征，而对于纳米颗粒、RNA 和基因治疗等新型剂型来说，开发难度更大。与此同时，生物制药领域不断发展演变，致力于更快地为患者提供突破性药物。在这种情况下，计算机模拟模型可以通过减少繁琐且经验性的实验工作（例如实验设计（DOE）析因研究）来加速开发过程。这些模型旨在阐明过程或系统的本质，并实现最佳设备设计、制造工艺开发、放大和工艺转移，从而在整个 DP 开发生命周期中节省大量时间、成本和材料需求。可以根据用于关联所考虑系统的独立（输入）变量和因（输出）变量的框架，对计算机模拟模型进行分类。基于第一性原理（从头算）或唯象方程的模型也被称为白箱模型。分子动力学（MD）、计算流体动力学（CFD）和热动力学反应工程方法（REA）是此类模型的示例，它们已被用于描述冷冻和解冻过程。相反，在黑箱模型中，系统的机理细节被忽略（或未知），仅利用输入和输出之间纯粹的数学关系来描述问题。此类数据驱动模型的示例包括线性回归和复杂的机器学习技术。具有工程相关性的大多数冻融模型是基于热和质量传递经典方程的基于物理的模型与实验获得的输入参数（例如通过数据插值）的组合，可以被称为灰箱模型。由于冷冻和解冻广泛应用于许多实际应用中，因此有关此类物理过程的文献相当丰富。因此，讨论与生物制药冻融相关的每项基于建模的研究的细节超出了本节的范围。相反，本节的目标是提供科学界最近探索的不同技术和相关问题的一瞥。表 1 从主要感兴趣的产品或工艺属性以及相应的建模框架方面总结了这些努力。虽然本节的重点不是纯实验研究，但它们在提供用于校准和验证模型的关键数据方面的价值不容小觑。鉴于实验和建模是互补的技术，表 2 旨在作为寻求完善其最佳实验实践的科学家的额外资料来源，并利用独立的实验数据来验证冷冻和解冻模型。从这一简要且最新的文献综述中可以清楚地看出，需要结合多种建模和实验技术来描述在药品冻融过程中发生的多尺度和耦合生物物理过程。一般来说，现有的热和质量传递模型能够准确预测冷冻（或解冻）基质内溶质和温度梯度的演变。然而，目前还没有建立一个通用的建模框架来预测原位生物化学关键质量属性（CQAs）的演变。鉴于相关机制的复杂性和分子性质，大多数关于这一主题的努力采取了务实的逐案方法，将可测量的产品和工艺参数（如冷却速率、温度、溶质浓度和 pH 分布）直接与感兴趣的 CQAs（例如聚集和效力损失）相关联。 3.1.冷冻产品实用注意事项 冷冻生物制剂药品的一个关键方面是定义储存和运输条件以及允许的偏差。通常建议将冷冻药品在低于冷冻浓缩物的玻璃化转变温度的温度下储存。然而，在某些情况下，只要产品质量属性被认为不受长期储存的影响，药品就可以在高于玻璃化转变温度的温度下储存。对于含有在较低温度下容易结晶的辅料（即果糖、NaCl、海藻糖等）的配方，最好将产品运输温度不低于储存温度。需要在开发过程中评估储存时间外研究和冻融循环，以告知允许的偏差，并处理在处理过程中的偏差。 4.结论 生物制药生产中还有其他几个关键单元操作也可以从建模方法中受益。随着计算机的快速发展，从 CPU 时间角度来看原本难以解决的问题变得可行了，因此计算机模拟模型的实际应用机会将继续增长。作为当前工业革命浪潮（工业 4.0）的一部分，数字孪生、大数据、人工智能（AI）和机器学习（ML）等术语已经在生物制药领域的不同方面成为现实。FDA 和 ASME 也认识到计算预测工具的重要性，并建立了建模与仿真工作组，以进行评估和监管指导。鉴于此，我们的行业应不断扩展和实施建模专业知识，通过构建和增强能够显著影响我们的工艺开发和故障排除的预测工具。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观，不代表本站立。