KRAS(Myrio Therapeutics)

导读K-RAS难以成药主要有两点原因：一是由于KRAS蛋白的空间结构缺乏较深的疏水口袋, 阻碍了高亲和力抑制剂的识别；二是KRAS对核苷酸GTP亲和力极强，相对一般激酶（Kinase）的纳摩尔级别结合亲和力， KRAS与底物皮摩尔级别的结合亲和力是非常高的。药物很难与GTP竞争，难以结合KRAS蛋白并抑制其活性。K-RAS 突变是人类癌症中最常见的致癌驱动因素之一。虽然 G12C 突变体的小分子抑制剂已经成功开发，但对其他 KRAS 热点突变体的等位基因特异性抑制仍然具有挑战性。作者 | 阿卜2022年8月24日，加州大学旧金山分校霍华德休斯医学研究所Kevan M. Shokat教授团队在JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY(JACS)期刊上发表了题为Chemoselective Covalent Modification of K-Ras(G12R) with a Small Molecule Electrophile的文章。作者以K-RAS(G12C)抑制剂（MRTX849）的结构为母核，引入能够共价靶向精氨酸的双酮酰胺结构，成功开发出K-RAS (G12R)共价抑制剂。doi: 10.1021/jacs.2c05377K-Ras(G12R)的共价化学配体的发现在生理 pH 值下，精氨酸的胍基团(pKa3 = 12.5)完全质子化具有弱亲核的。为了实现突变精氨酸的化学选择性靶向，作者首先考虑了优先与胍或脒反应的官能团，设计合成的化合物 3 具有 α,β-二酮酰胺。当将 100 μM 化合物 3（分子量 = 674 Da）与重组 K-Ras（G12R）·GDP（GDP = 鸟苷二磷酸）在 pH 7.5 和 23 ℃下孵育并通过完整蛋白质质谱监测反应时，观察到形成两种新的蛋白质种类，其分子量与化学计量共价加合物一致，损失一或两个当量的水（分别为 +656 Da 和 +638 Da，图 1C）。作者假设该反应的产物包括与 Arg12 的咪唑啉加合物及其脱水产物（图 1B），尽管它们的化学特性仍有待确定。图一化合物3的合成及性质研究化合物3对精氨酸的选择性在pH7.5下延长孵育后，化合物3未修饰野生型 (WT) K-Ras·GDP（图 2A, 2B），证实了其与Arg12的特异性。化合物3与K-Ras(G12R)·GppNHp (K-Ras突变位点是G12R，并且含有GppNHp这样一个GTP水解酶) 的反应要慢得多，72 小时后修饰 <5%（图 2A）。该反应依赖于 pH 值，并且在 pH 值 6 时速率大大降低。反应速率在 pH 值 8 时达到最大值，并且在pH值9时没有进一步增加（图 2C）。与未修饰的 K-Ras(G12R)·GDP 相比，K-Ras(G12R)·GDP·3 加合物的热稳定性显着提高（图 2D），熔融温度提高了 9.1 摄氏度。图二探究化合物3的特异性K-Ras(G12R)·GDP·4加合物的晶体结构K-Ras(G12R)·GDP 和化合物4（化合物 3的结构类似物）的共晶，其衍射到 1.7 Å（图3A)，化合物 4 结合在 K-Ras 的 Switch II 口袋中，配体和蛋白质之间的共价键具有明确的电子密度（图 3A）。来自 η 氮的亲核加成也似乎是立体选择性的，因为电子密度清楚地表明叔醇是 S-构型（图 3A，B）。加合物的构象也不同于共价K-Ras (G12C)配体，如 MRTX849（图 3D）：加合物是在远离蛋白质表面的地方形成的，结构中的酰胺羰基不参与氢键与 Lys16 的相互作用。图三 K-Ras(G12R)·GDP·4加合物的晶体结构化合物3对K-Ras的共价修饰探究3和Arg12之间的反应是否会导致K-Ras(G12R) 的功能性抑制，作者测试了未配体和化合物3结合的K-Ras(G12R) 的核苷酸交换活性。化合物3抑制Sos介导的交换并显着降低EDTA介导的交换速率。为了在复杂的蛋白质组中探索精氨酸靶向亲电试剂对K-Ras的共价修饰，利用了K-Ras和3之间的反应后分子量增加（图 4B）。反应性的差异表明化合物3在细胞裂解物中保持活性，但不能与内源性 K-Ras(G12R) 结合。化合物3和4在浓度低于 100 μM 时不显示细胞活性。作者观察到内源性 K-Ras(G12R) 的共价修饰，Ras 带的向上移动证实了K-Ras(G12R) 的主要 GTP 核苷酸状态可以是其治疗靶向的限制因素。这代表了未来优化的机会，要么通过在 GTP 结合状态下识别 K-Ras 的配体支架，要么通过将 K-Ras 转移到其 GDP 结合状态。图四核苷酸交换和共价修饰总结与展望作者使用 α,β-二酮酰胺作为优先的精氨酸反应性官能团，鉴定了 K-Ras(G12R) 的第一个突变体选择性共价配体。发现这些配体与K-Ras (G12R) 产生稳定的咪唑鎓加合物，并使用 X 射线晶体学直接观察到一种此类加合物的结构。他们的工作为靶向该癌基因迈出了重要的第一步，未来的药物化学优化可能会产生针对 GTP 结合形式的更有效的配体。参考文献：[1] Zhang Z, Morstein J, Ecker AK, Guiley KZ, Shokat KM. Chemoselective Covalent Modification of K-Ras(G12R) with a Small Molecule Electrophile. J Am Chem Soc. 2022 Sep 7;144(35):15916-15921. doi: 10.1021/jacs.2c05377. Epub 2022 Aug 24. PMID: 36001446; PMCID: PMC9460778.扫码加入BiG生物创新社读者交流群，分享、交流纯粹的行业知识，非诚勿扰！BiGScientific Driven, Making Impact!创新生态丨医药论坛丨行业分析媒体公关丨BiG Webinar联系我们商务：Max   18662346610媒体：Kathy 17621909690

6月初在美国芝加哥召开的第58届美国临床肿瘤学会（ASCO）年会吸引了3万余名医药行业专家人士参与，我国也有超过50家药企的研究成果在大会上发表。ASCO大会的主角由肿瘤领域的专业医生，以及在此领域投入巨额研发精力的药企研发人员构成，同时也有比如FDA这类的监管机构参与。君实生物在美国的旧金山和马里兰设有两个研发中心，共有全职员工30余名。今年ASCO期间，君实生物高级副总裁姚盛博士和团队里的另外6位同事亲临现场，并且在会议结束后接受医药魔方独家采访，分享了其ASCO现场参会感。姚盛博士见证肿瘤治疗方式的变迁医药魔方：姚博士您好！您大概从什么时候开始关注ASCO的？姚盛：我最早开始关注ASCO应该是2010年，那时候还在学校里做转化医学研究。之所以关注，是因为我当时参与的一个分子标记物（biomarker）的I期研究首次在ASCO报道。这个分子叫MDX-1106，就是后来大家熟知的PD-1抗体药物nivolumab。在此之前，我参与临床会议的频次相对较少，主要是参加像AACR这类偏早期学术性会议。之后每年对ASCO都保持密切关注，一般现场参加，前两年由于疫情只能远程参会。医药魔方：连续参加这么多年，哪一次让您印象最为深刻？姚盛：2010年第一次参加，是让我印象最深、记忆犹新的一次。因为在此之前，虽然免疫检查点抑制剂，比如针对CTLA-4的ipilimumab已经在ASCO上披露过几次，但针对PD-1的免疫检查点抑制剂是首次报告。一些企业大概也是听到2010年的那个报告后启动PD-1抗体项目，2014年niovlumab和pembrolizumab陆续获批。2014年被行业普遍视为“免疫治疗”开启的元年。比较巧的是，我也是在2014年年初加入君实生物的，此后我和同事每年都会参与ASCO。从2014年到2021年，免疫治疗相关内容几乎每年在plenary session（全体大会报告）占重要部分，年年都有重磅的III期临床试验结果披露，我们去年就有一项鼻咽癌国际多中心III期研究（JUPITER-02）入选。总的来说，这八年间用“免疫治疗大爆发”来形容也不为过。另外，我们还观察到一个小现象。其实在2014年之前，ADC药物也曾掀起研发热潮，但是这股热潮很快就过去了，或者说被免疫治疗的光环盖过了。而到了今年，靶向治疗和ADC又重回ASCO热门报道了。医药魔方：回过头来看，参会心态发生了哪些变化？姚盛：连续关注了ASCO十多年来，个人心态确实发生了比较大的变化。2010年首次关注时，ASCO对我来说是一个新鲜事物，是每年一次的全球肿瘤界医疗和制药领域重磅的年度盛宴。参与的前几年主要以学习为主，有很多高度期待的临床试验，其中有惊喜，也有遗憾，尤其是看到那些经过多年努力最后不得不以失败告终的试验。整体上能很明显感受到，在业界的共同努力下，这十多年来肿瘤治疗方式发生了翻天覆地的变化。各类肿瘤患者的生存期因治疗方式的变革而不断提升，比如2010年之前，晚期黑色素瘤治疗后的总生存期（OS）基本在一年左右，免疫治疗开始应用之后，实现五年生存的患者变多，肺癌的OS也至少翻了一倍。同时也看到不少技术和疗法的兴替，比如像ADC，研发似乎也有一定的周期性。医药魔方：您的团队今年去ASCO现场的情况？有哪些参会任务？姚盛：君实生物目前在美国设立了两个研发中心，主要覆盖了从药物早期发现开发到后期的临床阶段工作，全职员工一共有30多人，此外临床和注册工作还配置了大量的顾问。今年，我们美国团队一共有7位同事现场参与ASCO年会，主要是肿瘤医学、临床运营、转化研究、注册这几个职能构成的。不过今年与往年相比情况特殊，ASCO自疫情以来首次开放了线下参会。由于国内研究者无法来到现场，我们同事承担了20多项壁报的讲解和交流任务，我几乎都抽不出时间听其他报告（笑）。除了特瑞普利单抗，我们今年也有一款全球first-in-class BTLA在研产品icatolimab在大会上发布了两个壁报。从fast follower，到现在真正能做出自己的first-in-class，这是中国创新药发展进步的一个“缩影”，我们也感到很自豪。医药魔方：就现场参会感受来讲，今年有哪些不一样的体会？姚盛：个人感觉恢复线下会后，无论是口头报告还是壁报讨论，还是很火热的。医生们也很高兴，终于有机会面对面地和壁报作者进行讨论。人流量要比往年多，ASCO官方也披露参会人数超过疫情前的任何一年。如果中国研究者能够来，这个数量还会增加很多。往年一般来ASCO参会的都是研究型肿瘤医生，今年有个创纪录的是，有大量社区型肿瘤医生（community physician）来参会。可能是ASCO大会做了相关的宣传工作，弥补了国际参会的不足吧。国外社区医院跟国内差不多，一般只是看病，确实也没有时间精力来做研究或者说重心不在研究上。这次ASCO参会，感受到社区型医生的关注度更加前置：以前他们主要关注有什么上市药品可以用，现在他们会关注这些药物在其他瘤种上的应用，同时在新药开发的早期阶段就有一定关注。免疫治疗渐成标准，靶向治疗热潮重回医药魔方：免疫治疗今年没有进入大会主题报告，但是ADC似乎突然“火”了？姚盛：对。今年大概是十年来首次没有免疫治疗III期试验入围plenary session，相对比较沉寂。这些年来，我们看到免疫治疗的治疗基线不断前移，已经逐渐实现了从末线、一线、辅助、新辅助的转变过程；同时也是从单药到化疗，和标准疗法联合，以及到新的疗法联合的转变。可以说，免疫治疗已经成为“璀璨的星星”，变成大家都接受的，甚至像传统放化疗一样的标准治疗了。今年的“头条位置”让给了其他新兴疗法，不仅仅是ADC药物，而是整个靶向治疗再次成为热点，这点感受还是很强烈的。医药魔方：为什么ADC能够重回热潮？姚盛：ADC虽然在2014年之前热过一阵，但直到2020年只有T-DM1一款药物获批。最近两年才陆续有了几款ADC上市。之前批的少，主要是它的毒性瓶颈没有被克服。在过去，ADC技术还未成熟的情况下，在很多靶点上无法达到很好的长期遗留效果，即使产生了一定效果，也很快产生耐药，或者对正常组织的毒性太大，无法继续用药。这次的ASCO上，HER-2 ADC取得了很大的成功。是否能延伸到所有靶点还有待验证，不过这一结果证明有这种可能，因此ADC又焕发青春了。医药魔方：除了DS-8210之外，还看好哪些ADC开发？姚盛：随着科学家们在有效载荷、连接子以及旁观者效应（bystander killing）研究上的积累，使得行业对ADC设计上的认知发生了变化。DS-8201的开发，改变了大家对HER-2靶点的认知，同时还将带动后面一系列ADC药物的发展。Nectin4 ADC在获批之后，现在头一次在免疫和化疗耐药UC患者里，对比化疗显示出了OS优势，这也是很重要的一个进展。咱们国产的HER-2 ADC RC-48也在HER-2（1+）也就是HER-２低表达的尿路上皮癌显示很好的疗效，这跟DS-8201在HER-2（1+）的乳腺癌里的表现有点异曲同工。采用叶酸受体的ADC治疗卵巢癌也取得了有进一步结果。所以ADC，我觉得今年还是比较闪亮的。另外，如果从瘤种角度分析，今年是乳腺癌的大年，多个研发药物都是在乳腺癌领域取得成效。除了三阴性乳腺癌外，乳腺癌的十年生存期已经提高到90%以上，随着HER-2，HER-3 ADC，TROP-2 ADC新疗法发现，这一数字还将继续提升，并且让乳腺癌患者在一线二线失败之后，有了更多更好的治疗方法。医药魔方：您当时在DS-8201报告现场吗？除此之外，还有哪些让您印象深刻？姚盛：我在现场。今年的plenary session DS-8201算是最亮眼的，大家都起立鼓掌了。这个研究确实很大地扩展了HER-2靶向治疗的获益人群。另外我印象比较深的，报道得比较多的还有一个研究，秦叔逵教授领衔的III期研究用EGFR抗体尼妥珠单抗联合化疗治疗K-Ras野生型胰腺癌对比化疗，有了显著的OS提升。我觉得这个还是挺受关注的，因为胰腺癌确实一直没有好的治疗方法，尤其是OS提升方法，非常非常稀缺。虽然K-Ras野生型只是一小部分人群，但确实是给这部分人群探索出一条新的延长生命的方法。这虽然是个纳入纯中国患者的研究，但是在现场还是挺受关注的。今年其他小分子靶向治疗也是蛮多的。比如说第二款KRAS G12C抑制剂（Mirati公司），也显示出不差于Amgen的KRAS抑制剂的疗效。还有多个EGFR抑制剂，比如专门针对exon-20插入突变的EGFR抑制剂，EGFR/cMet双抗，都显示出进一步疗效。另一方面，FGFR抑制剂在胆道肿瘤的结果也有进一步明确。医药魔方：就像您说的，除了HER-2靶点新的应用场景，大家可能也在考虑其他靶点是否可行。您觉得需要考虑哪些点？姚盛：根据目前的研究，业界逐渐达成了一个共识，一款好的ADC药物可能需要旁观者效应，这跟以前的概念有所区别。相应的，检测方法也需要跟上配套。HER-2表达药物的市场最大，目前也取得了成功。但是，ADC的治疗窗很大程度上是由靶点在肿瘤组织和正常组织表达差决定的。每个靶点都需要单独评估，每个ADC都有它的复杂性。并且跟精准诊断技术的提高也有关系。你能不能找到合适的人群？能否找到合适的伴随诊断试剂盒也会直接影响临床研究的最终结果。联合疗法是大势所趋医药魔方：DS-8201的最新临床试验结果披露后，对您们研发开展有何启示？姚盛：我认为靶向治疗因为它低毒精准的特点，现在技术上又解决了细胞毒性问题，接下来5到10年都会是热点。靶向疗法的治疗窗有很大的想象空间。以前认为ADC药物有毒性限制，首先成药就是非常难的，其次应用也会比较有限。回过头看，可能还是技术层面的不成熟。现在ADC找到了一个相对低毒有效的剂量，只要正常组织和肿瘤组织有差别，基本就有成药可能。这个（研究）之后，业界对整个ADC领域所有靶点都会再捋一遍。根据新的概念，以前认为不能靶向的，现在又能靶向了。所以对于整个靶向治疗的影响还是比较大的，存在一系列的机会。君实从5年前开始也开发了自己的ADC平台，在这个领域有了长足的进展。我们的Claudin18.2 ADC已经进入临床，Nectin4等一些其他的ADC也会逐渐进入临床。同时与我们成熟的免疫治疗结合开发联合治疗，我们觉得这个领域还是有很大发展前途的。医药魔方：ADC具备跟免疫疗法联合的潜力吗？姚盛：ADC相当于定向化疗，针对特定单一的肿瘤抗原或者肿瘤靶标。几乎所有ADC都很难避免诱导耐药的问题，因为它把阳性细胞都杀光了，最后的阴性细胞或者耐药细胞就会长出来。尤其是早些年开发的ADC出现逃逸突变的概率特别高，后来开发出有“旁观者效应”的ADC后，这种逃逸就没那么快，但是基本上用一段时间还会出现。从机理上看，免疫治疗与ADC结合的优势很明显。ADC的定向化疗功能起效块，可以大量减瘤负荷，释放出很多肿瘤抗原，再利用免疫治疗调动机体多维度靶向的免疫反应，产生长期免疫记忆，肿瘤产生逃逸的可能性变小。尤其今年ASCO上就有两个例子：RC-48联合特瑞普利单抗，Nectin4 ADC联合帕博利珠单抗，均在一线UC治疗领域取长补短，获得了非常可观的效果，目前都进入了III期阶段。所以ADC和不同免疫治疗药物联用，都有可能取得协同增效的结果。相信未来还会看到更多其他靶向治疗和免疫治疗的联合。医药魔方：最近整个资本市场的行情其实并不是太理想，对一些需要持续融资的biotech可能也不太友好。您觉得接下来怎么去突破这个寒冬，或者会有哪些标志性的事情？姚盛：我觉得现阶段可能对于follower来说是一个寒冬。要是企业没有找出很好的，有独特性的新药，很难吸收到进一步的资本投资了。另外一个，国内资本寒冬可能还是因为国内医疗市场没有预先想得那么多，开拓海外市场非常重要。所以一个企业想要发展，海外的拓展以及对于新的治疗方法和手段的开发都很关键。国内的药物研发经过近5年到10年，基础架构已搭建得相对完善，咱们有研发first-in-class药物和生产的能力了。中国做出全球first-in-class药物只是一个时间问题。健康是永久的话题。我还是很看好这个行业的发展。当然，周期性的调整，行业内的优胜劣汰都是难免的。单纯做follower确实机会不大，所以一定要从全球着眼，要做first-in-class治疗药物或治疗手段。这是必须的。推荐阅读：再鼎医药陈娅静：人才国际化是双向流动的蔡家强：中国创新药行业发展才刚刚开始，未来还很长强静：浮躁是FIC最大的敌人，真正的科学创新需要长期主义