近日，诺华在药物化学权威期刊JMC上发表了一篇题为《Lead Optimization of Multimutant KRAS Switch-II Pocket Macrocyclic Inhibitors via Isosteric Replacement to Improve ADME and Oral Exposure》的研究论文。该团队针对先导化合物BRSD-143(1)的代谢瓶颈，通过精准生物电子等排替换策略，在保持多突变KRAS抑制活性的同时，系统优化了成药性。
图文摘要
01
INTRODUCTION
研究背景
KRAS是癌症中RAS家族最常见的突变基因，其G12、G13和Q61位点突变在胰腺癌、结直肠癌及肺癌中广泛存在；尽管靶向KRAS^G12C的共价抑制剂已获批上市，但针对KRAS^G12V、G12D和G13D等突变的治疗需求依然迫切。通过稳定配体构象以强化SwII口袋内多重相互作用的大环化策略，是当前开发多突变KRAS抑制剂的关键手段。作者团队此前发现的先导化合物1（BRSD-143）对多种KRAS突变具有高亲和力，并在小鼠肿瘤模型中表现出良好的体内疗效，然而代谢物鉴定显示其2-氟吡咯啶易发生氧化代谢、萘酚则易遭遇葡萄糖醛酸化清除，导致大鼠和犬的口服药代动力学性质不佳，使其只能局限于早期小鼠模型研究；此前对哌啶和萘酚基团的修饰亦未能实现活性与ADME性质的平衡。基于上述背景，本研究采用生物电子等排替换策略，以等排体分别取代2-氟吡咯啶和萘酚基团，旨在保留靶标亲和力的同时规避代谢缺陷、改善口服暴露。
02
RESULTS AND DISCUSSION
①化合物1优化中的关键性质与特征
先导化合物BRSD-143(1)通过氨基甲酸酯与Gly10形成双齿相互作用、质子化2-氟吡咯烷与Glu62形成盐桥、以及萘酚羟基与Asp69形成氢键，实现对KRAS SwII口袋的高亲和力结合，但其ADME性质存在明显缺陷：MDCK渗透性为15.4×10⁻⁶ cm/s，人/小鼠/大鼠/犬肝微粒体固有清除率分别为338、542、491和535 μL/min/mg蛋白，小鼠口服生物利用度仅13%，大鼠仅0.3%，犬为8.7%；代谢物鉴定揭示2-氟吡咯烷易发生氧化代谢，萘酚则面临严重的葡萄糖醛酸化清除，因此优化策略聚焦于以生物电子等排体分别替换这两个基团以改善口服暴露。
②吡咯烷氮杂双环辛烷替换的构效关系
以氮杂双环[4.2.0]辛烷（ABO）替换2-氟吡咯烷的系列衍生物中，化合物6保留亚纳摩尔级TR-FRET活性但MDCK渗透性仅0.63×10⁻⁶ cm/s，N-甲基化产物7渗透性改善至5.37而微粒体稳定性下降，4-氟代ABO非对映异构体8–11中9和11活性较好但整体ADME性质不佳，3-甲基ABO（12）和氧杂ABO（13）兼具强效细胞活性与改善的渗透性（分别为22.9和32.3×10⁻⁶ cm/s）且12的代谢稳定性优于13，三环四氢咪唑并吡啶14虽活性良好但代谢稳定性差，由此确定化合物12为在靶标亲和力、细胞效力、渗透性和代谢稳定性间最平衡的候选化合物。
③化合物12与GDP状态KRAS^G12V结合的X射线共晶结构
X射线晶体学分析显示，化合物12与GDP状态的KRAS^G12V结合时（PDB: 12FG），ABO基团与Glu62残基形成盐桥，同时完整保留了氨基甲酸酯与Gly10的双齿相互作用以及萘酚羟基与Asp69的氢键相互作用，从结构上证实ABO可作为2-氟吡咯烷的有效生物电子等排体。
④化合物12的体外ADME与临床前PK特征
化合物12在人、小鼠、大鼠和犬肝微粒体中的固有清除率分别为357、290、312和468 μL/min/mg，小鼠口服给药（3 mg/kg）AUC为695 h·nM、生物利用度23%，大鼠口服无生物利用度，犬为8.9%；大鼠静脉给药表观清除率异常高可能源于给药后药物沉淀导致的暴露量低估，而腹腔给药AUC约3180 h·nM且清除率与微粒体预测值一致，肠道S9实验显示跨物种葡萄糖醛酸化代谢显著，尤以大鼠最为突出，表明该通路仍是限制口服暴露的主要因素。
⑤化合物1与12在异种移植模型中的抗肿瘤活性
体内药效学研究表明，在RKN模型中化合物12以1 mg/kg给药实现33.6%肿瘤生长抑制、以3 mg/kg给药实现41.2%肿瘤消退，略低于化合物1在3 mg/kg时的约56%消退，而在SW1990模型中两者以30 mg/kg每日两次给药时肿瘤生长抑制水平相当，且所有治疗组均耐受良好、未观察到体重下降。
⑥吲唑生物电子等排体的构效关系
以吲唑替换萘酚的系列衍生物中，采用17元大环的原型化合物20对KRAS^G12V GMPPNP的IC₅₀降至281 nM且细胞活性丧失（RKN和SW1990均>500 nM），缩减为16元大环并引入氯原子得到21后TR-FRET活性显著恢复（GMPPNP IC₅₀为5 nM）但细胞活性仍较1大幅降低（RKN 76 nM，SW1990 27 nM），进一步将2-FP替换为ABO得到22和23后细胞活性进一步下降；量子力学计算显示吲唑NH的pKa（约12–13）显著高于萘酚OH（8.3），导致氢键供体能力减弱，这解释了细胞活性降低的原因。
⑦化合物20与GDP状态KRAS^G12V结合的X射线共晶结构
化合物20与GDP状态的KRAS^G12V共晶结构（PDB: 12FF）显示，其结合模式与此前类似物一致，吲唑NH与Asp69形成氢键的几何构型与化合物1近乎相同，从而支持活性损失主要源于电子效应导致的氢键强度减弱，而非结合构象差异。
⑧化合物1与21在RKN异种移植模型中的抗肿瘤活性
在RKN异种移植模型中，化合物21以10 mg/kg给药仅实现56.5%的肿瘤生长抑制（%T/C），未能达到化合物1在3 mg/kg时约54%的肿瘤消退水平，且两者均耐受良好、无体重下降，表明尽管21的PK性质改善，但其细胞活性的显著损失仍导致体内抗肿瘤疗效不足。
代谢物鉴定研究比较了三种化合物在大鼠肝细胞及肠道S9中的代谢命运，结果显示1和12均产生大量葡萄糖醛酸化代谢物（M+176峰面积分别为1.37×10⁸和1.01×10⁷），而21低于定量限；在大鼠肠道S9中，1和12在UDPGA存在下表现出高固有清除率（277 μL/min/mg），而在NADPH条件下均低于6 μL/min/mg，21在两种条件下均稳定（低于6），证实吲唑替代酚羟基可有效规避葡萄糖醛酸化介导的首过代谢清除。
图片来源：ACS
⑨化合物21的小鼠与大鼠PK总结
药代动力学研究证实，化合物21在小鼠口服给药（3 mg/kg）后AUC为2660 h·nM、生物利用度77%，大鼠口服给药（2 mg/kg）后AUC为3320 h·nM、生物利用度41%，体内清除率在小鼠和大鼠分别为22和6.3 mL/min/kg，分布容积分别为2.4和1.34 L/kg，表明通过吲唑替换消除主要葡萄糖醛酸化清除通路后，口服暴露量和生物利用度较1和12实现了显著提升。
图片来源：ACS
总结与展望
过去二十年间，随着发现SwII口袋可通过与半胱氨酸发生共价反应来靶向KRASG12C，RAS靶向研究持续加强；然而，针对G12D、G12V和G12S等其他KRAS突变、通过结合该口袋调控RAS信号的配体研发进展有限，迄今鲜有分子推进至I期以后，主要难点在于难以获得兼具强效靶标抑制与能提供持续暴露时间以驱动肿瘤消退的药代动力学性质的分子。本研究通过解决2-氟吡咯烷和萘酚官能团的代谢缺陷来优化化合物1的性质：利用光诱导[2+2]环加成反应构建的新型ABO砌块获得了包括化合物12在内的新先导，其在体外和体内与其2-氟吡咯烷同类物展现出可比的活性；而以吲唑替换萘酚虽显著改善了药代动力学性质，却未能在该系列中重现等效活性，且尚不足以支持在未进一步优化的条件下开展深入体内研究。综上，通过SwII口袋实现突变KRAS肿瘤最大程度消退的门槛极高，而能够调控RAS ON状态的药物似乎更具前景，可能成为下一代RAS靶向疗法。
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https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c01454
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