C-049

靶向半胱氨酸（Cys）的共价药物在癌症治疗中取得了巨大的成功。其中知名的分子包括靶向EGFR用于治疗非小细胞肺癌的奥西替尼（osimertinib）以及靶向BTK用于治疗B细胞淋巴瘤的伊布替尼（ibrutinib）。然而，这些药物在不同的肿瘤亚型中的表现差异很大。这意味着同一个半胱氨酸在不同的肿瘤细胞中可能有着不同的活性。而揭示半胱氨酸在不同肿瘤细胞中的活性差异，将有助于共价药物的理性设计。针对此，来自哈佛医学院的研究团队对25种肿瘤亚型的416支细胞器进行了基于活性的蛋白质组分析（Activity-Based Protein Profiling, ABPP）。具体而言，如下图A所示，首先使用三种广谱性较好的弹头KB02、KB03和KB05与细胞中的Cys反应。高活性的Cys会被弹头结合而低活性的不会。然后，使用DBIA去结合未反应的Cys。进而，通过富集与质谱分析，可以反过来推导各个Cys的反应活性。研究人员对高活性的Cys进行富集分析，发现在蛋白家族层面，微管结合蛋白的Cys往往具有高活性；从通路层面，Rho GTP酶通路上蛋白的Cys往往有高活性。不过，Cys活性和蛋白质的氨基酸丰度没有明显关系。此外，他们也发现，例如在PIK3CA·C301中，其活性在不同细胞系间有显著差异。他们将Cys的活性数据及其在蛋白家族、结构域与通路的分析结果总结成DrugMap数据库，并开源在网站上（drugmap.net）（上图B-G）。之后，研究人员对DrugMap进行了更深入的分析。首先，构建了一个深度学习模型，以一个Cys的结构描述符与附近氨基酸分布作为输入，预测该Cys能否与KB03结合。最后模型的AUC约为0.7，这表明Cys的局部结构特征与Cys活性相关（上图A-C）。为了进一步探讨这种相关性，他们对结构特征进行了富集分析。结果表明，满足中度裸露的、处在α螺旋或PPI界面上的、附近有碱性氨基酸的以及处在蛋白质口袋中的Cys有更高的活性（上图D-N）。在所有的Cys中，有些Cys在任何细胞系中都保持高活性，而另一些Cys在一些细胞系中活性高，在另一些细胞系中则活性低（上图A-B），后者所在的蛋白往往和细胞内的氧化还原机制相关（上图C）。基于此，他们先向K562细胞内加入还原剂tmTECP，发现Cys活性的分布显著右移；通过调节氧化还原通路来调节细胞内的氧化还原环境，发现加入KI696（提升抗氧化的NRF2的表达）或加入DOXY（减少细胞内过氧化氢的含量）会使得Cys活性的分布右移，而加入BSO（减少抗氧化的谷胱甘肽）或Piercidin A (提升NADH/NAD)均不会使得Cys活性的分布发生显著变化。（上图D-E）。上述结果表明，Cys的活性于细胞的氧化还原状态有关，并且不同的Cys的活性可能是收到不同氧化还原通路所调控的。他们还进一步给出了一个例子。例如，基因KEAP1的突变会提升NRF2的表达，进而提升细胞环境的还原性。事实上，发生该基因突变的细胞系中，多个Cys的活性发生显著变化（上图G-H）。不同的肿瘤细胞的氧化还原环境差异很大，这样进一步强调了分析不同肿瘤细胞Cys活性的重要性。进而，他们研究了蛋白质构象与Cys活性的关系。首先计算了同一个蛋白上，两两Cys，活性在不同细胞系上的相关性（这种相关性可能和蛋白质构象变化相关，即构象变化会协同影响多个Cys的活性）。这一计算发现，高度相关的Cys有着一些相同的特征，例如中等暴露（上图A-B）。在所有Cys对中，研究者注意到相关性最高的，在UGDH上的C64与C112（上图C）。其中，C112处在UGDH的一个构象变化区域附近（上图D）。加入UGDH的变构调节剂UDP-xylose，热稳定性实验表明UGDH的构象发生变化（上图E），而Cys活性测定实验则有解释Cys的活性提升（上图F）。这一结果表明UGDH·C112的活性与UGDH的构象有关。在最开始测定Cys活性的ABPP实验中，先加入弹头，再加入DBIA，会降低DBIA与Cys的结合率。然而，在一些体系中，他们观察到加入的弹头会促进DBIA与Cys的结合（上图G）。他们猜测这可能是因为弹头结合了另一个Cys，使得蛋白构象发生变化，从而促进当前Cys与DBIA的结合（称之为“反向可靶性”）。为了验证这一点，他们选择了反向可靶性出现比较厉害的RACK1蛋白。这个蛋白上有多个Cys，其中除了C182有正向可靶性，其余均为反向可靶性（上图H）。据此，他们推测弹头与C182结合后，会引起蛋白质构象变化，使得其与Cys更容易与DBIA结合。他们通过热稳定性实验验证了这一猜想（上图I-K）。此外，他们通过将已报道的，会引起构象变化共价药物加入蛋白中，发现也会引起其他Cys反应活性的变化。据此，可以看到Cys的活性受蛋白质构象调控（上图L-M）。接着又研究了点突变与Cys活性的关系。他们首先研究了Cys活性与相关基因表达量之间的关系，发现有些Cys的活性（如ACTL8·C197和AGO3·C238）与表达量线性相关，但总体上确没有很强的相关性（上图A）。不过，他们发现Cys的活性与该蛋白的突变压力有很好的线性相关性（上图B-C）。这表明Cys活性可能与附近的点突变相关。他们寻找了其中一个例子。例如在PRDX5中，在发生突变的HCC1395细胞系中，其Cys活性会远高于未发生突变的其他细胞系（上图D-F）。在分析完DrugMap中的规律后，他们进一步挑选了DrugMap中活性高、表达量多且重要的两个Cys靶标（上图A-B）开展药物设计。在NFκB1靶标上，他们用先前的ABPP方法筛选了一个4000+的商业Cys弹头库，从中筛选出了苗头化合物SH-7346。该苗头化合物相比另一个苗头化合物SH-6484有着更好的Cys选择性。苗头化合物被进一步改造为先导化合物SH-1696（上图C-D）。通过点突变实验、质谱检测与晶体，他们验证了SH-1696的确与NFκB1·C61结合（上图E-G）。SH-1696能抑制肿瘤细胞增殖，其IC50为4.916 μM。从机制上，SH-1696能显著降低NFκB1相关基因的表达（上图H-J）。在SOX10靶标上，研究人员通过U257细胞的增殖表型，对1000个Cys弹头的库进行筛选，最终获得了苗头化合物2-A01，并进一步改造为先导化合物SH-0029，其抑制增殖的IC50为11.85μM（上图E-F），并通过点突变实验验证了SH-0029与SOX10·C71结合（上图G）。有趣的是，虽然有着不错的IC50，SH-0029与SOX10·C71的结合程度并不高（上图H）。由于SOX10·C71位于PPI位点附近，他们采样SH-0029是通过影响PPI作用来调控蛋白的。对次，作者进行了排阻色谱实验与Co-IP实验，发现SH-0029能促进SOX10二聚化，从而抑制细胞的增殖表型（上图I-K）。进一步发现SH-0029可以广谱抑制51种肿瘤细胞系的增殖。RNA-Seq实验表明SH-0029能抑制增殖相关基因的表达。综上，本文通过大量的ABPP实验，构建了Cys在不同肿瘤细胞亚型中的活性变化（DrugMap），并据此总结出了Cys活性与局部结构特征、细胞内氧化还原状态、蛋白质构象以及周围点突变的存在相关。作者挑选了DrugMap中的两个靶点（NFκB1·C61与SOX10·C71），并进一步筛选和改造出了全新的共价抑制剂，能显著抑制肿瘤细胞的增殖。本文也为未来靶向Cys的共价肿瘤药物的设计提供了新的思路。参考文献Takahashi M, Chong HB, Zhang S et al. DrugMap: A quantitative pan-cancer analysis of cysteine ligandability. Cell. 2024 Apr 17:S0092-8674(24)00318-0. doi: 10.1016/j.cell.2024.03.027. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓