LDLR/TF

天下风云出我辈，一入江湖岁月催；皇图霸业谈笑间，不胜人生一场醉。提剑跨骑挥鬼雨，白骨如山鸟惊飞；尘事如潮人如水，只叹江湖几人回。话说自从8年前安进公司将赛诺菲和再生元公司告上法庭起，关于PCSK9靶点的抗体药物专利大战愈演愈烈，从美国打到欧洲，又从欧洲打到日本，从地区法院打到联邦法院，又从联邦法院打到最高法院。围绕PCSK9靶点的抗体专利之争甚至改变了美国对于抗体专利授权的标准，让USPTO修改审查指南，这一仗可谓惊天地泣鬼神。然而，2021年一款针对PCSK9靶点的新药横空出世，让安进公司、赛诺菲和再生元公司感受到了森森寒意。这款新药却不是抗体药物，而是RNAi药物。2021年，诺华在欧盟率先推出siRNA降血脂长效疗法Inclisiran。该药通过RNAi抑制肝脏PCSK9的合成，给药频率比抗体更低，每年只需两针，便能持续降低低密度脂蛋白胆固醇水平。2022年，Inclisiran进入美国市场，销售额增速迅猛。仅2022年第一季度，Inclisiran的收入就已超过2021全年的表现。2022年全年更是达到1.12亿美元。GlobalData预测，Inclisiran到2027年，销售额有望达到25亿美元。Inclisiran有望成为有史以来最成功的RNAi药物。其横空出世带动了一波RNAi药物研发的热潮。Inclisiran是首款降低LDL-C的RNAi疗法，通过靶向肝细胞受体ASGPR的GalNAC配体递送到细胞内，降解PCSK9的mRNA，从而减少PCSK9的产生，进而减少LDLR被PCSK9结合造成的内吞降解，最终更多LDLR可以结合内吞LDL-C，达到降低血脂的效果。Inclisiran的作用机理如下图所示：Circulation Research Vol. 120, No. 7 A New Approach to PCSK9 TherapeuticsInclisiran由RNAi的头号玩家Alnylam公司最早开发。在小核酸药物江湖可以说，“为人不识Alnylam，便称英雄也枉然”。在Inclisiran的分子设计上，Alnylam应用了其Enhanced Stabilization Chemistry（ESC）技术，并结合了其特色的GalNAc递送平台。Inclisiran是一种完全化学稳定的双链RNA，靶向 PCSK9 mRNA的3'UTR。Inclisiran药物分子的结构示意图如下所示：CliniExpert • 2020/08/18从Inclisiran药物分子的结构可以看出，所有RNAi药物背后的专利壁垒主要来自于：序列，化学修饰和递送系统三个方面。首当其冲的是RNAi的底层序列专利壁垒。RNAi概念的首次提出是在1998年，Andrew Fire（华盛顿卡内基研究所，Carnegie Institution of Washington ）和Craig Mello（马萨诸塞大学医学院，University of Massachusetts Medical School）首次在秀丽隐杆线虫中发现了RNAi的现象并在Nature上发表了Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans的文章。目前这篇文章的引用次数已经上万次，而Andrew Fire和Craig Mello也因为这篇文章获得了2006年的诺贝尔奖。Craig Mello和Andrew Fire所在的马萨诸塞大学（THE UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS）和华盛顿卡内基研究所（THE CARNEGIE INSTITUTION OF WASHINGTON）在1997年12月提交美国优先权专利申请US60/068562，后于1998年提交正式申请和PCT国际专利申请PCT/US1998/027233，该专利家族是RNAi领域的基础核心专利，称之为Carnegie专利族。基本上所有跟RNAi相关的方法都落入其保护范围，但是当时Fire和Mello发现长度为25个或更多核苷酸的 RNA 分子可以引发免疫反应，从而使其不适合临床使用，于是马萨诸塞大学和华盛顿卡内基研究所没有自己开发药物，而是将这个专利家族采用普通许可的方式广泛许可给RNAi领域的各个药物开发公司，包括后来的Alnylam公司（2002年许可）和其早期主要竞争对手SiRNA公司（2003年许可）。这个专利族在中国没有同族专利申请。这个专利族在2018年前后到期。当时正在马萨诸塞大学即将完成博士后工作的Phil Zamore，看到Craig Mello发表的论文后，毅然决然将自己独立以后的研究方向定为了RNAi领域。两年后，2000年Zamore与MIT著名教授Phil Sharp、Dave Bartel（Whitehead研究所）和Tom Tuschl（当时在马普研究所）在Cell杂志上共同发表了一篇论文，他们在果蝇体外系统中使用化学合成的具有3’突出端的21和22nt RNA介导序列特异性mRNA的降解，表明靶向步骤可以与dsRNA的加工步骤分离，并将这种短的RNA定义为siRNA，可以避免长dsRNA引发的非特异性干扰素反应，从而可以应用于疾病治疗。这篇论文的引用次数也达到了四千多次。基于这个发现，RNAi领域正式步入了siRNA药物时代，从而可以真正开发能用于临床的RNAi药物。同年这四大天王提交了美国优先权专利申请US60/193594，并于2001年提交国际申请PCT/US2001/010188，这就是后来称之为Tuschl I专利的专利家族。Tuschl I专利族实际上由UMass、Max-Planck-Institute、MIT和Whitehead Institute四家共有。在此基础上2002年，四大天王作为共同创始人成立了Alnylam公司。但是，Tuschl I专利最早优先权申请提交仅仅过了不到1年，2000年12月，Max-Planck-Institute的Tuschl等人进一步验证了在人类细胞中使用化学合成的具有3’突出端的并互补配对的21个核苷酸（nt）的siRNA可以诱导序列特异性的 RNAi 沉默。这次Tuschl单独提交了专利申请，并且在中美欧日都获得了授权，这个专利家族称为Tuschl II专利族。Tuschl II专利族由马普研究所和欧洲分子生物学实验室共有。最原始的Carnegie专利族，Tuschl I专利族和Tuschl II专利族，这三个专利族构成了现代RNAi药物研发的最基础的底层专利壁垒，几乎所有的siRNA药物都绕不开这三个专利族。Alnylam通过获得Carnegie专利族的普通许可，合并Kreutzer–Limmer早期专利族的持有者德国初创公司Ribopharma，收购sirna公司等，集齐了RNAi研发所有的底层专利的权益。这种垄断一直持续到2021年，这三个专利族均已经陆续到期退出历史舞台，这为RNAi领域后来者的跟进消除了最大的障碍。不知道国内2021年开始如雨后春笋般出现的小核酸药物公司跟这个原因有没有关系。除了底层专利壁垒，Alnylam还为针对PCSK9靶点的siRNA进行了新的专利布局，其中在美国的布局最为完备和复杂，保护范围覆盖PCSK9靶点的授权有效专利至少包括如下：Alnylam在美国对于Inclisiran的专利布局包括了序列，化学修饰，递送系统的大量专利，想突破其专利壁垒是难度很大的，好在中国的专利布局就没有那么复杂了，目前还有效的主要包括两件授权专利：1、CN104854242B，ZL201380063930.5，PCSK9 iRNA组合物及其使用方法；2、CN108220295B，ZL 201810143112.0，PCSK9 iRNA组合物及其使用方法；其中1号专利是母案，其权利要求1保护一系列靶向PCSK9的化学修饰的siRNA序列：1.一种用于抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9（PCSK9）的表达的双链RNAi剂，其中所述双链RNAi剂包含：(a)由核苷酸序列aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsAfsa（SEQ ID NO:1151）组成的反义链和由核苷酸序列CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfuUfgUf（SEQ ID NO:600）组成的有义链；(b)由核苷酸序列aCfaAfAfAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsAfsa（SEQ ID NO:1246）组成的反义链和由核苷酸序列CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuuuUfgUf(SEQ ID NO:695)组成的有义链；(c)由核苷酸序列aCfaaaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsAfsa（SEQ ID NO:1253）组成的反义链和由核苷酸序列CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfUfUfgUf（SEQ ID NO:702）组成的有义链；(d)由核苷酸序列aCfaAfAfAfgCfaAfaacAfgGfuCfusAfsg(SEQ ID NO:1263)组成的反义链和由核苷酸序列AfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuuuUfgUf(SEQ ID NO:712)组成的有义链；(e)由核苷酸序列aCfaaaAfgCfaAfaacAfgGfuCfusAfsg（SEQ ID NO:1269）组成的反义链和由核苷酸序列AfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfUfUfgUf（SEQ ID NO:718）组成的有义链；(f)由核苷酸序列asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsasa（SEQ ID NO:1369）组成的反义链和由核苷酸序列CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfuUfgUf（SEQ ID NO:818）组成的有义链；(g)由核苷酸序列asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfucuAfgsasa组成的反义链和由核苷酸序列CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgcuuuugu组成的有义链；(h)由核苷酸序列asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfgGfuCfsuAfgsasa（SEQ ID NO:1400）组成的反义链和由核苷酸序列CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfsuUfsuUfsgsUfs（SEQ ID NO:849）组成的有义链；或(i)由核苷酸序列asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa（SEQ ID NO:1387）组成的反义链和由核苷酸序列csusagacCfuGfuuuugcuuuugu（SEQ ID NO:836）组成的有义链；其中该有义链与至少一个配体缀合；和其中a、g、c和u分别是2’-O-甲基（2’-OMe）修饰的A、G、C和U核苷酸；Af、Gf、Cf和Uf分别是2’氟修饰的A、G、C和U核苷酸；且s是硫代磷酸酯键。基于母案授权的权利要求可以看出，其保护的基本上就是一些具体的序列，规避的难度貌似不高。然而这里不得不提Alnylam对于PCSK9项目的开发过程。Alnylam首先开发的是LNP递送版本的PCSK9靶点siRNA产品，但一期临床的结果并不令人满意，2013年与The Medicines Company合作后将递送系统改为GalNAc偶联物，最终形成现在的Inclisiran。Alnylam在开发LNP递送版siRNA产品的时候申请了一些专利，后来放弃了，比如中国的CN102458366B，在2019年因为未交年费而失效。有趣的是，这篇专利的实施例中公开了大量靶向PCSK9的双链RNA序列，不知道会不会破坏在后Inclisiran产品专利CN104854242B （ZL201380063930.5）中要保护的dsRNA序列的专利性呢？国知局发布的口审公告显示，Alnylam的ZL201380063930.5“PCSK9 iRNA组合物及其使用方法”专利被提起无效宣告请求，口审日期定于4月12日。看来，答案快要揭晓了。一 END 一唐华东律师北京植德律师事务所合伙人唐华东律师是北京植德律师事务所合伙人，深耕生命科学大健康领域，在技术和法律服务领域拥有十多年的实践经验，服务过医药生物、医疗器械、化学、化工、材料以及生命科学和食品等诸多行业的客户，能根据行业特点为客户提供有针对性的优质法律服务。唐华东律师曾代表众多业界领先的国内外公司处理各种专利申请和诉讼事务，也为国内外知名投资机构提供知识产权尽职调查服务。唐华东律师领导一支毕业于国内外一流院校的医药专业人才团队，为生命科学大健康领域的知识产权保护、投融资并购、上市重组、争议解决和政府合规等法律事务提供专业和高效的技术和法律支持。唐华东律师擅长从客户商业目的出发，提供具有可操作性的专利战略布局、专利挖掘、专利申请文件的撰写与审查、专利尽职调查、专利稳定性分析、FTO自由实施法律意见、专利无效挑战、专利侵权诉讼等服务。唐华东律师早期曾在国家知识产权局从事专利审查工作并获得高级职称。唐华东律师毕业于清华大学，获得生物化学与分子生物学专业博士学位，在中国政法大学获得法学硕士学位，并有海外访问学者经历。唐华东律师是拥有律师执照、专利代理师执照的双证律师。唐华东律师是中国专利保护协会医药专业委员会委员，清华健康中国同学会理事，世界中医药学会联合会知识产权分委会首届理事。

来自蒙特利尔大学等机构的科学家们通过研究在理解涉及人类心血管疾病和特定癌症发生的机制上又迈出了重大一步，文章中，他们发现了一种特殊的分子机制，即蛋白质PCSK9能降解低密度脂蛋白（LDL）的受体。 近日，一篇发表在国际杂志Molecular Metabolism上题为“Molecular interactions of PCSK9 with an inhibitory nanobody, CAP1 and HLA-C: Functional regulation of LDLR levels”的研究报告中，来自蒙特利尔大学等机构的科学家们通过研究在理解涉及人类心血管疾病和特定癌症发生的机制上又迈出了重大一步，文章中，他们发现了一种特殊的分子机制，即蛋白质PCSK9能降解低密度脂蛋白（LDL）的受体，而低密度脂蛋白是血液中最丰富的胆固醇颗粒。 LDL能在血液中积累并导致动脉粥样硬化和心脏病发生，LDL和与LDL相关的胆固醇（LDLc）的水平能被LDL受体（LDLR）调节从而从血液中收集LDL并将其内化，主要是进入到肝脏细胞中，细胞表面的LDLR能驱动LDL进入到所捕获的细胞中，随后LDLR就能返回到细胞表面进行另一轮捕获。大多数的家族性高胆固醇血症都与LDLR的功能失调有关，但更为罕见的癌症却与PCSK9蛋白相关，PCSK9存在于血液中，其与LDLR相关且能促进其被肝脏细胞所降解，并能预防其返回到细胞表面来捕获LDL，某些高胆固醇血症患者往往拥有超级“PCSK9”，其或能增强LDLR的降解。 科学家识别出关键蛋白调节低密度脂蛋白胆固醇背后的特定分子机制。 图片来源：Molecular Metabolism (2022). DOI:10.1016/j.molmet.2022.101662 近年来，有效的治疗性手段已经能用来抑制患者机体血液中PCSK9的功能（利用单克隆抗体）或减少其水平（利用RNAi技术），从而就导致LDLR的数量更大，并能确保相比常规他汀类药物而言使得LDLc的水平下降60%以上。如今研究人员揭开了此前被误解的机制，即PCSK9能将LDLR拖向溶酶体，而在溶酶体中细胞就能降解PCSK9-LDLR复合体。在实验室中，研究者Seidah等人通过进行结构分析揭示了这三种PCSK9伴侣蛋白复合体的形成过程，即LDLR, CAP1和HLA-C。 作为免疫系统的关键蛋白，HLA-C在其中就扮演着关键角色，其能将整个复合体引向溶酶体，HLA-C还能促进自身的识别，并刺激T淋巴细胞的抗肿瘤活性。PCSK9则能通过增加细胞表面HLA-C的水平来阻断肿瘤的生长以及相关的癌症转移。最终，研究人员希望能开发出新型抑制剂开预防PCSK9和HLA-C之间的相互作用，并阻断PCSK9对LDLR和HLA-C的功能。 这一研究突破有望应用于相应的临床实践，从而治疗心血管病变、多种癌症以及患者机体的癌症转移。综上，本文研究中，研究人员识别出了CHRD-P1.40复合体的三维结构，从而理解了P1.40、CAP1和PCSK9之间错综复杂的相互作用以及其调节LDLR降解背后的分子机制。（生物谷Bioon.com） 原始出处： CaroleFruchart Gaillard，Ali Ben Djoudi Ouadda，Lidia Ciccone, et al. Molecular interactions of PCSK9 with an inhibitory nanobody, CAP1 and HLA-C: Functional regulation of LDLR levels, Molecular Metabolism (2022). DOI:10.1016/j.molmet.2022.101662