BET家族成员BRD4是肿瘤发生发展的重要调控因子。在急性髓系白血病中,异常激活的BRD4定位超乙酰化启动子位点,招募P-TEFb等中介因子,促进MYC、BCL-2等原癌基因的表达,致使癌症进展。第一代Pan BET抑制剂由于剂量依赖毒性,临床推进受限。第二代BET BD2抑制剂通过提升BD2选择性获得了更高的安全性,目前已进入临床用于治疗急性髓系白血病和骨髓纤维瘤。然而,目前所有已报道的BET BD2抑制剂对BRD4同家族每成员BRD2、BRD3和BRDT的BD2结构域不具备选择性。由于抑制BRDT可能引发潜在的生殖毒性;而BRD3被报道在癌细胞中具有独特的抗增殖功能。因此,进一步提升BRD4 BD2亚型选择性是明确疗效,开发下一代BET抑制剂非常有前景的研究方向。近期,中国科学院广州生物医药与健康研究院的许永团队通过理性设计和系统性结构优化,开发了首个BRD4 BD2选择性小分子抑制剂。相关工作以“Discovery of the First BRD4 Second Bromodomain (BD2)-Selective Inhibitors.”为题发表在美国化学会药物化学核心期刊Journal of Medicinal Chemistry上(J Med Chem 2024, ASAP, https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02516)。
作者以课题组前期报道的BET BD2抑制剂XY153为先导分子(J Med Chem 2022, 65, 7, 5760–5799),采用基于结构的药物设计策略进行优化改造。在前期研究中,作者发现在BC通道区域引入空间位阻基团占据由Pro434和His437形成的BD2独有的疏水区域时,能初步提升化合物的BRD4 BD2选择性。基于此,作者推测BET蛋白的BC通道区域是提高BRD4 BD2亚型选择性的关键位点。根据共晶结构模式分析,作者在化合物XY153伸向BC通道的咪唑环2位和4位引入了不同大小的疏水位阻基团来优化分子结构(图1A)。开发获得了首个成药性良好、高结合活性、高选择性的BRD4 BD2选择性小分子抑制剂16o (XY221)。TR-FRET实验中,化合物16o对BRD4 BD2的结合活性为5.8 nM,相对其他BET BD2的选择性为9~32倍(图1BC)。BLI实验进一步验证了化合物16o优异的BRD4 BD2活性及选择性,选择性倍数达66~142倍(图1D)。TSA实验则证明了化合物16o在溴结构域家族蛋白中的优异选择性(图1E)。
图1:(A) 化合物XY153的共晶结合模式分析;(B) 化合物的结构优化过程;(C) TR-FRET实验验证化合物16o和16j的BRD4 BD2选择性;(D) BLI实验确证化合物16o的BRD4 BD2选择性;(E) TSA实验评估代表性化合物14d、16o和17c在溴结构域家族中的选择性
为了探究化合物选择性的结构基础,作者进行了共晶实验获得了化合物16j与BRD4 BD2的共晶结构(图2AB)。共晶结合模式分析表明,化合物16j大致保留了与XY153类似的结合模式,呋喃吡啶酮母核骨架占据KAc区域,与Asn433形成氢键作用,与Tyr390形成水介导的氢键作用。叔醇取代基伸向ZA通道,与Asp381形成氢键作用。咪唑环伸向BC通道,与Asn433形成氢键作用,与His437形成水介导的氢键作用。咪唑环2-位上的大位阻金刚烷基团占据Pro434和His437形成的疏水区域。咪唑环4-位上的小位阻乙基指向Leu385,并且由于乙基的空间位阻效应,分子内的4-氟-2,6-二甲基苯基发生了偏转(图2C),从而由于BD2/BD1的“Val439/Ile146”差异进一步提高了BD2选择性。但是,与已报道的BRD4 BD2多肽选择性抑制剂情况类似,16j-BRD4 BD2和XY153-BRD2 BD2口袋附近的氨基酸残基并没有观察到明显的差异(图2C),无法具体解释化合物16j的BRD4 BD2选择性缘由。作者推测化合物BRD4 BD2选择性的提升可能是由于四个BET BD2结构域与化合物结合的动态构象稳定性差异导致的。化合物16o与BRD4 BD1的共晶结构(图2CD)则揭示了16o在BC通道区域截然不同的结合模式,由于4-甲氧基甲基的引入,咪唑环发生了显著翻转(图2E),从而提升了BET BD2选择性。
图2:(A) 化合物16j与BRD4 BD2的共晶结构(8ZMQ);(B) 化合物16j与BRD4 BD2的静电势表面图;(C) 化合物16j-BRD4 BD2与XY153-BRD2 BD2的晶体叠合图;(D) 化合物16o与BRD4 BD1的共晶结构(8ZM8);(E) 化合物16o与BRD4 BD2的静电势表面图;(F) 化合物16o-BRD4 BD1与XY153-BRD4 BD1的晶体叠合图。
在细胞增殖抑制实验中(图3AB),16o对急性髓系白血病细胞增殖抑制活性较好(IC50 = 0.5 μM),同时对人正常肝上皮细胞的安全性更高(IC50 = 47.7 μM)。抗急性髓系白血病机制研究表明,16o能有效下调凋亡相关蛋白PARP、BCL-2、MCL-1;下调致癌基因MYC及其下游基因p21、ODC1;抑制AKT和AMPK的磷酸化;同时能选择性下调BRD4蛋白水平的表达(图3C)。在mRNA水平,化合物16o能有效下调MYC、p21、BCL-2的转录,对BRD4则没有明显的影响(图3D)。
图3:(A) 部分化合物抗急性髓系白血病MV4-11的增值抑制活性;(B) 化合物16o在多种癌细胞系中增值抑制活性;(C) 化合物10 (ABBV-744)、12 (XY153)、14d和16o在蛋白水平上的调控机制;(D) 化合物16o在mRNA水平上的转录调控。
鉴于化合物16o优异的BRD4 BD2选择性和活性,作者进一步评估了其成药性性质。先前的研究中,化合物12 (XY153)在人肝微粒体中的代谢稳定性不佳(T1/2 = 15 min),表现出种属代谢稳定性差异。令人兴奋的是,化合物16o在人和大鼠肝微粒体中均表现出优异的体外代谢稳定性,T1/2值均大于120 min(图4A)。在PK实验中,化合物16o表现出良好的药代动力学特性,口服生物利用度达13.1%(图4B)。本研究表明,化合物16o(XY221)作为首个BRD4 BD2抑制剂,有望作为小分子探针推动BRD4 BD2相关表观遗传学研究,并为本领域新一代BRD4 BD2选择性抑制剂的研发提供指引。
图4:(A) 化合物16o的体外肝微粒体稳定性实验;(B) 化合物10 (ABBV-744)、12 (XY153)和16o (XY221)的大鼠药代动力学性质。
许永课题组博士后李俊骅、博士后胡清清和硕士生朱润为本论文的共同第一作者,许永研究员、吴锡山副研究员和赵临襄教授为通讯作者。该项目得到国家重点研发计划、国家自然科学基金青年基金、广东省“一带一路”联合实验室基金、呼吸疾病全国重点实验室自主项目、中国科学院青年创新促进会、广州健康院自主部署项目、中国博士后科学基金面上项目、广东省博士后专项基金和广州市基础与应用基础研究青年“启航”项目的支持。
原文链接:Junhua Li#, QingQing Hu#, Run Zhu#, Ruibo Dong, Hui Shen, Jiankang Hu, Cheng Zhang, Xiaohan Zhang, Tingting Xu, Qiuping Xiang, Yan Zhang, Bin Lin, Linxiang Zhao,* Xishan Wu,*.Yong Xu*. Discovery of the First BRD4 Second Bromodomain (BD2)-Selective Inhibitors. J Med Chem 2024, ASAP. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02516.
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