Guanidine Hydrochloride

1.概述 粗蛋白起源于上游过程，其中条件影响蛋白质类型，但下游过程定义了最终产品。治疗产品，如分泌在培养基中的（哺乳动物细胞培养）或微生物细胞生物量或组分，是在发酵后获得的。下游处理涉及从宿主系统中分离、回收和纯化产品。通常，从上游到下游的过渡发生在回收步骤期间，即收获（澄清的上清液或细胞沉淀）。无论表达系统如何，通过离心或过滤实现细胞去除。 本章讨论了培养基收获，这对于生物产品的回收和纯化至关重要，包括对未来趋势的见解。本章主要关注两个最常用的生产系统，大肠杆菌和CHO，概述了这些系统的纯化和产品浓缩策略，然后是药物物质（DS）/药物产品（DP）的最终配方和填充（图11.1）。选择下游处理方法的初始步骤涉及了解蛋白质的特性、稳定性概况以及可能影响其结构的因素。下游处理方案通常包括捕获、中间纯化和抛光阶段（图11.2），每个阶段都有特定的目的。捕获步骤，第一个色谱单元操作，旨在隔离并稳定目标蛋白质，同时去除关键的宿主细胞组分。第二阶段的纯化消除了大多数污染物，如核酸和宿主细胞蛋白；其包含取决于后续的色谱过程和目标蛋白质的纯度概况。最后阶段，抛光，旨在实现最大产品纯度，同时消除与产品相关的杂质，如氧化或去酰胺化物种。选择或组合技术时会考虑目标蛋白质、产品质量和特定要求。下游过程的总体工作流程和目标保持不变：确保产品满足指定的质量属性和纯度概况，建立产品概况，并在过程开发和设计的初始阶段确定关键产品质量属性。纯化和有效回收是上游和整体生物生产过程成功的关键因素。选定的纯化过程需要稳健、可扩展，并能够有效去除或减少与产品和过程相关的污染物，以实现高纯度并确保安全。由于对潜在免疫原性效应或其他由产品偏离人类特性或潜在宿主细胞系统（例如，哺乳动物细胞）污染引起的危险存在担忧，因此维持重组蛋白的严格质量标准至关重要。选择适当的色谱分离方法依赖于目标蛋白质和其他样品中存在的物质的属性差异。色谱法是蛋白质纯化中的基本技术，作为一种高分辨率方法不断发展。传统和先进的技术都利用了蛋白质的物理和化学属性、其互动性质以及产品变体的特性。 图 11.1 重组蛋白纯化下游单元操作概览 图 11.2 三阶段纯化策略 表11.1和图11.3中展示了在各种色谱方法中使用的蛋白质特性示例。在选择树脂时，要考虑动态结合能力（DBC）、产量、质量、宿主细胞蛋白（HCP）去除和纯度等品质。提高生产力和成本效率涉及在不损害总产量的情况下最小化过程数量。相反，下游处理步骤对产品保护至关重要，因此需要密切监控。纯化的主要目的是减少或消除杂质和污染物，使其达到对患者安全的水平。影响下游纯化策略的杂质分为两类：与过程相关的和与产品相关的生物制造中的杂质。药物物质中的与产品相关的杂质是在制造或储存过程中发生的分子变异，与预期产品在功能、保护或效力方面不同。蛋白质的结构差异可能源于宿主生物体在蛋白质合成中的细胞机制或特定处理活动。这些偏差可能或可能不会从患者安全的角度被接受。产品变体是具有与目标产品相当的属性（活性、安全性、效力）的物质。需要对产品及其变体进行详细表征，以区分污染物和与产品相关的化学物质。与过程相关的杂质是与制造过程相关的污染物，包括宿主细胞蛋白、DNA和原材料（例如，细胞培养基、抗生素、用于纯化的色谱介质和特定缓冲组分）。上游过程杂质可能源自细胞基质或细胞培养，分别受表达系统和上游过程参数的影响，这些参数决定产品是分泌到介质中还是保留在细胞内。下游过程条件和来源材料也影响杂质，包括色谱介质、缓冲组分和可浸出组分。下游过程的主要目标是通过一系列纯化程序减少污染物，以确保最终产品满足纯度标准。监控下游单元操作涉及在每个阶段对产品进行纯度概况、稳定性和生物活性的筛查。随着目标分子从毒理学到临床以及安全性和效力测试的发展阶段，对表征、稳定性和整体产品概况的强调加剧。测试仅在最终确定上游和下游过程后开始，强调了它们在生物制药开发时间表中的关键作用。 图 11.3 各种色谱方法的示意图 2.大肠杆菌系统：回收和纯化 大肠杆菌中的重组蛋白生产发生在三个空间：细胞内、周质或细胞外。然而，主要的生产地点是细胞内，导致形成称为包涵体（IBs）的不溶性聚集体。包涵体是在细胞质和周质中发现的密集蛋白质团块，其密度高于细胞碎片，有助于过程中的分离。包涵体内的蛋白质通常保持稳定，并作为停止制造操作的合适阶段。这些团块通常含有90%-95%的蛋白质，减轻了下游纯化的负担。然而，蛋白质仍然不活跃且不溶，需要转化为其活性的天然构象。一旦实现，功能性蛋白质就会经历纯化和浓缩，以用于最终产品配方。纯化前的步骤涉及将不溶性蛋白质形式转化为其可溶的活性形式： • 必须破坏细胞以释放包涵体。 • 将包涵体与细胞碎片分离。 • 通过洗涤包涵体去除共沉淀污染物。 • 将包涵体溶解以变性，为重新折叠做准备。 • 将蛋白质恢复到其活性状态的过程称为重新折叠。回收包涵体并将蛋白质重新转化为其天然状态在处理阶段带来了额外的挑战。图11.4描述了在大肠杆菌中作为包涵体产生的重组蛋白的典型下游过程。对于在大肠杆菌细胞质中表达的可溶性蛋白质，不会形成包涵体，简化了回收所需蛋白质的过程。某些细胞质蛋白在最佳条件下可以自发折叠。 在细胞水平上修改表达机制和适当的载体设计，可以将胞内蛋白质表达从包涵体重新定向到可溶性胞质蛋白。虽然可溶性蛋白表达是一个有吸引力的选择，但其适用性因蛋白质类型而异。这一策略的成功依赖于大量表达蛋白质，至少超过总蛋白量的5%，从而在没有额外步骤（IB回收、溶解和复性）的情况下实现最大化的回收。 2.1.细胞破碎 在大肠杆菌中进行细胞内蛋白质合成后，细胞收获期间进行细胞破碎以提取包涵体（重组蛋白）。大肠杆菌的双层细胞壁由外层脂多糖（LPS）膜、水性周质间隙和内层薄肽聚糖细胞壁组成。为了进入细胞内区域而破坏这些细胞膜被称为细胞裂解（涉及外层富含LPS的膜和细胞质内膜）。细胞破碎方法包括化学、酶促或机械方法，或这些方法的组合。根据感兴趣的蛋白质、技术对产品质量的影响、下游处理和总产量来确定合适的方法。此外，考虑产品的特性（溶解度、细胞位置和物理属性）、批量大小、操作规模、处理时间、效率和蛋白质的稳定性对于评估和确定最佳方法至关重要。 2.1.1.物理方法 使用各种方法，如机械破碎（例如，研磨、高压匀质化和超声波）和非机械破碎（例如，冷冻/解冻、热处理和渗透冲击），以物理方式裂解细胞。 图 11.4 在大肠杆菌中表达的重组蛋白下游处理流程图 2.1.1.1.机械方法 机械破碎方法因其高破碎效率和可扩展性而在工业中受到青睐。这些方法涉及手持研磨器或带有旋转刀片的电动设备，以分解细胞。常见的设备包括Waring搅拌机、Polytron、手持研磨器（如Dounce和Potter-Elvehjem匀浆器）和高压匀质器（如French press）。Waring搅拌机类似于典型的家用搅拌机，主要用于研磨。Polytron通过将组织吸入带有旋转刀片的长轴来操作。这两种设备在研磨软固体组织方面表现出色。Dounce匀浆器通过将样品推到管子的侧面和杵之间来操作，产生剪切力。Dounce匀浆器适用于裂解组织培养细胞、细小组织块或仅需要温和裂解的应用。相反，Potter-Elvehjem匀浆器研磨组织并裂解细胞。将样品放入样品管中，以一定速度旋转杵。杵在管子上的重复运动产生的剪切力破坏细胞。然而，最普遍的工业设备是高压匀质器。样品在经历活塞作用下的高压（例如，20,000 psi）时通过一个狭窄的空间，导致细胞在从高压区过渡到低压区时膨胀和破裂。通常，样品需要多次通过这个匀质器以提高裂解效率。为了减少蛋白质变性，建议在匀质化过程中冷却样品（2-8ºC）。高压匀质器提供可扩展性，并适应各种样品体积（图11.5）。 图 11.5 高压均质机工作原理示意图 珠磨匀浆器是用于破坏大肠杆菌的常用机械方法。这种方法涉及在高速下剧烈摇动的珠子以破坏和裂解细胞。细胞悬浮液通过一个充满珠子（大约80%）的研磨室（包含一个旋转轴）。在高速下，珠子产生的剪切力和冲击力导致细胞破裂。该设备不使用任何外部探针，相对自包含，最小化污染风险。超声波是另一种用于细胞裂解的机械破碎方法。这种技术使用声波换能器产生脉冲高频声波，创建微观气泡，这些气泡通过辐射导致搅拌和最终的细胞裂解。它适用于均质化小样品体积，并有效地针对细菌和孢子。然而，超声波处理通常会产生过多热量，因此通常将样品浸入冰浴中并进行短时脉冲处理。尽管机械破碎方法常用，但存在挑战。这些包括产生热量、潜在的蛋白质变性、有限的选择性、可能会损坏敏感组分（如特定蛋白质）的剪切应力，以及细胞碎片的破碎，使回收过程更容易受到污染。2.1.1.2.非机械物理方法 冷冻/解冻 冷冻/解冻方法涉及将细胞悬浮液冷冻（使用干冰、乙醇或冷冻器），然后在环境温度或37ºC下解冻细胞。冷冻期间形成冰晶，导致细胞在解冻过程中膨胀和裂解。因此，需要多次冷冻/解冻循环才能有效裂解。热冲击 热裂解使用热量在大约50ºC的温度下变性膜蛋白，并裂解细胞的外膜，或在90ºC下裂解细胞质组分。渗透冲击 这种方法的细胞裂解涉及细胞的渗透压显著变化。最初，将细胞浸入高渗透压溶液中（例如，1 M蔗糖或高盐溶液；1M）。这迅速转变为低浓度溶液，引起细胞内的渗透冲击。因此，水分子从低盐浓度移动到高盐浓度（进入细胞），导致细胞内压力增加并导致爆炸。相反，首先将细胞暴露于低浓度溶液，然后暴露于高浓度溶液，导致水从细胞中流出，引起破裂。 2.1.2.化学方法 除了机械和非机械方法外，还使用涉及酶或化学添加剂（如洗涤剂）的化学破碎方法来裂解细胞。这些试剂通过酶促破坏细胞壁或膜、增加渗透压或沉淀细胞壁蛋白来工作。洗涤剂通过形成胶束，结合到脂质膜蛋白，并导致细胞膜破裂，使内部蛋白质和包涵体逸出。洗涤剂根据物理属性和作用类型而变化： • 阴离子：十二烷基硫酸钠（SDS）通过破坏蛋白质-蛋白质相互作用来重组细胞膜。 • 阳离子：溴化乙基三甲基铵可能会破坏细胞膜中的LPS和磷脂。 • Triton X100是一种非离子洗涤剂，可溶解膜蛋白。溶剂添加、混沌剂和金属螯合剂是用于细胞破碎的其他化学添加剂。溶剂添加通过提取细胞壁的脂质成分，增加细胞膜的通透性，并释放细胞内蛋白质。常用的溶剂包括甲苯、二甲基亚砜和某些醇类。像尿素这样的混沌剂可以溶解膜蛋白。EDTA是一种螯合剂，与细胞外膜上的金属离子Mg2+和Ca2+结合，增加通透性并导致细胞内组分的释放。 使用消化酶破坏细胞壁是另一种化学裂解细胞的技术。酶的选择取决于不同细胞类型和菌株的细胞壁和膜的变异性。例如，溶菌酶通常用于分解革兰氏阳性细菌的细胞壁。 化学方法比机械方法更容易实施且可扩展，但需要大量的资本支出。然而，其局限性包括需要较长的反应时间以实现有效裂解、下游操作的负担以确保有效去除化学物质，以及这些化学物质可能对操作员造成的潜在危害。 通常，在生物制造中采用多种破碎方法的组合来克服效率限制。例如，使用化学洗涤剂（Triton X-100）作为预处理，然后进行机械破碎（高压匀质化），可以提高裂解效率并减少通过匀质器的次数。类似地，在液体匀质化之前在缓冲液中加入螯合剂和洗涤剂以悬浮细胞沉淀物，与仅使用单一方法相比，可以提高效率。 在大肠杆菌中表达的可溶性蛋白的制备中，细胞会经历裂解，上清液会被清除以去除细胞碎片、脂质、核糖体和其他颗粒物质。清除后的蛋白质然后被引入适当的色谱柱进行捕获。 3.包涵体回收和分离 细胞破裂并释放其内容物后，包括包涵体和其他细胞组分，进行回收和分离过程。这些过程对于将不溶性包涵体与可溶性组分和不溶性细胞碎片分离至关重要。已应用了基于包涵体密度和溶解度变化的各种分离程序，以提高产量和纯度。在溶解和复性之前，需要回收和分离包涵体，以澄清、纯化和浓缩包涵体。离心、过滤或沉淀和双水相萃取等替代方法可以实现相对纯净的包涵体。离心是回收包涵体的常用技术。根据操作规模和液体体积，可以使用台式/地面离心机或连续离心机。调整速度和重力（通常在5,000-20,000 g之间）允许将包涵体收集为沉淀，而密度较低的细胞碎片在上清液中去除，从而减少处理体积。微滤或超滤是回收不溶性包涵体的替代方法。包涵体的大小在50至1500 nm之间，选择合适的大孔径过滤器（微滤：0.05 µm至5 µm，超滤：0.001 µm至0.1 µm）可以实现高产量的包涵体。此外，过滤通过大孔径去除细胞破碎过程中释放的可溶性杂质、DNA和毒素，从而有助于增强纯化。微滤用于从细胞裂解液中去除细胞和细胞碎片，目标大小范围为0.2 μm至10 μm。孔径从0.001 μm至0.1 μm的超滤膜，有效地消除了蛋白质、多糖和IBs等大分子。为了解决可能与包涵体共沉淀的杂质，使用包涵体洗涤缓冲液的透析步骤可以帮助去除它们。然而，由于有效处理所需的大量洗涤溶液消耗，其在大规模操作中的实用性受到限制。此外，在细胞裂解液处理期间，建议保持低跨膜压力（TMP），考虑处理时间、对产品质量的影响、膜污染和性能等因素。过滤操作的重要参数包括膜孔径、膜类型（中空纤维、平板）、渗透通量/污染、TMP和清洁。除了标准的离心或膜过滤外，其他方法如扩展床吸附、双水相液萃取、溶剂萃取、沉淀和尺寸排除色谱为从细胞裂解液中分离和纯化包涵体提供了替代方法，整合了细胞破碎和溶解。选择最合适的方法——离心分离、膜过滤或细胞破碎和溶解方法的组合——取决于各种因素，如感兴趣的蛋白质、操作规模、设施设计、缓冲消耗、整体生产过程和期望的纯度水平。同样重要的是评估每种方法的挑战和局限性，以确保可靠、稳健和经济上可行的包涵体回收和分离。根据选择的方法，可能需要整合洗涤溶液，因为包涵体高度不溶，特别是为了消除与之共沉淀的细胞杂质。尽管大多数包涵体通常纯度很高，但优化洗涤溶液显著提高整体纯度并简化操作。在溶解和复性之前提高纯度可以导致整体过程产量增加，并可能减少后续处理体积。例如，回收的包涵体可能需要用含有特定成分的溶液（例如，低水平的混沌剂、洗涤剂、盐和pH调整）进行洗涤，以有效去除细胞碎片和其他共沉淀杂质。在选择可能影响包涵体溶解和整体产量的混沌剂或剂（例如，使用高浓度的尿素或盐酸胍）时，保持纯度和回收率之间的微妙平衡至关重要。通常，离心用于洗涤后回收包涵体。最后，纯化水作为最后一步洗涤，去除化学剂和碎片，然后产生高纯度的包涵体沉淀。在这个阶段，浓缩和纯净的包涵体（IB）可以冷冻长期储存（通常在-20ºC）。这允许生产计划的灵活性，使多个上游批次的IB沉淀物汇集以进行进一步处理，并最大化下游操作。 3.1.包涵体溶解 一旦回收了IB沉淀，关键步骤是重新溶解它，为随后的复性做准备。溶解过程的目的是变性蛋白质并减少包涵体中聚集蛋白的数量。这种不溶性蛋白聚集体的变性旨在将其转化为可溶性线性多肽，通过化学剂和特定操作条件的结合实现。传统上，大量的变性剂被用于溶解包涵体。常见的物质包括6 M盐酸胍（GuHCl）、8 M尿素、洗涤剂、碱性pH（>9）、有机溶剂或N-月桂基肌氨酸。Gu-HCl作为一种有效的混沌剂，比尿素在变性过度聚集的包涵体方面更有效。然而，含有异氰酸酯的尿素溶液可能导致多肽的自由氨基集团发生羰基化，特别是在碱性pH下长时间孵育时，影响产品质量。高浓度混沌剂的一个挑战是沉淀的可能性，影响整体过程产量和随后的纯化步骤。在选择的变性剂纳入溶解技术之前，至关重要的是要与目标蛋白进行测试。 还原剂的存在和浓度、时间、温度、离子强度以及变性剂与蛋白质的比例等因素，显著影响每种变性剂的溶解效果。表11.2提供了溶解包涵体的初始实验条件，通常随后进行与溶解蛋白质兼容的纯化。 已经发布了多种溶解技术（例如，REFOLD数据库：http://pford.info/refolddb/），包括使用SDS（10%）、N-月桂基肌氨酸或其它洗涤剂，以及极端pH水平作为常用溶解剂的替代品。对于含有二硫键的蛋白质，通常使用还原剂如二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇或Tris(2-羧基乙基)膦（TCEP）来减少二硫键并稳定游离的半胱氨酸。 对于某些蛋白质，已经使用了含有较低浓度混沌剂的更温和的溶解溶液。采用温和的溶解条件已显示出可以保留类似天然的二级结构，可能通过将蛋白质变性到中间状态而不是完全线性多肽，从而改善蛋白质的复性。这种方法可能会提高重折叠产量，但其适用性在很大程度上取决于蛋白质和产生的包涵体。 溶解显著影响随后的重折叠条件；因此，溶解缓冲液和操作条件必须与复性过程相匹配。对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体通常具有非天然的分子内和分子间二硫键。将还原剂与混沌剂结合使用可以帮助减少这些键。在没有二硫苏糖醇、半胱氨酸或β-巯基乙醇的情况下，非天然二硫键可能会降低IBs的溶解度。对于可能已经处于还原状态的蛋白质，不必包含硫醇试剂。精氨酸通常用于溶解和/或重折叠缓冲液中，以防止蛋白质聚集，而EDTA可能被用来防止在变性和还原过程中暴露的游离半胱氨酸基团的氧化。 除了变性剂类型和添加剂成分外，还必须评估诸如试剂浓度、溶解缓冲液与IB沉淀的比例、反应时间、pH和温度等参数，以获得最佳的溶解条件。 3.2.包涵体复性 蛋白质复性从溶解包涵体（IBs）开始，以获得正确折叠的蛋白质。逐渐消除过量的变性剂和还原剂，然后将还原的蛋白质转移到氧化环境中，开始形成天然的二硫键。通过稀释、透析或柱上处理实现溶解IBs的复性。通常，复性在非常低的蛋白质浓度下进行，通常大约为10-100 g/mL，以防止聚集并逐渐将变性蛋白质转化为其天然、正确折叠的结构。 3.2.1.稀释 在复性方法中，稀释因其操作简便而脱颖而出。在这种方法中，溶解的IB被稀释到合适的复性缓冲液中。这个过程降低了蛋白质和变性剂的浓度，为二硫键形成创造了适当的氧化环境。在整个复性过程中维持低蛋白质浓度至关重要，以最小化聚集。控制稀释，如脉冲或滴注稀释，将溶解的IBs转化为复性缓冲液在一定时间内进行（慢速稀释），比快速稀释到过大体积中更受青睐，因为快速稀释可能导致由于环境突然变化而导致的增加聚集或错误折叠。持续混合复性溶液和变性蛋白质溶液对于防止聚集至关重要。选择适合处理体积而不妥协蛋白质质量的最佳稀释至关重要。 3.2.2.透析 透析是减少或消除溶解剂的另一种标准方法，通过允许成分通过缓冲液交换扩散。在透析过程中，溶解剂的浓度逐渐降低，促进蛋白质的正确复性。然而，透析是一个缓慢且繁琐的过程，尤其是在大规模进行时。 3.2.3.柱上 使用填充色谱柱进行复性提供了与传统方法相比具有吸引力的替代方案。这种方法包括各种技术： 变性蛋白质固定：将变性蛋白质固定在基质上，然后通过非特异性或亲和相互作用帮助复性，通过空间分离蛋白质。例如，使用融合标签进行亲和色谱，需要根据蛋白质-基质相互作用仔细优化复性条件。 基于SEC的变性剂稀释利用蛋白质和变性剂之间的分配系数差异，通过限制不同蛋白质形式扩散到复性混合物中来防止聚集。从柱子上洗脱的材料按大小分级，变性蛋白质被吸附，洗涤以去除变性剂，并通过结合和洗脱方法在复性溶液中洗脱。 创建复性反应器涉及在色谱柱的固定相上固定折叠催化剂。 柱上复性具有抑制非特异性分子间相互作用、实现最大蛋白质浓度和将纯化与复性整合的优势。然而，存在潜在沉淀、柱子污染和清洁困难等挑战。平衡柱色谱操作与复性对于成功的复性至关重要。 变性剂去除有助于天然蛋白质构象。复性缓冲液中的组分有助于正确折叠和天然二硫键（即稀释、透析或柱上）的形成。完全复性所需的时间从几小时到几天不等，取决于复性方法（稀释、透析或柱上）。优化复性条件显著影响整个过程的产量和效率。在复性过程中，发生两个关键过程：一级复性和高阶聚集，竞争第一和高阶反应。 没有一种适合所有情况的复性过程；一种适合一种蛋白质的方法可能不适用于另一种蛋白质，这是由于各种因素，包括复性缓冲液、添加剂的使用和变性剂去除率。最佳蛋白质浓度减少聚集，同时考虑复性条件，如pH、温度、复性缓冲液体积和处理时间。添加剂在天然二硫键形成、正确折叠、聚集抑制和蛋白质稳定性中起着至关重要的作用。实现这些目标通常需要几种添加剂来实现这些结果。pH和温度显著影响蛋白质稳定性、二硫键形成速率和正确折叠。逐渐降低pH或温度变化可以帮助正确折叠并沉淀错误折叠或不必要的蛋白质。二硫键形成是影响复性速率的关键步骤，影响整个过程的产量。因此，控制反应条件至关重要，以避免快速环境变化，这会阻碍在聚集之前稳定中间体的形成，特别是在目标是商业规模制造时。 为了跟踪复性进展并评估随时间变化的未折叠和正确复性的蛋白质的百分比，特定间隔的代表性样品会经历RP-HPLC分析。这些信息在过程开发的早期阶段尤为重要，当时优化条件以最大化回收。表11.3列出了各种复性方法的比较描述。 3.2.4.复性蛋白澄清的深层过滤 复性后，蛋白质通常在色谱纯化前进行澄清。这种澄清涉及使用带电深层过滤器、正常流动过滤，有时使用离心来去除蛋白质聚集体。由于复性蛋白质中存在不同的粒径，可能需要多个分离步骤。将多级深层过滤器和膜过滤作为单一操作结合使用通常可以满足多个分离的需求。虽然仍然使用离心，但可能不切实际，特别是对于大处理体积。在过滤过程中，最小化产品损失并获得高质量的滤液是挑战，以最大化后续纯化步骤的效率并保护柱子。 纤维素深层过滤器通常用于生物制药行业的这一目的。它们的厚度和深度捕获悬浮颗粒，其正电荷吸引进料流中的负电荷颗粒。通过将多个孔径过滤器串联创建的分级结构，最大化表面积并减少污染。最终滤液在装载色谱之前进行无菌过滤。可选地，在无菌过滤器前添加微孔膜可以防止较小颗粒堵塞最终无菌过滤器，保持通量。在深层过滤过程中监测压力和滤液浑浊度至关重要。 4.纯化 澄清复性蛋白质溶液后，随后的一系列单元操作专注于纯化蛋白质，生产出符合特定纯度要求的高纯度产品。某些蛋白质在纯化过程中面临挑战，需要使用基于物理化学的色谱方法来优化产量。选择合适的色谱分离方法取决于目标蛋白质和样品中其他化学物质的特性变化。 5.捕获 基于目标蛋白质和样品中其他化合物的特性选择最合适的色谱分离方法。初始捕获步骤旨在将产品绑定到基质上（由于电荷、特定相互作用或亲和性），同时防止杂质绑定，从而在洗脱过程中便于它们去除。产品可以通过阶梯梯度或线性洗脱方法洗脱，从而实现高产品浓度，但提供适度的纯度。例如，为了防止与蛋白酶的相互作用，强调高通量和较短的处理时间变得至关重要。某些产品变体可能会阻碍产品回收，并导致随后的降解，这在之后很难去除。 色谱过程和捕获步骤策略可能根据目标分子而变化。对于非抗体、寡核苷酸和多糖，阴离子交换色谱（IEX）或疏水作用色谱（HIC）更常用。相反，用于捕获抗体的亲和色谱，如Protein-A或Protein G。 在纯化复性蛋白质时，阴离子交换色谱（IEX）以及在较小程度上疏水作用色谱（HIC）已被证明是初始色谱阶段的有效方法。这些方法通过增强稳定性、减少聚集体和有效解决与过程和产品相关污染物的纯化挑战，提高了复性蛋白质的回收率。这些方法采用线性梯度洗脱进行分离，在纯化复性蛋白质中使用。在大肠杆菌表达系统中表达的可溶性蛋白质直接加载到色谱柱上，以将目标蛋白质与其他细胞污染物分离。这一步骤是在通过细胞破碎和澄清回收蛋白质之后进行的，旨在去除核酸和脂多糖以及宿主细胞蛋白。 亲和色谱，主要用于单克隆抗体（mAb）的纯化，也在探索用于各种重组蛋白质（例如重组胰岛素、血浆素原、GCSF、IFN-alpha、促卵泡激素）的大规模纯化。这一捕获步骤的关键要求是高度的回收率、产品稳定性和处理高容量的能力。 6.中间纯化 捕获步骤之后，使用疏水作用色谱（包括阴离子和阳离子交换）、尺寸排除色谱和反相色谱等高分辨率方法来去除大部分杂质，如宿主细胞蛋白、核酸和内毒素。通常不会将阴离子交换（AEX）作为捕获阶段，然后进行阳离子交换（CEX）色谱或相反。这些选择在很大程度上取决于目标蛋白质和杂质概况。 使用较低的流速、梯度洗脱和较小颗粒的基质来提高分辨率。通常，这些阶段后最终产品的纯度接近99%。 在整个色谱过程中，每个纯化步骤都不可避免地会损失一些产品。因此，不断努力在生物制造过程中最小化纯化步骤的数量。减少步骤不仅提高了处理速度，还提高了不稳定蛋白质的产量。在捕获步骤之后，评估产品质量、纯度、杂质概况以及中间和最终纯化步骤的目标，决定了中间纯化步骤的必要性。有些过程可能会跳过中间纯化步骤，倾向于抛光步骤，以节省生物制造操作。 6.1.抛光 纯化中的抛光阶段旨在消除聚集体（包括低分子量和高分子量蛋白质）、降解产物或其他产品变体的痕迹。先前的纯化过程已显著减少了与产品相关的污染物。这个阶段为配方或作为中间产品储存的纯化产品做准备。尺寸排除色谱和反相色谱是实现最终产品纯度的两种抛光程序。 有时，可能需要进行脱盐和缓冲液交换以修改纯化蛋白质的组成。尺寸排除色谱通过允许去除低分子量和高分子量污染物，同时使蛋白质转移到所需的缓冲液中，有效地实现这一点。这有助于对纯化蛋白质的储存条件进行最终调整。 纯化步骤可能不会按顺序发生，有时可能会在色谱步骤之间集成各种中间处理步骤，如通过切向流过滤（TFF）进行产品浓缩、盐沉淀或脱盐。当缓冲液组分发生改变时，通常需要进行脱盐，无论是在离子交换之前去除盐以使蛋白质样品能够结合到柱上，还是在纯化后去除低分子量污染物，或在纯化后获得最终纯化蛋白质。 图11.6展示了可溶性蛋白质的一般下游过程方案。 图 11.6 在大肠杆菌中表达的可溶蛋白的纯化方案（三步纯化策略） 图11.7说明了以包涵体（IBs）表达的蛋白质的三步和两步纯化方案。 图 11.7 表达蛋白的多步纯化方案 纯化过程之后，浓缩的纯化蛋白质主要经历TFF以生产药物物质（冻干或无菌溶液），然后储存以进行后续加工成药物产品。 7.哺乳动物系统纯化 在基于哺乳动物细胞的蛋白质生产中，产品通常分泌到培养基中。因此，产品回收的初始步骤涉及通过深层过滤、离心或替代分离方法将细胞与培养基分离。因为蛋白质分泌到媒体中，与大肠杆菌不同，分离过程不那么广泛。 经过澄清的收获物经历纯化和浓缩步骤，以获得符合特定纯度和安全目标的所需产品。了解蛋白质的性质及其污染物对于制定纯化策略至关重要。此外，在哺乳动物系统中生产的蛋白质可能存在病毒污染的风险。因此，下游操作必须包括针对病毒灭活和去除的步骤。 图11.8概述了单克隆抗体纯化的一般过程。单克隆抗体通过Fc区域共享一个共同特征，从而可以开发平台过程。在结构上，单克隆抗体表现出对称配置，由通过二硫键连接的相同重链和轻链组成。 图 11.8 单克隆抗体(mAb)纯化过程概览 对于经过澄清的收获物（CHO过程），可以采用类似于纯化复性蛋白质的三阶段纯化策略。 捕获：隔离并浓缩产品。 中间纯化：去除大部分大量杂质（例如，宿主细胞蛋白、核酸、DNA、内毒素和病毒）。 • 抛光：通过消除微量杂质和其他与产品相关的物质/杂质来实现高纯度。色谱法被选择和优化以适应纯化策略，旨在实现期望的结果。使用的步骤数量取决于蛋白质特性、目标纯度标准、产量、杂质身份和预期用途。从蛋白A色谱法开始，接着是一系列离子交换色谱法步骤，大多数操作在结合和洗脱模式下执行，除了阴离子交换色谱法，它在流穿模式下操作以获得所需的蛋白质。 8.捕获-蛋白A色谱法 设计用于分离和浓缩产品的捕获步骤（例如，离子交换，亲和色谱法）也应该有效地去除关键污染物。通常，这一步骤显著增加了产品浓度和纯度，特别是如果使用了高度选择性的亲和介质。其他捕获方法，如结晶和沉淀，是可行的，但涉及额外的加工步骤（例如，固液分离），在工业规模上并不那么成功。从小清蛋白开始的主要捕获单克隆抗体（mAbs）的亲和色谱法，经常使用蛋白A色谱法。mAbs中一致的Fc部分，这是蛋白A的目标结合区域，使其成为下游纯化捕获的主要选择。蛋白A色谱法涉及抗体以特定和可逆的方式结合到固定化的蛋白A配体。蛋白A，一种在金黄色葡萄球菌中发现的56-kDa表面蛋白，具有五个结合域，可以结合到免疫球蛋白G（IgG）的Fc区域。蛋白A的天然和重组形式都用作蛋白A树脂中的配体。该配体通常与交联琼脂糖（例如，Sepharose®）等基质结合，显示出高容量，能够结合至少两个抗体分子到单个结合的蛋白A分子。重组蛋白A，经过工程改造以增强结合能力，由于配体的修改，包括单域多聚体/单点耦合和多点连接，显示出鲁棒性和高容量。这些改变提供了额外的好处，如化学和热稳定性，使蛋白A能够承受2-11的宽pH范围并抵抗变性和chaotropic剂（例如，尿素，Gu-HCl）。图11.9说明了蛋白A的结构及其蛋白质结合机制。 图 11.9 蛋白A，它与免疫球蛋白结合 来源：E A S - 个人作品，创作共用署名许可 市场上有三种主要的蛋白A树脂，基于基质组成。• 基于琼脂糖的：例如，Protein-A-Sepharose® Fast Flow，MabSelect（Cytiva）。• 基于玻璃或硅的：例如，ProSep vA和ProSep vA Ultra（Millipore）。• 基于有机聚合物的：例如，聚苯乙烯-二乙烯基苯POROS A™和MabCapture™（Applied Biosystems）。这些树脂适用于实验室规模和商业规模的过程，柱直径从不到1厘米到2米不等。它们对高浓度的Gu-HCl、尿素、还原剂和低pH具有抵抗力。蛋白A还对Fab区域的特定变体表现出亲和力，这有助于纯化Fab片段。尽管蛋白A仍然是最广泛使用的人类和人源化mAbs纯化系统，但某些抗体可能不会强烈结合或根本不结合到蛋白A配体。然而，在特定情况下，这种选择性可能是有利的。蛋白A的替代品是蛋白G，一种在链球菌G组中发现的免疫球蛋白结合蛋白。它在结合特异性上与蛋白A不同。根据正在纯化的IgG，这两种替代品都可以有效地用于捕获步骤。这两种配体的一些关键特性包括：蛋白A：它显示出广泛的物种反应性，很好地结合来自各种物种的IgG，包括人类、兔子、小鼠和牛。蛋白G：对小鼠大鼠的IgG显示出更强的结合。原生蛋白G中存在的与白蛋白结合的位点在重组形式中已被消除。蛋白A可能是分离某些IgG亚型和其他类别的抗体以及消除其他抗体（例如，来自马或胎牛血清的交叉物种IgG污染）的更好选择。当与琼脂糖珠结合时，一些结合亲和力会改变；例如，大鼠IgG不结合到蛋白A但结合到Protein-A-Sepharose（表11.4）。色谱法通常采用亲和重力流或低/中压系统。结合能力由结合强度和流速决定。应考虑配体泄漏，蛋白A点连接到Sepharose在各种洗脱设置下显示出最小的泄漏。这些配体污染物在使用SEC进行抛光时被消除。亲和色谱法作为初始捕获步骤，提供了几个性能属性，简化了新分子的过程开发，例如对装载和洗涤溶液条件的鲁棒性。 在大规模mAb制造中，Protein-A-Sepharose（Cytiva）是最常用的捕获步骤。其结合能力超过了蛋白G Sepharose。此外，Cytiva的高性能介质产生了高分辨率以及尖锐和集中的峰洗脱。表11.5提供了一个商业上可用的蛋白A色谱介质的例子。评估每种树脂对蛋白A渗漏性是必要的。 此外，应考虑蛋白质聚集体的形成作为选择因素。蛋白A树脂表现出15-100 g mAb/L树脂的动态结合能力，这取决于mAb类型、吸附剂和流速（表11.5）。这种介质的典型结合和洗脱条件在表11.6中概述。为了优化蛋白A色谱法的性能，至关重要的是微调某些过程变量。这包括优化结合条件，如缓冲液组成和pH，以确保有效结合。它还涉及考虑洗涤条件，包括柱洗涤溶液的理想组成，因为过多的洗涤步骤可能会削弱配体结合并降低产量。同样重要的是洗脱条件，因为这些参数的任何变化都可能影响蛋白A的亲和力、纯度和杂质水平（表11.6）。 蛋白A色谱法是捕获重组mAbs的广泛青睐方法，因为它的韧性。根据目标蛋白的预期功能，例如用于诊断目的，仅使用蛋白A色谱法进行纯化可能就足够了。在这个阶段，显著去除了与过程相关的污染物，如宿主DNA、HCP和病毒。尽管蛋白A色谱法广泛使用，但它确实有一些局限性。树脂的高成本、其重复使用所需的程序可能导致交叉污染，以及腐蚀性清洁溶液如0.1 N NaOH对树脂性能的影响是显著的缺点。另一个担忧是非特异性结合的杂质，如宿主细胞蛋白、DNA和其他细胞培养衍生的杂质。因此，正在研究探索替代品，如离子交换和其他方法，以克服与蛋白A色谱法相关的这些局限性。扩大床色谱法也被视为从粗细胞培养介质中结合蛋白质的有益方法。 9.中间纯化和最终抛光 中间纯化步骤旨在将目标蛋白与污染物（如其他蛋白质、病毒、内毒素和DNA）分离。这一步骤的具体情况，包括分辨率和规格，严重依赖于蛋白A洗脱样品的特性和需要满足的最终产品规格。如果从捕获步骤获得的蛋白质纯度高，中间步骤可能是不必要的，过程可以进行到一个或多个抛光步骤，以进一步提高最终产品的纯度。在最终抛光期间，期望在分离样品的蛋白质成分时具有高分辨率。因此，中间纯化步骤的结合能力、分辨率和选择性至关重要，特别是如果捕获步骤产品的纯度较低，因为可能仍然存在大量杂质。洗脱目标蛋白可能涉及使用连续梯度或多步洗脱方法。 10.抛光 色谱中杂质的结合，如宿主细胞蛋白、DNA和其他细胞培养衍生的杂质，是非特异性的。例如，如果目标蛋白的等电点（pI）为中性到碱性，流穿模式适合于消除污染物。相反，所选条件会导致酸性杂质不与柱子结合。对于pI范围从酸性到低于中性范围的目标蛋白，"结合和洗脱"模式更可取。在高盐浓度条件下首先洗脱目标蛋白，留下大部分杂质结合在柱上。在阳离子交换（CEX）或阴离子交换（AEX）中，优化树脂、装载条件、杂质概况、装载的产品量、电荷变体概况和色谱条件是必要的，以最大限度地提高效率和回收率。这一步骤的主要变量通常包括柱装载、洗涤和洗脱缓冲液的组成。杂质概况和目标蛋白决定了使用疏水作用色谱、混合模式色谱，以及偶尔使用陶瓷羟基磷灰石色谱，以及离子交换色谱。疏水作用色谱作为IEX后的抛光步骤，或作为蛋白A纯化后的中间步骤。在其流穿模式下，HIC有效地消除了众多聚集体，确保了高产量。它在结合和洗脱模式下提供了出色的分辨率和分离过程和产品相关污染物。多模式色谱使用结合了不同相互作用类型的树脂来分离目标蛋白和杂质，如离子交换、疏水和氢键。这些树脂与标准单模式色谱树脂相比提供了不同的选择性，使它们适合于各种条件，如高和低电导率或pH。商业上可用的多模式色谱树脂的例子包括Capto MMC和Capto Adhere（Cytiva）。多模式色谱方法有效地去除了聚集体、宿主细胞蛋白和渗漏的蛋白A。陶瓷羟基磷灰石（CHT）因其独特的分离能力、无与伦比的选择性和分辨率而被利用，有效地去除了核酸、病毒、大分子和其他蛋白质。CHT作为大规模mAb纯化的抛光步骤，有效地去除了二聚体、聚集体和渗漏的蛋白A，使用梯度洗脱方法。抛光步骤对于确保去除意外和内源性病毒至关重要。总体而言，纯化策略应简化过程开发工作，确保实现产品质量属性，降低生产成本以使过程在经济上可行，并最小化下游处理的复杂性。 11.病毒去除、灭活和过滤 最终产品必须完全不含任何污染，包括细菌、支原体和病毒。哺乳动物细胞自然产生类似病毒的颗粒，这构成了重大的安全风险。来自哺乳动物细胞系统的单克隆抗体（mAbs）必须遵守严格的病毒安全规范，因为它们可能受到包膜和非包膜病毒的污染。这个过程包括对宿主细胞系进行表征，仔细检查所有原材料中可能存在的意外代理——特别是那些来自动物的——以及在各个生产阶段以及成品上进行测试。一个关键方面是通过病毒清除证明生产过程能够有效地处理和消除病毒。根据现行法规，来自哺乳动物细胞的治疗产品必须每百万剂量中少于一个病毒颗粒以确保安全。这一要求转化为内源性逆转录病毒大约12-18 log10清除和意外病毒6 log10清除。因此，将病毒去除策略整合到生产过程中，特别是在纯化步骤中。此外，在mAb过程中采用多种病毒清除措施，以确保病毒至少被一种机制消除，如果不是其他机制的话。病毒去除或灭活是通过将含有目标蛋白的溶液置于变性病毒蛋白而不影响活性成分的条件下实现的。常用的方法包括低pH灭活、洗涤剂、病毒过滤器、热处理、辐照和色谱法。 11.1.pH处理 在低pH下处理蛋白A洗脱物有效地针对包膜病毒。通常，将蛋白质溶液在低pH（大约3.0-3.5）下孵化至少一个小时在mAb过程中是一种常见的做法。此外，高pH处理，如使用氢氧化钠清洁色谱柱，已被证明对包膜和非包膜病毒都有效。暴露于极端pH条件可以显著减少病毒计数（大约> 4.0 log10）。 11.2.病毒过滤 病毒过滤依赖于基于大小的方法进行病毒清除，通常与mAb过程中的pH处理一起使用。病毒过滤器，作为超滤器或微滤器，具有非常小的孔，主要由聚醚砜（PES）、聚偏二氟乙烯（PVDF）和纤维素组成。它们根据大小分布被归类为逆转录病毒和细小病毒过滤器。表11.7总结了一些商业上可用的病毒过滤器，概述了最常见的病毒，尽管不是详尽无遗的，可能存在其他潜在的污染物。 滤器污染，由聚集体、碎片和DNA引起，是影响病毒过滤器性能的常见问题。预过滤器，如在Viresolve Pro病毒过滤器之前使用的带负电荷的Pall Mustang S，有助于防止这种情况。控制病毒过滤器的膜渗透性在特定范围内对于过滤过程至关重要。然而，由于蛋白质溶液的病毒过滤器负担的可变性，不同批次之间的吞吐量可能会有所不同。因此，评估大规模制造的过滤器需要使用最坏情况下的蛋白质进料样品测试其性能。确保病毒过滤器在使用前后的完整性至关重要。这些完整性测试确认了过滤器的性能，检查了缺陷或损坏，验证了符合制造商规格，验证了正确的安装，并且重要的是，进行了最终用户病毒保留研究。常用的非破坏性测试包括气泡点、前向流动、水侵入和二元气体测试。如果使用后的过滤器完整性测试失败，则重复过滤过程。过滤器供应商通常与药品制造商合作以满足这些要求。11.3.其他方法 11.3.1.色谱法 在mAb纯化中使用的色谱法可以有效地将包膜和非包膜病毒与目标蛋白分离。例如，亲和色谱法就是一个例子。然而，它作为一种补充方法的有效性取决于纯化条件和病毒特性。需要评估以评估色谱法在一致清除病毒方面的能力。 11.3.2.洗涤剂 这种方法主要用于血液制品的生产。牛磺胆酸钠和三（正丁基）磷酸酯（TNBP）有效地处理血浆衍生产品以灭活包膜病毒。洗涤剂处理通过溶解其脂质膜来灭活病毒，防止其结合或感染细胞。然而，洗涤剂不能用于对抗非包膜病毒。 11.3.3.热处理 这种方法用于人类血浆衍生和动物衍生产品的病毒去除。湿法和干法热处理改变了病毒蛋白结构，使病毒失活。热处理对包膜和非包膜病毒都有效。然而，非包膜病毒需要极高的温度才能有效灭活。这可能会影响目标蛋白的功能或使其变性，引起关注。 11.3.4.紫外线辐照 伽马辐照用于动物衍生的原材料。如呼肠孤病毒和CVV等病毒已使用这种方法使其失活。精确控制操作参数对于一致性、有效性和可重复性至关重要。低剂量UV-C辐射（254 nm）可以破坏病毒核酸，用于基于紫外线的处理，而不影响目标蛋白。一些细小病毒的耐药菌株在使用UV-C灭活时显示出增加的脆弱性。 12.病毒去除验证 无论选择哪种病毒去除方法，关注在消除病毒方面的鲁棒性、可靠性和一致有效性至关重要。基于风险的方法可能需要在生产过程中采用多种灭活或去除方法，以有效消除包膜和非包膜病毒。使用反映实际过程条件的模型病毒进行常规病毒验证研究，以满足监管期望。1997年FDA指南《人或动物细胞系来源的生物技术产品的病毒安全评估》中指出：“对最终产品中没有传染性病毒的信心，在许多情况下不仅仅来自于直接检测它们的存在，还来自于证明纯化方案能够去除和灭活病毒。” 病毒保护评估程序包括选择无病毒细胞系、检查未加工散装、评估下游过程去除病毒的能力，最终测试产品以确认没有污染病毒。在下游处理过程中验证病毒去除涉及检查细胞基质、原材料、病毒灭活/去除和最终产品测试。尽管主细胞库（MCB）或工作细胞库（WCB）中没有病毒致病性或逆转录酶活性，但仍存在逆转录病毒或意外病毒污染的问题。电子显微镜可以检测到类似病毒的颗粒（VLPs）。显微镜检查不能确定可疑颗粒的生物学相关性，特别是它们的致病性，例如在杂交瘤细胞中存在大量A型颗粒，其致病性极低或不存在。尽管病毒样颗粒的数量与它们的致病性之间存在差异，但通常使用总减少因子来计算颗粒数量。很难排除未知病毒的可能性，未知病毒可能具有未知的潜在危险生理影响。病毒污染使开发特定检测变得复杂。没有准确和灵敏的检测，监测蛋白质药物下游阶段病毒的存在、去除或灭活变得困难。预防措施包括对生产细胞进行特定病毒的广泛检测，并在各个发酵阶段检测意外病毒。因此，验证病毒清除步骤受到高度重视，通常通过病毒挑战或添加研究来促进。这项研究涉及以已知滴度向产品中添加病毒，并在整个过程中使用致病性检测进行监测。病毒清除/滴度减少（以log10表示）通常在过程的各个阶段（如果不是全部）进行计算。病毒清除或灭活的研究需要使用与已知或疑似病毒相同属或科的相同病毒，或与它们密切相关的非特异性病毒。该程序评估在涉及已知病毒的操作中实现的病毒减少的总体水平。假设故意将病毒插入单元操作样品在特定步骤显示足够的清除，任何下游单元操作在这种情况下不应进行测试。由于病毒清除研究涉及的复杂性，重点放在少数有效的单元程序上以消除病毒。通常在下游过程中，一日志减少因子不会显著影响总体清除因子，通常为2-3。虽然确定过量清除（清除-风险）可能具有挑战性，但它应该是任何努力减轻病毒感染风险的关键方面。应避免在cGMP设施中进行病毒添加实验，除非在大规模生产中，这是例外。为了防止抛光阶段的潜在病毒负担，应在小规模试验中使用可扩展设备进行病毒验证实验，特别是在捕获和中间阶段。在有足够的病毒进行明智结论的情况下，应该单独考虑可能清除病毒的步骤。确认原位清洁和常用色谱柱和过滤系统的效率至关重要。分数阶乘设计适用于调查，因为可以实现100-1000的缩小因子。病毒清除测试通常在过程和产品生命周期中进行两次。第一次与生产临床阶段I材料相关，证明至少消除了两种不同的病毒。第二次涉及在生产阶段III材料期间消除四种不同的病毒。Xenotropic murine leukemia virus (XMuLV)、minute virus of mice (MVM)、Simian virus 40 (SV40)和pseudorabies virus (PRV)通常用作四种病毒模型，因为它们代表了潜在意外代理的各种特征。验证模型病毒必须与细胞系中怀疑的病毒相似或相同，或与可能感染细胞的病毒密切相关，例如重组或杂交瘤细胞的逆转录病毒。为了实现病毒的理想减少因子，模型病毒应该以高滴度产生，并且可以用灵敏的检测轻松检测。在浓缩病毒溶液以提高体积滴度时要小心，因为病毒颗粒聚集可能导致通过过滤机械去除增加但可忽略不计，或由于病毒颗粒在聚集体中心的防御而减少灭活。用作感染源的模型病毒包括SV40、人类脊髓灰质炎病毒1、动物细小病毒、副流感病毒或流感病毒、Sindbis病毒、RNA病毒和鼠类逆转录病毒。在涉及哺乳动物细胞培养或生物材料的情况下，通过下游处理实现病毒清除，类似于对细菌污染进行无菌测试的验证。使用适当的单元过程进行添加实验，以评估病毒清除的影响。为了确保单个中间体的病毒分布平衡，将负载的病毒滴度与处理后的含产品分数（例如色谱过程的流穿或洗脱液或过滤过程的渗透液）的（残留）病毒滴度进行比较。在大多数情况下，病毒灭活在两步程序中发生（快速阶段1和慢速阶段2）。在不同时间间隔采取样本，至少有一个时间点小于最小暴露时间，用于构建灭活曲线。定量致病性检测应该是灵敏的、可重复的，并进行足够的重复以确保统计有效性。检测病毒污染的检测通常由于测试技术的生物学性质而产生高度可变的结果，因此需要对检测的准确性、可重复性、重复性、线性、定量限和检测限进行广泛的验证。客观的统计评估是必要的，正如FDA的“考虑要点”、EMEA的“指导说明”、ICH指南和其他来源所强调的。形成斑块和细胞病理学检测是定量病毒清除研究中两种最常见的体外检测方法，都经过验证并常规用于确定病毒滴度。Q5A，ICH协调三方指南的第四阶段，提供了对测试的更深入的见解。 在对工艺样品进行滴定之前，探索缓冲溶液可能如何与检测细胞相互作用或降低模型病毒的致病性至关重要。用于病毒滴定的各种检测细胞，如SC-1细胞（逆转录病毒）、CV-1细胞（SV 40）、L 929细胞（呼肠孤病毒）和Vero细胞（PI3），被采用。XC斑块测定能够长时间检测逆转录病毒。该程序涉及用样品接种SC-1细胞，紫外线照射细胞层，并在特定培养期后用XC细胞覆盖。一旦细胞层形成斑块，就进行计数。逆转录病毒感染的细胞单层结构决定了斑块或浓缩形成单位（pfu/FFU）的滴度。对于不形成斑块或病灶但引起细胞病理效应（CPE）的病毒，滴度表示为TCID50（组织培养感染剂量，使总细胞数的50%感染）。由于常用腐蚀性溶液使病毒变性或被过滤膜基质捕获，因此在包括色谱或过滤保留阶段的洗涤和再生在内的整个工艺周期中保持病毒分布是不可能的。批准的病毒滴度通常在10^7到10^9 mL^-1范围内，但由于需要1:10-20的添加进行验证实验而减少1 log。由于检测细胞体积的限制，通常使用0.1-1.0 mL进行滴定，对所有工艺流体进行滴定在技术上具有挑战性。单元活性降低因子计算涉及处理前后的工艺流体体积和病毒滴度。降低因子以log10单位表示，由每个操作的“单独降低因子”（Ri）组成。在纯化过程中组合的特定降低因子产生总体病毒降低因子。病毒清除的累积仅对具有不同物理化学措施的步骤有效。表示90%滴度降低的1日志降低因子由于检测的可变性而在病毒清除中被认为是微不足道的。电子显微镜量化细胞培养液中的病毒颗粒，但在不同发酵规模的样本代表性方面却是一个挑战。培养中的细胞，在每毫升10^6到10^7个细胞的密度下，经过几次对数降低后，通过电子显微镜分析的细胞减少到大约10^3/mL。在来自准备过程的颗粒物质中识别病毒颗粒需要专业知识。样本准备方法，如高速离心，通常产生复杂的聚集体，使病毒识别变得模糊。验证纯化过程的风险评估涉及逐个案例评估多个因素，包括细胞基质、病毒性质、培养方法、目标蛋白、工艺设计、预期产品用途、患者人群以及给药剂量/频率。尽管将病毒清除验证外包给专业实验室很常见，但由于时间、成本或资源限制，复制某些病毒设置在生产设施中可能会带来挑战。 13.产品浓缩 切向流过滤（TFF）是用于来自大肠杆菌和CHO系统的产品的标准程序。其主要功能包括澄清、浓缩和纯化蛋白质。在TFF系统中，流体沿膜表面切向注入，其中一些进料组分在压力下穿过膜进入滤液侧。无法通过膜孔的大颗粒和分子被保留，并被交叉流扫走，防止膜堵塞并提高通量（图11.10）。 图 11.10 切向流过滤 TFF根据进料中分离分子的大小进一步分类。超滤（UF）是最普遍的形式，将蛋白质与缓冲成分（例如，缓冲液交换、脱盐和浓缩）分离。膜孔径范围为1至20 nm，有效分离1kD至1000 kD范围内的蛋白质（称为名义分子量限制，NMWL）。压力驱动的超滤过程保留了较大的分子（蛋白质产品），使较小的分子通过。这种分离主要是由于在施加压力下通过膜的成分的过滤速率变化所致。超滤膜通常采用聚砜、聚醚砜、聚偏二氟乙烯和再生纤维素等聚合物。它们的微孔结构控制选择性、分子保留和过滤通量（例如聚乙烯）。由于它们对强力清洁剂、酸和高温的抵抗力，这些膜可以重复使用而不会显著降低性能或带来污染风险。纤维素膜在渗透性和保留性方面优越，广泛用于蛋白质应用，优先考虑成功的工艺所需的高保留。在选择正确的膜时，需要考虑的因素包括NMWL等级、化学兼容性和污染限制（表11.8）。在制造过程中，两种常见的UF系统包括病毒过滤和高性能切向流过滤（HPTFF）。HPTFF通过利用大小和电荷的差异实现分离。通过改变缓冲液pH和离子强度来增加产品和杂质之间的差异，从而最大化效率。特别是在mAb纯化技术中，HPTFF有效地去除了宿主细胞蛋白（HCP）和宿主细胞DNA污染物。 透析过滤（DF）是一种TFF技术，将蛋白质缓冲液转化为可保存和可稳定的形式。它与超滤或其他分离方法合作，以提高产品产量或纯度。在透析过滤过程中，缓冲液进入循环罐，而滤液退出设备服务。通常，目标蛋白产品位于保留液中，透析过滤将组分从保留液冲洗到滤液中，将缓冲液交换和不需要的杂质去除/减少结合到一种技术中。透析过滤可以以批处理或连续体积模式进行。批处理模式涉及向循环罐中添加大量缓冲液，浓缩保留液，并重复该过程，直到达到所需的透析体积数。连续体积模式通过以与滤液去除相同的速率添加缓冲液来维持保留液体积，比批处理模式提供更受监管的产品浓度。DF步骤的主要目的是从保留液产品中去除不需要的缓冲液或污染物种，根据使用的透析体积数量影响产量。UF/DF配方步骤是一个不可或缺的、被广泛采用的阶段，处理最高的产品浓度，主要在其最终配方中 - 下游处理的一个组成部分。UF/DF操作内部的演变强调鲁棒性、高产量和成本效益。此外，UF/DF在色谱步骤之前或之间用于缓冲液交换和产品浓缩过程的标准位置。在此过程中，保留液罐包含目标蛋白产品，而膜组件保留进料。进料泵通过切向流和压力将进料通过膜推进。传统的批处理模式操作涉及多次循环进料和保留液通过过滤组件，直到达到所需的蛋白质浓度。此外，过程监控工具、测试产品回收的设备和清洁方法确保操作一致性和所需的产量。TFF系统包括传统的不锈钢和更近期的一次性方法，由中空纤维或盒式组件构建。自动化一次性系统的出现，带有一次性流路和较低的体积保持，提高了灵活性，降低了交叉污染风险，并由于最小化的清洁任务而加快了周转（图11.11）。 图 11.11 超滤/微滤系统示意图 近年来，单次通过TFF（SPTFF）获得了显著地位 - 这是批处理模式操作的高级版本。在这里，在通过过滤组件单次通过后，保留液达到足够的浓度，无需循环。这种高通量和回收归功于进料通道中停留时间的增加，这是由降低流速或更长的路径长度带来的。SPTFF特别适用于色谱或其他具有大处理体积的中间步骤之间的体积减少步骤。 无论操作模式如何，明确工艺目标——最终产品浓度、杂质去除、体积减少和缓冲液交换至关重要。这种清晰度最大化了工艺效率，使得在商业级别进行稳健和一致的放大操作的精确规划成为可能。至关重要的是，优化TFF（UF/DF）的过程参数以最小化产品损失。TFF（UF/DF）工艺的几个关键过程参数值得考虑：• 透膜压力（TMP）指的是横跨膜的压力差。它决定了推动进料通过膜所需的力量。滤液流量增加，直到在特定的TMP水平达到平稳。当蛋白质浓度上升或进料流速下降时，TMP下降，直到通量达到平稳（图11.12）。最佳活性发生在维持高通量而不施加过多压力或膜处蛋白质浓度过高的TMP。 • 交叉流速由进料通道类型决定，是溶液在进料通道中横向穿过膜的速度。相同的TMP下更高的交叉流速导致通量增加，可能会使更多产品通过，导致产品降解。为了对抗这一点，平衡增加的通量与更多的泵通过次数和保持体积对于适当的交叉流速至关重要。 • 膜面积根据总处理体积和过程通量确定。虽然选择更长的过程时间可能会减少膜面积和保持体积要求，但过低的值可能会损害产品质量（导致降解或污染）。建议包括一个安全裕度以考虑污染和进料流的变化。 • 在大多数应用中，滤液控制用于目标产品保留在保留液中，没有控制设定点，并且可能无限制地运行。对于与超滤结合的透析过滤操作，确定透析过滤过程的起点至关重要。高浓度配方通常更受青睐，尤其是当注射体积较低时（在大多数单克隆抗体的皮下给药中很常见）。然而，不同的药物模式，如抗体药物偶联物、双特异性抗体、细胞和基因疗法，已经促使对现有的TFF系统进行调整（例如，一次性系统、SPTFF、增强监控和预灭菌即插即用选项）。 图 11.12 DP准备活动的示意图 14.分析方法 下游处理主要旨在减少或消除与过程和产品相关的污染物，以获得纯化的产品。制造过程中的中间测试调整过程参数，确保整体过程控制。这些分析程序是阶段分析技术（PAT）的基础。监测与产品相关的杂质，如高分子量和低分子量物种、糖变体和电荷变体，对于整体保护产品至关重要（对于mAb产品）。目前可用的方法已经取得了很大的进步，使得中间测试成为一个关键工具。改进包括高通量技术，使得能够快速处理样品，更快地周转，可以有效地支持下游操作，特别是依赖特定分析测试的操作，例如，装载和下游单元操作的最佳操作需要了解细胞培养基中的产品浓度（即滴度），以及随后的产品池，同样对于产品浓度步骤也是如此。在确定测试适用于大规模操作时，必须考虑该阶段产品的性质，例如，易降解性，以评估过程保持条件并最小化在这种情况下的测试时间。 对于由大肠杆菌生产的重组蛋白，扫描电子显微镜（SEM）使用细胞破碎和回收分析（CDRA）评估包含体的形态和大小。SEM有助于评估细胞破碎方法和培养条件对包含体发展的影响。传统的平板方法涉及在均质化前在选择性和非选择性培养基上平板裂解样品，然后孵化12-24小时。在琼脂平板上计数细胞以确定每次通过后的均质化效率。如收获和澄清程序中的浑浊度测量，监测离心过程以回收包含体。SDS-PAGE是评估回收操作中包含体纯度的宝贵工具。它在制定洗涤溶液策略和评估宿主细胞相关蛋白污染物的减少方面特别有用。此外，这种方法有助于检查蛋白质的溶解和复性。通过在非还原条件下的SDS-PAGE分析，可以分析地检测分子间（和偶尔的分子内）二硫键。这涉及用碘乙酰胺（防止错误的二硫键交换）顺序处理蛋白质，然后在没有还原剂的情况下用SDS处理。如RP-HPLC、SDS-PAGE和分析SEC等技术是迅速评估变性或复性程度的明确选择。然而，甚至可以使用表面等离子共振（SPR）和光散射。定性和定量方法在确定有利于溶解和复性的条件方面都很有用。 各种标准分析测试旨在确定蛋白质滴度，同时监测单元操作中与过程和产品相关的去除。估计蛋白质滴度的方法包括UV280nm、RP-HPLC、Bradford测定、Lowry测定、Octet和ProA HPLC。对于聚集体分析，SDS-PAGE、CE-SDS和分析尺寸排除方法是估计低和高分子量物种的常用方法。电荷变体分析通常涉及CEX-HPLC和iCE。有几个商业HCP试剂盒可用于监测与过程相关的杂质，提供定制抗HPC-抗体的选项。这些试剂盒主要是基于ELISA的，自动化免疫分析系统也提供他们的HCP试剂盒。 15.下游处理设备和系统组件 下游处理包括多种设备和辅助组件，通常称为支架，复杂程度各不相同。特定于下游操作的设备通常包括： • 缓冲液准备和存储系统。 • 细胞破碎和离心（微生物过程）。 • 纯化系统/色谱分离。 • 过滤系统（膜过滤、深层过滤等）。这些过程中使用的设备必须在各个规模（实验室、中试和商业规模生产）上提供灵活性，同时确保由于设备选择而不会降解或损坏产品。药物制造商和设备制造商之间的合作对于满足特定过程需求量身定制的用户需求规范（URS）至关重要。生物加工的重大进展导致了用于纯化和膜过滤操作的完全自动化支架的开发。一次性色谱支架由于其快速周转和消除清洁和清洁验证要求而越来越受欢迎。支架支持高效设置和简化处理，每个单元或系统组件都考虑到过程要求和功能操作而设计。关键设计特点包括： • 过程控制单元/功能系统，其中处理产品（例如，色谱柱、膜过滤器等）。 • 自动化系统使传感器与过程控制系统中的检测单元连接/通信，以允许操作和监控。提供各种硬件/软件平台，可选定制配置。 • 进气和排气系统（例如，缓冲液罐、保持罐等）连接到过程控制单元和其他二次配件，包括管道、阀门、泵等。 • 测量设备/探头/传感器用于控制和监控过程（例如，pH、电导率、UV、压力传感器）。制造商通常在将制造支架交付给用户设施之前进行工厂测试。随后，在现场安装和资格认证练习（IQ、OQ）以验证规格，然后才在制造操作中使用该设备。 16.传感器、探头和仪表 对于上游生物反应器操作，在线或内置监测和控制过程参数很常见。下游过程监测参数包括： • 流速、pH、电导率和色谱单元操作的紫外线， • 澄清、过滤的压强、流速/速度， • 流速、浓度因子、压强、电导率、蛋白质浓度、温度。监测各种参数作为控制回路的反馈，优化过程。监测数据存储在自动化系统中，允许趋势分析并包含在批处理文档中（例如，紫外线分析、纯化过程中的色谱图，TFF系统中的压力监测（TMP））。pH、电导率、温度和压力通常使用内置或离线探头或传感器进行监测（表11.9）。 及时监测关键过程参数对产品质量有重要贡献，了解过程影响和高效过程。传感器设计取决于单元操作和产品/蛋白类型。例如，在色谱中，内置传感器应检测蛋白质、核酸、碳水化合物、盐、流速，并执行压力安全检查。离线仪器通常确定由处理条件导致的产品质量。 16.1.紫外线监测 紫外光谱对于下游单元操作至关重要，测量大约280nm（有时高达340nm）处的芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）的吸收，以扫描从柱子洗脱的不同蛋白质。紫外线监测有助于色谱分离，系统有时具有自动零点功能，以标准化基线紫外线吸收。在某些TFF应用中，UV单元监控蛋白质通过膜的突破。这对于高浓度蛋白质很有用。或者，紫外线传感器也可以安装在保留液线上，以确定保留液的回收率，以最小化最终产品的稀释并最大化总产量。傅里叶变换红外光谱（FTIR）根据多肽中的酰胺键振动（二级结构）对蛋白质进行表征，评估结构变化。 16.2.pH监测 pH测量作为过程控制、缓冲标准和适当的反应环境。pH探头（玻璃或塑料）在每次操作前进行校准，但不应暴露于极端的电导率值。 16.3.电导率监测 电导率测量在监测色谱和过滤操作中起着至关重要的作用。它们用于监督或调节梯度操作，例如离子交换色谱或疏水作用色谱，其中增加的盐浓度有助于洗脱。在透析过滤操作中，测量电导率有助于跟踪进度并确定何时达到目标过程电导率。此外，电导率测量提供了过滤操作中滤器平衡的见解，并作为原位清洁（CIP）的终点。探头策略性地放置在保留液和渗透液线上，以监控缓冲液交换并在冲洗操作期间测量电导率。 16.4.压力传感器 压力传感器广泛应用于生物处理操作中，主要作为设备和操作者的安全措施。例如，在TFF中，压力传感器监测透膜压力（TMP），检测盒式和高系统压力之间的压力差。如果压力激增，关键是停止进料泵。同样，在色谱柱和深层过滤系统中，随着时间的推移监测压力降作为性能参数的指标。在产品湿润应用中，通常使用内置隔膜传感器，而其他传感器或仪表覆盖非产品接触区域。 16.5.温度 在下游处理中并不普遍需要温度控制，但特定操作偶尔需要控制温度。这些操作在温度控制的生产区域内进行。对于可能需要控制温度的复性操作，罐（夹套容器）连接到循环冷却器，以帮助保持所需的温度。温度对pH和电导率测量的影响很大。校准和测量应在相同的温度下进行，或者使用仪表的控制选项进行手动温度补偿是必要的。一些pH计具有自动温度补偿功能。鉴于缓冲液在不同温度下表现出不同的pH值，使用校准温度下的缓冲液值至关重要。大多数新仪表包括NIST校准。监测样品的温度、pH和电导率可能是有利的。 16.6.流量计 流量计通过提供实时监测来控制操作流速至关重要。它们通常集成到色谱和过滤系统中。高精度内置和非侵入式流量传感器通常用作内置组件，能够在管道内双向测量。在切向流过滤（TFF）系统中，质量流量或磁感应流量计测量保留液和渗透液侧的流量。流量在操作规模扩大时尤其重要，确保在不同规模上系统性能一致。磁流量计比质量流量计便宜，但需要最低液体电导率以准确测量流量。 16.7.空气传感器 空气传感器在色谱系统中发挥关键作用，通过检测样品或缓冲液的结束，防止空气进入系统。这种保护功能保护柱子免受空气造成的潜在损坏，并允许自动装载。值得注意的是，空气传感器作为非侵入性设备运行。 17.流路 在色谱和过滤系统中，流路是一个重要组成部分，可以由塑料或不锈钢制成。在生物处理操作中，首选一次性流路，因为它易于插入/拔出选项。这些预组装和预灭菌的流路便于快速即插即用功能。此外，一次性流路套件附带有关可提取物和可浸出的文件，以满足监管要求（例如，Cytiva流路套件，QuantaSep 300 SU系统与一次性流路Sepragen，Repligen的PROCONNOX）。因此，流路应有效地适应低容量过程。 18.泵 泵在上游和下游操作中都具有重要意义，适用于广泛的应用，从泵送培养基和培养物到缓冲液和娇嫩的蛋白质溶液。为特定过程选择合适的泵需要仔细考虑许多因素，包括流速要求、液体的物理性质、剪切敏感性和压力需求。在蠕动泵中，当流体进入泵头时，它被夹在两个滚筒之间。这种运动创造了一个空隙，导致管道被滚筒封闭。流体和空隙之间的交替导致流动产生脉冲而不是平稳运行。所有泵都存在脉冲，但无脉冲流动可以更好地控制流速并进行更精确的定时操作。减少脉冲的方法包括使用可调阻塞的泵头、采用多滚筒设计、利用脉冲阻尼机制或修改排放管道布局。进液管线通常在泵系统中被忽视，它通过管道或管道输送源流体材料。对进液管线进行注水是必要的，这个特性可能是泵本身的一部分 - 可以自注水或不可以自注水。自吸泵即使从空管中也可以抽取进料液，而非自吸泵在操作前需要在其管线中有液体。较短的进液管线可以通过减少能源消耗和延长泵的寿命来提高操作效率。此外，它有助于最小化空化现象，这种空化现象会显著降低泵的性能和耐用性。空化是由于流体中压力波动导致气泡形成，使液体流的压力降至被泵送液体的蒸汽压力以下。这些微小的气泡崩溃，导致附近组件损坏。不同类型的泵对进液管线有特定的要求以实现最佳功能。例如，离心泵需要直接而简洁的进液管线。进液管线的最高点是泵入口，它必须保持紧密、无漏气的连接以确保正确的泵操作。在磁力驱动泵中，保持进液管线长度最短并将其逐渐安装到泵上可以防止气泡形成。进液管的直径应与泵的进液尺寸相匹配或超过它。另一方面，隔膜泵需要一个不塌陷、加强的进液管线。关于生物过程中最常用的泵： • 蠕动泵通常用于一次性或可处置应用，由于其与柔性管道（例如，硅胶）的兼容性。然而，这些泵有局限性，例如由于泵头的不断运动和摩擦，管道容易断裂。因此，建议不要将它们用于高粘度液体或高流速，这可能会有产品损失或污染的风险。 • 转子泵：适用于高粘度液体和大体积，但容易受到流体中硬颗粒的损坏。通过使用流量计的变频驱动进行速度控制是常见的。 • 隔膜泵：主要用于下游操作，如色谱法，有多种压力等级可供选择，适用于需要100多巴压力的高压色谱应用。 19.阀门 阀门调节系统内的产品和缓冲液流动，影响压力-流动特性。不锈钢、聚丙烯（PP）、聚偏二氟乙烯（PVDF）和聚醚醚酮（PEEK）等材料常用于阀门制造。各种类型的阀门适用于不同的生物制药制造操作：用于一次性系统中的软、柔性管道的夹管阀，用于低压操作的隔膜阀，以及在HPLC系统中广泛使用的球阀。 20.内联过滤（无菌过滤和颗粒过滤） 过滤是下游过程中的重要操作，应用于收获澄清、缓冲液和溶液准备、色谱法以及最终产品的最终过滤等阶段。通常采用微滤、超滤、纳滤和通过无菌级过滤器的直接流动过滤。标准流动过滤涉及将进料直接通过膜进行过滤，称为直接流动或死端过滤。这种方法通常用于色谱单元操作和无菌过滤，如病毒过滤，通过从缓冲液和进料中去除颗粒，减少生物负荷，有效保护色谱柱。为了优化过滤参数，评估过滤面积、孔隙率和滤芯配置至关重要。放置在过滤单元上游和下游的压力传感器通过估计压力差来监测和控制过滤操作，发出何时需要更换过滤器的信号。对于颗粒和微生物的去除，膜孔径范围从0.1微米到10.0微米。在上游和下游操作中使用的过滤器进行使用前和使用后的完整性测试。进行诸如气泡点测试、前向流动测试、水侵入测试和双气体测试等测试。这些测试测量湿润膜阻止气体自由流动的能力，使用气泡点和前向流动测试进行测量。干疏水膜用作阻止水自由流动的屏障，在水侵入测试（HydroCorr测试）中使用非湿性流体。双气体测试中使用两种气体混合物，其渗透性差异很大。该测试涉及确定湿润膜上游和下游的气体混合物的组成。如果使用后完整性测试失败，则进行重新过滤。在考虑生物生产过程时，选择和规范设备应主要与操作需求保持一致。随着生物处理中过程强化的出现，更小规模的设备具有潜在优势，特别是在满足毒理学和临床研究的产品数量要求方面。此外，较小的支架提供兼容性优势，并促进一次性技术的实施。大多数下游处理设备由不锈钢制成，由于腐蚀风险，这在需要极端条件的操作中带来局限性。聚丙烯、EPDM、PTFE和PEEK等塑料常用于管道、测量室、阀门和垫圈。pH和UV传感器通常使用玻璃组件。包括不锈钢在内的许多元素被认为是可提取的，需要药物制造商和供应商之间进行测试和文件记录。随着目标产品在最终药物物质或药物产品准备中向增加的纯度迈进，对无菌或无菌条件的需求加剧，要求流程路径和产品接触表面进行卫生设计。传统的清洁方法涉及使用不同浓度的腐蚀性溶液进行诸如柱子和过滤膜清洁、设备维护以及其他消耗品的任务。如果需要，也可以应用蒸汽灭菌。一次性系统替换了几个组件，显著减少了清洁程序并加快了周转时间。 21.总结 开发稳健的下游过程并满足产品质量要求的成功取决于每个单元操作的效率和回收率。产品损失可能会对产品的经济可行性产生重大影响，强调需要系统化的方法来确定每个单元操作的目标和期望。例如，三阶段纯化计划并不一定要求所有制造过程都进行三个色谱阶段。决策应以纯度标准和蛋白质的预期用途为指导。虽然平台流程可以简化处理类似产品的多产品设施中的操作，但需要评估对这种方法的调整。下游操作通常有固有的局限性。例如，色谱树脂在色谱程序中对使用寿命、批间变异性、清洁、再生过程和病毒清除能力方面的挑战。应探索针对减少处理时间和通过过程强化简化过程的优化工作。诸如根据杂质水平调整介质体积的策略可以最小化树脂和缓冲液消耗，同时提高经济可行性。优先考虑过程效率、鲁棒性和可扩展性至关重要。诸如将色谱步骤整合到多模式过程中、持续处理以及采用消除与包装、清洁和维护相关的复杂性的一次性系统的创新方法已经获得了关注。尽管它们的实施仍然有限，但这些技术为提高生产力和灵活性提供了机会。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。