Understanding the molecular basis that influences the viscosity behavior of antibodies is essential for the development of high-concentration antibody therapeutics. In this study, we investigated the pH-dependent viscosity behavior of four IgG₄ antibodies and dissected the structural and physicochemical factors contributing to their viscosity profiles. Two antibodies (mAb2 and mAb3) showed marked viscosity increases with rising pH, whereas the viscosity of mAb1 and mAb4 remained largely unchanged. To explore the mechanisms behind this divergence, we performed molecular dynamics simulations, surface charge mapping, and measurements of protein-protein interaction coefficients (k_D). Antibodies with increasing viscosity over pH displayed significantly larger solvent-accessible surface areas (SASA), prominent negative surface charge patches in the Fv region, and stronger intermolecular attraction at elevated pH. These trends were further validated by viscosity reduction under high-salt conditions, suggesting a key role of electrostatic interactions. These findings highlight that solvent exposure and localized charge distributions act synergistically to promote self-association, offering a framework to better understand and mitigate antibody viscosity in molecular design and formulation.

2025-06-01·INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES

Increasing the developability of lambda chain antibodies: engineering to confer protein L binding activity and its consequences

Article

作者: Jolivet, Louis ; Boursin, Fanny ; Alvarenga, Larissa Magalhães ; Fonseca, Mariana Fernandes ; Prado-Costa, Bianca ; Aubrey, Nicolas ; Dupeyrol, Gaëlle

Antibody engineering is essential to the development of commercially viable biotechnological tools. Within this context, Protein L (PpL) is commonly used to purify antibodies due to its ability to bind to the variable light chain. However, one limitation is that protein L does not bind to lambda chain antibodies, which negatively influences their developability. Therefore, the objective of this study was to utilize the lambda antibody mAb3 (an anti-Acanthamoeba IgG) as a template to construct recombinants fragments with protein L binding ability and associated benefits. We were able to produce four functional mAb3-derived scFvs, two of them capable of binding PpL, as demonstrated by PpL-affinity purification, ELISA and western blotting. In addition, it was possible to optimise the thermal stability of one of the PpL-binding scFvs by up to 8.7 °C compared to the original sequence, reaching a melting temperature of 67.2 °C, while maintaining high production yields. The scFvs also conserved the same reactivity profile against Acanthamoeba antigens as the parental molecule. Based on the PpL-binding scFvs, minibody and scFv-Fc fragments were also expressed, all of which retained the PpL-binding and antigen recognition profiles. In conclusion, this study demonstrates that with a few mutations, lambda chain antibodies can be optimized to increase their developability as potential therapeutic or diagnostic molecules.

2025-03-01·BIODRUGS

An Automated Tool for Glycosimilarity Assessment of mAb Therapeutic Biosimilars: Trastuzumab and Bevacizumab as Case Studies

Article

作者: Shrivastava, Anuj ; Patil, Sanjeet S ; Shah, Rohan ; Rathore, Anurag S

BACKGROUND:

With the expiration of patents for multiple biotherapeutics, biosimilars are gaining traction globally as cost-effective alternatives to the original products. Glycosylation, a critical quality attribute, makes glycosimilarity assessment pivotal for biosimilar development. Given the complexity of glycoanalytical profiles, assessing glycosimilarity is nontrivial.

OBJECTIVE:

This study proposes a Python-based automated tool for rapid estimation of glycosimilarity index (GI).

MATERIALS AND METHODS:

A comprehensive analytical glycosimilarity comparison of the trastuzumab originator product, Herclon (Roche), with five marketed biosimilars:Trasturel (Reliance Life Sciences), Canmab (Biocon), Vivitra (Zydus Ingenia), Hertraz (Mylan), and Biceltis (Cipla), has been performed. Similarly, a comparison between the bevacizumab originator product, Avastin (Roche), and its five biosimilars: Abevmy (Mylan), Krabeva (Biocon), Ivzumab (RPG LifeSciences), Bryxta (Zydus), and Advamab (Alkem Labs), is presented. Glycan profile has been assessed using liquid chromatography-fluorescence detection, and the data have been integrated using the XGBoost-machine learning algorithm to quantify glycan composition. The GI has been calculated by combining profile similarity and compositional similarity, estimated on the basis of the criticality and tolerance of each glycan.

RESULTS:

The tool enabled rapid GI estimation (< 1 min/sample) with reduced errors compared with Excel (> 10 min/sample). Biosimilars exhibited high GI with several exceeding 95%, while the lowest GI observed were 87.80% for trastuzumab and 92.39% for bevacizumab.

CONCLUSIONS:

The Python-based tool offers a high-throughput and a reliable platform for glycosimilarity assessment, outperforming traditional analysis. Minor variations in glycosylation patterns were observed among the biosimilars, suggesting a modest glycosimilarity variation (GI range between 80 and 100%). However, the limited number of innovator batches analyzed constrained the establishment of definitive tolerance limits. Future studies should focus on analyzing larger datasets to improve accuracy and define precise tolerance limits, enhancing the tool's reliability and its potential to accelerate biosimilar development.

项与贝伐珠单抗生物类似药(Zydus Cadila Healthcare Ltd.) 相关的新闻（医药）

2026-07-03

·SM4Life

2026年上半年，FDA批准了哪些新药上市？

2026年上半年，美国FDA药品评价和研究中心（CDER）共批准了22款新药上市，绝大部分为全新分子实体（NME）与创新生物制品，部分为现有药物的复方，覆盖肿瘤、罕见病、代谢疾病、感染性疾病、中枢神经等多个治疗领域，诞生了全球首个PROTAC蛋白降解剂、首个口服非肽类GLP-1受体激动剂、首款丁肝疗法等多个里程碑式产品。 1、组氨酸铜（Copper histidinate）商品名：Zycubo 研发公司：Sentynl Therapeutics 适应症：用于0-17岁儿科患者Menkes病（门克斯病，ATP7A基因突变导致的铜转运缺陷病）的治疗作用机制：作为铜替代疗法，以组氨酸铜复合物形式皮下给药，绕过患者肠道铜吸收缺陷，直接补充生物可利用铜，恢复赖氨酰氧化酶、多巴胺β-羟化酶等铜依赖性酶的生理功能，改善神经发育与多器官功能异常。2、地法米司特（Difamilast）商品名：Adquey 研发公司：Acrotech Biopharma（原研为大冢制药）适应症：2岁及以上患者轻中度特应性皮炎的局部外用治疗作用机制：新型非甾体类磷酸二酯酶4（PDE-4）抑制剂，通过抑制PDE-4活性升高细胞内环腺苷酸（cAMP）水平，减少炎症因子与趋化因子释放，缓解皮肤炎症与瘙痒，无激素相关副作用。3、米沙哌酮（Milsaperidone）商品名：Bysanti 研发公司：Vanda Pharmaceuticals 适应症：成人精神分裂症，以及双相I型障碍相关的躁狂或混合发作作用机制：非典型抗精神病药物，通过5-HT₂A受体拮抗、多巴胺D₂受体部分激动、5-HT₇受体选择性拮抗三重机制，稳定多巴胺与5-羟色胺信号，同时改善认知与睡眠，降低锥体外系反应与体重增加风险。4、培精氨酸酶（Pegzilarginase-nbln）商品名：Loargys 研发公司：Immedica Pharma 适应症：联合饮食蛋白限制，治疗2岁及以上成人和儿童精氨酸酶1缺乏症（ARG1-D）导致的高精氨酸血症作用机制：酶替代疗法，为经PEG修饰的重组人精氨酸酶1，可将血浆中过量的精氨酸分解为尿素和鸟氨酸，快速持续降低血精氨酸水平，缓解其神经毒性，是该罕见病首款病因治疗药物。5、那维培肽（Navepegritide）商品名：Yuviwel 研发公司：Ascendis Pharma 适应症：用于2岁及以上、骨骺未闭合的软骨发育不全儿童患者，促进线性生长作用机制：长效C型利钠肽类似物，通过靶向激活利钠肽受体C（NPRC），调控软骨细胞增殖与分化，改善长骨生长；每周一次皮下给药，是首款针对该疾病的每周一次疗法。6、利奈昔巴特（Linerixibat）商品名：Lynavoy 研发公司：葛兰素史克（GSK）适应症：成人原发性胆汁性胆管炎（PBC）相关的胆汁淤积性瘙痒作用机制：全球首款针对该适应症的口服回肠胆汁酸转运体（IBAT）抑制剂，通过阻断胆汁酸的肠肝循环重吸收，减少血液循环中致瘙痒介质，从根源缓解PBC患者难治性瘙痒症状。7、艾可奇肽（Icotrokinra）商品名：Icotyde 研发公司：强生（Janssen）与Protagonist Therapeutics联合开发适应症：12岁及以上、体重≥40kg的中重度斑块状银屑病患者，适合系统治疗或光疗作用机制：全球首款口服IL-23受体抑制剂，为环肽类分子，以皮摩尔级亲和力结合IL-23受体，阻断下游炎症信号通路；每日口服一次，疗效接近注射型生物制剂，突破了IL-23靶点只能注射给药的局限。8、替维度酶α（Tividenofusp alfa-eknm）商品名：Avlayah 研发公司：Denali Therapeutics 适应症：体重≥5kg的亨特综合征（黏多糖贮积症II型，MPS II）儿科患者，改善中枢神经系统受累表现作用机制：经工程化改造的酶替代疗法，可穿透血脑屏障，替代患者缺失的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，降解中枢与外周组织中蓄积的硫酸乙酰肝素，是首款能有效改善MPS II中枢症状的药物。9、瑞拉克兰特（Relacorilant）商品名：Lifyorli 研发公司：Corcept Therapeutics 适应症：联合白蛋白紫杉醇，治疗接受过1-3线系统治疗（至少一线含贝伐珠单抗）的铂耐药上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌作用机制：选择性糖皮质激素受体（GR）拮抗剂，通过竞争性结合GR，解除皮质醇对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，增强化疗药物的细胞毒性，且不影响其他甾体受体功能。10、艾可德胰岛素（Insulin icodec-abae）商品名：Awiqli 研发公司：诺和诺德适应症：改善成人2型糖尿病患者的血糖控制作用机制：每周一次的长效基础胰岛素类似物，通过氨基酸修饰与脂肪酸侧链结合，实现与白蛋白可逆结合，缓慢释放活性单体，半衰期长达8天；每周一次皮下注射即可平稳控制基础血糖，提升患者用药依从性。11、奥格列龙（Orforglipron）商品名：Foundayo 研发公司：礼来（Eli Lilly）适应症：联合低热量饮食与增加体力活动，用于成人肥胖或超重合并至少一种体重相关合并症的长期体重管理作用机制：全球首款获批的口服非肽类GLP-1受体激动剂，通过结合GLP-1受体跨膜区的别构位点激活受体，抑制食欲、延缓胃排空、调节糖脂代谢；无需空腹服用，突破了传统GLP-1药物需注射或严格空腹的限制。12、多拉韦林/艾拉替韦复方（Doravirine and Islatravir）商品名：Idvynso 研发公司：默沙东（Merck）适应症：作为完整治疗方案，用于病毒学抑制稳定、无病毒学治疗失败史、无多拉韦林耐药相关突变的成人HIV-1感染者，替代现有抗逆转录病毒方案作用机制：每日一次单片复方，由非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTI）多拉韦林，与新型核苷逆转录酶转位抑制剂（NRTTI）艾拉替韦组成；艾拉替韦通过阻断逆转录酶转位过程抑制病毒复制，对多耐药毒株仍保持强效活性，二者耐药谱互补。13、维地司群（Vepdegestrant）商品名：Veppanu 研发公司：Arvinas与辉瑞（Pfizer）联合开发适应症：治疗至少接受过一线内分泌治疗后进展、携带ESR1突变的ER阳性、HER2阴性晚期或转移性乳腺癌成人患者作用机制：全球首款获批上市的PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）药物，为异双功能小分子：一端结合雌激素受体（ER，含突变型），另一端招募E3泛素连接酶CRBN，形成三元复合物后诱导ER泛素化，被蛋白酶体彻底降解；从“抑制靶点”升级为“清除靶点”，可克服内分泌治疗耐药。14、索托克拉（Sonrotoclax）商品名：Beqalzi 研发公司：BeOne Medicines（百济神州）适应症：治疗接受过至少两线系统治疗（包括布鲁顿酪氨酸激酶BTK抑制剂）的复发/难治性套细胞淋巴瘤成人患者作用机制：新一代高选择性BCL-2抑制剂，通过结合抗凋亡蛋白BCL-2，解除其对细胞凋亡的阻断，诱导肿瘤细胞凋亡；相比一代产品亲和力更强、半衰期更短，毒性累积风险更低，是美国十年来首款全新BCL-2抑制剂，也是首个获批该适应症的BCL-2药物。15、巴曲司他（Baxdrostat）商品名：Baxfendy 研发公司：阿斯利康（AstraZeneca，原研CinCor Pharma）适应症：联合其他降压药物，用于成人高血压治疗作用机制：高选择性醛固酮合酶（CYP11B2）抑制剂，特异性抑制肾上腺醛固酮合成，不影响皮质醇生成；针对难治性高血压效果显著，为高血压治疗提供了精准的内分泌调控新路径。16、布林韦肽（Bulevirtide-gmod）商品名：Hepcludex 研发公司：吉利德科学（Gilead Sciences）适应症：治疗无肝硬化或伴代偿期肝硬化的成人慢性丁型肝炎病毒（HDV）感染作用机制：美国首款获批的慢性丁肝治疗药物，为合成脂肽，通过结合肝细胞表面的牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）受体，阻断HDV与HBV的病毒进入过程，抑制病毒感染与扩散，填补了丁肝领域长期无药可用的空白。17、匹维单抗舒尼汀（Pivekimab sunirine-pvzy）商品名：Decnupaz 研发公司：艾伯维（AbbVie，原研ImmunoGen）适应症：成人浆细胞样树突状细胞母细胞性肿瘤（BPDCN，超罕见血液肿瘤）作用机制：CD123靶向抗体药物偶联物（ADC），由靶向CD123（IL-3受体α链）的人源化单抗，与DNA烷基化有效载荷DGN549偶联；结合肿瘤细胞后内吞，释放 payload 形成DNA链间交联，诱导细胞凋亡，是8年来BPDCN领域首款新药。18、头孢吡肟/齐德巴坦复方（Cefepime and Zidebactam）商品名：Zaynich 研发公司：Wockhardt 适应症：治疗由敏感革兰阴性菌导致的成人复杂性尿路感染（cUTI），包括肾盂肾炎作用机制：新型抗感染复方，第四代头孢菌素头孢吡肟抑制细菌细胞壁合成，齐德巴坦兼具β-内酰胺酶抑制与青霉素结合蛋白2（PBP2）结合双重作用，二者协同增强对多重耐药革兰阴性菌的抗菌活性，为耐药菌感染提供新的治疗选择。19. 通用名：恩西特韦（Ensitrelvir）商品名：Xocova 研发公司：盐野义制药（Shionogi）适应症：用于成人及12岁以上青少年接触COVID-19感染者后的暴露后预防作用机制：口服3CL蛋白酶抑制剂，通过阻断新冠病毒主蛋白酶（Mpro/3CLpro）的活性，抑制病毒复制与成熟；此前已获批新冠治疗适应症，本次新增暴露后预防用途，为密接人群提供主动防护手段。20. 通用名：环泊酚（Cipepofol）商品名：Cypsedo 研发公司：海思科医药集团（Haisco Pharmaceutical）适应症：成人手术中的全身麻醉诱导作用机制：GABA_A受体正向变构调节剂与直接激动剂，为丙泊酚类似物，通过引入环丙基结构提升受体亲和力；麻醉起效快、注射痛更轻、血流动力学更稳定，是首款由中国企业自主研发并获FDA批准的静脉麻醉创新药。21. 通用名：加多曲胺（Gadoquatrane）商品名：Ambelvist 研发公司：拜耳（Bayer）适应症：用于成人与儿科患者（含足月新生儿）的磁共振成像（MRI），检测与显示血管异常病变（中枢神经系统及全身各部位）作用机制：新一代四聚体大环钆基对比剂，凭借独特的四聚体结构实现超高弛豫率，信号增强效率显著优于传统产品；仅需0.01mmol/kg剂量即可达到同等成像效果，钆暴露量较传统大环对比剂降低60%，适合长期反复检查的患者。22. 通用名：替比培南匹伏酯（Tebipenem pivoxil）商品名：Utebzi 研发公司：GSK与Spero Therapeutics联合开发适应症：用于口服治疗选择有限或无替代方案的成人复杂性尿路感染（含肾盂肾炎），由敏感菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等）引起作用机制：美国首款获批的口服碳青霉烯类抗生素，为前药设计，口服吸收后经酯酶水解释放活性成分替比培南，通过结合青霉素结合蛋白抑制细菌细胞壁合成；抗菌谱广、对多数β-内酰胺酶稳定，可替代静脉碳青霉烯用于序贯治疗，提升患者便利性。 2026年上半年FDA获批新药呈现三大趋势：一是技术平台突破，PROTAC、口服GLP-1小分子、穿血脑屏障酶替代疗法等前沿技术首次落地商业化；全球首款PROTAC蛋白降解剂获批，正式开启“靶点清除”的新药研发范式；口服非肽类GLP-1激动剂、穿血脑屏障酶替代疗法、口服碳青霉烯抗生素、醛固酮合酶抑制剂等首创机制集中问世，药物作用模式从传统靶点抑制向降解、阻断、功能替代多维度拓展，ADC、ASO等成熟技术也持续迭代新靶点与新载荷。二是罕见病与未满足需求优先，超半数获批药物针对罕见病或难治性适应症；治疗领域分布上，罕见病与肿瘤仍是核心赛道，超半数新药针对超罕见遗传病与难治性肿瘤，持续填补无药可用的临床空白；肿瘤领域向耐药细分人群深耕，覆盖ESR1突变乳腺癌、铂耐药卵巢癌、PTEN缺失前列腺癌等精准亚型。同时代谢、抗感染、中枢神经领域同步迎来重磅突破，肥胖、难治性高血压、慢性丁肝等适应症均迎来全球首创疗法。三是中国创新药出海加速，环泊酚等本土研发产品成功登陆美国市场。研发主体上，医药巨头与Biotech深度协同成为主流，礼来、诺和诺德、辉瑞等通过自研+BD领跑重磅赛道，Arvinas、Denali等Biotech凭借前沿技术实现首款产品商业化；中国创新药出海进入收获期，两款本土自主研发新药成功获批，全球创新贡献度持续提升。往期精选： 1、2026，FDA获批新药预测TOP10：基于最新三期临床数据，这些药物将改写临床治疗格局！ 2、2026年前两月FDA批准首次进入临床一期的5款小分子药物全解析：涵盖炎症、肿瘤、神经退行性疾病！ 3、2025年FDA批准上市的小分子新药到底长啥样？结构、机制、疗效，一文全梳理 4、2026 Q1 FDA批准的8项小分子IND申请，谁将领跑赛道？ 5、继ADC之后的下一个新赛道：全球临床阶段的抗体核酸偶联药物（AOC）玩家大盘点！

2026-06-24

·Cytiva学堂

文献速递丨MAM引领Protein A填料全生命周期管理新纪元

在单克隆抗体（mAb）药物的商业化生产中，Protein A亲和层析填料一直是不可或缺的核心耗材。然而如何准确评估填料的状态、寿命和清洁效果，长期以来困扰着广大药企。 2026年3月，礼来（Eli Lilly and Company）研究团队发表了一项开创性研究，首次将多属性方法（Multi-Attribute Method, MAM）系统性地应用于Protein A填料分析，为填料的全生命周期管理提供了全新的分子级视角【1】。 Protein A填料的经济账 Protein A亲和层析填料在生物制药生产中被广泛用作单克隆抗体以及Fc融合蛋白纯化的首要捕获步骤【2】，目前全球已有超过200种治疗性抗体上市，同时还有1000多种候选药物正在接受评估【3】，2024年全球治疗性抗体市场规模约2500亿美元，预计到2029年这一数值将翻倍至5000亿美元【4】。然而，Protein A亲和填料也是单克隆抗体药物生产中最大的成本因素之一，当生产规模的Protein A层析柱直径超过100 cm时，填料支出可能超过百万美元【5】。 Cytiva作为行业领先的供应商，MabSelect系列填料涵盖了从经典到工程化改造配基的完整产品线，其中MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX和MabSelect PrismA这四款Protein A填料是本次礼来团队的核心研究对象。研究用的填料样本不仅涵盖了完全未使用的全新填料，还收集了来自礼来工业制造管线中历经112至291次实际纯化周期的旧填料。一把MAM钥匙开多把锁 Protein A填料污染主要源于进样料液中成分的非特异性吸附，包括宿主细胞蛋白（HCP）、单克隆抗体聚集物或片段、以及其他杂质在颗粒表面及内部的累积，从而堵塞孔道并限制与配基的接触【6】。传统研究Protein A填料的污染和降解需要借助颗粒分析、HPLC、荧光光谱、SDS-PAGE、电子显微镜等多种技术平台进行组合拳式评估，不仅费时费力，且难以获得分子层面的完整信息。以往用于蛋白质结构表征的MAM技术通过将液相色谱与高分辨率质谱联用（LC-HRMS），能够在单次分析中同时获取填料身份鉴别、配基完整性、化学修饰、残留杂质、清洁效果等多个关键质量属性（CQA）【7】。图1：MAM流程示意图，胰蛋白酶消化-C18反相液相色谱-高分辨率质谱-BYOS软件数据分析 MAM方法被用于填料全生命周期管理的三个关键方面：确认Protein A配基的身份识别与污染和清洗相关的化学修饰，以指导合适的CIP策略评估使用后填料上残留的mAb和HCP污染身份鉴别：分子指纹锁定填料类型在GMP生产中，由于同时使用多种具有不同配基和基质的填料，需要一种可靠的识别方法以防止标签错误或交叉污染。尽管傅里叶变换红外光谱（FTIR）、配基密度测量和结合能力分析等技术较为常见，但这些方法往往缺乏用于准确鉴定填料所需的特异性。作为更有效的替代方法，MAM通过利用Protein A配基独特的氨基酸序列，使用胰蛋白酶酶解并结合C18反相液相色谱与高分辨率质谱分析，可生成特异性的肽段图谱，这种“分子指纹”能够可靠地确认不同类型的填料身份（图2）。图2：MabSelect系列填料的肽段图谱从图2中可以看到，未经改造的MabSelect填料保留了天然Protein A的五个免疫球蛋白结合域（E、D、A、B、C domain），其肽段图谱最为复杂；而MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX填料采用重复Z结构域的工程化改造配基，图谱相对简洁且完全相同。值得注意的是，尽管这两款填料配基序列一致，但MabSelect SuRe LX的总峰面积更高，实现了分析层面的明确区分。配基完整性：揭示填料的耐碱稳定在Protein A亲和层析纯化抗体过程中，循环经历上样、冲洗、洗脱以及高pH CIP操作会使Protein A填料长期暴露于多重化学应力之下，这些条件容易诱发蛋白配基发生氧化、脱酰胺与断裂等修饰，继而削弱配基的完整性与填料性能。礼来研究团队对三组新、旧Protein A填料进行了MAM对比分析，其中来自礼来工业制造管线的3款旧填料：MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX分别历经了116次、291次、112次的实际纯化周期（表1）。表1：三组礼来工业管线MabSelect填料的CIP方法和纯化周期与全新填料相比，使用过后的MabSelect填料表现出整体信号强度的降低，而图3中黑色箭头所标示出的MabSelect填料肽段明显缺失，很可能是由于反复暴露于酸性洗脱和碱性清洗条件下导致的配基裂解所致。图3：MabSelect新旧填料的肽段图谱对比（红色：历经116 cycles后的旧填料，蓝色：新填料） MAM分析进一步展示了MabSelect SuRe填料在历经近300次纯化循环后，肽段图谱和新填料近乎相同，这得益于MabSelect SuRe工程化改造配基所增强的碱性降解抗性。图4中多个肽段位点表现出天冬酰胺脱酰胺（3′, 4′, 5′）和天冬氨酸异构化（3′′,5′′），这两类现象均对pH波动极为敏感，这表明即便是耐碱Protein A配基在重复低pH洗脱与高pH CIP循环过程中仍然容易受到累积性化学修饰的影响。图4：MabSelect SuRe新旧填料的肽段图谱对比（红色：历经291 cycles后的旧填料，蓝色：新填料）清洁效果：从“看不清”到“看得透” 宿主细胞蛋白（HCPs）是在单克隆抗体生产过程中引入的工艺相关杂质，可能影响终产品的安全性和有效性，传统检测方法例如ELISA和LC-MS方法只能检测洗脱液中的可溶性杂质，而吸附在填料表面的杂质往往被忽略，仍与Protein A配基强结合的HCPs和残余的mAbs可能无法被常规流程捕获【8】。 MAM最令人兴奋的应用在于其能够直接检测残留在填料基质上的mAbs和HCPs，MAM方法直接对填料进行酶切分析，彻底解决了这一盲点。礼来研究团队为评估杂质累积情况，对三种填料MabSelect、MabSelect SuRe 和 MabSelect SuRe LX 进行了MAM分析，检测结果如表2所示。表2：三款旧填料的残余mAbs以及HCPs 对于未经改造的MabSelect填料，历经116次纯化循环后不仅含有大量的目标MAB1残留，且检测到了多种不同HCPs，包括肌动蛋白以及血小板应答蛋白TSP-1等。相比较之下，经过291次纯化循环的MabSelect SuRe仅残留0.38%的MAB2，同时HCPs也低于系统检测限，这充分体现出工程化改造配基在抗杂质积累和可清洁性方面的显著优势。值得注意的是，尽管MabSelect SuRe LX在112次纯化循环后的HCPs 低于系统检测限，但是残留MAB3含量却远高于近300个纯化循环的MabSelect SuRe填料，这极大概率是由于采用不同CIP策略导致的：MabSelect SuRe填料采用了0.1 M NaOH和1 M醋酸的交替清洗，而MabSelect SuRe LX仅仅采用了0.05 M NaOH+1 M NaCl的低浓度碱洗（表1），碱液浓度的降低使得填料表面残留mAb的富集趋势更为明显。基于LC-MS的MAM分析可同时定量Protein A填料上残留的mAbs和HCPs，并在反复使用后对化学修饰进行图谱分析，从而提高工艺监测和故障排查的灵敏度和特异性。总结与展望礼来团队的研究首次将MAM从蛋白的表征领域拓展到填料分析，建立了一个填料全生命周期管理的新体系。随着下一代Protein A填料向更高结合能力、更高配基密度和更强耐碱稳定性持续进化，能够解析细微分子变化的高级分析工具将变得日益关键。 MAM应用在未来无疑将为生物制药行业的填料选择、清洁优化和生命周期管理提供前所未有的精准洞察，助力更稳健、更高效、更可持续的下游工艺开发。相关阅读： protein A与抗体亲和互作机理浅析声明：本文为作者原创首发，严禁私自转发或抄袭，如需转载请联系并注明转载来源，否则将追究法律责任参考文献 1、 Zhang, J.; Larsen, M.; Blanc, T.; Parekh, B.S.; Hsieh, M.-C. The Multi-Attribute Method (MAM), An Advanced LC-MS Approach for Protein A Resin Performance and Lifecycle Evaluation. Antibodies 2026, 15, 26. https://doi.org/10.3390/antib15020026 2、 Rathore, A.S.; Narnaware, S. Purification of Therapeutic Antibodies by Protein A Affinity Chromatography. Methods Mol. Biol.2022, 2313, 169–177. 3、 Crescioli, S.; Kaplon, H.; Wang, L.; Visweswaraiah, J.; Kapoor, V.; Reichert, J.M. Antibodies to watch in 2025. MAbs 2025,17, 2443538. 4、 Monoclonal Antibody Therapeutics Market: Growth, Size, Share, and Trends. 2024. 5、 Rathore, A.S.; Pathak, M.; Ma, G.; Bracewell, D.G. Re-use of Protein A Resin: Fouling and Economics. BioPharm Int. 2015, 28,28–33. 6、 Jiang, C.; Liu, J.; Rubacha, M.; Shukla, A.A. A mechanistic study of Protein A chromatography resin lifetime. J. Chromatogr. A2009, 1216, 5849–5855. 7、 United States Pharmacopeial Convention. <1060> Mass Spectrometry-Based Multi-Attribute Method for Therapeutic Proteins.In USP–NF. USP <1060> Mass Spectrometry-Based Multi-Attribute Method for Therapeutic Proteins; United States Pharmacopeial Convention: Rockville, MD, USA, 2025. 8、 Yao, Y.; Wen, X.; Pan, H.; Chen, Z. Residual host cell proteins: Sources, properties, detection methods and data acquisition modes. Front. Microbiol. 2025, 16, 1658366.

2026-05-25

·艺药荟

基因泰克研究：基于靶向整合的CHO细胞池实现单抗和双抗的快速GMP生产

欢迎加入“艺药荟”知识星球，持续尊享学习资源! 经典阅读：摘要单克隆抗体(mAb)是对抗包括COVID-19、埃博拉病毒、呼吸道合胞病毒、艰难梭菌和炭疽在内的许多急性传染病的有效治疗剂。因此，单克隆抗体有助于抗击未来的大流行。不幸的是，单克隆抗体的开发通常需要数年时间，限制了其在大流行期间拯救生命的潜力。因此，“大流行单克隆抗体”的研发时间需要缩短。一种加速工具是“延迟克隆”，它利用基于靶向基因整合(TI)的新型中国仓鼠卵巢(CHO)技术。CHO细胞库而非CHO克隆可用于I/II期临床材料生产。然后，最终的CHO克隆(生产具有相似产品质量特征且优选具有更高滴度的单克隆抗体)可用于III期试验和商业化生产。这种替代可将时间缩短~3个月。我们评估了我们的新型CHO TI平台以实现延迟克隆。我们创建了四个独特的CHO细胞库，表达三种独特的单克隆抗体(mAb1、mAb2和mAb3)以及一种双特异性单克隆抗体(BsAb1)。然后，我们对mAb1和mAb2进行了单细胞克隆，从每个细胞库中鉴定出三个高表达克隆。CHO细胞库和克隆在Ambr15生物反应器中并排接种。CHO细胞库产生的单克隆抗体滴度高达10.4g/L(mAb3)和7.1g/L(BsAb1)。亚克隆产生的CHO克隆相对于CHO细胞库表达更高的滴度，同时产生相似的产品质量特征。最后，我们通过进行为期3个月的细胞老化研究表明CHO TI细胞池是稳定的。总之，我们的CHOTI平台可以提高未来“大流行单克隆抗体”进入临床的速度。 1 | 引言在新冠疫情全球大流行期间，全球每日确诊死亡人数于~15000年1月达到峰值，为每日2021人，导致~7万例与新冠相关的确诊死亡病例。如果未来发生大流行，每天有~10000人死亡，提前~100天(即~3个月)开发并施用有效疗法，可挽救额外~1万人的生命。然而，要实现这一节省时间的目标，需要实施创新解决方案。在新冠疫情期间，部分措施是通过使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞库(而非CHO克隆)来生产I/II期临床试验材料。单克隆抗体(mAb)开发中的一个主要限速步骤发生在细胞系开发阶段:单细胞克隆和单克隆性保证至少会使开发时间增加3个月。目前使用CHO细胞库进行mAb的现行药品生产质量管理规范(GMP)生产，为几种新冠mAb疗法在2020年11月获得紧急使用批准铺平了道路，2020早于2020年12月mRNA疫苗获得紧急使用批准。除了提前获得紧急批准外，分析表明新冠mAb是降低住院率和死亡率的非常有效的工具。我们认为并非所有CHO细胞系都是一样的，正如我们之前对三种mAb的研究所表明的那样——在从同一CHO宿主进行稳定转染并随后进行单细胞克隆以产生相同mAb而生成的多个细胞系中，观察到细胞生长、生产力和产品质量存在相当大的差异。虽然一些研究表明单细胞克隆并不能保证CHO克隆是稳定的，但其他研究人员表明，采用现代CHO细胞系开发(CLD)技术(如转座酶介导的基因整合和TI)创建的CHO细胞库是稳定的，并且可以高滴度表达mAb并生产高质量的材料。因此，可能不需要单细胞克隆来生产用于GMP生产的细胞系。人用药品注册技术国际协调理事会(ICH)是一个制定生物制药行业指南以促进监管标准全球协调的组织。ICH Q5D文件(上次更新于1998年9月)通过规定“对于重组产品，细胞底物是含有所需序列的转染细胞，该细胞已从单个细胞祖细胞克隆而来”，阐明了单克隆性要求。单细胞克隆的要求部分源于该行业早期对杂交瘤技术的依赖，该技术产生多克隆细胞系。因此，需要单细胞克隆来分离产生mAb的细胞系。第一个被批准用于治疗用途的mAb是莫罗单抗-CD3(Orthoclone OKT)，于1985年获得FDA批准。它是由OrthoBiotech使用杂交瘤技术开发和生产的。尽管早期使用了杂交瘤技术，但生物制药行业转向了重组CHO细胞系和重组DNA技术来大规模生产mAb。到2022年，107种需要在哺乳动物细胞培养中表达的已批准生物治疗药物中有95种(89%)使用CHO细胞。目前，市场上仍在销售的仅有一种批准的生物制品，它采用传统杂交瘤技术(即CIS BioInternational生产的贝西莫单抗)。 CHO细胞与重组DNA技术的结合与使用杂交瘤技术生产mAb有着根本的不同。CHO细胞系代表表达单一目标mAb的单克隆群体，而杂交瘤技术产生表达多种抗体的多克隆细胞系。CHO CLD技术的细节已在众多综述论文中进行了总结。由于对CHO细胞库进行单细胞克隆会使药物开发时间至少增加3个月，从而可能延迟临床试验的启动，生物制药行业对此种公认的要求提出了一致的不同观点。具体而言，来自七家生物制药公司(安进、百时美施贵宝、渤健、基因泰克、杨森、礼来和辉瑞)的几位CHO专家在2016年的一篇白皮书中对单克隆性的必要性提出了质疑。研究人员认为，“监管重点应主要放在确保实际给予患者的材料的产品质量上，以及确保工艺一致性并在产品的整个生命周期内实施适当的控制策略”，而不是专注于保证单细胞来源。几位著名的学术CHO专家在随后的出版物中也对克隆性的必要性提出了质疑。在2016年至2019年期间的一系列论文和公开演讲中，美国食品药品监督管理局(FDA)的研究人员引用了该白皮书和国际人用药品注册技术协调会(ICH)的Q5D指南，并强调“生产细胞系的克隆衍生是一个可能对产品质量产生影响的因素”。由于越来越多的证据表明单细胞克隆并不能保证细胞系的稳定性，并且CHO细胞库可以是稳定的并能产生高滴度的高质量材料，生物制药公司决定通过在CHO细胞库中生产非临床材料来缩短药物开发时间线。来自六家不同公司(基因泰克、百时美施贵宝、辉瑞、礼来、渤健和安进)的研究人员在《生物技术进展》2017年11月/12月版的一个特别版块中发表了不同的细胞培养方法来生产非临床材料(例如用于药物非临床研究质量管理规范(GLP)毒理学研究的材料)。所有这些策略都通过在开始GLP毒理学研究生产之前不等待最终的CHO克隆被选定来节省时间。基因泰克的研究人员描述了一种方法，将48个CHO克隆(通过随机基因整合获得)汇集在一起。一组克隆不是一个CHO细胞库。百时美施贵宝的研究人员描述了一种随机基因整合微型库方法，在转染后将5000至10000个细胞接种到各个孔中。辉瑞的研究人员使用FLP/FRT重组创建了CHO靶向整合(TI)细胞库。辉瑞的研究人员报告了六种不同单克隆抗体的滴度为0.6至1.6g/L。礼来的研究人员利用猪尾巴转座酶介导的基因整合来创建CHO细胞库，四种独特单克隆抗体的滴度为3.5至5.0g/L。研究人员还进行了细胞老化研究，并使用多种正交分析技术证明CHO细胞库至少在55代内是稳定的。渤健的研究人员利用随机基因整合方法为三种独特的单克隆抗体创建了CHO细胞库。CHO细胞库的滴度范围为1.7-7.0g/L。安进的研究人员为一种单克隆抗体和一种Fc融合蛋白创建了CHO细胞库，并将CHO细胞库的性能与用于临床生产的克隆进行了比较。进行了细胞老化研究(~40代)，以使用多种正交方法成功证明CHO细胞库的稳定性。在2019冠状病毒病(COVID-19)大流行的早期，维里生物技术公司的布莱恩·凯利发表了一个方案，将一种“大流行单克隆抗体”的药物开发时间线从~12个月缩短到~6个月。凯利的~35建议之一是利用新的CHO细胞系开发(CLD)技术(例如TI)，并在I期药品生产质量管理规范(GMP)生产中使用CHO细胞库。来自维里、礼来、药明生物和帝奇安的研究人员在第七届加速生物制药开发国际会议(AccBio2·21)上解释了他们独特的加速时间线方法。一个关键要点是使用新的CHO CLD技术，如TI，来创建用于GMP生产的非克隆CHO细胞库。这些成功的抗COVID单克隆抗体药物开发者采用了“延迟克隆”，即使用CHO细胞库(非克隆库)来生产用于GLP毒理学研究的材料和I期/II期材料。在全球疫情之后，多个组织的研究人员发表了几篇论文(大多在2022年)，证明了他们各自专有的CHO平台适合使用CHO细胞库生产GMP材料，从而大幅缩短COVID-19治疗性单克隆抗体的CMC时间线。多篇报告表明，CHO细胞库具有可扩展性且适合GMP生产。药明生物报告称，使用WuXia平台，8种独特分子的CHO细胞库滴度在1.5-4.0g/L之间。此外，对于一种特定的单克隆抗体，当比较在3升、15升、50升、500升和2000升生物反应器中生产的不同批次的材料时，CHO细胞库(第1代)的产品质量概况与最终克隆(第2代)相似。药明生物的研究人员还报告称，7种独特单克隆抗体的CHO细胞库(第1代)和CHO克隆(第2代)的产品质量概况相似。默克雪兰诺的研究人员利用Leap-In转座酶系统为两种独特的单克隆抗体创建了CHO细胞库。滴度在1.3至6.0g/L之间。在非GMP的200升生物反应器中培养的CHO细胞库与GMP的2000升生物反应器中培养的CHO细胞库的产品质量概况相似。勃林格殷格翰(BI)的研究人员也利用Leap-In转座酶系统创建了一个用于GMP生产的稳定CHO细胞库。BI的研究人员报告称，该CHO细胞库(2000升规模)的滴度为~3.5g/L。最终克隆在80升和12,000L规模下的滴度为~5g/L。此外，CHO细胞库的产品质量概况与最终CHO克隆的相似。BI的研究人员还报告称，在不到3个月的时间内创建了GMP级原料药(DS)。Catalent的研究人员开发了一种基于phiC整合酶的名为GPEx Lightning的CHO TI平台。使用phiC整合酶将感兴趣的基因插入位于CHO基因组中的着陆垫。报告的CHO细胞库滴度在3至7g/L之间。此外，对40+代进行了稳定性研究。在细胞老化研究过程中，滴度和基因拷贝数保持稳定。最后，再生元的研究人员在细胞培养工程第十八届会议上报告了使用CHOTI细胞库(称为同基因细胞系)生成GLP-Tox材料以及用于COVID-19中和抗体的GMP生产。再生元的研究人员声称，使用他们基于Cre-LoxP重组的平台，从转染到创建研究细胞库仅需18天。我们最近描述了一种基于使用Cre/Lox重组将单克隆抗体基因靶向整合到位于CHO基因组转录热点的着陆垫上的CHO TI平台的开发。我们表明，在创建CHO克隆(最终用于生物制品的临床和商业生产)方面，TI明显优于随机基因整合方法。一些优势包括更高的产品滴度、增强的稳定性、低基因拷贝数以及减少序列变异发生的频率。在本研究中，我们旨在确定我们的CHO TI平台是否能够快速生产材料，以实现未来“大流行单克隆抗体”的GMP生产。具体而言，我们评估了一种延迟克隆策略，即使用CHO细胞库生产用于I/II期临床研究的材料，但最终使用具有相似产品质量概况的CHO克隆进行商业生产。 2 | 材料与方法 2.1 | 细胞培养 CHO细胞在基于专有DMEM/F12的培养基中于125mL个摇瓶容器中培养，摇瓶以150rpm,37℃转速振荡，且5%CO2。细胞以3×10^5个细胞/mL的接种密度每3-4天传代一次。 2.2 | 抗体质粒DNA构建为构建TI质粒单克隆抗体构建体(mAb1-3)，将抗体重链(HC)和轻链(LC)基因克隆到一个包含L3和LoxFAS序列的前载体，以及一个包含LoxFAS和2L序列和嘌呤霉素(pac)选择标记的后载体中。在双质粒系统中，pac的起始密码子位于前载体末端，而pac编码序列的其余部分位于后载体开头。对于双特异性抗体1(BsAb1)，HC#1和LC#1基因克隆到前载体中，而HC#2和LC#2基因克隆到后载体中。所有抗体基因均在CMV启动子之前，并在SV40poly(A)序列之后。Cre重组酶质粒(pOG231，来自GeoffreyWahl博士的团队)用于所有重组介导的盒式交换(RMCE)过程。 2.3 | CHO细胞库的生成与稳定克隆的生成通过MaxCyteSTX电穿孔法(MaxCyte公司，盖瑟斯堡，马里兰州)将表达质粒转染到靶向整合(TI)宿主细胞中。然后用嘌呤霉素和1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘)尿嘧啶(FIAU，Moravek公司)筛选重组酶介导的盒式交换(RMCE)转染细胞库。筛选后，使用美国纽约康宁公司的384孔板，通过有限稀释法对RMCE细胞库进行单细胞克隆(SCC)，目标密度为0.4个细胞/孔。将平板在37℃,5%CO2和80%湿度条件下培养2周，根据汇合度挑选克隆，并通过均相时间分辨荧光(HTRF)分析筛选抗体效价，以获得顶级单细胞克隆，用于扩大规模进行ambr15生物反应器评估。 2.4 | Amber15生物反应器 Amber15微型生物反应器实验在15mL工作体积下进行。采用了一种专利补料方案，接种后使用浓缩营养补料，并在12天的分批补料培养过程中按需添加葡萄糖。生物反应器培养中，溶解氧和搅拌分别维持在空气饱和度40%和1400转/分钟的设定值。通过添加CO2气体或0.5M Na2CO3将培养pH控制在7.20+/-0.03。培养温度维持在35℃。使用BioProfile FLEX2自动细胞培养分析仪(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的Nova Biomedical Corporation公司)分析培养样品中的活细胞浓度和活力。第12天的滴度通过带有紫外检测的蛋白A亲和色谱法测定。 2.5 | 通过数字液滴PCR进行基因拷贝数分析使用ddPCRTM超级混合物试剂盒(伯乐公司)进行数字液滴TMPCR(ddPCR)检测。每个20μLddPCRTM反应包含ddPCRTM1X预混液、900nM正向引物、900nM反向引物、250μM探针、3单位的HaeIII限制性内切酶和样品DNA。在室温下孵育10min后，使用自动液滴发生器(伯乐公司)生成液滴。PCR热循环条件为在95℃下10min，随后进行40个循环，94℃持续30s，60℃持续1min，然后在10min下98℃以使酶失活。PCR后，在QX200™液滴读数仪(伯乐公司)上读取液滴。使用Quanta Soft软件(伯乐公司)收集和分析数据。基于参考基因Bax和白蛋白的预期拷贝数对重链(HC)和轻链(LC)基因拷贝数进行归一化。本研究中使用的引物是使用PrimerExpressv3.0(赛默飞世尔科技公司)设计的。引物序列如下： 2.6 | 产品质量分析使用配备氟碳涂层毛细管柱(100µm×5cm)和两性电解质溶液的iCE280分析仪(Convergent Bioscience)，通过毛细管等电聚焦(cIEF)测量电荷变体。通过使280nm紫外线穿过毛细管并进入电荷耦合器件数码相机的镜头，获得聚焦抗体电荷变体的图像。通过亲水相互作用液相色谱(HILIC)和荧光检测测量聚糖。使用Sepax ZENIXSEC-300柱，在等度条件下，以pH7.2、150mM NaCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)为流动相，通过SEC-MALS分析大小变体。 2.7 | 使用流式细胞术进行群体分析为了检测抗体表达，细胞用与别藻蓝蛋白(APC)偶联的山羊抗人IgG亲和纯F(ab')2片段(Jackson Immuno Research Laboratories，西格罗夫，宾夕法尼亚州)在室温下染色30min，然后用PBS洗涤两次。使用FL4通道在4色FacsCalibur(Becton Dickinson，富兰克林湖，新泽西州)上进行流式细胞术分析以检测抗体。使用FlowJo_V8软件(Flowjo，阿什兰，俄勒冈州)进行数据分析。未转染的CHO细胞用作抗体表达的阴性对照。 3 | 研究结果 3.1 | CHO靶向整合细胞库产生了高产品滴度和高质量产品通过重组酶介导的盒式交换(Cre/Lox重组)在我们的CHO靶向整合平台中创建了针对四种不同分子(mAb1、mAb2、mAb3和BsAb1)的CHO细胞库，随后在选择培养基中进行为期~3周的筛选过程。筛选后，将CHO细胞库接种到ambr15生物反应器中。在为期12天的补料分批培养过程中，所有四种测试分子的产品滴度范围为5.2g/L(mAb1)至10.4g/L(mAb3)。在相同的12天补料分批培养过程中，BsAb1(一种四链双特异性抗体)的CHO细胞库滴度为7.1g/L(图1a)。除了产生高滴度外，根据多种正交技术，CHO细胞库还产生了高质量的产物。更具体地说，根据SEC-HPLC，所有三种单克隆抗体的所有四种分子的主峰百分比均>95%，双特异性抗体的主峰百分比>85%(图1b)。正如预期的那样，N-聚糖主要是GOF和G1F，对于所测试的两种糖基化单克隆抗体，Man5水平较低(图1c)。mAb3和BsAb1代表两种无糖基化分子。图1 Ambr15评估中CHO TI库的滴度和产品质量属性。(a)四个CHOTI库在第12天的滴度；(b)四个TI库的SEC-HPLC图谱；(c)mAb1和mAb2库的聚糖图谱。mAb3和BsAb1是无糖基化分子，因此没有聚糖图谱。 3.2 | 根据多种正交分析技术，CHO TI库在为期3个月的细胞老化研究中保持稳定表达mAb1、mAb2、mAb3和BsAb1的CHO库在含有选择试剂(嘌呤霉素)的滚动摇瓶种子培养体系中传代3个月。尽管其他CHO研究人员已证明在1.5至2个月的细胞老化研究(~40至~55代)过程中具有稳定性，但我们希望将细胞老化研究延长至远超所需的最短时间，即3个月，并在~100代后测量稳定性。在每个月(第1、2和3个月)末，细胞被冷冻保存。在细胞老化研究结束时，所有细胞样本在选择培养基中同时解冻，并使用多种正交技术进行进一步检测。图2 Ambr15评估中细胞老化后CHO TI库在第12天的最终滴度。CHO库分别老化1、2和3个月。在不同时间点对细胞进行冷冻保存。在细胞老化研究结束时，将细胞同时解冻，并在ambr15生物反应器运行中进行评估。从ambr15生物反应器收获时，确切的解冻后细胞年龄分别对应于28天(第1个月；~31代)、57天(第2个月；~62代)和85天(第3个月；约93代)。首先，将细胞接种到ambr15生物反应器中。在为期12天的补料分批培养过程结束时，对样品进行产品滴度和产品质量分析(即SEC-HPLC的主峰百分比、N-聚糖分析和clEF的电荷变体图谱)。此外，通过ddPCR测量重链和轻链基因的拷贝数。第1、2和3个月样品从ambr15生物反应器收获时确切的细胞年龄分别为28、57和85天(解冻后)。细胞年龄是通过假设时间零点对应于含有特定CHO库的冷冻小瓶的解冻来计算的。尽管进行了长达3个月(约93代)的细胞老化研究，但CHOTI库似乎是稳定的。图2显示，所有四种分子在第1、2和3个月的CHOTI库的滴度相似。表1显示，所有四种分子在第1、2和3个月的CHOTI库的产品质量指标相似。图3a、b显示，所有四种分子在第1、2和3个月的CHOTI库的重链和轻链基因拷贝数相似(在测定变异性范围内)。同样，通过流式细胞术生成的细胞染色直方图显示，所有四种分子在第1、2和3个月的CHOTI库均有单一的高表达群体(图4)。表1 Ambr15评估中不同年龄的CHO TI细胞池的产品质量属性。注意:mAb3和BsAb1是去糖基化分子，因此无法获得N-聚糖谱。图3 不同年龄的CHO TI库的重链和轻链基因DNA拷贝数。条形图代表三次技术重复的平均值(误差条为标准差)。(a)重链拷贝数；(b)轻链拷贝数。图4 不同年龄的CHO TI细胞池的FACS分析图谱。细胞用APC偶联的抗人IgG染色。在FacsCalibur上检测抗体表达。未转染的宿主细胞用作抗体表达的阴性对照(前浅灰色峰)。后深灰色峰来自CHO TI细胞池。 3.3 | 延迟克隆:CHO TI克隆株的滴度高于CHO TI细胞池，但产品质量概况相似我们使用CHO TI平台对两种糖基化分子(mAb1和mAb2)测试了一种延迟克隆策略。我们采用简单的有限稀释法进行单细胞克隆(使用图1中的相应CHO细胞池)。图5显示，mAb1的三个顶级克隆株中有两个(从小克隆筛选中鉴定)的滴度均为>10g/L(是亲本CHOTI细胞池滴度的两倍)。不仅所有三个顶级克隆株的滴度都很高，而且关键产品质量属性(SEC-HPLC的主峰、电荷变体概况和N-聚糖)与亲本CHO细胞池相似。此外，图5显示，mAb2的顶级克隆株的滴度为~10g/L(高于亲本CHO TI细胞池的~7g/L)。不仅所有三个顶级克隆株的滴度都很高，而且关键产品质量属性(SEC-HPLC的主峰、电荷变体概况和N-聚糖)与亲本CHO细胞池相似。 mAb1和mAb2的顶级克隆株的滴度远高于其各自的亲本CHO TI细胞池，这并不奇怪。在TI平台中，特定克隆株的滴度并非仅由基因拷贝数决定。一种可能的解释是，亚克隆诱导的表观遗传变化导致分离出更高滴度的细胞系。图5 前三个克隆的CHO TI库及相应的滴度(a)和产品质量属性(b-e)。(a)滴度(b)高分子量聚集体百分比分布图(c)电荷分布图(d)次要N-聚糖分布图(e)主要N-聚糖分布图。有趣的是，我们通过这种方法的小规模克隆筛选分离出了少量的CHO克隆(每个单克隆抗体~50个克隆)。相比之下，对于标准的克隆和表达筛选(CLD)，我们通常每个项目分离并筛选数百个单个CHO克隆，以鉴定一个同时产生高滴度和高质量产物的细胞系(此外还要稳定且不产生任何序列变体)。我们想评估小规模克隆筛选是否能鉴定出一个产生的滴度和产物质量与亲本CHOTI库相似的单个CHO克隆。尽管进行了小规模克隆筛选(每个单克隆抗体约50个克隆)，单细胞克隆产生的克隆对于mAb1和mAb2的滴度都更高，且产物质量谱与库相似，这表明我们的TICHO平台采用延迟克隆方法是可行的。 4 | 讨论 4.1 | 缩短单克隆抗体药物的研发周期对于应对未来的大流行至关重要近期的新冠疫情让我们想起了致命传染病快速传播所导致的发生频率、致命性和经济损失。在有记录以来的~3200年里，共发生了~250次全球大流行(每~13年发生一次大流行)。这些大流行造成了~400百万人死亡。为了预防或减轻下一次大流行的影响，世界需要更有效的治疗手段，包括疫苗、小分子药物和生物制剂。单克隆抗体已被证明是对抗许多传染病的有效疗法。除了抗新冠单克隆抗体外，还有已获批用于治疗埃博拉、呼吸道合胞病毒、艰难梭菌和炭疽感染的单克隆抗体，mAbs针对寨卡、登革热和流感等其他传染病的单克隆抗体也正在研发中。由于单克隆抗体在~40年的时间里一直保持着总体安全且对一系列不同疾病高度有效的记录，它们仍然是一类有吸引力的治疗药物。依赖单克隆抗体来应对下一次大流行的一个缺点是典型单克隆抗体的药物研发周期很长(通常以年为单位)。如前所述，在新冠疫情开始时，VirBiotechnology的BrianKelley发表了一份方法，描述了如何加速“大流行单克隆抗体”的药物研发周期。其中一个建议是利用新的CHO技术(如TI)，并将这些CHO TI细胞池用于一期临床材料的GMP生产(而不是等待最终的CHO克隆)。更具体地说，Kelley主张并行进行标准细胞系开发工作流程，随后使用最终的CHO克隆进行三期和商业化生产(延迟克隆)。几家公司成功利用这一策略在创纪录的时间内开发出了新冠单克隆抗体。根据图6，利用我们的CHO TI平台创建用于一期临床材料GMP生产的CHO TI细胞池可将CMC周期缩短~3个月。图6 大流行单克隆抗体的传统与加速细胞系开发及CMC时间表的比较 4.2 | 靶向基因整合是CHO TI库稳定性的关键卫生当局强调了细胞系稳定性对于在生产生物制品时尽量减少关键性能指标和产品质量的批次间差异的重要性。有许多例子表明，CHO细胞系的细胞老化增加与重组蛋白表达水平降低相关。随着细胞老化而出现的这种表达降低归因于多种因素，包括基因沉默和基因拷贝数丢失，但与冷冻保存无关。有趣的是，在这些例子中，许多CHO细胞系源自随机基因整合，随后进行单细胞克隆，包括我们之前对随机整合产生的细胞系的经验。显然，单细胞克隆和单克隆性保证并不能确保随后的CHO细胞系是稳定的。相比之下，有几个CHO库在细胞老化后是稳定的例子。礼来公司的研究人员使用piggyBac转座酶和Leap-In转座生成了CHO库，并将这些CHO库与随机基因整合对照进行比较。在这两种情况下，随机整合库都是不稳定且异质的，而CHO库(由两种不同的转座子介导的基因整合方法产生)即使在~55代/细胞倍增后也是稳定的。如引言中前面所述，Catalent的研究人员在一项超过40代的细胞老化研究中展示了CHO TI库(由PhiC整合酶产生)的稳定性。著名的CHO细胞专家最近强调了TI(相对于随机基因整合)作为克服历史上在源自随机基因整合的CHO细胞系中观察到的许多稳定性问题的一种手段的优越性。鉴于我们在为期3个月的细胞老化研究(约93代)中显示的CHO库稳定性以及礼来公司和Catalent研究人员报告的CHO库稳定性数据，基因整合方法与其他因素(如稳定且高产的基因整合位点)相结合，而不是单细胞克隆过程，可能是创建用于生物制品GMP生产的稳定CHO细胞系的更关键因素。因此对于TI平台，选择良好的CHO宿主细胞系、鉴定稳定且高产的热点、质粒载体工程、转染条件、选择条件和宿主细胞工程在决定成功方面都起着至关重要的作用。 4.3 | 延迟克隆的多重益处在本研究中，我们评估了我们的CHO TI细胞系开发平台(基于靶向基因整合)，以生产一种未来的“大流行单克隆抗体”。我们之前曾报道，我们的CHO TI细胞系相较于基于随机基因整合的传统CHO细胞系开发平台具有许多优势。这些优势包括产生稳定的CHO克隆，其具有高滴度、所需的产品质量特征且序列变体频率低。在本研究中，我们表明我们的CHO TI平台还能产生具有高滴度、所需产品质量且稳定的CHO细胞池。因此，我们的平台适用于加速药物发现工作流程，该流程需要使用CHO细胞池进行GMP生产。鉴于高产品滴度，这些CHO细胞池能够轻松支持临床试验。假设总体工艺回收率为70%，单次2000L生物反应器运行可生产7kg的mAb1最终药物产品(~5g/L×2000L×70%)。同样，单次2000L生物反应器运行(~10g/L×2000L×70%)可生产14kg的mAb3药物产品。为了更好地理解这些数字，礼来公司针对COVID-19单克隆抗体巴尼韦单抗的I期试验仅需要0.06kg的材料(6名患者×700mg单剂量+6患者×2800mg单剂量+6名患者×7000mg单剂量=63g)。同样，礼来公司针对巴尼韦单抗单药治疗的II期试验(ACTIV-2/A5401研究)仅需要~0.8kg的材料(223名患者×700mg单剂量+94名患者×7000mg单剂量=814g)。因此，一个CHO TI细胞池单次2000L生物反应器运行就能轻松生产出足够的GMP材料，以支持“大流行单克隆抗体”的I/II期临床试验。我们还证明，使用我们的平台，单细胞克隆能够产生具有相似产品质量特征的更高滴度细胞系。创建高滴度细胞系对于高产量产品尤为有利。为了更好地理解这些滴度，考虑一种高产量治疗药物，预计每年原料药峰值需求为3000kg/year。如果我们假设这种高产量产品是一种“大流行单克隆抗体”，每位患者剂量为700mg，那么每年3000kg可生产约430万剂。假设在2000L生物反应器中进行商业化生产，总体工艺回收率为70%，一个5g/L的CHO细胞池每年需要~430次运行才能满足全球需求。相比之下，一个10g/L的CHO克隆每年仅需要一半的运行次数(约215次)。因此，由于细胞系滴度更高，能够更快地生产出救命剂量。为了满足未来“大流行单克隆抗体”快速且大量的需求，将需要高滴度的CHO克隆。因此，应采用延迟克隆方法，即使用最终的高滴度CHO克隆(而非中等滴度的CHO细胞池)进行商业化生产。需要明确的是，我们并不主张在传统(非大流行)药物开发的GMP生产中普遍使用CHO细胞库。即使ICH Q5D和其他监管指南得到更新，并且卫生当局最终认可在传统单克隆抗体开发中采用延迟克隆(即仍坚持在商业化生产中使用CHO克隆)，延迟克隆也会给传统单克隆抗体开发带来商业风险。例如，如果在商业化生产的细胞系开发过程中，难以轻易鉴定出能够生产与用于I期临床生产的原始CHO细胞库具有相同产品质量特征的材料的CHO克隆，那么在某些情况下，药物开发的时间表和成本可能会大幅增加。然而，将CHO TI细胞库专门且有限地用于“大流行单克隆抗体”的I/II期临床材料的GMP生产，是应对下一次全球大流行并拯救众多生命的众多工具中的一个小工具。邀您加入“艺药荟社群”交流学习! 备注：姓名+单位+方向版权说明：本文欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权或其他合作需求，请联系梓树ZiShu（微信：Z07302256）。免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表“艺药荟”立场，亦不代表“艺药荟”支持或反对文中观点。本文不作为治疗方案推荐。如需治疗指导，请前往正规医院就诊。

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