CJ-13982

本研究由德国亥姆霍兹感染研究中心及莱布尼茨天然产物研究与感染生物学研究所 - 汉斯-克诺尔研究所Russell J. Cox教授以预印本形式于2026年1月15日发表在预印本平台ChemRxiv上。研究背景 烷基柠檬酸（Alkyl Citrates）是一类由草酰乙酸与脂肪酰基或聚酮类辅酶A硫酯在烷基柠檬酸合酶（ACS）催化下缩合而成的真菌源特殊代谢产物。该类化合物结构多样，且往往蕴含着显著的生物活性。例如，CJ-13,982是人体角鲨烯合成酶（Squalene Synthase, SQS）的微摩尔级别抑制剂，具有开发成为降胆固醇药物的潜力；而Cianitrins家族（如C1, C3, C5, C6）则是磷脂酶A2（Phospholipase A2, PLA2）的有效抑制剂，可作为抗炎剂的先导化合物。此外，角鲨他汀S1（Squalestatin S1）作为烷基柠檬酸中的明星分子，因其独特的4,8-二氧杂双环[3.2.1]辛烷核心结构，对角鲨烯合成酶具有皮摩尔级别的超强抑制活性。 尽管具有重要的应用前景，烷基柠檬酸类化合物的化学全合成面临巨大挑战。其分子中包含连续的手性中心和高氧化的三酸核心，合成过程中需要复杂的保护基策略和冗长的步骤。以cianitrins C1为例，最新的化学全合成需要15个线性步骤和超过30种不同的试剂与溶剂，不仅效率低下，而且碳足迹高，不符合当前绿色可持续合成的发展趋势。因此，开发高效、简洁、环境友好的生物合成路线，对于获得此类活性天然产物及其结构类似物具有迫切意义。 本研究聚焦于一类在 Hypoxylaceae 科真菌中广泛存在的、功能未知的隐性生物合成基因簇（BGC）。核心问题在于： 鉴定与解析： 该基因簇（命名为 ctr）是否负责合成已知的活性烷基柠檬酸（如CJ-13,982和cianitrins）？其具体的生物合成路径如何？ 功能表征与工程化： 如何利用该生物合成体系，通过异源表达和酶学手段，实现目标化合物的一步法生物合成？ 理性设计与创造新品： 能否通过组合生物合成（Combinatorial Biosynthesis）策略，引入来自其他途径（如角鲨他汀途径）的关键酶，对核心骨架进行定点氧化修饰，从而创造出具有新颖结构和改善生物活性的“非天然”天然产物？ 生物活性评估： 这些通过生物合成获得的已知及新化合物，其抑制SQS和PLA2的活性如何？结构修饰如何影响其活性和选择性？研究结果 研究团队首先通过对47个 Hypoxylaceae 科真菌成员的基因组进行挖掘，发现了一个高度保守的 ctr 基因簇。该基因簇预测编码两个脂肪酸合酶（FAS）亚基（CtrR3, CtrR4）、一个烷基柠檬酸合酶（CtrACS）、一个α-酮戊二酸依赖的非血红素铁双加氧酶（CtrR1）、一个FAD依赖的单加氧酶（CtrL2），以及推测的转运蛋白和转录因子。通过BLASTp分析，发现CtrR1与来自角鲨他汀S1生物合成途径中的氧合酶Mfr1和Mfr2具有显著同源性（相似度分别为45%和38%），这首次暗示了 ctr 簇可能以类似角鲨他汀的氧化模式合成cianitrins。 为了验证 ctr 簇的功能，研究者选取了其中来自 Hypomontagnella monticulosa 的基因，在米曲霉（Aspergillus oryzae）NSAR1菌株中进行异源表达。当仅表达 ctrR3（FASβ）、ctrR4（FASα）和 ctrACS 时，转化子成功生产了主要产物 CJ-13,982 (7)，产量达12.5 mg·L⁻¹，而野生型米曲霉则不产生该化合物。通过全面的NMR和旋光分析，确定了其立体构型为(2S, 3S)-CJ-13,982。这一结果直接证明了 ctr 簇中FAS和ACS负责了烷基柠檬酸核心骨架的构建：FAS合成了可能的十四酰基辅酶A（C14:0），随后由CtrACS催化其与草酰乙酸缩合形成 7。 接下来，研究者在上述体系中共同表达了推测的氧合酶基因 ctrR1。代谢谱分析显示，除了 CJ-13,982 (7)，还产生了新的氧化产物。通过分离鉴定，确定了 4-hydroxy-CJ-13,982 (12) 以及 2,4-dihydroxy-CJ-13,982 (13) 的存在。更重要的是，从培养物中分离并鉴定出了已知的氰酸菌素 Cinatrin C1 (8) 和 Cinatrin C3 (9)。已知 8 和 9 是 13 的内酯化产物，且其绝对构型为2S, 3S, 4R。由此，完整揭示了cianitrins的生物合成途径：CtrR1依次催化CJ-13,982 (7)的C-4和C-2位羟基化，生成二羟基中间体 13，后者可自发或酶促内酯化形成cianitrins C1和C3。这一途径完美印证了其与角鲨他汀生物合成在氧化逻辑上的相似性。 为了进一步确认CtrR1的功能并探索工程化潜力，研究进行了体外酶学实验。纯化的重组CtrR1能够以 CJ-13,982 (7) 为底物，在α-酮戊二酸、Fe²⁺和抗坏血酸存在下，一步催化生成12和13，其中12是先形成的中间体，随后被进一步羟基化为13。这为在体外一锅法合成cianitrins前体提供了可能。 基于CtrR1与Mfr1/Mfr2的同源性，研究进入了组合生物合成的核心阶段。由于Mfr1和Mfr2在之前的研究中难以可溶表达，本研究将其与硫氧还蛋白（TrxA）融合，成功获得了可溶且有活性的TrxA-Mfr1和TrxA-Mfr2。体外实验获得了令人兴奋的结果：TrxA-Mfr1表现出与CtrR1相似的活性，将7转化为12和13；而TrxA-Mfr2则展示了截然不同的区域选择性，特异性地催化7的C-7位羟基化，产生了全新的化合物 7-hydroxy-CJ-13,982 (14)。当尝试将Mfr1和Mfr2与7共同孵育时，LC-MS检测到了可能朝向4,8-二氧杂双环[3.2.1]辛烷结构演进的多种氧化产物，但仅成功分离鉴定了 14。 为了在体内实现新化合物的一步发酵生产，研究者在米曲霉中构建了多种基因组合。共表达 mfr2 与 ctrR3/R4/ACS 成功实现了 7-hydroxy-CJ-13,982 (14) 的从头生物合成。更进一步，通过共表达 ctrR3/R4/ACS、mfr1、mfr2 以及效率更高的2,4-双加氧酶 ctrR1，显著提高了另一个新化合物的产量，并鉴定其为 7-hydroxy-cinatrin C3 (15)。这标志着通过理性组合来自不同生物合成途径的酶，成功创造了两个结构新颖的烷基柠檬酸类衍生物。 生物活性测试是评估这些合成成果价值的关键。研究建立了针对SQS和PLA2的体外抑制实验。结果显示，原始化合物 CJ-13,982 (7) 对SQS和PLA2均有一定的抑制活性（IC₅₀分别为33 μM和29 μM）。Cianitrins C1/C3混合物（8/9） 对PLA2的抑制活性显著增强（IC₅₀ = 14 μM），但对SQS的抑制减弱。最具启发性的发现来自于新化合物：7-hydroxy-CJ-13,982 (14) 对SQS的抑制活性（IC₅₀ = 24 μM）与7相当，但对PLA2的抑制活性大幅下降（IC₅₀ > 1000 μM）。 同样，7-hydroxy-cinatrin C3 (15) 也表现出对SQS的选择性抑制（IC₅₀ = 57 μM），而对PLA2无抑制。这一结果表明，在脂肪链的C-7位引入羟基，能够显著改变化合物的生物活性谱，使其从双靶点抑制剂转变为对SQS具有选择性的抑制剂。这为基于生物合成途径的理性药物设计提供了重要线索：虽然单一的7-羟基化未能像角鲨他汀那样极大提升对SQS的抑制强度（从微摩尔到皮摩尔），但它迈出了关键的第一步，即通过改变氧化模式来调节选择性和为后续衍生化奠定基础。结论与展望 本研究成功解密了cianitrins家族化合物的生物合成之谜，证实其遵循与角鲨他汀类似的氧化逻辑。通过异源表达 ctr 基因簇，在米曲霉中建立了从葡萄糖出发、一步发酵生产CJ-13,982及cianitrins C1/C3的高效平台，这与需要15步以上的化学全合成相比，在步骤经济和绿色可持续方面具有压倒性优势。 更重要的是，本研究开创性地将来自角鲨他汀途径的氧合酶Mfr1和Mfr2与 ctr途径相结合，实现了组合生物合成。不仅验证了Mfr2作为C-7羟化酶的新功能，更合成了两个全新的烷基柠檬酸衍生物 14 和 15。活性研究表明，C-7羟基化是调节化合物对SQS与PLA2选择性的关键开关。 这项工作雄辩地证明，全生物合成（Total Biosynthesis） 已不再是单纯模仿天然产物的工具，而是发展成为能够理性设计并高效合成已知及新颖生物活性分子的强大平台。虽然其在底物范围灵活性上目前仍不及传统有机合成，但其在合成步骤、效率和可持续性方面的优势，尤其是在构建复杂手性中心和多重含氧官能团方面，使其在天然产物药物研发领域极具竞争力。随着越来越多烷基柠檬酸类BGCs的被发现和解析，无需经过冗长化学合成即可获得大量结构类似物并进行构效关系研究将成为现实，大大加速药物先导化合物的发现与优化进程。 原文链接： https://chemrxiv.org/engage/api-gateway/chemrxiv/assets/orp/resource/item/695bce91900d745c4375126e/original/total-biosynthesis-and-engineering-of-cinatrins-inhibitors-of-phospholipase-a2-and-squalene-synthase.pdf