Hydrochlorothiazide/Triamterene/Dihydralazine Sulfate/Reserpine

摘要:佐剂是添加到疫苗中以增强产生的免疫反应的材料，是疫苗的重要组成部分，但很多时候被忽视。虽然疫苗总是包含一个抗原来告诉身体要接种什么，但同样重要的是，佐剂提供了如何产生一个完整的反应的重要因素。佐剂领域的发展一直很慢，20世纪30年代首次在获得许可的疫苗中使用佐剂，并且在接下来的80年里一直是获得许可的疫苗中唯一的佐剂。然而，随着疫苗成为抵御新的和复杂病原体的前沿，设计有效疫苗时考虑所有组成部分是很重要的。在这里，我们总结了获得许可的疫苗中佐剂的使用情况，以及临床试验中新型佐剂的使用情况，特别关注所使用的材料及其对免疫反应的影响。我们讨论了五大类佐剂材料：铝盐、纳米颗粒、病毒载体、TLR激动剂和乳液。对于每一类，我们深入探讨了当前的临床试验空间，这些材料对疫苗接种的影响，以及它们可以改进的一些方式。佐剂为改善疫苗反应和稳定性提供了一个激动人心的机会，这篇综述将有助于了解这一领域的当前进展。 转化影响声明：在COVID-19大流行之后，针对传染病的疫苗成为了焦点。虽然抗原一直是疫苗设计的重点关注对象，但佐剂是增强疫苗免疫反应的重要工具，大部分尚未得到充分开发。本文广泛回顾了佐剂的历史、当前疫苗佐剂领域以及临床试验中佐剂的进展。特别强调了佐剂的材料格局及其作用机制。展望未来，尽管新型疫苗佐剂领域具有令人兴奋的新技术和材料，但仍需要更多的东西来满足新的和复杂病原体的保护需求。 1.引言 疫苗接种是对抗传染病的重要公共卫生策略。疫苗通过使用抗原训练免疫系统，从而让身体产生针对特定抗原的抗体和/或特定抗原的T细胞的免疫反应。抗原和佐剂是疫苗的两个基本组成部分。抗原向免疫系统传达“要对抗什么”，而佐剂则增强免疫反应的强度。佐剂还可以提供额外的好处，包括减少所需抗原剂量，这提供了成本和依从性的好处。 自1926年Alexander T. Glenny发现铝盐（alum）作为佐剂以来，佐剂在疫苗中一直很常见。它被用于20世纪30年代美国食品药品监督管理局（FDA）批准的白喉和破伤风疫苗中。从那时起，alum就被添加到许多疫苗中以增强免疫反应。然而，尽管研究不多，直到2009年才有除了alum之外的其他佐剂被用于许可的疫苗中。由于佐剂材料的缺乏，许多疫苗设计时使用了减毒活病毒（例如，麻疹、腮腺炎和风疹疫苗以及水痘疫苗），以利用它们固有的佐剂特性；但它们对免疫受损个体构成风险。此外，许多疫苗使用了无佐剂的灭活（杀死）病原体（例如，季节性流感和脊髓灰质炎疫苗），这些疫苗单独使用可能难以实现效果。由于这些困难，以及20世纪80年代出现的重组蛋白抗原，其免疫原性低于减毒活病毒和全杀死抗原，佐剂创新的重要性变得更加明显。自2010年代以来，随着几种大流行病（如埃博拉、寨卡和COVID-19）的出现，FDA许可的疫苗中添加了几种佐剂材料，许多其他佐剂也在临床研究中，佐剂创新呈上升趋势。在这里，我们提供了针对传染病疫苗接种的当前临床佐剂景观的概述。我们重点介绍了FDA许可疫苗中的12种佐剂，并讨论了300多项疫苗佐剂的临床试验。本综述中的佐剂被广泛定义为与抗原分开的成分，它产生免疫反应，这允许评估脂质纳米颗粒和病毒载体等抗原载体，尽管它们不被CDC认定为佐剂。本综述的主要目的是向读者提供当前疫苗佐剂的临床景观，这可能指导未来开发更安全、更有效的佐剂的努力。 2.许可疫苗中的佐剂 自2010年代以来，许可疫苗中使用的佐剂迅速发展，在此之前，铝盐是唯一被许可疫苗中的佐剂。随着我们对免疫学和疫苗学的了解不断发展，更多具有不同作用机制（MOA）的材料被开发出来。到目前为止，FDA许可的疫苗中已经使用了12种佐剂（表1）。在这里，我们回顾这些产品并强调它们的适应症。 2.1.铝盐 自20世纪30年代以来，各种形式的铝盐一直占据着佐剂领域的主导地位。它最初是在Glenny用铝钾硫酸盐纯化白喉类毒素时偶然发现的，发现含有铝盐沉淀物的疫苗导致了更强的抗体反应。目前有四种类型的铝盐用于疫苗——氢氧化铝（AH）、磷酸铝（AP）、硫酸铝钾（alum）和无定形羟基磷酸硫酸铝（AAHS），其中AH和AP在许可疫苗中使用最多。AH是通过将铝溶液与氢氧化钠混合制备的，形成结晶铝羟氧化物。结晶度影响其吸收能力，由小晶体组成的AH具有更大的表面积和更强的吸收能力。AP是化学上无定形的羟基磷酸铝，是通过将铝盐溶液与三钠磷酸盐溶液混合或通过将铝盐与磷酸盐溶液混合并用氢氧化钠沉淀来配制的。与AH不同，AP是非结晶的，其吸收能力通常由缓冲条件和起始材料的组成决定。除了结晶度，还存在粒径和形状的变化。AH以长形颗粒的形式存在，平均计算尺寸为4.5×2.2×10纳米，而AP是大约50纳米的片状颗粒。尽管它们具有不同的物理化学特性，但由于它们在临床上验证的效力和安全性，含铝佐剂已被用于许多疫苗中，以特别增强体液反应，并继续在活跃的临床试验中使用（表1和图1b）。 2.2.AS04 AS04在2009年获得FDA批准，并由葛兰素史克（GSK）开发，用于HPV疫苗Cervarix。这种佐剂仍然使用氢氧化铝作为关键成分之一，但它还添加了一种Toll样受体（TLR）4激动剂，单磷酸脂A（MPL），被吸收到铝颗粒上。MPL是脂多糖（LPS）的一种纯化和解毒衍生物。LPS由许多革兰氏阴性细菌产生，并存在于它们的外膜上，使它们能够被免疫系统识别。脂质A是LPS的主要毒力因子，使其成为操纵成激动剂的理想选择。对于AS04，MPL衍生自Salmonella minnesota R595菌株的LPS。在临床前开发中，发现200纳米的颗粒大小是理想的，每剂含有50微克的MPL和500微克的氢氧化铝。添加MPL被证明能够产生比仅含铝的疫苗更强大、更持久的免疫反应（尤其是细胞免疫反应）。这在很大程度上是由于MPL能够通过激活抗原呈递细胞（APCs）和增加炎症细胞因子来诱导早期免疫反应。 2.3.AS03 AS03由GSK开发，用于H1N1疫苗，并在2013年获得许可使用；然而，这种疫苗目前在美国储备中，且AS03不在当前接受的任何疫苗中。这是第一种在许可疫苗中使用的不含铝的佐剂，属于油包水乳液新型佐剂。AS03包含角鲨烯（21.38 mg/ml）、Tween 80（9.72 mg/ml）和（D,L）-α-生育酚（23.72 mg/ml），配制在磷酸盐缓冲液（PBS）中。AS03的粒径约为150 nm，这被认为有助于抗原呈递细胞（APCs）的摄取。与铝盐相比，AS03诱导更强的抗原特异性抗体和T细胞反应，以及更高水平的细胞因子和免疫细胞募集到引流淋巴结。在配方方面，（D,L）-α-生育酚增强了AS03诱导的免疫反应的幅度，这将在本综述后面讨论。 2.4.MF59 MF59用于季节性流感疫苗（Fluad和Fluad Quadrivalent），在1997年获得欧洲许可后，于2015年获得FDA许可。目前，MF59佐剂的季节性流感疫苗仅用于65岁及以上的人群，以补偿他们减弱的免疫反应。这种佐剂由诺华公司开发，也是一种类似于AS03的油包水乳液。MF59由角鲨烯（4.3%）和两种表面活性剂，Tween 80（0.5%）和Span 85（0.5%），在柠檬酸缓冲液中组成，粒径约为160 nm。MF59可以通过在注射部位产生免疫能力环境来增强细胞和体液免疫反应，并且依赖于配方中的所有三个组分协同工作以产生最强大的免疫反应。 2.5.外膜囊泡 OMVs并不被传统定义为佐剂，因为它具有载体能力；然而，它们固有的佐剂特性在它们添加到配方中很重要。OMVs源自革兰氏阴性细菌的外膜，形成约25-250 nm的球形囊泡，展示许多细菌抗原和蛋白，可以作为TLR激动剂。这项技术仅被许可用于一种脑膜炎球菌B群疫苗，Bexsero，由诺华公司开发，然后被GSK在2015年美国批准前收购。各种革兰氏阴性细菌自然产生OMVs以应对压力，但也可以通过用于Bexsero的洗涤剂提取法获得。在Bexsero的情况下，OMV与重组蛋白抗原一起传递，并提供自身的固有抗原成分，主要的是PorA，因为它源自N. meningitidis细菌。OMVs的一个主要优势是它们同时表达的细菌抗原和自然存在于它们上的强效TLRs，这使得OMVs成为先天免疫反应的强大驱动力。Bexsero还与氢氧化铝配方，以增加佐剂效果。 2.6.AS01B AS01B是另一种组合佐剂，由皂苷QS-21和TLR4激动剂MPL的脂质体配方组成，大约100 nm大小。这种佐剂用于2017年FDA许可的带状疱疹疫苗（Shringrix），以及WHO预认证的RTS,S疟疾疫苗。虽然MPL之前在AS04佐剂系统中使用过，但这是首次在许可疫苗中使用QS-21——一种从南美树木Quillaja saponaria Molina树皮中提取的皂苷分子。QS-21特别被发现可以调节先天免疫系统，从而增强抗原特异性抗体反应和CD8 T细胞。以脂质体配方的QS-21仍然被用来传递许多TLR激动剂，将在本综述的TLR激动剂部分进一步讨论。当一起配方时，MPL和QS-21协同工作以增强对抗原的免疫反应。 2.7.CpG基序（1018和7909） 未甲基化的CpG基序，CpG 1018和CpG 7909，是两种TLR9激动剂，用于之前许可的疫苗中。CpG 1018首次在2017年用于许可的乙肝疫苗Heplisav-B中；CpG 7909则在2023年7月用于许可的炭疽疫苗Cyfendus中。CpG基序由中心未甲基化的CG二核苷酸和侧翼区域组成，源自合成的寡脱氧核苷酸（ODN），模仿细菌DNA。细菌DNA代表一种强大的病原体相关分子模式（PAMP），激活先天免疫系统。在感染期间，细菌DNA中高比例存在的未甲基化CpG基序与免疫细胞上的TLR9相互作用，触发保护性免疫反应。通过合成复制细菌DNA和分离特定触发特定免疫反应的合成未甲基化CpG基序，CpG 1018和7909是具有特定TLR9激活能力的佐剂，导致特别偏向细胞介导的或Th1反应的保护性反应。CpG基序通常与铝佐剂（例如，在含有CpG 7909的FDA许可的炭疽疫苗中）结合使用，因为这两种佐剂的结合导致强大的细胞和体液免疫。 2.8.rVSV 西非埃博拉病毒流行（2013-2016）导致了第一种许可的病毒载体疫苗。Vesicular Stomatitis Virus (VSV)是一种基于病毒载体的佐剂，用于默克公司的埃博拉疫苗ERVEBO（也称为V920, rVSVΔG-ZEBOV-GP或rVSV-ZEBOV），该疫苗于2015年获得FDA许可。ERVEBO是一种具有复制能力的、减毒的重组水泡性口炎病毒（rVSV）载体，其糖蛋白基因被ZEBOV替代。VSV糖蛋白G允许附着和进入宿主细胞，这被ZEBOV糖蛋白模仿以产生ZEBOV抗原特异性免疫反应。与其他许可的佐剂系统相比，rVSV是独特的，因为它编码抗原在载体表面表达，而不是被混合或绑定。然而，由此产生的免疫反应仍然由rVSV载体决定，与抗原无关，表明这项技术本身就是一种强大的免疫调节剂。具体来说，疫苗引发与VSV类似的感染，导致针对病毒蛋白的特定细胞和抗体反应，因此保护人们免受未来的暴露。疫苗在超过5000名接种者及其未接种的接触者中实现了100%的疫苗效力。 2.9.脂质纳米颗粒 两种基于脂质纳米颗粒的疫苗已由Pfizer-BioNTech和Moderna获得FDA许可。Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗中的脂质纳米颗粒，现在称为Comirnaty（BNT162b2），是美国第一种COVID-19疫苗，于2021年8月获得FDA许可。BNT162b2在43,548名参与者中显示出95%的效力预防COVID-19。疫苗的抗原是修饰的核苷酸RNA（modRNA），编码SARS-CoV-19病毒的刺突蛋白，由四种脂质配制的脂质纳米颗粒保护：一种离子化脂质（（（4-羟丁基）吖啶二基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）），一种聚乙二醇化脂质（2-[（聚乙二醇）-2000]-N,N-十四烷基乙酰胺），以及两种结构脂质（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和胆固醇）。疫苗在接种后显示出强烈的抗原特异性抗体反应、CD8+和CD4+ T细胞反应，以及免疫细胞产生的IFNγ。另一种脂质纳米颗粒用于Moderna的SPIKEVAX COVID-19疫苗，也称为mRNA-1273，该疫苗于2020年12月获得FDA紧急使用授权，随后于2022年1月获得许可。与Pfizer-BioNTech的疫苗类似，Moderna的SPIKEVAX在30,420名参与者中显示出94.1%的效力。尽管它有类似的局部和全身反应，如头痛、发烧和疲劳，但没有安全问题。疫苗包含一个由脂质纳米颗粒包裹的信使核糖核酸（mRNA）抗原，由四种脂质组成：SM-102、聚乙二醇（PEG）2000二硬脂酰甘油（DMG）、胆固醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）。与BNT162b2类似，mRNA-1273诱导CD4 T滤泡辅助、CD8+和Th1反应。 2.10.Matrix-M Novavax生产的COVID-19疫苗NVX-CoV2373含有纳米颗粒佐剂Matrix-M，该佐剂于2022年10月获得FDA的紧急批准。后来暂停，并在包括SARS-CoV-2 Omicron变体的刺突蛋白的更新疫苗中重新授权紧急使用。目前，它已于2023年10月由FDA重新授权紧急使用。Matrix-M佐剂是一种40 nm基于皂苷的纳米颗粒佐剂，由来自Quillaja saponaria树皮的两种纯化组分混合，与胆固醇和磷脂结合。疫苗与SARS-CoV2刺突蛋白三聚体抗原配制成27.2 nm的纳米颗粒，并与Matrix-M佐剂结合，制成NVX-CoV2372疫苗。结合使用时，该疫苗已显示出诱导强烈的Th1型和T滤泡辅助细胞（Tfh）反应，促进中和抗体的产生，以及CD4+ T细胞和CD8+ T细胞反应。该疫苗已被证明是安全的，副作用轻微至中等，如注射部位疼痛、头痛和疲劳。 3.当前临床试验 在这一部分，我们提供了截至2023年6月当前新疫苗佐剂临床试验的概况。我们在clinicaltrials.gov数据库上使用关键词“vaccine”和“communicable diseases”以及“recruiting, not yet recruiting, active, not recruiting, or enrolling by invitation”的状态进行了搜索。我们还指定了研究类型为“Interventional Studies”。返回的条目（总共641个）然后手动筛选，排除已经获得FDA许可或WHO预认证的疫苗，并且正在寻求扩展到不同人群/剂量计划的使用。排除后，总共识别出523项试验。在这个集合中，对不同的疫苗配方进行了分析，以识别佐剂成分。当多个试验中疫苗配方一致时，即使用了相同的抗原和佐剂组合，这些试验被归为一类。相反，当一个试验通过使用多个佐剂和/或抗原评估多种疫苗配方时，该试验根据疫苗配方的数量被多次计数。这导致了389种独特的疫苗配方正在评估中。 在识别的活跃疫苗临床试验中使用了多种佐剂（图1）。然而，23%的识别试验的疫苗配方中没有包含佐剂（图1a）。大约50%的这些不含佐剂的配方使用减毒活病毒作为抗原，这种抗原具有固有的高免疫原性。然而，这些类型的疫苗可能对免疫受损者有增加的安全问题。在其他50%不含佐剂的疫苗试验中，大多数使用灭活病原体作为抗原。使用灭活病原体可以提高疫苗的安全性，但可能会降低免疫原性，因为病原体不能复制或进入免疫细胞以促进强大的免疫反应。此外，没有佐剂，这些疫苗配方完全依赖于身体识别灭活抗原为危险并产生免疫反应。年度季节性流感疫苗使用灭活的流感病毒作为抗原，没有佐剂。这些疫苗通常效果有限。例如，在2007-2008年流感季节，流感疫苗Fluzone的保护率据报道仅为68%，强调了增加佐剂以提高疫苗免疫原性的必要性。 图1 展示了当前临床试验空间中许可疫苗的佐剂情况。(a) 根据佐剂许可状态评估的临床试验中独特疫苗配方的分类，其中独特的疫苗配方由试验空间中不同的佐剂和抗原组合定义。每个部分显示了独特疫苗配方的数量及其在整个试验中的百分比。(b) 显示了包含许可疫苗佐剂的临床试验数量，作为该佐剂在独特疫苗配方中使用的次数，以及在重复疫苗配方中使用该佐剂的试验数量。 一些识别的疫苗试验没有指定使用的佐剂，我们将这些试验在图1a中归类为“未知”。此外，对于确实包含佐剂的疫苗配方——之前在许可疫苗中使用过或新颖的——我们根据不同的佐剂类别进一步对它们进行分类（图2）。在接下来的讨论中，我们将逐步了解这些佐剂类别，讨论它们各自的机制，并概述每个类别的临床试验概况。 图2 展示了按佐剂类别划分的临床试验数量。这既包括包含独特疫苗配方的试验，也包括包含重复配方的试验。 3.1.铝盐 铝盐在识别的临床试验中继续占据主导地位，代表目前正在评估的疫苗配方中使用最广泛的佐剂（图2）。这些配方中的许多，88%，将铝盐作为配方中唯一的佐剂。然而，10%的配方包括TLR激动剂作为组合。类似于在AS04中看到的，添加TLR激动剂可以增强免疫反应，特别是细胞免疫，这是基于铝的佐剂单独难以实现的。将在本综述后面更深入地讨论TLR激动剂重点试验。在当前的临床试验景观中，使用铝佐剂的疫苗正在用于保护多种传染病，包括COVID-19、HIV、霍乱、百日咳等。 尽管铝盐作为佐剂的使用历史悠久，但其促进免疫反应的作用机制尚未完全阐明。在发现之后，Glenny等人提出了佐剂的作用机制——库效应，建议抗原库的创建可能导致持续和缓慢的抗原释放。这个机制多年来被该领域广泛接受，但最近这一观点因观察到在注射后2小时移除注射部位的铝库并不影响抗原特异性免疫反应而受到挑战。这与早期的研究形成鲜明对比，早期的研究表明，在注射后4天内移除库影响了免疫反应，但在注射后7天移除时则没有影响。总体而言，库的形成和库的持续时间如何影响整体佐剂效果仍然不清楚。除了库效应，还探索了铝的其他免疫调节特性，以描绘更完整的机制图景。具体来说，已经显示铝佐剂在注射部位诱导大量坏死，导致DAMPs（如DNA和尿酸）的释放。这些DAMPs促进免疫细胞的渗透和激活，最终与下游免疫反应相连。在渗透到现场的免疫细胞中，树突状细胞被确定为铝机制中的关键细胞。树突状细胞不仅增强了从注射部位到引流淋巴结的抗原运输，而且对铝的反应激活并增加了通过单核细胞分化为树突状细胞的细胞数量。虽然铝难以启动细胞免疫反应，但它通过激活补体级联反应是强大的体液免疫反应调节剂。 即使没有完全的机制理解，铝佐剂仍然在许可疫苗或那些在活跃的临床试验中广泛使用（图2）。铝佐剂在所有许可疫苗的佐剂中拥有最长的安全记录，过去80年一直是值得信赖的添加剂。虽然需要新材料来扩大佐剂空间，但铝佐剂在临床研究中继续占据主导地位。 3.2.纳米颗粒 纳米颗粒是识别试验中另一种广泛使用的疫苗佐剂（图2）。纳米颗粒可以由多种材料配方制成，其物理和化学属性如大小、形状、表面结构、物理化学性质、溶解度以及疏水性/亲水性可以调节。这激发了纳米颗粒佐剂在疫苗开发中的使用，特别是在COVID-19大流行期间。虽然许多纳米颗粒仅被视为抗原载体，但根据其材料和物理化学属性，纳米颗粒可以作为佐剂增强免疫反应。 纳米颗粒作为疫苗中的候选物质具有吸引力，因为它们具有可调节性。使用的抗原可以是封装在颗粒内的核酸，也可以是配方在颗粒表面的肽和蛋白质。佐剂成分也可以来自构建颗粒所用的材料，如Matrix M的情况，或者来自结合在表面的配体，如TLR激动剂，包括可能对抗原的多方面免疫反应。一些纳米颗粒还允许定时释放，通过使用金材料，这可以通过频繁暴露增强免疫反应。在当前的临床试验景观中，有75种独特的疫苗配方使用基于纳米颗粒的佐剂，总共有98项试验，包括Matrix-M、金纳米颗粒、脂质纳米颗粒以及其他脂质载体的变化（图3a）。其中，三种纳米颗粒已在许可疫苗中使用，包括Pfizer-BioNTech和Moderna设计的脂质纳米颗粒以及牛津大学设计的Matrix-M。自COVID-19大流行以来，纳米颗粒在临床疫苗中取得了很大进展，并继续作为识别活跃临床试验中的第二大佐剂组，在独特的疫苗配方中占18.2%，在总试验中占16.4%（图2）。 图3 展示了临床中纳米颗粒佐剂的情况。(a) 根据纳米颗粒类型：脂质纳米颗粒、Matrix-M、白桦脂醇纳米颗粒（NP）、金纳米颗粒（GNP）、纳米结构脂质载体（NLC）和脂质无机纳米颗粒（LION），在临床试验空间中包含纳米颗粒佐剂的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。(b) 根据负责临床试验的主体，包含脂质纳米颗粒的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。 3.2.1.脂质纳米颗粒 脂质纳米颗粒（LNPs）是由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的不同比例制成的球形囊泡。通过在这些角色中使用不同的材料并改变它们的比例，许多公司已经生产了自己的LNPs用于疫苗接种（图3b）。这四种脂质的组成包裹了核酸和蛋白质作为针对目标疾病的抗原。在生理pH下，可电离脂质具有中性电荷，减少毒性并促进mRNA的摄取。当与细胞质相互作用时，可电离脂质的正电荷诱导mRNA释放到宿主细胞中。LNPs在识别的活跃临床试验中占纳米颗粒基佐剂的最大组（图3a），有55种独特的疫苗配方跨越67项试验，用于针对COVID-19、HIV、带状疱疹、尼帕病毒等多种疾病的疫苗接种（图3b）。如前所述，已有两项脂质纳米颗粒疫苗获得许可：Moderna的SPIKEVAX COVID-19疫苗和Pfizer-BioTech的Comirnaty COVID-19疫苗。在最近的一项研究中，发现LNPs可以诱导强烈的体液反应，如T滤泡辅助（Tfh）细胞、记忆B细胞和浆细胞。 Pfizer-BioNTech和Moderna疫苗都展示了类似的机制。疫苗包含编码SARS-CoV-2病毒刺突糖蛋白的修饰核苷mRNA，一旦进入宿主细胞质，就被放置在LNP中以保持稳定性和保护。然而，LNP不仅仅是抗原载体系统，而是具有自己的佐剂能力。BNT162b2（NCT05541861）和mRNA-1273（NCT05383560）LNPs以及临床试验中使用的其他LNPs，都包含类似的四个关键成分——可电离脂质、胆固醇、聚乙二醇化脂质和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC），这些脂质的确切组成和比例都有专利差异。在这两种情况下，可电离脂质被认为是产生佐剂反应的原因。当增加LNP配方中可电离脂质的摩尔比例时，发现促炎细胞因子如IL-6的诱导随之增加。此外，可电离脂质直接影响疫苗产生的体液反应。当LNPs与抗原蛋白共注射时，无论是否包含封装的IVT-mRNA，都能产生抗原特异性抗体。然而，在LNPs缺乏可电离脂质的情况下注射抗原蛋白时，无法产生抗原特异性抗体。这表明可电离脂质在抗原生成和先天免疫信号传导中都起着至关重要的作用，尽管负责免疫激活的确切机制仍然不完全清楚。配方中的聚乙二醇化脂质保护纳米颗粒免受吞噬作用，允许长时间循环。最后，辅助脂质、胆固醇和DSPC通过稳定抗原封装和增强膜刚性来增强纳米颗粒的稳定性，从而提高整体效果和生物分布。一旦宿主细胞被感染，mRNA被翻译成SARS-CoV-2刺突蛋白，在宿主细胞上表达。虽然这两种疫苗类似，但它们具有不同的储存能力。Pfizer的BNT162b2需要在-60°C至-80°C下储存，可以储存6个月，而Moderna的mRNA-1273疫苗可以在2°C至8°C下储存，长达30天。 3.2.2.Matrix-M Matrix-M是一种40 nm的球形基于皂苷的纳米颗粒，由Quillaja saponaria树皮中的两种纯化组分Fraction-A和Fraction-C混合，与胆固醇和磷脂配方。有两种皂苷组分，Matrix-A和Matrix-C，组合成Matrix-M。在临床上，Matrix-M纳米颗粒在纳米颗粒类别中占独特疫苗配方的20.3%，占总试验的25%（图3a），目前用于针对包括Epstein-Barr病毒感染、疟疾和COVID-19在内的多种疾病的疫苗接种。在最近一项测试Matrix-M在没有抗原的情况下的小鼠免疫刺激性的研究中，发现佐剂将淋巴结和脾脏中的免疫细胞数量增加了3倍，并诱导了强烈的Th1反应。在注射部位，Matrix-M增强了先天免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的渗透，并促进了促炎细胞因子的释放。这种细胞因子的释放启动了更多先天免疫细胞的涌入，引发了一系列局部免疫反应，在随后的24-48小时内展开。Matrix-M和抗原也一起流向淋巴结，导致B细胞激活和增殖增加，以及T细胞的激活和极化。B细胞进一步增殖和分化为记忆B细胞和浆细胞，产生高亲和力抗体，通过疫苗针对的目标感染威胁提供保护。基于皂苷的佐剂一直被认为是有利的，并已用于动物疫苗以及在许可疫苗中使用的AS01b佐剂中的脂质体配方QS-21。如前所述，Matrix-M是Matrix-A和Matrix-C皂苷组分的组合，而QS-21包含Matrix-C。由于其不稳定性，QS-21与胆固醇一起在像AS01B这样的脂质体基佐剂中配方。 3.2.3.基于白桦脂醇的球形纳米颗粒 基于白桦脂醇的球形纳米颗粒大小为100-180 nm。白桦脂醇是由桦树皮产生的五环卢帕烷型萜类化合物配方而成，已显示出具有抗真菌、抗病毒和抗致癌作用。目前在临床景观中，基于白桦脂醇的纳米颗粒出现在一项名为Betuvax-CoV-2（NCT05270954）的COVID-19疫苗试验中。Betuvax-CoV-2包含基于白桦脂醇的球形纳米颗粒表面的重组RBD-SD1-Fc融合蛋白，该配方旨在模拟SARS-CoV-2病毒以类似方式触发免疫系统。在BetuvaxcoV02的最新研究中，它被证明是安全且可耐受的，并且对疫苗接种有轻微反应。已显示出特异性IgG抗体滴度以及对抗原的强烈CD4+和CD8+ T细胞反应。白桦脂醇的免疫调节机制有限，但已证明白桦脂醇可以增强人外周血淋巴细胞的增殖，以及增强巨噬细胞中的抗炎和促炎活性。由于白桦脂醇是一种常见自然资源的提取物，该化合物的丰富性和低细胞毒性使其作为疫苗佐剂更受欢迎。 3.2.4.金纳米颗粒 金纳米颗粒（GNP）在疫苗中特定用于增加抗原稳定性、抗原在淋巴结中的积累以及抗原呈递细胞的有效抗原摄取。在当前的临床研究景观中，有一项试验使用了金纳米颗粒，具体是用于COVID-19的生物制剂PepGNP-COVID-19，这是一种经皮COVID-19疫苗（NCT05633446）。虽然尚不清楚这种精确配方如何结合COVID-19抗原，但GNP可以通过多种方式与抗原结合，如通过硫醇和胺链接的化学缀合、吸附和封装。GNP的大小对于免疫反应至关重要。比较20 nm和40 nm的球形GNP时，较大的球形GNP被发现更有效地产生IL-6和IL-12等细胞因子。GNP的形状也很重要。当骨髓源性树突状细胞用杆状GNP处理时，发现两种特定的促炎细胞因子IL-1b和IL-18的产生增强。相比之下，像临床疫苗中看到的立方体和球形GNP导致不同促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFa）、IL-6、IL-17和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的水平升高。 3.2.5.纳米结构脂质载体 纳米结构脂质载体（NLC）被称为第二代脂质纳米颗粒，有可能克服以前脂质纳米颗粒的限制。它们由一个由液态和固态脂质组成的脂质基质核心组成，形成结晶结构，由脂质和表面活性剂壳层包围，与具有固态脂质核心的LNP相反。具体来说，NLCs由于其不完美的晶体结构，表现出更高的药物载荷能力，通过避免脂质结晶来防止药物驱逐，并增加药物溶解度和控制释放。目前，有一项活跃的试验中使用了NLC，其中自放大RNA（saRNA）抗原结合在NLC的外部。这种鼻内疫苗AAHI-SC2是由Access to Advanced Health Institutes（AAHI）开发的，用于保护COVID-19（NCT05370040）。这种疫苗中使用的NLC大约为125 nm，核心由固态脂质三酰甘油和液态脂质（角鲨烯）组成，壳层由表面活性剂和阳离子脂质1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）组成，这有助于复合RNA。该平台是全球分发的绝佳候选物，因为它允许在冷藏状态下作为液体长期稳定，同时至少保持一年颗粒大小和浓度。疫苗可以很容易地从其液体形式配方，通过将疫苗RNA与NLC混合以创建NLC/RNA复合物，该复合物通过与阳离子脂质DOTAP的静电相互作用形成。此外，整个复合物可以很容易地冻干，并在室温下储存8个月或冷藏近两年。这种热稳定性是以前LNP配方所未见的，并且可以显著改善疫苗的分发。AAHI-SC2疫苗被证明可以产生高血清特异性IgG和SARS-CoV-2武汉株特异性中和抗体。在小鼠中比较肌肉内主剂和鼻内增强剂时，发现IFNγ分泌T细胞显著增加，具有强烈的Th1偏向反应和微不足道的Th2和Th17反应。此外，鼻内途径有强大的呼吸道粘膜免疫反应，具有SARS-CoV-2反应性的肺驻留记忆和肺归巢T细胞群体。异质给药方法，肌肉内主剂和鼻内增强途径，显示出使用这种佐剂最大化强大的粘膜和系统免疫的潜力。 3.2.6.脂质无机纳米颗粒 脂质无机纳米颗粒（LION）是52 nm颗粒，旨在增强治疗剂的稳定性、传递和免疫原性。在当前的临床试验中，LION在两项独特的疫苗配方中使用，共进行了三项针对COVID-19疫苗接种的试验。在这两种配方中，LION与自复制mRNA（repRNA）结合，编码SARS-CoV-2的刺突蛋白，结合在LION的外部，形成了在韩国由Quartis开发的疫苗QTP104（NCT05876364）和在美国和巴西由HDT Bio开发的疫苗HDT-301（NCT05132907，NCT05542693）。LION由含有15 nm超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒的角鲨烯乳液核心组成，以增强稳定性，并由表面活性剂和阳离子脂质DOTAP包围。基于角鲨烯的佐剂在本综述中已多次提及，而SPIO纳米颗粒在MRI对比和铁替代疗法中有着临床历史。一旦LION配方完成，它就与RNA结合，形成LION复合物。RNA的复合类似于NLCs中的情况，阳离子脂质DOTAP与嵌入的RNA分子形成静电连接。LION的优点是它可以在室温下稳定至少3个月，使其成为全球分发的绝佳候选物。对repRNACoV2S进行的持续研究表明，可以诱导SARS-CoV-2刺突蛋白的抗原特异性T细胞和抗体反应。此外，疫苗诱导了强烈的Th1偏向免疫反应，疫苗诱导了抗刺突蛋白IgG抗体和强烈的T细胞反应，更高剂量增强了Th1反应。在小鼠中进行的单次肌肉内免疫接种在14天后实现了100%的血清转换以及强烈的抗原特异性IgG反应。免疫接种还在年轻和老年小鼠之间进行了比较，所有年龄的小鼠都有强烈的脾T细胞反应，最老的17个月龄组的T细胞反应各异。非人灵长类动物如猕猴与小鼠的结果一致，并表明长期抗原特异性记忆T细胞反应。 3.3.病毒载体 病毒载体是被修改的病毒，普遍用于将目标基因传递给宿主细胞。在疫苗接种中，它们主要被识别为抗原载体，传递DNA抗原和蛋白抗原给免疫细胞。然而，病毒载体也具有佐剂能力，因为它们可以模仿由病毒引起的自然感染。通常，自然感染是通过病毒通过表面受体附着到宿主细胞上发生的。病毒的存在通过识别载体上的病原体结构或PAMPs以及与模式识别受体（PRR）的相互作用，有效地触发先天免疫反应。虽然载体诱导类似病毒的感染，但病毒载体被修改为非致病性和复制缺陷，以避免进一步的病毒特异性感染。虽然病毒载体是有效的佐剂，但它们也有一些缺点。主要的是，很难调节启动的先天反应，有时载体可能引起过于强烈的先天反应，导致细胞毒性、对重复剂量的免疫以及强烈的炎症反应，这些可能会降低效果甚至被身体清除。 在临床上使用的载体来自几个病毒家族，包括副黏液病毒、腺病毒科和正黏液病毒科。在每个家族中，有几种不同的病毒载体通过基因编辑进行了修改，以避免预先存在的免疫，同时减少毒性和免疫原性。如前所述，有一种病毒载体佐剂，即rVSV，已被用于默克公司的许可rVSV-ZEBOV扎伊尔埃博拉疫苗中。还有两种病毒载体获得了WHO和FDA的临时紧急批准。阿斯利康COVID-19疫苗中的ChAdOx1载体在2021年2月获得了WHO的紧急批准，但此后该批准已被撤销。此外，詹森COVID-19疫苗中使用的Ad26载体在2021年2月获得了FDA的紧急批准，但由于与疫苗接种相关的潜在血凝块风险，这一批准已被撤销。在当前的临床景观中，有27种病毒载体佐剂分布在八个病毒家族中。在临床试验中的佐剂中，15.8%的总试验和13.6%的独特疫苗配方使用了病毒载体，使其成为临床试验疫苗景观中第三大佐剂组。 3.3.1.弹状病毒 rVSV是临床试验中正在测试的唯一弹状病毒家族的病毒载体。rVSV是一种活的、减毒的重组水泡性口炎（印第安纳）病毒（VSV）。目前，该载体正在评估针对尼帕病毒、拉沙病毒和埃博拉苏丹病毒病（ESVD）的疫苗中的四种独特疫苗配方。VSV是一种11 kb非分段、单链、负义RNA病毒，由11,000-12,000个核苷酸组成，编码五个基因：N、P、M、G和L。该病毒主要感染昆虫、马、牛和猪，因此避免了人类的预先存在的免疫，并增加了VSV病毒载体疫苗的有效性。VSV的糖蛋白G是一种III类病毒融合蛋白，允许细胞附着和膜融合并使感染成为可能。在许可的rVSV ZEBOV疫苗中，VSV-EBOV，EBOV糖蛋白（GP）被整合到VSV载体中，其中G开放阅读框架被故意移除。这种修改允许复制rVSV显示弹状病毒的形态，同时在其表面表达EBOV GP。与其他病毒载体一样，rVSV产生与宿主的Toll样受体（TLRs）和模式识别受体相互作用的信号。这种相互作用触发先天免疫反应，从而增强适应性免疫反应。VSV病毒载体已被证明是一个有希望的平台，因为它的血清价、高复制性和接种个体中的低至温和症状。然而，虽然在产生所需抗原的免疫反应方面有效，但许可的疫苗也在超过三分之一的受试者中证明了对载体本身VSV的细胞毒性T细胞和抗体反应；这可以直接影响VSV-EBOV的复制能力。尽管如此，由于对免疫反应的积极影响和高制造性，这种载体继续被探索用于各种疫苗：rVSV可以通过转染表达感兴趣基因的哺乳动物细胞或HEK293T来高滴度生产。 3.3.2.腺病毒 腺病毒是非包膜双链DNA二十面体形状的病毒，在病毒载体空间中占主导地位，包括人类和黑猩猩腺病毒载体。在腺病毒科家族中，Mastadenovirus属由感染人类和非人灵长类动物（如牛、犬和黑猩猩等灵长类动物）的血清型组成。血清型进一步分为A-G种。在当前的临床试验空间中，人类腺病毒载体代表最大的病毒载体家族，有17种独特的疫苗配方跨越33项试验，研究多种COVID-19疫苗，以及HIV、狂犬病、霍乱等（图4a）。在56种人类腺病毒血清型中，野生型血清型引起轻度至中度的呼吸道或胃肠道疾病症状。这些多样化的菌株通常源于病毒复制过程中发生的自然基因变异。数字命名有助于科学家对这些变体进行分类和研究，每个数字代表人类腺病毒大家族中一个独特的基因组和血清型身份。在临床试验景观中，Ad5是最常用的病毒载体，包括针对COVID-19和诺如病毒的10种独特疫苗配方。在COVID-19大流行期间，Ad5病毒载体已被用作COVID-19疫苗平台，临床试验中正在测试几种载体修改的COVID-19疫苗。在最近的一项研究中，发现不同剂量并没有显著增加抗体产生水平，这表明腺病毒载体的限制。Ad5病毒载体被证明可以产生特异性抗体和长期T细胞反应，但证明了高血清流行率，因为52%的参与者有高预先存在的免疫。Ad5载体被证明是有效和安全的，但由于其高血清流行率，许多其他衍生物已经从稀有人类腺病毒物种和非人灵长类动物中创造出来，这些物种今天出现在临床试验空间中，如用于COVID-19疫苗Ad26.COV2.S的Ad26。 图4 展示了临床中病毒载体的情况。(a) 根据病毒家族，临床试验空间中包含病毒载体的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。(b) 根据血清型，包含腺病毒载体的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。 由于黑猩猩腺病毒（ChAd）在系统发育上与人类腺病毒相似，这两个腺病毒家族之间有许多相似的特征。ChAd在临床试验景观中的13种独特疫苗配方和27项总试验中被发现，构成了第二大病毒载体组。ChAd载体在各种传染病的试验中，包括HIV、COVID-19、狂犬病和埃博拉。在ChAd载体中，ChAdOx1在临床上最流行，有四种独特的疫苗配方和16项总试验（图4b）。ChAd病毒载体是起源于腺病毒科Mastadenovirus属的猴腺病毒；它们主要结构为非包膜双链DNA，能够感染人类和非人灵长类动物。最常用的猴腺病毒载体ChAdOx1源自黑猩猩腺病毒Y25，由牛津大学开发。这个载体是安全和高度可制造的，并且可以在2°C–8°C下储存，使其成为全球分发的理想选择。ChAdOx1还避免了人类腺病毒载体中发现的预先存在的免疫。在对单剂量ChadOX1 nCoV-19（AZD1222）进行的研究中，发现它诱导了强烈的Th1免疫反应、IgG1和IgG3抗体产生，以及CD8 T细胞、自然杀伤细胞和B细胞群体。像ChadOX1一样，许多其他载体，如ChAd155和ChAd36，显示出类似的免疫反应，具有强大的体液和细胞反应。总的来说，ChAd载体是有效的，并且适合全球分发，同时避免了人类腺病毒载体中发现的预先存在的免疫。 3.3.3.痘病毒科病毒 改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）是痘病毒科家族中唯一的病毒载体，并且在临床上用于10种独特的疫苗配方和11项总试验，占病毒载体景观中独特疫苗配方的17.2%。痘病毒是双链DNA病毒，它们在宿主细胞的细胞质中复制，从而消除了病毒与宿主基因组的整合。通常已知感染人类和动物，痘病毒通常引起病变、皮疹和皮肤结节。MVA载体是天花病毒的高度减毒株，已证明在人类中安全，包括HIV感染者，同时是一个多功能平台，可以长期储存。冻干MVA疫苗被证明可以在37°C下储存长达2周，并且在冷藏时超过一年。MVA主要在临床试验中用于上呼吸道疾病，如COVID-19、呼吸道合胞病毒、中东呼吸综合征（MERS）和疟疾。它已被证明可以诱导大量抗原特异性CD8和CD4 T细胞反应和快速记忆分化。在最近的一项研究中，MVA-EBOV-GP的给药，一种针对埃博拉病毒（EBOV）糖蛋白（GP）的病毒载体疫苗，导致了病毒中和抗体的产生，而MVA-EBOV-NP，一种针对埃博拉核蛋白（NP）的病毒载体疫苗，触发了针对NP的细胞毒性CD8 T细胞的发展。两种疫苗都证明了在引发保护性免疫反应方面的同等效力。 3.3.4.副黏液病毒 目前临床试验中有来自副黏液病毒科的两种病毒载体正在接受测试：PIV5和新城疫病毒（NDV），代表了九项总试验中的五种独特疫苗配方（图4a）。副黏液病毒是大小为150-300 nm的包膜病毒。它们是单链RNA病毒，像痘病毒科家族一样在宿主细胞质中复制。病毒含有两种跨膜糖蛋白：三聚体融合（F）蛋白使膜融合，而血凝素-神经氨酸酶（HN）、血凝素（HA）或糖蛋白（G）使病毒附着。这些病毒以其感染脊椎动物而闻名，如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和副流感病毒。两种病毒载体PIV5和NDV都含有相同的两种跨膜糖蛋白：血凝素-神经氨酸酶蛋白HN和融合蛋白F。这些载体目前正在进行针对COVID-19和合胞病毒等上呼吸道感染的试验。PIV5在哺乳动物中表现出低毒力，除了犬类上呼吸道感染外，并且由于可以在Vero细胞中生长至8×108 PFU/ml，因此具有很高的可制造性。在最近一项针对PIV5 RSV疫苗的鼻内研究中，大约50%的参与者在基线时对PIV5中和抗体呈血清阳性，但显示出对RSV F蛋白的强烈细胞免疫反应；因此，先前接触这种病毒载体并不会抑制反应。类似地，NDV可以低成本大规模生产，因为它是一种禽病毒，可以在受精鸡蛋中生长。NDV在人类中没有预先存在的免疫，但已知在禽类中具有传染性和危险性。过去，NDV已被用作癌症治疗的安全候选物，并通过在肿瘤细胞中诱导I型和III型抗病毒干扰素以及非癌症细胞中的III型而显示出溶瘤优势。 3.3.5.正黏液病毒科病毒 正黏液病毒科由球形病毒组成，包含分段的单链负链RNA。这个家族最显著地包括流感病毒，它们在当前临床试验病毒载体空间中有代表。有两种独特的疫苗配方跨越两项试验，包含流感A病毒（图4a）的变种，特别是H1N1和H3N2，用于针对COVID-19的疫苗。流感病毒可以感染哺乳动物和鸟类，引起人类的轻度至重度呼吸道疾病，有四个亚型：A、B、C和D。亚型是基于蛋白质血凝素（H–H18）和神经氨酸酶（N1-N11），常见的亚型H1N1和H3N2是常见的在人类中传播的病毒。血凝素（HA）对病毒进入宿主至关重要，而神经氨酸酶（NA）有助于从感染细胞中释放新形成的病毒颗粒。正在评估的疫苗之一Corfluvec利用两种不同的减毒流感载体通过鼻内途径传递，重组H3N2载体用于初次免疫，基于2009年出现的H1N1病毒的重组H1N1pdm09载体用于增强（NCT05696067）。DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1也在临床评估中，用于针对COVID-19的保护；这种疫苗通过鼻内途径传递，利用流感A H1N1载体（A/California/4/2009, CA4）（NCT05200741）。虽然在两项试验中使用的载体都是弱化株，但预先存在的免疫原性对载体对疫苗的整体有效性和反应原性的影响尚不清楚，需要进一步阐明。 3.3.6.沙粒病毒科 沙粒病毒科由包膜单链病毒RNA组成。来自这个家族的皮钦德病毒（PICV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）构成了两种独特的疫苗配方，与交替载体免疫策略结合，测试慢性乙型肝炎治疗疫苗（NCT05770895）。PICV是一种非致病性RNA病毒，源自Oryzomys albigularis，也称为米鼠。它在感染啮齿动物的地区的人类人群中显示出低血清流行率，这减轻了PICV载体疫苗中的预先存在的免疫。LCMV由双节段负链RNA组成，但与PICV不同，LCMV是一种致病性病毒，通过有毒啮齿动物引起多种神经系统疾病，如脑膜炎、脑炎和婴儿出生缺陷。为了安全，LCMVs经历了遗传突变，减弱了复制能力并减少了疫苗中的致病性。沙粒病毒科因其能够诱导强大和功能性的细胞毒性T细胞反应而在过去的免疫学研究中被利用；然而，这两种基因相关的载体在初次增强组合中的使用增强了这种反应并避免了载体中和抗体。 3.3.7.疱疹病毒科 疱疹病毒科由大型双链DNA基因组组成。人类巨细胞病毒（HCMV）是疱疹病毒科中唯一目前在临床试验中的病毒载体，用于针对HIV疫苗VIR-1388，由Vir Biotechnology开发（NCT05854381）。这种疫苗已经显示出使用弱化的CMV病毒含有HIV材料来产生针对慢性HIV感染的HIV特异性T细胞。HCMV在欧洲和美国的人群中显示出80%的流行率，在非洲和亚洲为100%。HCMV感染在健康个体中通常是无症状的，但可能对免疫系统受损的患者，包括婴儿和艾滋病患者，构成严重的健康风险。症状可能表现为CMV单核细胞增多症、发热、白细胞减少、肺炎和胃肠疾病；在艾滋病患者中，常常导致视网膜炎。然而，这种疫苗目前用于没有HIV的健康成年人，并且由于HCMV在大多数成年人中是无症状的，因此它是健康个体中作为病毒载体的良好候选物。此外，在对小鼠CMV（MCMV）的研究中，即使在血清阳性患者中，病毒也被证明可以诱导T细胞反应；虽然这种特性使其难以预防CMV，但可以作为载体使用。HCMV是一个特例，因为它产生高频率的病毒特异性CD4+ T细胞，具有一系列的细胞毒性和效应功能，以及在宿主一生中充当效应记忆细胞的CD8+ T细胞群体。这种现象被称为“记忆膨胀”，使其成为具有长期免疫潜力的有效病毒载体，特别是对于需要强大细胞反应的疾病，如HIV。在非人模型中，CMV载体疫苗还证明了能够被遗传改变并编程多样化的CD8+ T细胞，具有不同的表位目标。这允许CMV载体针对特定的CD8+ T细胞反应量身定制，以针对不同的疾病模型。 3.4.TLR激动剂 TLR是一种模式识别受体（PRR），是具有识别微生物的病原体相关分子模式（PAMPs）或受损组织的危险相关分子模式（DAMPs）的先天免疫受体。PRR最初由Charles Janeway在1989年提出，他假设它们作为先天和适应性免疫系统之间的联系。在这一预测之后，TLR4在1996年首次被发现，1998年发现LPS可以与该受体结合。从那时起，已经鉴定出具有独特先天免疫途径的其他TLR受体。TLR激动剂首次在2009年获得FDA许可的HPV疫苗中的AS04佐剂中使用。AS04含有TLR4激动剂MPL，也用于2017年许可使用的带状疱疹疫苗中的AS01b佐剂。在AS04和AS01b中，MPL被吸收到另一种免疫调节剂上，如铝或QS-21的脂质体配方。另外两种TLR激动剂（CpG 1018和CpG 7909）分别在2017年和2023年在临床许可疫苗中使用，每种都是未甲基化的CpG基序，作用于TLR9。 3.4.1.TLR3激动剂 TLR3激动剂是目前在临床中使用的一个小众材料群体，只有六种独特的疫苗配方在八项总试验中被评估（图5b）。在免疫细胞中，TLR3特别存在于髓样树突状细胞（mDCs）、巨噬细胞和肥大细胞上，主要定位在这些细胞的内质体中。配体结合后，TLR3与适配蛋白TRIF相关联，导致以I型干扰素（IFN）分泌增加为标志的抗病毒反应。TLR3在DCs上的激活非常重要，因为这启动了强大的IFN释放，并诱导了对适应性免疫重要的抗原特异性免疫反应。TLR3激活产生的强烈IFN反应和先天免疫级联反应，使这条途径对保护免受多种病毒如流感、RSV等的侵害变得重要。这种受体识别双链RNA（dsRNA），这是病毒复制的中间体，因此被临床中的TLR3激动剂所模仿。 图5 展示了临床中TLR激动剂的情况。(a) 根据TLR编号，包含TLR激动剂的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。(b) 根据TLR激动剂类型以及进一步指定的激动剂，临床试验空间中包含TLR激动剂的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。 在已识别的临床试验中，有三种TLR3激动剂每种都在两种独特的疫苗配方中被探索——Poly I:C、PIKA和dsRNA发夹——只有PIKA作为其配方中唯一的佐剂（图5b）。Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C)是一种合成的dsRNA类似物，是一种常见的TLR3激动剂，用于癌症和传染病应用。在临床中，Poly I:C目前用于三种试验中的两种不同的疫苗配方。它与QS-21和脂质分子结合，形成MA105，正在作为带状疱疹疫苗中的佐剂进行测试。此外，它与另外两个组分，宿主防御肽IDR-1002和阳离子聚合物佐剂聚磷氮烷（PCEP），结合形成TriAdj，正在研究用于新型COVID-19疫苗。另一种结合使用的TLR3激动剂是dsRNA发夹，它与Ad5病毒载体结合，用于Vaxart开发的口服诺如病毒（NCT05626803）和口服COVID-19（NCT05067933）疫苗。利用TLR3激动剂进行这种给药途径可以在肠道中产生更强大的先天免疫反应，因为TLR3可以在肠道上皮细胞中找到。在这个系统中，dsRNA发夹被纳入病毒载体，并与抗原编码在同一病毒载体上。在小鼠的流感模型评估中，dsRNA发夹在载体中的包含被证明可以增强对抗原的抗体反应。在已识别的试验中评估的最后一个TLR3激动剂是PIKA，这是一种由YS Biopharma开发的dsRNA稳定化学类似物，在用于狂犬病（NCT05667974）和COVID-19（NCT05463419）疫苗的两种配方中，PIKA与TLR3相互作用并启动与该受体相关的先天免疫途径。 3.4.2.TLR4激动剂TLR4激动剂是当前在活跃的临床试验中评估的最常见的TLR激动剂（图5a）。这可能是由于TLR4激动剂MPL在AS04和AS01B中的FDA批准历史。TLR4是一种跨膜蛋白，主要表达在髓样起源的免疫细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。它也存在于非免疫细胞上，如上皮细胞、神经元和中枢神经系统（CNS）细胞。TLR4最初是通过其能够感知LPS而被发现的，然而，它也能够结合由组织损伤产生的内源性分子，即DAMPs。重要的是，TLR4本身不能感知LPS。相反，TLR4必须与细胞表面的MD-2物理相关联才能对LPS做出反应，形成LPS/TLR4/MD-2复合物以启动细胞中的相应免疫途径。一旦启动，TLR4可以触发两个独立且竞争的途径：MyD88独立（TRIF依赖）和MyD88依赖途径。适配蛋白如MyD88与TLR4复合物的关联决定了随后的免疫反应。MyD88依赖的反应导致如IL-6和TNF-a等促炎细胞因子的释放，而MyD88独立的反应导致I型IFN释放。 如前所述，在许可疫苗佐剂部分，MPL是来自Salmonella minnesota R595的LPS的非毒性衍生物，包含多个单磷酸脂A（六酰基、五酰基、四酰基和三酰基）的同系物，并与铝盐和QS-21结合使用，以前许可的佐剂系统中针对TLR4途径。脂质A是LPS的保守分子模式，是LPS免疫反应的主要诱导剂，使其成为作为佐剂使用的关键焦点。临床级MPL由GSK独家生产，用于他们的佐剂系统，而其他“通用”形式的单磷酸脂A也在临床中使用，并被指定为MPLA。在本综述中，MPL和MPLA将被称为MPL。MPL已被证明可以激活MyD88依赖和TRIF依赖途径，但偏向于TRIF依赖途径，这有助于其与LPS相比的低毒性和其整体佐剂效果。由于其天然衍生，MPL具有一些固有的异质性和制造难题，促使产生了一种纯合成的六酰基脂质A衍生物，葡萄糖基脂质A（GLA）。MPL和其他天然衍生的内毒素可能具有不同数量的链、附着位点和链内的碳原子；而GLA作为合成替代品，具有明确定义的链附着数量和碳原子长度。GLA产生与MPL类似的反应，但与LPS相比具有较低的内毒素性，偏向于通过TRIF依赖途径发出信号，并在小鼠树突状细胞中具有相似的剂量和时间依赖性反应。然而，它在人类单核细胞衍生的树突状细胞上显示出更强的刺激能力。另一种合成MPL，3D-PHAD，也在当前的临床试验空间中普遍存在，存在于ALF佐剂家族中的ALFQ和ALF43中。尽管GLA是六酰基MPL的合成结构类似物，3D-PHAD是源自细菌LPS的3-脱酰基单磷酸脂A的纯五酰基合成类似物，在临床前分析中显示出与GLA的等效性。 GLA、3D-PHAD和MPL在当前临床试验空间中占有显著地位，其中GLA在约17%含有TLR激动剂的疫苗配方中最为常见，3D-PHAD约占12%，MPL约占10%。这些激动剂通常与其他佐剂或载体结合配方，只有一种疫苗配方仅评估TLR激动剂MPL。当与其他材料结合使用时，这些TLR4激动剂通常与氢氧化铝（AS04）、QS-21脂质体（AS01b、AS01e、ALFQ）配方，或者在GLA的情况下与角鲨烯乳液（GLA-SE）配方。MPL、GLA和3D-PHAD正在活跃的临床试验中评估，用于保护免受寄生虫和细菌感染，如血吸虫病和麻风病，以及病毒感染，如HIV和COVID-19。 尽管MPL、GLA和3D-PHAD在TLR4临床试验空间中占主导地位，但目前还有两种TLR4激动剂正在评估中。第二代脂质佐剂（SLA）由开发GLA的同一家公司AAHI开发，其设计基于TLR4/MD-2复合体的结构知识，而不是MPL。SLA旨在通过从GLA的酰链末端移除碳原子来更好地适应MD-2，这允许与TLR4/MD-2复合体进行更紧凑的相互作用。这种紧凑的结合导致与GLA相比TRIF途径偏向的转变，导致Th1趋化因子和细胞因子的增加。SLA与角鲨烯乳液配方，并在一项针对带状疱疹保护的临床试验中使用。在活跃的临床试验中评估的最后一个TLR4激动剂是EcML，它存在于一种疫苗配方中，跨越两项针对COVID-19的试验。EcML是由Eubiologics通过工程大肠杆菌（E.coli）菌株生产的纯化MPL。它已被证明在小鼠中产生与MPL类似的免疫效应，同时减少了商业可获得MPL的制造时间和成本。目前正在评估的EcML配方与QS-21脂质体结合。 3.4.3.TLR7激动剂 TLR7激动剂在临床试验空间中是最少的TLR激动剂（图5a）。TLR7是一种内质体跨膜蛋白，主要存在于浆细胞样树突状细胞（pDCs）和B细胞上。它也存在于其他非免疫细胞类型上，如角质形成细胞和上皮细胞，但水平较低。TLR7感应富含鸟苷和尿苷的单链RNA（ssRNA）、ssRNA病毒，以及合成抗病毒核苷类似物。当结合时，TLR7通过MyD88胞质适配蛋白发出信号，通过与其他下游蛋白的关联和激活，导致炎症体激活和促炎细胞因子的释放，以促进先天免疫反应。 图6 展示了使用TLR激动剂的独特疫苗配方与其配方组合材料的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。 Imiquimod是一种合成的咪唑喹啉胺，咪唑喹啉类药物是一类小于400 Da的合成核苷类似物，是迄今为止唯一被FDA批准用于细胞内TLR的激动剂。尽管它尚未作为传染病疫苗中的佐剂被用于许可的疫苗，但它目前被批准用于基底细胞癌或生殖器疣的局部治疗。Imiquimod已被证明可以结合TLR7并局部诱导多种促炎细胞因子，导致Th1偏向的免疫反应。目前在疫苗临床试验空间中，Imiquimod被用作流感和疟疾保护的局部佐剂，这两种抗原都被注入真皮空间。另一种TLR7激动剂正在临床试验中评估，之前在其他空间中未经批准。苯并萘骈吡啶-磷酸盐是一种TLR7激动剂，被吸收到铝上，产生完整的佐剂AS37，由诺华开发，后来被GSK收购。苯并萘骈吡啶类药物是通过体外筛选优化的一类新型TLR7激动剂，然后通过体内评估以产生具有低系统暴露、增加局部先天免疫反应和长期T细胞和抗体反应的顶级候选药物。产生的TLR7激动剂通过磷酸盐化学修饰，允许吸附到铝上，从而增强注射部位的保留，并加强随后的免疫反应。在临床试验空间中，AS37正在用于针对金黄色葡萄球菌和乙型肝炎的疫苗接种。 3.4.4.TLR7/8激动剂 TLR7/8激动剂具有独特的能力，能够结合TLR7和TLR8，以促进更强大的先天免疫反应。TLR8与TLR7类似，位于内质体膜上；然而，它在髓样树突状细胞和单核细胞上的表达更多，而不是像TLR7那样在pDCs上。TLR8通过MyD88途径发出信号，但在诱导的细胞因子谱上与TLR7不同。虽然TLR7主要与产生IFNα相关，但TLR8与产生其他促炎细胞因子如TNFα和IL-12相关。因此，激活这两个受体的能力有利于在对佐剂的反应中诱导更完整的细胞因子。 目前有两种TLR7/8激动剂正在活跃的临床试验中评估（图5b）：咪唑喹啉镓（IMDG）和3M-052。如前所述，咪唑喹啉类药物是一类能够与TLR7和TLR8特异性相互作用的核苷类似物。Ocugen开发的针对COVID-19保护的疫苗正在进行一项试验，该疫苗与吸附在铝上的IMDG一起使用。IMDG是一种二聚体咪唑喹啉分子，通过C2位置链接，具有拮抗TLR7和TLR8的独特能力，通过诱导强烈的I型干扰素反应，导致Th1免疫反应。3M开发的另一种TLR7/8激动剂3M-052在临床试验空间中有很强的流行性。这种激动剂出现在五项临床试验中，每项试验评估针对HIV和COVID-19的独特疫苗配方。在这五项试验中，3M-052都被吸附到铝上，其中一项试验还评估了未吸附的激动剂单独使用。3M-052是一种合成的咪唑喹啉酮，结构类似于resiquimod，但有一个18-C脂肪酸链，增强了分子的疏水性，因此减少了系统的扩散，并在免疫接种部位和引流淋巴结中提高了生物利用度。通过激活TLR7/8途径，3M-052诱导促炎细胞因子的释放，并增强Th1免疫反应。 3.4.5.TLR9激动剂 TLR9感应未甲基化的CpG二核苷酸，这是微生物DNA的特征。含有CpG基序的合成寡核苷酸（ODN）可以模仿这种感应并作为TLR9激动剂。TLR9是一种内质体膜受体，主要在pDCs和B细胞上表达，并在其他免疫细胞亚群上表达，通过MyD88途径发出信号，以启动I型干扰素的释放，从而改善对抗原的先天免疫反应。此外，TLR9激动剂有助于将适应性反应偏向Th1，并促进B细胞的增殖。有四种不同的CpG ODN类别，它们在人类细胞中的激活能力不同。B类ODN在临床试验中被最广泛研究，包括两种CpG佐剂，CpG 1018和CpG 7909，这些佐剂被用于许可的疫苗。这些ODN包含1至5个CpG基序，嵌入在磷酸硫代（PS）骨架中，可以触发pDCs分化并产生TNFα，同时仍然刺激B细胞增殖并分泌IgM。A类ODN包含一个CpG基序，被回文序列包围，导致形成茎环结构。虽然这些ODN同样触发pDC成熟和IFNα的释放，但由于它们定位在早期内质体上，它们不影响B细胞。 由于其在许可疫苗中的历史，TLR9激动剂在TLR激动剂的临床试验空间中占有强势地位，仅次于TLR4激动剂：共有30项试验和18种独特的疫苗配方。目前正在活跃的临床试验中评估六种TLR9激动剂，其中B类ODNs主导该空间，以及以前使用的TLR9激动剂CpG 1018在所有TLR9激动剂中最普遍。CpG 1018出现在10种独特的疫苗配方中，占19项针对COVID-19、流感、HIV和瘟疫的疫苗试验。除了一项试验（NCT05506969）外，CpG 1018都被吸附到氢氧化铝上。这种吸附已被证明可以增强对抗原的免疫反应。CpG 7909，另一种以前使用的B类ODN，是第二普遍的TLR9激动剂，用于四种独特的疫苗配方和五项总试验中；这种激动剂只在一半的配方中被吸附到氢氧化铝上，其余的独立交付。另外两种B类ODN也在评估中，CpG 10104和CpG55.2，都用于一种独特的疫苗配方中，分别针对钩虫（NCT03172975）和COVID-19（NCT05279456）。虽然CpG 10104正在测试吸附到氢氧化铝上，CpG55.2是与一种新型多糖佐剂Advax配方的，这是δ-菊粉颗粒。CpG 2216是一种A类ODN，正在评估结核病疫苗GamTBvac（NCT04975737）中。CpG 2216与一种阳离子衍生的右旋糖酐，右旋糖酐DEAE一起交付，以形成完整的佐剂系统。 3.4.6.组合材料 正如许多评估TLR激动剂的试验中所看到的，这些TLR激动剂并非总是单独交付；相反，只有15%的疫苗配方仅使用TLR激动剂和抗原。相反，这些激动剂通常与另一种佐剂材料结合使用，以增强其在注射部位的传递和持久性，以及由此产生的免疫反应。最常用的组合材料是氢氧化铝，占40%的疫苗配方正在评估中，其中TLR激动剂被吸附到铝颗粒的表面。脂质体是第二常用的组合材料，用于23%含有TLR激动剂的疫苗配方中。这些配方中几乎全都使用了QS-21的脂质体配方，如在许可疫苗中使用的佐剂系统AS01B。如前所述，QS-21是从南美树Quillaja saponaria Molina的树皮中提取的一种皂苷分子。QS-21是一种重要的免疫调节材料，促进促炎环境并增强对抗原的整体免疫反应。将QS-21与胆固醇结合在脂质体配方中是一个重要步骤；游离的QS-21具有毒性并导致细胞坏死。然而，当与胆固醇不可逆地结合时，它失去了毒性，同时保持了佐剂效果。虽然QS-21脂质体配方在化学组成和物理特性上有所不同，但使用的基础材料是一致的：磷脂、胆固醇、QS-21和TLR激动剂。在临床试验空间中最常见的脂质体配方是与TLR4激动剂、MPLA衍生物或合成类似物结合使用的，MA105是唯一含有TLR3激动剂Poly I:C的脂质体配方。AS01系统和ALFQ是临床试验空间中最普遍的脂质体佐剂。AS01使用中性的二油酰磷脂酰胆碱（DOPC），与磷脂的33.7摩尔百分比的胆固醇，而ALFQ使用两种磷脂，中性的二酰磷脂酰胆碱（DMPC）和阴离子的二酰磷脂酰甘油（DMPG），与55摩尔百分比的胆固醇。这些化学差异导致两种脂质体的大小差异，AS01产生均质的100纳米颗粒，ALFQ导致脂质体的大小从50到30,000纳米不等。在临床试验中评估的不含QS-21的脂质体，ALF43，是ALF家族的成员，保持与ALFQ相同的磷脂组成，并添加3D-PHAD，但由43摩尔百分比的胆固醇组成。与氢氧化铝不同，脂质体，特别是QS-21的脂质体配方，目前只在与TLR激动剂结合时出现在临床试验空间中。 角鲨烯乳液是与TLR激动剂结合的第三常见的材料，在已识别的临床试验中。这些与GLA和SLA结合的稳定乳液将在下一节中讨论。如前一节所讨论的Ad5载体也用于传递dsRNA发夹，它作为TLR3激动剂。这种组合出现在两项独特的疫苗配方和三项试验中，是临床试验空间中唯一的病毒载体和TLR激动剂的组合。临床试验空间中也有新颖的组合材料。TriAdj是一种独特的组合，由宿主防御肽IDR-1002、阳离子聚合物佐剂聚磷氮烷（PCEP）和TLR3激动剂Poly I:C组成。虽然IDR-1002尚未显示出增强免疫细胞释放促炎细胞因子的能力，但它已在体外显示出是强效的诱导剂，对人类外周血单核细胞产生中性粒细胞趋化因子CXCL1和CXCL8以及单核细胞趋化因子CCL2和CCL7。这将有助于通过白细胞募集在注射部位创造一个免疫能力环境。另一方面，PCEP单独与小鼠抗原一起交付时，促进了IFNy和IL-4的产生，导致强大的抗原特异性Th1和Th2反应。另一种新颖的组合材料，右旋糖酐DEAE，用于针对结核病的GamTBvac疫苗（NCT04975737）。右旋糖酐是一种天然多糖，是药物和抗原传递中最研究的α-葡聚糖之一；它已被证明可以增强细胞和体液反应，尽管确切机制尚不清楚。在GamTBvac中，阳离子右旋糖酐衍生物，右旋糖酐-DEAE，被CpG 2216（TLR9激动剂）包围，形成完整的佐剂系统，而抗原与右旋糖酐结合域融合，并在右旋糖酐上非共价固定。与右旋糖酐类似，右旋糖酐-DEAE的机制尚不清楚，但已显示出这种多组分佐剂允许抗原缓慢释放，刺激TLR9，并激活吞噬作用，所有这些都导致Th1免疫反应。最后一个新颖的组合材料也是一种天然多糖，菊粉，被配方成颗粒并与TLR9激动剂CpG55.2结合，用于针对COVID-19的佐剂系统（NCT05279456）。作为一种植物衍生的多糖，天然形式的菊粉没有免疫调节活性；然而，当结晶成颗粒形成δ-菊粉时，它具有强大的佐剂活性。δ-菊粉在40°C以上的温度下才溶解，这意味着它在体内保持稳定，可能增强其免疫学能力。重要的是，它还显示出启动人类补体系统，导致抗体反应，以及结合到单核细胞并增强它们的趋化因子产生。这些组合材料在佐剂系统中各自发挥作用，与TLR激动剂协同作用，并增强整体免疫反应。 3.5.乳液佐剂 乳液佐剂自2013年AS03在许可的H1N1疫苗中使用以来，一直在FDA许可的疫苗中使用，随后在2015年的流感疫苗中使用MF59。AS03和MF59都是基于角鲨烯的水包油乳液，AS03还包括(D,L)-α-生育酚（维生素E）以增加额外的免疫激活。在当前的临床试验景观中，大约9%的试验和大约8%正在评估的独特疫苗配方包含乳液佐剂。目前正在活跃的试验中评估12种独特的乳液佐剂，其中两种（AS03和MF59）已经用于许可的疫苗中。水包油（O/W）乳液是临床试验中最主要测试的乳液佐剂形式，也是许可疫苗空间中的形式，12种独特乳液佐剂中有11种是水包油乳液。另一种正在评估的乳液是油包水（W/O）乳液。这两种乳液之间的主要区别在于它们的连续相和分散相。O/W乳液具有水的连续相，油相分散其中，而W/O乳液则相反。在这两种类型的乳液中实现乳液的稳定性都很困难，但由于水滴的高流动性，W/O乳液的稳定性更低。此外，由于油的高浓度，W/O乳液的毒性和局部反应原性是一个更大的问题，导致在临床中评估的W/O乳液较少。 3.5.1.油包水乳液 Montanide ISA-51是目前唯一在临床试验中测试的W/O乳液，与肽配方结合，用于针对COVID-19的保护。这种乳液由矿物油和来自曼尼德单油酸酯家族的表面活性剂组成。W/O佐剂将留在注射部位并创建一个库，以缓慢释放抗原，这有助于整体免疫反应。此外，这种W/O库诱导炎症，并导致免疫细胞的募集以摄取抗原。虽然这些佐剂在增强对抗原的免疫反应方面非常有效，但它们可能带来严重的局部和系统性不良反应，这也是过去相关临床试验终止的原因。特别是，当以前在HIV疫苗中评估时，Montanide ISA-51的注射随后是注射部位的局部肿胀以及头痛、恶心和发烧等系统性反应。最令人关注的是，在多名患者中注射部位形成了无菌脓肿，这被认为是由佐剂诱导的炎症引起的。佐剂可以长时间留在注射部位，免疫细胞清除疫苗需要数月时间。由于这一点，以及油中产品持续激活TLRs引发的炎症级联反应，这种佐剂可能导致严重的炎症反应，对患者产生负面影响。 3.5.2.水包油乳液 对于O/W乳液，角鲨烯是临床试验中这些佐剂中使用的主要材料。事实上，在活跃试验中的11种独特的O/W乳液中，除了一种之外，都包含角鲨烯在它们的配方中。角鲨烯是一种从植物和鲨鱼肝油等几个关键来源天然衍生的三萜。在许多配方中，角鲨烯被用来稳定配方，促进抗原的溶解，并改变抗原的释放。它也是一种生物相容材料，与许多W/O乳液中使用的矿物油相比，它表现出较少的持续毒性。然而，过度捕捞减少了鲨鱼的数量并增强了对它们的保护，未来几年需要更可持续的资源。 MF59类似物 许可的角鲨烯乳液佐剂MF59目前正在七项临床试验中评估流感和COVID-19疫苗。当前临床试验空间中使用与MF59相同成分的另外三种佐剂（表2），其中SCT-VA02B在三项针对COVID-19的独特疫苗配方中使用相同的配方。SWE用略微改变的组成配方乳液，因此可以自由进行技术转让，以装备发展中国家的疫苗制造商；其组成有角鲨烯占3.9%，两种表面活性剂均为0.47%，目前正在评估COVID-19疫苗。SQBA佐剂呈现出与SWE类似的配方，也正在评估COVID-19疫苗。尽管配方有轻微变化，但这些角鲨烯乳液利用相同的免疫激活和反应有效地发挥作用作为佐剂。它们通过肌肉细胞释放ATP和细胞因子诱导，导致炎症细胞涌入注射部位，摄取抗原并将其带到引流淋巴结进行处理，从而在注射部位创造短暂和局部的免疫能力环境。MF59还显示出在淋巴结诱导RIPK3依赖性坏死凋亡，随后是凋亡，这与其诱导CD8+ T细胞反应和抗体反应的能力有关。已经研究了MF59中每个单独组分在加强免疫反应中的影响。单独的组分并不像整个配方那样有效。事实上，角鲨烯、Tween 80和柠檬酸缓冲液单独交付时没有免疫刺激性效果。Span 85在肌肉中确实有刺激性效果，但没有导致抗体或T细胞的产生，而MF59配方实现了这一点。 AS03类似物 AS03是另一种基于角鲨烯的乳液，通过包含DL-α-生育酚和去除Span 85，所有这些都在PBS缓冲液中配方，略有不同的组成。目前正在临床评估的两种其他佐剂包含AS03的不同变体（表2），其中BFA03代表相同组分的类似配方，以及用较少DL-α-生育酚（10 mg/ml）和饱和衍生物角鲨烷（30 mg/ml）配方的角鲨烷基乳液。AS03目前正在11项试验中的五项独特疫苗配方中评估，用于针对COVID-19和乙型肝炎的保护，BFA03（NCT05398848）和角鲨烷基乳液（NCT05726084）每种都用于针对COVID-19的保护。添加DL-α-生育酚（合成形式的维生素E）区分了这些配方及其产生的免疫反应，与MF59类似。与角鲨烯类似，DL-α-生育酚是一种可生物降解的聚异戊二烯。与不包含DL-α-生育酚的AS03配方相比，其中使用了等量的角鲨烯作为替代品，不含DL-α-生育酚的配方在肌肉中细胞因子释放的增加更早，与完整的配方相比，后者在注射后24小时调节了更多的促炎细胞因子。此外，当从配方中省略DL-α-生育酚时，观察到引流淋巴结中粒细胞浸润和单核细胞抗原装载的减少。这些配方依赖的先天免疫反应的变化导致在没有DL-α-生育酚的情况下接种疫苗时抗体反应减少了3.5至6倍。总的来说，AS03及其目前在临床中的类似物受益于DL-α-生育酚的添加。与MF59直接比较针对H5N1株的保护时，两种佐剂都能诱导广泛的同源和异源亚型抗体反应；然而，AS03实现了比MF59更高的抗体滴度和广度，突出了DL-α-生育酚在配方中的潜在益处。 GLA-SE 和 SLA-SE GLA-SE 和 SLA-SE 都使用了相同的角鲨烯乳液，称为稳定乳液（SE），它允许分别吸收 TLR 激动剂 GLA 和 SLA。这些乳液由 AAHI 开发，该公司也开发了 TLR 激动剂。这些乳液最初是首先基于配方的稳定性，其次是基于由此产生的适应性免疫反应而设计的。所得到的乳液由磷酸铵缓冲液中的水相与表面活性剂poloxamer 188（0.9 mg/ml）和甘油（22.5 mg/ml）混合乳化，以及包含DMPC（19 mg/ml）和 GLA 或 SLA（0.25 mg/ml）的10%油相在角鲨烯油中。这种75-90 nm大小的颗粒被发现在小鼠中诱导依赖于配方的免疫反应。具体来说，在评估 GLA-SE、单独的 SE 和水溶液配方中的 GLA（GLA-AF）时，与其它配方相比，GLA-SE 显示出产生强大的抗原特异性 Th1 反应，增加抗原特异性 Th1 CD4 细胞和抗体同种型转换到 IgG2c 亚类。这种对先天和适应性反应的增强主要归因于 GLA-SE 启动 IFNy 产生和激活炎症体——一种病原体识别途径——的能力，与单独的 SE 或 GLA-AF 相比。在当前的临床试验空间中，SLA-SE 正在一项针对带状疱疹保护的试验中使用，而 GLA-SE 与 MF59 一样在该领域中占据主导地位，出现在九项试验中的七种独特的疫苗配方中，使其成为在活跃的临床试验中研究最多的乳液配方，尚未在 FDA 许可的疫苗中使用。 LiteVax LiteVax 是一种新型角鲨烯乳液配方，与 MF59 和 AS03 保持相似，其中角鲨烯是主要成分，浓度为 80 mg/ml，表面活性剂 Tween 80 为 40 mg/ml。目前，LiteVax 正在作为已许可的季节性流感疫苗的佐剂在临床中使用。LiteVax 与 AS03 和 MF59 不同之处在于引入了另一种免疫调节成分，麦芽糖 40-单硫酸酯 1,2,3,6,20,30,60-十七烷酸酯（CMS），浓度为 40 mg/ml，与其他成分在 PBS 中配方。CMS 是碳水化合物脂肪酸硫酸酯（CFASE）的单硫酸盐衍生物。CFASE 佐剂之前在癌症疫苗和如流感等传染病的佐剂中进行了探索；然而，其毒性和副作用，如局部反应原性和体温升高，导致探索 CFASE 的改良。CMS 比 CFASE 反应原性低，同时保持免疫学益处，并且在针对流感的疫苗接种中能够产生比 MF59 类似物高 10-20 倍的抗体滴度。尽管完整的 LiteVax 配方被发现在体外轻微调节树突状细胞激活，但单独的 CMS 被发现在上调成熟共刺激标志物方面比完整配方更有效。这表明 CMS 对 LiteVax 的免疫调节活性的重要性，以及 CMS 增强乳液佐剂免疫反应的潜力。 Ne01（20% 纳米乳液） Ne01 是活跃的临床研究中唯一不包含角鲨烯的 O/W 乳液配方。它专门设计为粘膜佐剂，目前正在评估作为鼻内 H5N1 疫苗。这种乳液（400 nm 大小）最初在密歇根大学发明，现在由 BlueWillow Biologics 开发。它通过在水中乳化十六烷基氯化吡啶（CPC, 1%）、Tween 80（5%）和乙醇（8%），与大豆油（64%）混合制造，并且在室温下与抗原结合保持稳定和免疫原性长达 6 个月，在 40°C 下保持 3 个月。这种佐剂已经在雪貂中显示出产生强烈的细胞和体液反应，并有效地保护它们免受 H5N1 的致命挑战。虽然这种佐剂的确切机制仍在阐明中，但它已经显示出通过产生 IL-6 和 IL-17 产生 Th17 反应，也通过产生 IFNy 产生 Th1 反应。此外，已经显示 Ne01 导致抗原摄取和随后的上皮细胞凋亡，然后被树突状细胞吞噬，导致抗原摄取和 APC 成熟的间接途径。 3.6.以前许可的减毒活疫苗 减毒活疫苗由于使用活体、减毒的病毒，具有固有的佐剂特性。在针对疟疾保护的临床试验中，卡介苗（BCG）——减毒结核病（TB）疫苗——和黄热病疫苗YF-17D（也称为Stamaril）被皮内注射，与抗原一起用作佐剂。卡介苗由Calmette和Guerin开发，自1921年首次用于人类以来，至今仍是唯一许可的TB疫苗。它由导致牛结核病的分枝杆菌的减毒株组成，已被证明除了结核病外，还能对其他分枝杆菌感染如麻风病和Buruli溃疡提供保护。卡介苗在注射部位广泛诱导促炎反应，导致免疫细胞浸润和IFNy释放增加。卡介苗表达的各种蛋白质作为TLR激动剂，可以刺激免疫细胞。最终，这些先天反应导致强烈的体液和细胞适应性免疫反应。 黄热病疫苗Stamaril或YF-17D由Sanofi开发，于1987年获得WHO预认证，但在美国仍被视为研究性产品，未获得许可。它使用黄热病病毒的减毒17D-204株；重要的是，黄热病病毒疫苗的17D系列被认为是迄今为止生产最有效和最安全的减毒活疫苗之一。该疫苗通过多种TLR激动剂激活几种树突状细胞亚群，导致促炎细胞因子的产生，并导致强大的体液和细胞适应性免疫反应。 4.结论 佐剂是疫苗的重要组成部分，不仅可以增强整体免疫反应，还可以增强疫苗稳定性。当用于针对传染病的疫苗时，应用能够使疫苗在没有有效冷藏的情况下运输到各个地区的材料，或通过减少所需疫苗剂量和/或频率来降低疫苗成本，这一点至关重要。然而，尽管佐剂有潜力改善疫苗接种，但在铝盐获得批准后的近80年里，第二个获得FDA批准的佐剂才出现。尽管自2010年代以来，许可疫苗中使用了更多的佐剂，但铝盐继续主导佐剂领域，并且仍然是临床试验空间中最常用的佐剂。然而，就像单一抗原不能期望对所有病原体提供保护一样，单一佐剂也不能。正如在COVID-19大流行期间所经历的那样，新的或复杂的病毒和病原体需要在佐剂空间以及抗原方面的设计意图。这种完整的疫苗设计对于引发广泛和长期的保护至关重要。虽然超过一半针对传染病疫苗的活跃临床试验没有使用佐剂或使用了以前许可疫苗中的佐剂，但36%的试验正在研究尚未在许可疫苗空间中使用的新型佐剂。这些佐剂基于各种材料，如纳米颗粒、病毒载体、TLR激动剂和乳液，单独使用或与其他免疫调节材料结合使用。 展望未来，应评估更多材料作为疫苗接种中的佐剂，并应对多种抗原和疾病评估其免疫调节效果。在临床试验空间中，佐剂创新和探索方面存在明显差距。我们不能继续依赖我们已经拥有的材料来满足即将到来的大流行病的需求，也不能期望一个免疫原性差的抗原能引发足够强烈的免疫反应。通过对免疫调节化合物的更强大的物质理解，我们可以准备制定涉及合理设计的抗原以及佐剂的有效疫苗。佐剂的安全性在为公众接种疫苗时也极为重要，可能是许多在临床试验中评估的疫苗不使用佐剂或涉及以前许可疫苗中的佐剂的主要原因，这些疫苗具有经过验证的安全性。然而，通过有意识地设计安全性和免疫原性兼顾的佐剂，我们最终可以制定出更有效的疫苗，而不会牺牲患者的安全性。虽然疫苗一直是公共卫生的一部分，但佐剂领域相对处于起步阶段，看到未来我们将欢迎哪些新材料进入该领域将是令人兴奋的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

8月4日晚间，华润三九发布重大资产购买预案，拟斥资62.12亿元购买天士力28%股份，交易完成后，华润三九将取得天士力的控制权。中国制药行业已经很多年未见如此巨额的并购案，一时间议论纷纷。 华润拥有悠久而丰富的发展史，央企作为国家意志体现之一，承担的更多的是稳定社会的责任。华润医药在过去几十年的发展中，通过“撒钱”式的合纵连横，已经成长为中国制药工业中的巨无霸。近年，在国企改革、中国特色估值体系建设等改革大潮的助推下，华润医药的的并购整合脚步正在不断加快。在整体发展战略中，作为央企的思路，似乎与普通药企的发展路径又有很大不同。 01 脚步加快 除却控股天士力这笔大交易，在今年过去的前7个月，华润医药的并购与整合大戏不断上演。 7月17日，华润医药旗下的博雅生物发布公告称，拟斥资18.2亿元收购绿十字香港控股有限公司（以下简称“绿十字香港”）100%股权，从而间接收购境内血液制品主体绿十字(中国)生物制品有限公司(简称“绿十字”)。 据悉，收购前，韩国企业GC持有绿十字香港77.35%股权，韩国私募股权基金Synaptic持有15.33%股权，46名韩国籍自然人共持有7.32%股权。由绿十字香港控制的绿十字目前拥有白蛋白、静丙、VIII因子、纤原、乙免及破免6个品种16个品规，现有4个浆站，2023年采浆量104吨。 按此前评估，绿十字香港股东全部权益价值为16.8亿元，增值率为160%，若按交易价格18.2亿元计算，实际溢价率为182%。 大幅溢价且未设置业绩对赌协议的并购，再次展现了博雅生物的豪气，而这样的豪气撒钱的底气，大概率是“不差钱”的央企大佬华润医药给的。 不过18.2亿元买来一张生产牌照、4个在营单采血浆站等等稀缺资源，也十分划算。 除了加快并购脚步，肉眼可见地，华润医药体系内的整合速度也在加快。 今年6月，昆药集团通过了收购华润圣火51%股份的议案，该项交易计划耗资17.91亿元。这笔交易的主要目的是为实现华润医药体系内的三七业务战略性、专业化整合，助力昆药集团打造三七产业链标杆企业，并可以解决昆药集团与华润三九在血塞通软胶囊产品上的同业竞争问题。 华润圣火主要生产研发销售血塞通软胶囊（核心产品）、黄藤素软胶囊、磺胺嘧啶银乳膏、三七冻干系列产品及其他普药。旗下共有3家控股子公司，主要经营三七中药材、三七皂苷、三七资源等三七产业链相关业务。2023年华润圣火总营收7.51亿元，净利润2.03亿元。 事实上，该项交易在2022年华润三九收购昆药集团时就已承诺，但是承诺的期限为5年内，如今收购案通过，从侧面也反应了华润医药体系内部的整合正在加速。 如此加速整合的例子还有很多。 今年2月，华润双鹤发布公告称，拟斥资31.15亿元收购华润紫竹药业集团。该笔交易同样为关联交易。 华润紫竹的核心产品为国内知名紧急避孕药产品毓婷、金毓婷，长年稳居同类产品市占率第一位。近年来华润紫竹的业绩整体持续增长，2021年、2022年及2023年，分别实现营业收入9.03亿元、9.59亿元、10.88亿元；净利润分别为2.19亿元、2.69亿元、3.38亿元。该笔交易完成之后，华润双鹤的“女性健康+儿科”的战略拼图也得以实现。 此外，近两年内，外延并购和内部整合还包括华润医药商业先后收购立方药业51%股权、科伦医贸51%股权、复大医药75%股权，华润医药完成收购华润江中约9.21%股权，华润双鹤收购天安药业约89.68%股权等。 从这些内部整合的案例，我们还无法完全清晰明了地看清华润医药的宏伟目标，需要站在一个更高的角度才有可能摸清“华润系”的整个战略意图。 02 中药为王 华润旗下的华润医药集团，2023年总营收2447.04亿元，净利润77.75亿元，是名副其实的中国医药界巨无霸，位列医药制造行业第四、医药商业位列行业前三，是国内第一大非处方药（OTC）制造商。 上市公司平台共有9家，其中A股7家，包括华润三九、江中药业、东阿阿胶、昆药集团、华润双鹤、博雅生物、迪瑞医疗；港股2家，包括华润医药和华润医疗。这其中，港股的华润医药作为整体上市的母公司，控制着华润三九、江中药业、东阿阿胶、昆药集团、华润双鹤和博雅生物。 华润医药集团股权机构 来源：海通国际证券研报 在2023年总营收中，华润医药的制药、医药分销、药品零售三个主要业务分部收入分别达434.6亿元、2021.5亿元、95.8亿元，同比分别增长14.3%、11.4%、26.2%。其中分销和零售业务属于流通领域，毛利率较低，贡献不了多少利润，主要利润还是靠制药工业支撑。 在制药工业中，华润三九收购昆药集团后已成为华润医药大当家，其旗下明星产品众多，“999”品牌家喻户晓；华润双鹤为“华润系”的主要化药平台，深耕慢病业务、专科业务和输液业务；东阿阿胶专注于阿胶及阿胶系列；江中药业聚焦中成药、保健食品，有“江中”、“初元”两个中国驰名商标和“杨济生”、“桑海”两个江西省著名商标；博雅生物为血液制品企业。 收入结构中，中药板块收入215.93亿元，化药板块170.32亿元，营养保健品及其他27.04亿元，生物药收入仅21.36亿元。 由此可见，华润医药中药板块的占比较大。 在一系列政策的加持下，中药有望迎来长周期的政策红利窗口期。2021年3月，《第十四个五年规划和2035年远景目标纲要》印发，提出“坚持中西医并重和优势互补，大力发展中医药事业”；2022年3月，《“十四五”中医药发展规划》正式印发，明确了“十四五”时期中医药发展目标任务和主要指标；2023年2月，国务院印发《中医药振兴发展重大工程实施方案》，着重强调中药服务体系建设和医保支付倾斜政策的落地...... 支付端来看，中药在医保和基药目录中的占比逐渐提升，同时，中药在医保谈判中成功率较高，在药品集采中降幅相对缓和；审批端来看，中药研发申报流程进一步规范化。 根据弗若斯特沙利文测算，2021年，中国中药市场规模为4302.2亿元，受新冠疫情影响，预计2025年市场规模达到5231.1亿元，并在2030年达到6030.5亿元。 华润医药掌握的中药产品，均为优质资产，品牌响亮，深入人心。叠加华润医药自有的强大医药商业渠道，这些中药资产连年增长。2023年，江中药业、东阿阿胶、华润三九的中药板块等都取得不错的成绩。 如果单纯从市场累计计算，华润医药中药板块的市值已超过片仔癀和云南白药，但因其“一分为四”的格局而较少受到关注。 03 仍需再接再厉 中药在市场上有其特殊性，即“越老越吃香”，讲究的是百年老字号、独家秘方、独家品种。谁掌握的“独家”、“老字号”越多，谁就越有话语权。因此，华润医药的中药板块只会越来越好。 但化药、生物药板块则恰恰相反，追求的是一个“新”字。 华润医药化药平台华润双鹤的主要营收产品诸如复方利血平氨苯蝶啶片、苯磺酸氨氯地平片均为仿制药，受集采影响较大。尽管在研发战略中，已转段启程“技术驱动”和“创新驱动”，但在研管线中绝大部分还是仿制药研发。 只有在BD项目中，可见少量创新药项目。从美国Novita公司引进的全球唯一专门阻断肿瘤转移的Fascin蛋白抑制剂，已在中国完成I期临床试验。 在生物药方面，博雅生物的血液制品为华润医药生物药板块的营收大头，目前未见成熟的创新药如单抗、细胞疗法等生物药上市。 鲜为人知的是，华润医药很早就拥有自己的生物医药公司，在股权结构清晰可见。 华润生物是华润医药旗下创新生物药平台，于2016年成立，共拥有4家子公司，业务涵盖生物药的研发、生产和销售。目前拥有3个已上市品种，24个在研品种，其中6个处于临床研究阶段，覆盖肿瘤、心脑血管、过敏性疾病等领域，承担多项国家科技“重大新药创制”支持专项。 华润昂德生物和北京润禾吉生物为华润生物旗下两大生物研发生产公司。 华润昂德生物2018年之前为东阿阿胶的全资子公司，2018年完成资产重组后成为华润生物的生产平台。具备重组蛋白类生物药、冻干粉针剂、小容量注射剂生产能力，目前有3个产品上市销售，分别是人促红素注射液、重组人组织型纤溶酶原激酶衍生物和注射用重组人白介素-11（I）。 北京润禾吉生物成立于2011年，拥有多项蛋白质药物研发和生产的核心技术和专利。目前主要在研项目是国家I类候选新药、分子靶向长效抗肿瘤药物聚乙二醇重组人血管内皮抑制素（M2ES），该项目已进入临床试验研究阶段。 此外，华润医药在2021年7月斥资8亿港币购得永泰生物10%的股权，高调宣布进入细胞治疗领域。但这笔投资没有产生业务交叉和人才资源互通并购，更像一笔财务投资，且目前已发生亏损。 04 结语 从年报中披露的战略目标中，华润医药的重点依然在中药板块，正在积极布局“银发经济”业务，纵深推进中药产业链建设。这个战略方向是正确的，拥有强大医药商业网络的加成，中药板块可高枕无忧。但在中药之外，创新药时代浪潮之下，作为不缺钱的央企巨头，也应把战略重心往这方面挪一挪。相信有华润这类巨无霸的参与，中国创新药的发展将更加的红火。后续发展如何，药渡还将持续关注。 参考资料 各大公司公告、官网、年报等 海通国际证券、华创证券、西部证券研报等 《18亿元吞下韩资药企，华润系再一次出手“血战”》，济南时报，2024-07-24 《并购潮下，华润的医药帝国》，药渡，2023-5-6 《已超片仔癀、云南白药！4家中药上市公司总市值1360亿，华润系大动作，释放什么信号？》，新财富杂志，2024-06-18