Rh2/LA-UASP NPs

大家好，今天分享一篇在著名期刊ACS Applied Materials & Interfaces上发表“Colon-Targeting Angelica sinensis Polysaccharide Nanoparticles with Dual Responsiveness for Alleviation of Ulcerative Colitis”的研究论文 简短版 肠道免疫功能障碍和肠道菌群失调是溃疡性结肠炎（UC）发病机制中的关键致病因素；然而，目前临床上用于UC治疗的一线药物由于其非靶向治疗效果和严重的副作用，常常面临巨大挑战。在本研究中，我们制备了基于当归多糖的具有pH和氧化还原双响应性的结肠靶向纳米颗粒，以在结肠炎症部位特异性释放天然活性化合物人参皂苷Rh2，从而极大地缓解UC症状并改善肠道微生物稳态。这些载Rh2的双响应纳米颗粒（Rh2/LA-UASPNPs）的粒径为117.00±4.80nm，是通过将当归多糖与人尿刊酸和α-硫辛酸（α-LA）接枝得到的聚合物LA-UASP制备而成。正如预期的那样，这些Rh2/LA-UASPNPs在pH5.5和10mMGSH条件下实现了pH和氧化还原双响应药物释放。稳定性、生物相容性和体内安全性实验表明，所制备的纳米颗粒具有优异的结肠靶向能力和Rh2在炎症结肠中的显著积累。同时，这些Rh2/LA-UASPNPs能够逃离溶酶体并被肠黏膜细胞高效内化，从而有效抑制促炎细胞因子的释放。动物实验表明，与UC小鼠相比，Rh2/LA-UASPNPs显著改善了肠黏膜的完整性并增加了结肠长度。此外，体重减轻、组织学损伤和炎症水平得到了极大改善。UC小鼠经Rh2/LA-UASPNPs治疗后，肠道菌群的稳态和短链脂肪酸（SCFAs）水平显著改善。我们的研究证明，这些具有pH和氧化还原双响应性的Rh2/LA-UASPNPs是有前景的UC治疗候选药物。 详细版 溃疡性结肠炎（UC）是一种无法治愈的复发性炎症性肠病，其特征是肠上皮屏障破坏、免疫功能严重失调和肠道菌群失衡。它与肠穿孔、中毒性巨结肠、贫血、结肠癌等疾病的死亡率增加密切相关。为缓解症状，大多数UC患者需要终身服药以防止UC并发症的进一步发展。目前，UC治疗的一线药物包括氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、微生物制剂、生物制剂等。尽管这些一线药物被证明是有效的，但越来越多的临床证据表明，长期服用这些药物可能会导致严重的全身毒性和副作用，如感染、恶性肿瘤和自身免疫性疾病。因此，考虑到传统治疗方法未能达到预期效果，寻找有效的治疗策略以最小的副作用缓解UC症状势在必行。 近年来，纳米载体（包括脂质体、纳米颗粒和胶束）已被广泛用于UC的有效预防和治疗。使用纳米载体包封UC治疗的一线药物可以显著降低药物的毒性。此外，由于纳米载体在体内具有缓释和延长循环时间的特性，它们有可能极大地提高一线药物治疗UC的愈合效果。同时，利用UC患者结肠上皮完整性破坏导致的肠细胞间隙，这些纳米载体有望通过在上皮炎症组织中被动聚集的增强渗透和滞留（eEPR）效应，实现有效的药物递送和快速释放，从而提高UC的治疗效果。这些纳米载体用于UC治疗的显著特征有助于增强一线药物的有效性并减少副作用。然而，由于可用生物材料的限制，制备具有有效靶向结肠炎症部位并实现持续释放能力的纳米载体仍然是一个重大挑战。 与传统纳米载体不同，基于细胞内刺激（pH、氧化还原、酶）的刺激响应型纳米载体由于其独特的性能而备受关注。炎症结肠的微环境通常以pH降低、氧化还原水平升高以及细胞质基质和细胞器中酶表达水平高等为特征，这与正常生理环境不同。基于这些特征，合理设计的刺激响应型纳米载体不仅可以特异性靶向结肠炎组织并增强药物在结肠中的积累，还可以实现精确的药物释放以提高UC治疗药物的疗效，被认为是理想的药物递送系统。这些优势鼓励许多研究人员构建刺激响应型纳米载体用于UC的有效治疗。例如，Xu等人使用己烷-1,6-二醇二丙烯酸酯和4-氨基-1-丁醇为原料制备了包封姜黄素的pH敏感聚合物纳米颗粒，用于UC的靶向治疗。这些姜黄素纳米颗粒表现出pH响应释放，并通过TLR4-MAPK/NF-κB通路显著降低DSS诱导的UC小鼠的炎症反应。在另一项研究中，Tie等人使用胱胺二盐酸盐作为连接体制备了原花青素纳米颗粒以缓解UC症状。正如预期的那样，原花青素纳米颗粒在高浓度GSH下表现出降解并有效释放药物，从而有效减轻UC引起的炎症细胞因子水平升高和肠道菌群失衡。 然而，由于结肠炎微环境的复杂性，这些具有单一刺激响应的纳米颗粒难以确保在细胞内的精确药物释放。因此，构建多重响应纳米载体以提高UC的预防和治疗效果是一种有前景的策略。 从许多动物、植物或微生物中提取的天然多糖作为具有良好安全性和生物相容性的外部材料，已被广泛应用于纳米载体中。更重要的是，大多数天然多糖不仅被证明具有优异的生物活性，还可以逆转肠道菌群失衡并增加短链脂肪酸（SCFAs）水平，从而有效调节肠道菌群，这对UC治疗非常有益。值得一提的是，天然多糖具有丰富的化学基团，如羟基、羧基和氨基，易于进行化学修饰以提高其疏水性。在这些生物活性多糖中，从当归中提取的当归多糖（ASPs）具有优异的药理活性，如抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗氧化、抗糖尿病、保肝等。此外，在UC治疗中，ASP不仅可以抑制促炎细胞因子的表达并促进慢性溃疡的愈合，还可以促进紧密连接蛋白的表达并保护肠屏障功能。基于此，ASP可用作潜在有效的UC治疗药物递送纳米载体。一方面，尿刊酸由于含有羧基，可以通过酯化反应与ASP上的羟基结合，得到两亲性聚合物，从而在水中自组装形成纳米颗粒。此外，尿刊酸由于含有咪唑基团而表现出pH响应性。这种特性使接枝尿刊酸的纳米颗粒能够在炎症部位的酸性环境中降解，从而实现药物的快速释放。另一方面，α-硫辛酸（α-LA）含有羧基链和二硫键。因此，α-LA不仅可以对ASPs进行疏水修饰，还可以通过炎症细胞中高浓度GSH引起的二硫键断裂而表现出氧化还原响应特性。上述材料为构建pH/氧化还原双响应纳米颗粒递送系统提供了有利的前提条件。 人参皂苷作为人参的主要生物活性化合物，据报道具有多种药理功能，包括抗氧化、抗菌、抗肥胖、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等。其中，人参皂苷Rh2被证实通过调节STAT3/miR-214信号通路有效缓解小鼠UC症状。然而，人参皂苷Rh2在体内的吸收较差，大部分被人体代谢，导致其生物利用度低。例如，据报道人参皂苷Rh2在大鼠中的口服生物利用度仅为约5%，在狗中仅为16%。人参皂苷Rh2在食品、医药等领域的应用受到严重限制。因此，开发有效的人参皂苷Rh2递送系统对于提高其生物利用度和治疗效果至关重要。 如上所述，在本研究中，我们以ASP为亲水链，分别通过尿刊酸和α-硫辛酸（α-LA）进行疏水修饰，得到具有pH/氧化还原双响应特性的聚合物LA-UASP。随后，使用合成的聚合物LA-UASP制备纳米颗粒以包封人参皂苷Rh2（Rh2/LA-UASPNPs），并通过eEPR效应进一步特异性递送至结肠炎组织的炎症部位。我们的研究表明，这些具有pH/氧化还原双响应性的纳米颗粒在缓解UC症状和有效调节肠道菌群水平方面具有巨大潜力（方案1）。 3.1.LA-UASP的制备与表征 通过两步酯化策略分别接枝尿刊酸和α-硫辛酸制备聚合物LA-UASP。如图S1A所示，第一步，尿刊酸的羧基被DCC和DMAP活化，然后通过共价酯键与ASP偶联，得到聚合物UASP。在聚合物UASP的1HNMR谱中，6.38和7.50-7.80ppm处的信号分别归因于尿刊酸中乙烯基质子和咪唑基团的存在，证实了尿刊酸与ASP的成功偶联（图S2A）。接下来，设计α-LA的羧基通过酯键与UASP的羟基偶联，形成聚合物LA-UASP（图S1B）。使用1HNMR进一步证实LA-UASP的结构（图S2B）。1.35-1.67ppm处的化学位移归因于硫辛酸环上CH2CH2CH2基团的信号。1.87ppm、2.41ppm和3.18ppm处的峰是由于SSCH2CH2CH的存在，表明α-LA成功连接到UASP中。使用红外光谱确定多次修饰步骤后聚合物化学结构的变化。在聚合物UASP和LA-UASP的红外光谱中（图S3），在1689和1693cm-1处清晰地观察到新的峰，这归因于酯键的伸缩振动，表明聚合物的成功合成。此外，为了进一步验证上述结论，通过X射线能谱进一步分析了聚合物LA-UASP的元素分布和元素含量。显然，C、N、O和S四种元素在聚合物LA-UASP中均匀分布（图S4A,C），分别占57.54±0.39、6.04±0.13、32.95±0.48和3.46±0.04%（图S4B），这再次有力地证明尿刊酸和α-LA成功连接到ASP上。接下来，通过热重分析确定聚合物的热稳定性。从图S5中可以观察到，聚合物UASP和LA-UASP均经历两个阶段的降解。在第一阶段，聚合物UASP和LA-UASP在约200和213°C下降解，重量损失分别为8.17和7.20%。该阶段可能是由于高达200°C时物理吸附的分子间和分子内湿度。聚合物UASP和LA-UASP的第二次热分解分别在约366和373°C下发生。该阶段的降解可能归因于聚合物上官能团的降解，如CO、OH等。不难看出，聚合物LA-UASP的热稳定性在降解温度和重量损失方面均优于UASP，表明两步酯化反应极大地提高了聚合物纳米载体的热稳定性。这一结果对于聚合物纳米载体在后续活性成分包封和生物活性应用中非常有利。 3.2.纳米颗粒的制备与表征 通过反溶剂法在超声辅助下，将疏水改性的两亲性聚合物LA-UASP在水介质中自组装形成纳米颗粒（LA-UASPNPs）（图1A）。作为疏水性抗炎药物，人参皂苷Rh2被载入LA-UASPNPs中（Rh2/LA-UASPNPs）。TEM结果显示，LA-UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs均呈现均匀的球形，平均粒径分别约为25和50nm（图1B(a,b)）。然而，通过DLS测量的LA-UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs的粒径（分别为67.44±4.49和117.00±4.80nm）大于通过透射电子显微镜（TEM）测量的粒径（图1C），这可能是由于纳米颗粒在水中的溶胀。此外，LA-UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs的电位分别为-9.65±0.19和-18.55±0.76mV（图1D）。显然，这些结果表明Rh2/LA-UASPNPs在PBS中分散良好；然而，大多数游离Rh2悬浮在表面或沉到底部，表明本研究构建的纳米载体非常有利于提高Rh2的溶解度。如图1F,G所示，LA-UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs仍然含有C、N、O和S四种元素，表明尿刊酸和α-LA成功接枝到ASP上，并且经过多步纳米颗粒制备步骤后，合成的聚合物LA-UASP不会降解，这足以证明聚合物纳米载体LA-UASP具有优异的稳定性。此外，LA-UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs呈球形分布，与TEM结果一致。为了证明Rh2的有效包封和Rh2的化学结构，分别通过红外光谱、紫外光谱和X射线衍射对Rh2和LA-UASPNPs的混合物、LA-UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs进行了表征（图S6）。结果表明，无论在红外光谱、紫外光谱还是X射线衍射图谱中，在Rh2和LA-UASPNPs的混合物中都能清晰地观察到Rh2的特征峰。Rh2/LA-UASPNPs的结构与LA-UASPNPs相似，但没有Rh2的特征峰，表明Rh2成功包封在纳米颗粒内部。此外，与Rh2相比，Rh2和LA-UASPNPs的混合物、LA-UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs在红外光谱中均显示出新的特征峰酯键。这些结果再次有力地证明了本研究制备的纳米载体具有突出的稳定性。通过HPLC测定Rh2/LA-UASPNPs的包封效率和载药量分别为75.41±1.78和6.86±0.34%。 3.3.纳米颗粒的稳定性 众所周知，生物活性成分由于其稳定性差，在食品、补充剂和药物中的应用通常受到限制。通常，由负载活性成分的纳米颗粒或microparticles组成的药物递送系统可以克服这些挑战。考虑到纳米颗粒稳定性的关键作用，在本研究中，分别评估了不同环境条件对纳米颗粒稳定性的影响。不出所料，在不同浓度的盐离子溶液中未发现LA-UASPNPs的粒径和粒径分布有显著变化（图S7A）。此外，LA-UASPNPs在储存数月后，其粒径和粒径分布没有显著变化（图S7B）。不仅如此，通过TEM观察到的LA-UASPNPs的形态在储存2个月和4个月后仍然呈现均匀的球形，表明纳米颗粒具有良好的储存稳定性（图1B(c,d)）。此外，正如预期的那样，LA-UASPNPs在FBS中的粒径与在PBS中相比没有显著变化，表明LA-UASPNPs在血清中表现出更好的稳定性（图S7C）。这一结果为纳米颗粒在体内的有效递送提供了初步基础。 3.4.纳米颗粒的体外药物释放特性 实现药物从纳米颗粒向结肠炎组织的控制释放对于有效缓解UC至关重要。由于含有咪唑基团和二硫键部分，Rh2/LA-UASPNPs有望对pH和氧化还原条件敏感。因此，在本研究中，模拟炎症部位的特殊生理环境，分别在pH7.4、pH5.5、pH7.4+GSH和pH5.5+GSH环境中测定Rh2从纳米载体的释放速率。如图1E所示，96小时后，Rh2/LA-UASPNPs在pH7.4时仅释放41.31±0.83%的Rh2，而在pH5.5时Rh2的释放增加（44.01±1.42%）。这种现象的主要原因是Rh2/LA-UASPNPs中的酯键在弱酸性环境中断裂，导致Rh2的释放增加，而Rh2/LA-UASPNPs在中性条件下稳定。此外，在相同的pH条件（pH7.4）下，加入10mMGSH后，Rh2的释放显著增加（46.04±1.64%），表明Rh2/LA-UASPNPs对氧化还原条件敏感。同样，在pH5.5+GSH条件下释放的Rh2（53.77±0.74%）比在pH5.5条件下更多。该结果证明具有pH和氧化还原双响应性的纳米颗粒比仅具有pH响应性的纳米颗粒具有更高的药物释放行为，为后续的细胞和动物实验提供了关键的理论基础。从上述结果可以看出，Rh2/LA-UASPNPs在较低pH和含有10mMGSH的条件下Rh2的累积释放量最高。上述结果表明，Rh2/LA-UASPNPs由于具有pH和氧化还原双响应特性，有利于纳米颗粒在炎症组织中的特异性积累。 3.5.纳米颗粒的细胞内摄取 高效的细胞摄取是纳米颗粒发挥抗炎作用的关键。因此，对纳米颗粒的细胞摄取行为进行了评估。如图2A所示，纳米颗粒不仅可以通过eEPR效应被动聚集在炎症组织中，还可以由于pH和氧化还原双响应特性主动靶向炎症组织。由于粒径较小，纳米颗粒容易通过内吞作用被肠上皮细胞或免疫细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞和M细胞）摄取。在本研究中，为了评估纳米颗粒在炎症组织中的pH和氧化还原响应性，使用UASP为原料按照Rh2/LA-UASPNPs的制备方法制备了Rh2/UASPNPs。将Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs用FITC标记以进行追踪和定位（FITC-Rh2、FITC-Rh2/UASPNPs和FITC-Rh2/LA-UASPNPs）。不出所料，Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs在细胞内表现出比Rh2更强的荧光强度，表明这些纳米载体可以有效增强Rh2的细胞内内化和吸收（图2B）。原因可能是这些纳米颗粒提高了Rh2的溶解度和稳定性，从而增加了Rh2的细胞内摄取。更有趣的是，Rh2/LA-UASPNPs比Rh2/UASPNPs具有更强的荧光强度，表明纳米颗粒的pH和氧化还原双刺激响应特性促进了纳米颗粒的进一步摄取。此外，还对不同样品的平均荧光强度进行了定量分析。Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs的荧光强度分别为193.43±3.37、207.05±3.34和218.07±3.68（图2C）。 3.6.体外抗炎活性研究 为评估纳米颗粒的体外抗炎活性，采用LPS诱导细胞炎症。首先，分别测定了细胞中促炎细胞因子（NO、iNOS、TNF-α和IL-1β）和抗炎细胞因子（IL-10）的水平（图2D−H）。值得注意的是，经Rh2和纳米颗粒处理后，细胞的促炎细胞因子水平（包括NO、iNOS、TNF-α和IL-1β）降低，而抗炎细胞因子IL-10水平升高，表明Rh2和纳米颗粒具有显著的抗炎作用。值得注意的是，Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs显示出比游离Rh2更高的抗炎活性，这可能是由于纳米颗粒具有更强的细胞摄取能力。有趣的是，Rh2/LA-UASPNPs的抗炎作用远优于Rh2/UASPNPs，这可能是基于具有pH和氧化还原双响应的Rh2/LA-UASPNPs比仅具有单一pH响应的Rh2/UASPNPs具有更突出的细胞摄取能力，从而使其具有更高的抗炎活性。这些结果在纳米颗粒的体外药物释放行为以及细胞摄取结果中得到了有力验证。 此外，通过定量逆转录q-PCR（qRT-PCR）测定Rh2和纳米颗粒的体外抗炎作用。同时，Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs显著下调了三种促炎细胞因子（iNOS、TNF-α和IL-1β）的mRNA表达水平，并显著上调了抗炎细胞因子（IL-10）的mRNA表达水平（图S8）。更有趣的是，Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs在抑制iNOS、TNF-α和IL-1β标志物的mRNA表达水平以及对IL-10表达水平的影响方面表现出比Rh2更突出的能力。综上所述，上述结果表明这些纳米颗粒具有优异的抗炎活性，并能有效调节相关炎症因子的表达。 3.7.纳米颗粒的氧化应激水平 研究报道，活化中性粒细胞释放的过高水平活性氧（ROS）和MPO不仅诱导细胞损伤，还激活炎症信号并增强免疫反应。此外，在氧化应激条件下，乳酸脱氢酶（LDH）被细胞释放到培养基中（图3A）。鉴于炎症与氧化应激水平的密切关系，通过测定细胞内氧化应激水平进一步评估了纳米颗粒对LPS诱导炎症的抑制作用。 首先，评估了纳米颗粒的ROS清除能力。如图3B所示，LPS刺激的细胞中观察到强绿色荧光。不出所料，经Rh2和Rh2负载的纳米颗粒处理后，细胞的荧光强度大大减弱，特别是Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs比Rh2具有更强的ROS清除能力。引人注目的是，在Rh2/LA-UASPNPs处理组中几乎检测不到荧光信号，与空白组相似，表明纳米颗粒不会产生过量的ROS。荧光强度结果如图3C所示。此外，测定了不同样品处理的细胞中ROS水平（图3D）。正如预期的那样，获得了类似的结果。 随后，评估了细胞中MPO的水平。显然，经Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs处理后，MPO水平显著降低（图3E）。值得注意的是，与Rh2相比，Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs具有更优异的MPO水平抑制能力。此外，检测了细胞上清液中LDH的含量（图S9A）。同样，Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs均显著抑制LPS诱导的LDH水平升高。值得注意的是，经Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs处理后，分泌到细胞上清液中的LDH量远低于Rh2。此外，还测定了细胞中SOD和GSH的含量（图S9B,C）。将RAW264.7细胞与Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs共孵育24h后，细胞内的抗氧化水平（包括SOD和GSH）显著升高。这些表明纳米颗粒可以有效调节细胞内氧化应激水平，这对纳米颗粒的抗炎活性非常有利。 接下来，通过JC-1探针评估细胞内线粒体膜电位以评估细胞的早期凋亡。如图3F所示，对照组显示强红色荧光。相比之下，LPS处理组显示弱红色荧光和强绿色荧光，表明RAW264.7细胞线粒体膜电位降低并发生早期凋亡。与Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs孵育24h后，RAW264.7细胞的红色荧光显著增强，绿色荧光减弱，表明Rh2和纳米颗粒可以减少线粒体膜电位的降低并抑制LPS诱导的炎症损伤。值得注意的是，Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs的红色荧光显著强于Rh2。对红色荧光、绿色荧光和红/绿荧光比值进行定量，结果与上述结果一致（图S10和3G）。 此外，为了证明上述结论，测定了细胞中线粒体膜电位水平（图S9D）。也获得了类似的结果。 3.8.溶酶体逃逸 为研究纳米颗粒的细胞内转运，使用LysoTrackerRed探针进行溶酶体逃逸实验。如图3H,I所示，在2h时细胞内的红色荧光（染色溶酶体）和绿色荧光（染色纳米颗粒）基本重叠并呈现黄色，Pearson相关系数（R）为0.06，表明部分纳米颗粒被困在溶酶体中。然而，随着孵育时间的增加，红色和绿色荧光逐渐分离。12h后，从图像中可以看出大部分绿色荧光与红色荧光分离。同时，从6h到12h，Pearson相关系数R从0.71降至0.20。这些结果表明Rh2/LA-UASPNPs与溶酶体的共定位减少，表明Rh2/LA-UASPNPs可以逃离溶酶体并释放Rh2。 3.9.纳米颗粒对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用 进行了体内研究以评估Rh2/LA-UASPNPs对UC症状缓解的治疗作用。小鼠适应性喂养7天后连续21天给予不同药物，最后7天给予3.5%DSS水诱导溃疡性结肠炎（图4A）。经Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs处理后，与DSS处理组相比，小鼠的结肠长度、结肠指数和体重均显著改善（图S11和4B,C）。此外，在UC实验过程中，观察到UC小鼠出现严重腹泻和便血，导致DAI值较高（图4D）。然而，Rh2/LA-UASPNPs组的DAI值远低于DSS对照组、Rh2组和Rh2/UASPNPs组。据报道，当发生结肠炎症时，UC小鼠的肝脏和脾脏肿大，肝脾指数增加。在本研究中，Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs组的肝脾指数（图4E）和脾脏重量（图S12）均低于DSS处理组。在先前的研究中也获得了类似的结果。 分析了不同样品中炎症细胞因子（MPO、NO、TNF-α、IL-1β和IL-10）和氧化应激（SOD、GSH和MDA）的水平。正如预期的那样，Rh2、Rh2/UASPNPs或Rh2/LA-UASPNPs有效降低了UC小鼠的MPO活性和促炎因子（NO、TNF-α、IL-1β）水平，并显著增加了抗炎因子（IL-10）水平，表明Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs具有优异的抗炎活性（图S13和5A−D）。同时，Rh2、Rh2/UASPNPs或Rh2/LA-UASPNPs比DSS组显示出更高的SOD和GSH水平以及更低的MDA水平，表明这些纳米颗粒有效抑制了炎症结肠黏膜中的氧化应激（图S14）。重要的是，Rh2/UASPNPs或Rh2/LA-UASPNPs在抑制结肠组织中促炎因子水平和改善UC小鼠血清氧化应激水平方面的效果比Rh2更强。这些结果与纳米颗粒的体外抗炎活性结论一致。 接下来，通过H&E染色和PAS染色检查结肠组织的组织学形态。显然，在DSS处理组中观察到严重的结肠上皮损伤、炎症细胞浸润、隐窝消失和杯状细胞耗竭（图4F）。Rh2、Rh2/UASPNPs或Rh2/LA-UASPNPs显著改善了小鼠的结肠炎症、上皮损伤以及隐窝和杯状细胞破坏。更重要的是，Rh2/LA-UASPNPs显示出与健康对照组相似的结肠组织形态和组织学评分，表明Rh2/LA-UASPNPs对DSS诱导的UC具有显著的预防作用。H&E评分也证实了这一结果（图S15）。接下来，测定了紧密连接蛋白occluden-1（ZO-1）的表达以检查肠层的完整性。显然，经Rh2、Rh2/UASPNPs或Rh2/LA-UASPNPs处理后，结肠组织中ZO-1的表达显著增加，表明Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs对UC小鼠的肠屏障损伤和肠通透性具有保护作用（图4F）。特别是，Rh2/LA-UASPNPs在保护结肠黏膜屏障方面比Rh2和Rh2/UASPNPs具有更突出的效果。此外，免疫荧光染色结果显示，Rh2/LA-UASPNPs处理组UC小鼠的ZO-1阳性面积大于DSS处理组和其他组（图5E）。所有上述结果表明Rh2/LA-UASPNPs对DSS诱导的UC具有优异的预防作用。 3.10.肠道菌群分析 肠道菌群稳态与人类健康密切相关，而DSS诱导的UC会导致结肠菌群紊乱。为此，通过调节UC小鼠肠道菌群平衡可实现UC的有效预防。首先，分析了纳米颗粒对UC小鼠肠道菌群α多样性的影响。根据泛/核心物种曲线及Shannon和Sobs稀释曲线的平坦度，表明本测序的样本量充足（图S16和S17）。如图S18所示，等级丰度曲线呈平滑下降趋势，表明本研究样本具有较高的物种多样性。 如图S19所示，与健康对照组相比，DSS处理组不仅Shannon指数和Simpson指数显著降低，Chao指数和Ace指数也显著降低，表明UC小鼠的群落多样性和群落丰富度显著下降。有趣的是，经Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs处理后，得到了与上述相反的结果，表明Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs有效改善了UC小鼠肠道菌群的多样性和丰富度。特别是Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs的效果更为显著，甚至高于阳性对照5-ASA。上述结果表明，这些纳米颗粒有效改善了UC小鼠肠道菌群的α多样性。 随后，利用物种组成分析纳米颗粒对UC小鼠肠道菌群的调控作用。从UpSetVenn图结果来看，对照组、DSS组、5-ASA组、Rh2组、Rh2/UASPNPs组和Rh2/LA-UASPNPs组分别鉴定出468、246、449、340、381和453个OTU（图6A）。显然，未经任何处理的UC小鼠在DSS处理后物种数量受到严重破坏。此外，Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs具有优异的维持UC小鼠肠道菌群物种数量的能力。图6B显示了UC小鼠肠道菌群的群落组成。在属水平上，与对照组相比，DSS处理组中的norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus和Lachnospiraceae_NK4A136_group显著下调，而Bacteroides、Turicibacter和Ruminococcus在DSS处理组中显著上调。经Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs处理后，norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus和Lachnospiraceae_NK4A136_group显著上调，而Bacteroides、Turicibacter和Ruminococcus显著下调，表明Rh2和Rh2负载的纳米颗粒有效改善了UC小鼠的肠道细菌。从群落组成饼图中也获得了类似结果（图S20）。此外，群落热图显示，在属水平上，DSS处理组与其他组的关系最远，表明DSS组的群落组成与其他组存在显著差异（图6C）。 然而，Rh2/LA-UASPNPs和5-ASA与空白对照组最为接近，表明Rh2/LA-UASPNPs和5-ASA处理的UC小鼠的群落组成接近正常水平。多级物种Sunburst图和Circos图显示了属水平物种的分布和比例（图S21）。此外，三元相图显示了空白对照组、DSS组和Rh2/LA-UASPNPs组的物种组成和分布比例。有益菌如norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group在空白对照组和Rh2/LA-UASPNPs组中均有分布，而Bacteroides在DSS处理组中分布（图S22）。上述结果表明，这些Rh2/LA-UASPNPs可有效改善UC小鼠肠道菌群的群落组成。 接下来，利用β多样性、样本分组和物种差异评估纳米颗粒对UC小鼠肠道菌群的调控作用。从主成分分析（PCA）、主坐标分析（PCoA）和NMDS分析结果可以发现，空白对照组与DSS组完全分离，而5-ASA和Rh2/LA-UASPNPs的物种组成与空白对照组相似（图6D、E和S23A）。在ANOSIM/Adonis分析中，组间对应的箱线图距离值（代表组间差异）显著大于其余箱线图距离值（代表组内差异），表明本研究的动物实验分组具有实际意义（图6F）。此外，PLS-DA分析结果也证实了组间差异（图S23B）。同时，还比较了DSS组和Rh2/LA-UASPNPs组主要菌群的差异（图6G），显示Bacteroides、norank_f_Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Lactobacillus等主要菌群在两组间存在显著差异。 研究表明，短链脂肪酸是肠道菌群产生的主要代谢产物之一，对维持肠道稳态具有非常有益的作用。鉴于此，我们通过检测UC小鼠粪便中的短链脂肪酸来评估纳米颗粒对UC小鼠肠道菌群的调节作用。结果显示，DSS处理后，粪便中乙酸、丙酸、丁酸和总酸的含量显著低于空白对照组（图5F−I）。然而，经Rh2、Rh2/UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs处理的UC小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸和总酸的含量显著增加。 所有这些结果表明，这些Rh2/LA-UASPNPs通过改善肠道菌群的α多样性、群落组成、β多样性和代谢产物，可有效维持UC小鼠肠道菌群的稳态和平衡。 3.11.体内生物分布 药物在炎症结肠组织中的特异性积累对于有效缓解UC至关重要。因此，我们评估了纳米颗粒在UC小鼠中的生物分布。首先，在Rh2/LA-UASPNPs中用Cy7替代Rh2，使用活体动物成像系统可视化游离药物和载药纳米颗粒在结肠炎模型中的分布（图7A）。然后，在不同时间点分离UC小鼠的结肠炎组织和主要器官并进行离体成像。如图7B(a,b)所示，可以看出在12h前，游离Cy7在结肠炎组织中的荧光强度显著高于Cy7/LA-UASPNPs，这可能是由于未受纳米载体保护的游离Cy7通过血液循环直接到达结肠。在12h时，游离Cy7在结肠炎组织中的荧光强度最强。随后，游离Cy7的荧光强度开始下降。在48h时，几乎观察不到荧光信号。这一结果可能是由于未经纳米载体保护的Rh2在小鼠体内过早降解。值得注意的是，Cy7/LA-UASPNPs在48h时仍具有较强的荧光强度，表明本研究构建的纳米载体保护药物免受过早降解，并增加了药物在体内的循环时间和在结肠炎组织中的选择性积累，从而提高了药物的生物利用度。此外，对结肠炎组织进行荧光定量，结果与结肠荧光成像趋势一致（图S24A）。此外，为了证明所制备的纳米颗粒在结肠炎部位的靶向能力，测定了Cy7/LA-UASPNPs在健康小鼠结肠组织中的分布。显然，在经Cy7/LA-UASPNPs处理的健康小鼠结肠中未观察到比结肠炎组织更强的荧光强度（图7B(c)和C），表明本研究构建的pH和氧化还原双响应纳米颗粒更有可能在结肠炎部位特异性积累。 此外，评估了游离Cy7以及Cy7/LA-UASPNPs在主要器官中的生物分布，并对荧光强度进行了定量（图7D和S24B−F）。Cy7和Cy7/LA-UASPNPs的积累主要在肝脏和肾脏中观察到，但在其他器官中检测到较弱的荧光信号，表明Cy7和Cy7/LA-UASPNPs几乎从循环中清除。 3.12.药代动力学分析 接下来，通过对大鼠静脉注射Rh2和Rh2/LA-UASPNPs，进一步评估其体内药代动力学。血浆药物浓度-时间曲线和主要药代动力学参数如图S25和表1所示。显然，游离Rh2的药物浓度下降迅速，注射后12h大部分Rh2被排出体外。与游离Rh2相比，Rh2/LA-UASPNPs显示出连续的血浆药物浓度-时间曲线，并且至少48h内可维持较高的血浆药物浓度。值得注意的是，Rh2/LA-UASPNPs处理的大鼠的血浆浓度-时间曲线下面积（（从0到t的总面积），AUC0−t，2071.02±105.39μg/mL·h）是游离Rh2（886.88±43.97μg/mL·h）的2.34倍。此外，Rh2/LA-UASPNPs处理的大鼠的血浆药物半衰期（t1/2，14.38±1.14h）是游离Rh2（3.93±0.15h）的3.66倍。更重要的是，Rh2/LA-UASPNPs处理的大鼠的相对生物利用度（Fr，233.52±14.27%）是游离Rh2（100±0.00%）的2.34倍。上述结果表明，本研究构建的纳米载体显著延长了Rh2在体内的循环时间，提高了Rh2的生物利用度，有利于药物递送至结肠炎组织。这些与体内生物分布结果一致。 3.13.纳米颗粒的生物相容性评估 众所周知，生物相容性评估是纳米颗粒未来生物应用的必要前提。首先，测定了纳米颗粒的细胞相容性。如图S26所示，LA-UASPNPs与RAW264.7和Caco-2细胞共孵育72h后仍表现出超过90%的细胞活力。值得注意的是，RAW264.7细胞表现出健康的细胞形态和强绿色荧光，细胞核也呈完整的圆形（图S27）。上述结果表明，该纳米载体具有优异的细胞相容性，对细胞无不良影响。 由于本研究中的动物实验是通过尾静脉注射给药，因此必须确保纳米颗粒具有良好的血液相容性。结果显示，不同浓度的Rh2/LA-UASPNPs与血液共孵育1或3h后均未发生溶血（图S28），且在3h时溶血率均低于0.5%（图S29），表明Rh2/LA-UASPNPs在血液循环中能够保持完整性。此外，进一步分析了相关血液学参数。结果显示，Rh2、LA-UASP和Rh2/LA-UASPNPs组的白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血小板计数（PLT）、淋巴细胞计数（Lymph）、中间细胞数（Mid）、中性粒细胞数（Gran）、血红蛋白浓度（HGB）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度（RDW）和平均红细胞血红蛋白（MCH）与PBS组无显著差异（图S30）。这一结果不仅证明这些纳米颗粒不会引起人体病理变化，而且有力地说明了其安全性和可靠性。 3.14.纳米颗粒的体内安全性测定 此外，研究了纳米颗粒的体内安全性。正如预期的那样，给予Rh2、LA-UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs后，小鼠的体重和主要器官的器官指数与PBS组相比没有明显变化（图S31）。此外，Rh2、LA-UASPNPs和Rh2/LA-UASPNPs处理组的肝脏和肾脏功能指标，包括ALT、AST、TBIL、LDH、白蛋白、肌酐、UA和BUN，与PBS组相比没有显著变化（图8A−H）。此外，值得注意的是，所有组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和结肠）的H&E染色组织切片均未显示可检测到的损伤或任何炎症病变（图8I）。总之，结果表明该纳米载体具有优异的体内安全性和巨大的临床应用潜力。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！