NU7441

本文围绕FDA已批准的抗抑郁药度洛西汀（Duloxetine）展开研究，通过多维度的虚拟筛选、体外功能验证、分子机制解析、体内动物实验及人脑类器官验证，系统阐明了度洛西汀通过抑制TRPM2离子通道阻断缺血诱导的过度自噬，最终发挥脑缺血神经保护作用的完整机制，为缺血性脑卒中的药物重定位提供了坚实的临床前证据。 一、研究背景与立题依据 1. 缺血性脑卒中是全球范围内致残和致死的首要神经系统疾病，其核心病理特征为脑血流骤减导致的氧气和营养缺乏，进而引发神经元、胶质细胞和血管内皮细胞的级联损伤与死亡。目前临床一线治疗手段仅为溶栓和机械取栓，存在治疗窗窄、适用人群受限的核心缺陷，尚无有效的神经保护药物获批上市，因此亟需开发新的治疗策略。 2. 巨自噬（简称自噬）是细胞高度保守的降解-回收系统，在缺血应激下会被快速激活，但其在脑缺血中的作用长期存在争议：适度自噬可通过清除受损细胞器维持神经元稳态，而过度或持续的自噬会引发自噬性细胞死亡，加重缺血损伤。因此，筛选靶向自噬的小分子调节剂，不仅能解析自噬在脑缺血中的具体作用，更能为脑卒中开发创新治疗手段。 3. 度洛西汀是5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRI），已被FDA批准用于抑郁症、焦虑症和慢性疼痛的治疗，既往研究提示其在脑缺血模型中存在潜在神经保护作用，但其作用是否与自噬调控相关、具体分子靶点和作用机制尚未明确，这也是本研究的核心科学问题。 二、研究方案 本研究采用“虚拟筛选富集-体外功能初筛-多维度验证-分子机制解析-体内药效验证-遗传学佐证-人源模型转化”的研究策略，技术路线见图1A。研究思路为：先从化合物库中锁定具有中枢神经系统（CNS）活性的自噬调节剂，再聚焦度洛西汀解析其自噬调控机制，最终在多种体内外模型中验证其神经保护作用，同时通过基因编辑模型佐证“早期自噬抑制发挥脑缺血保护”的核心科学假设。 三、计算机虚拟筛选，富集 CNS 活性候选化合物 直接对近 7000 个化合物进行全量功能筛选，存在工作量大、假阳性高、体内转化成功率低的问题；而脑缺血治疗的核心靶点在中枢，化合物必须具备良好的血脑屏障穿透性和类药性，因此先通过计算机模拟进行初筛，大幅缩小筛选范围。 实验设计 针对Selleckchem生物活性化合物库的6839个小分子，采用QikProp工具预测其吸收、分布、代谢、排泄（ADME）特性，分两轮完成筛选： 1. 第一轮初筛：基于类药性核心参数（表1），包括 Lipinski 五规则、Jorgensen 三规则、油水分配系数、代谢位点数量等，筛选出符合 95% 已知成药参数范围的 1927 个化合物； 2. 第二轮富集：聚焦 CNS 活性关键参数（CNS 活性评分、血脑分配系数 QPlogBB、MDCK 细胞渗透性 QPPMDCK）进行线性加权打分，设定阈值 0.367，最终筛选出 898 个化合物进入后续功能筛选，同时对其靶点通路进行分类分析。 实验结果 1. 初筛后仅28.17%的化合物（1927个）符合成药性标准，第二轮筛选后最终得到898个化合物（占原库13.13%），其中超350个为FDA已批准药物，具备成熟的临床安全性数据，为药物重定位奠定了基础； 2. 898个化合物覆盖19个生物学类别，其中神经元信号通路占比17.71%，同时包含免疫炎症、PI3K-AKT-MTOR等自噬相关通路，靶点覆盖全面（图1F）。 图1 研究概览及基于类药性与中枢神经系统相关特性的化合物虚拟筛选 (A) 研究技术路线示意图；(B-D) 基于中枢神经系统活性评分 (B)、血脑分配系数预测值 (C)、MDCK 细胞渗透性预测值 (D) 的化合物分布散点图，虚线标注了 95% 已知药物的参数范围；(E) 初筛得到的 1927 个化合物的中枢神经系统活性与穿透特性（累积评分），阴影区域标注了评分高于 0.367 的入选化合物，每个圆点代表单个分子；(F) 基于已知靶点通路的入选化合物库组成分布图。 四、构建自噬调节剂筛选平台，完成功能初筛 虚拟筛选仅为理化性质预测，需通过功能实验验证化合物对自噬通量的真实调控作用，且需模拟脑卒中缺血/再灌注的病理环境，因此需要构建稳定、灵敏、可高通量检测的自噬筛选体系。 实验设计 1. 构建稳定细胞筛选体系：构建稳定表达 pHluorin-mKate2-人源 LC3（PK-hLC3）的 Neuro-2a 细胞单克隆。该报告系统的核心原理为：pHluorin 是 pH 敏感的绿色荧光蛋白，在溶酶体酸性环境中荧光会快速淬灭，而 mKate2 的红色荧光不受 pH 影响；因此 pHluorin 的荧光强度可直接反映自噬通量 —— 自噬激活时，自噬体与溶酶体融合，pHluorin 荧光淬灭，强度下降；自噬被抑制时，荧光强度上升。最终筛选出性能最优的 7B11 单克隆细胞。 2. 体系稳定性验证：用经典自噬抑制剂巴弗洛霉素 A1（Baf，阻断自噬体 - 溶酶体融合）和自噬激活剂 Torin-1（MTOR 抑制剂）处理细胞，通过流式细胞术检测 pHluorin 的平均荧光强度（MFI），采用 Z’因子和严格标准化均数差（SSMD）评估体系的稳定性和筛选窗口（表 2、表 3）。 3. 病理模型构建：采用氧糖剥夺（OGD）+ 复氧模拟体内缺血 / 再灌注（I/R）过程，优化 OGD 时长，确定 15h OGD 可使 pHluorin 荧光强度下降 25%，且不影响细胞活力，同时可显著上调缺氧标志物 HIF1α，完美模拟缺血病理环境。 4. 化合物初筛：对 898 个化合物（1μM）进行 3 次重复筛选，通过稳健 Z 分数（Robust Z-score）和 p 值确定阳性候选物，同时排除具有细胞毒性的化合物。 实验结果 1. 7B11 细胞克隆的筛选性能优异：Baf 处理后 pHluorin 荧光强度显著升高，Torin-1 处理后显著降低，体系 Z’因子稳定在 0.5~1 之间，SSMD 达到 “优秀” 阈值，筛选体系稳定、可靠、灵敏度高（图 2A-D）； 2. OGD 处理呈时间依赖性降低 pHluorin 荧光强度，15h 达到筛选所需的 25% 降幅，成功构建缺血样筛选模型（图 2C）； 3. 初筛最终得到 22 个阳性候选化合物，其中 7 个可激活自噬，15 个可抑制自噬；排除已知的自噬抑制剂（ULK-101、奎纳克林）后，对剩余候选物开展后续验证（图 2G）。 图2 基于荧光筛选体系在 7B11 细胞中鉴定自噬调节剂 (A1-A4) 7B11 细胞的共聚焦显微镜最大投影图像，展示 PK-hLC3 与 mKate2 的分布情况，分组为：对照组 (A1)、200 nM 巴弗洛霉素 A1（Baf）处理 6 h 组 (A2)、250 nM Torin-1 处理 24 h 组 (A3)、Baf+Torin-1 联合处理组 (A4)；(B) 流式细胞术检测得到的代表性直方图，横轴为 pHluorin 荧光强度，纵轴为经模式归一化的事件数；(C) 氧糖剥夺（OGD）处理过程中，0、1、2、3、4、6、10、15 h 时间点 pHluorin 荧光强度的时程分析，数据以 0 h 时间点为基准进行归一化，，垂直虚线标注了荧光强度下降 25% 的时间窗口（决定系数 r²=0.704，p<0.0001）；(D) 不同处理组 7B11 细胞的 pHluorin 荧光强度定量直方图，分组为：二甲基亚砜（DMSO）对照组、200 nM Baf 处理 15 h 组、250 nM Torin-1 处理 24 h 组、OGD 处理 15 h 组；数值以均值 ± 标准差表示，以 DMSO 对照组为基准归一化，圆点代表独立复孔；(E) 实验流程时间线；(F) 各实验对照组的 pHluorin 荧光强度综合定量结果（以相对于对照组的均值比 ± 标准差表示），分组为：对照组、Baf 组（200 nM 处理 15 h）、Torin-1 组（250 nM 处理 24 h）、OGD 组（处理 15 h）；(G) 3 次独立重复筛选结果的火山图，横轴为稳健 Z 分数，纵轴为 p 值的负对数，红色圆点代表 22 个类先导候选化合物，虚线标注了统计学显著性阈值；(H) 各多孔板的信噪比（S:N）计算结果。 五、候选化合物的体外多维度验证 初筛仅在报告细胞系中得到阳性结果，需通过经典自噬检测手段在野生型细胞中验证化合物的自噬调控活性，明确其调控自噬的阶段（早期/晚期），同时验证剂量依赖性和对血脑屏障的影响，为体内实验筛选出最优候选物。 实验设计 1. 一级验证（Western blot）：在野生型Neuro-2a细胞中，用1μM候选化合物单独或联合Baf处理15h，检测LC3-I向LC3-II的转化。核心原理：Baf阻断自噬体-溶酶体融合，会导致LC3-II累积；早期自噬抑制剂会阻断自噬体形成，即使联合Baf也会降低LC3-II水平；晚期自噬抑制剂会进一步增加LC3-II累积。 2. 二级验证（剂量依赖性）：对阳性化合物设置 0.1、1、10μM 的浓度梯度，验证其自噬调控的剂量-效应关系，排除无浓度依赖性的化合物。 3. 三级验证（金标准 TEM）：通过透射电子显微镜直接观察自噬囊泡（AVs）的数量和大小，直观验证化合物对自噬的调控作用，以3-MA（经典早期自噬抑制剂）、Torin-1为对照。 4. 四级验证（血脑屏障兼容性）：构建体外神经血管单元（NVU）模型，评估化合物对血脑屏障（BBB）完整性的影响，筛选出不破坏、甚至保护BBB的化合物。 实验结果 1. Western blot结果显示，NU7441、波齐替尼、ONC212、贝达喹啉、度洛西汀、WAY640783联合Baf处理后，可显著降低LC3-II水平，证实其为早期自噬抑制剂；MK-8745、Dp44mT单独处理可显著升高LC3-II，为自噬激活剂（图3A-D）； 2. 剂量依赖性实验显示，仅NU7441、度洛西汀、ONC212、波齐替尼可浓度依赖性降低联合Baf后的LC3-II水平，其余化合物无明确剂量-效应关系，被排除（图3E-L）； 图3 入选类先导化合物在亲本Neuro-2a细胞中的验证 (A、B) Neuro-2a 细胞分别经 DMSO（对照）、100 nM Baf 单独 / 联合 1 μM NU7441 (A)、1 μM MK-8745 (B) 处理 15 h 后，MAP1LC3/LC3 与 ACTB/β- actin的蛋白质免疫印迹结果；(C、D) 18 个候选化合物的验证结果，以 ACTB/β- actin归一化的 LC3-II 倍数变化表示；(C) 柱形图为 1 μM 单药联合 Baf 处理组相对于单独 Baf 处理组的 LC3-II 倍数变化；(D) 柱形图为 1 μM 单药处理组相对于 DMSO 对照组的 LC3-II 倍数变化；(E-H) Neuro-2a 细胞经 100 nM Baf，以及 Baf 联合浓度梯度递增（0.1、1、10 μM）的各化合物处理 15 h 后，MAP1LC3/LC3 与 ACTB/β- actin的蛋白质免疫印迹结果；定量结果见直方图(I-L)。 3. TEM金标准验证：NU7441联合Baf可显著减少AVs的数量和面积；度洛西汀、ONC212、波齐替尼联合Baf的表型与3-MA联合Baf完全一致，AVs数量增加且出现肿胀，提示自噬降解过程受阻；MK-8745和Dp44mT的表型与Torin-1一致，证实其自噬激活作用（图4）； 4. NVU模型结果显示，度洛西汀可逆转Baf诱导的BBB通透性增加，对BBB具有潜在保护作用，其余化合物对BBB完整性无显著影响。 图4 自噬囊泡的透射电镜（TEM）分析 (A-J)Neuro-2a细胞的电镜显微照片，处理分组为：DMSO对照组(A)、100nM Baf处理15h组(B)、250nM Torin-1处理15h组(C)、Baf联合5mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理组(D)、Baf联合10μM NU7441/度洛西汀/ONC212/波齐替尼处理组(E-H)、10μM MK-8745/Dp44mT单独处理组(I、J)；(D、H)：自噬囊泡（AVs）的高倍放大图像；(K)以100μm²归一化的自噬囊泡总数定量结果，以均值±标准差表示，每组电镜照片量≥18张；(L)单个细胞内自噬囊泡的总面积定量结果，以均值±标准差表示，每组电镜照片量≥18张，直方图中圆点代表单个细胞。 六、度洛西汀在原代神经元中的自噬调控验证 Neuro-2a为肿瘤细胞系，其自噬调控机制与原代神经元存在差异，而脑卒中的核心保护靶点是皮层神经元，因此需在原代神经元中验证候选化合物的自噬调控活性，同时评估其神经元毒性，锁定最终的研究目标。 实验设计 1. 提取小鼠 E17.5 天的原代皮层神经元，体外培养 7 天（DIV7），采用营养剥夺（ND）模拟缺血后的营养缺乏，激活神经元自噬；同时加入 10μM 候选化合物处理 15h，通过 Western blot 检测 LC3-II 和自噬底物 SQSTM1/p62 的水平（SQSTM1/p62 随自噬激活被降解，随自噬抑制发生累积，是自噬通量的核心标志物）。 2. 通过 MTT、钙黄绿素/PI 双染检测化合物对神经元活力的影响，排除具有神经元毒性的化合物。 3. 同时检测度洛西汀在原代脑内皮细胞、星形胶质细胞 OGD 模型中的自噬调控作用，明确其细胞特异性。 实验结果 1. NU7441 可显著降低 ND 诱导的 LC3-II 升高，证实其在神经元中仍为早期自噬抑制剂，但会降低神经元活力；ONC212 存在显著神经元毒性，被排除；波齐替尼对神经元自噬无显著调控作用； 2. 度洛西汀处理后，神经元中 LC3-II 和 SQSTM1/p62 水平同时显著升高，提示其并非阻断自噬体形成，而是抑制了神经元的自噬通量，阻断了自噬底物的溶酶体降解；同时度洛西汀不影响神经元基础活力，还可显著提高 ND 处理后的活细胞比例，具备优异的神经元安全性（图 5）； 3. 原代脑内皮细胞对 OGD 的自噬响应极弱，度洛西汀对其自噬无显著调控；在星形胶质细胞中，度洛西汀可增加 OGD 处理 10h 后的 SQSTM1/p62 水平，提示其也可抑制星形胶质细胞的自噬通量。 图 5 类先导化合物在神经元中的验证 (A-F) 原代神经元培养物经营养剥夺（ND）处理 15 h，同时单独 / 联合 10 μM 候选化合物处理后，总蛋白提取物中 MAP1LC3/LC3 与 ACTB/β-actin的蛋白质免疫印迹分析结果。 七、度洛西汀调控自噬的分子机制解析 已证实度洛西汀可有效阻断神经元的自噬通量，需明确其具体的分子靶点和作用通路，这是阐明其神经保护作用的核心，也为后续药物优化和临床转化提供靶点依据。 实验设计 1. 溶酶体功能检测：在OGD处理的Neuro-2a细胞中，通过免疫荧光检测溶酶体标志物LAMP1、LysoTracker染色观察溶酶体形态，同时检测SQSTM1/p62的亚细胞定位和表达水平，明确度洛西汀对自噬-溶酶体系统的影响。 2. 靶点验证实验：基于既往报道度洛西汀可抑制TRPM2阳离子通道，且TRPM2与钙信号、溶酶体功能、自噬调控密切相关，开展系列验证： RT-qPCR检测Trpm2在Neuro-2a、原代神经元、正常/缺血小鼠脑组织中的表达； 免疫荧光检测TRPM2的亚细胞定位； 采用TRPM2特异性抑制剂ACA和2APB，单独或联合度洛西汀处理OGD细胞，检测SQSTM1/p62水平，验证二者是否存在叠加效应。 实验结果 1. 度洛西汀可导致OGD处理后细胞的LAMP1+溶酶体、LysoTracker标记的溶酶体发生显著肿胀，同时SQSTM1/p62出现明显累积，且与LAMP1的共定位率降低，直接证实度洛西汀阻断了自噬底物的溶酶体降解过程，进而抑制自噬流（图6A-F）； 2. Trpm2在Neuro-2a、原代神经元、正常和缺血小鼠脑组织中均稳定表达，TRPM2蛋白主要定位于内质网，少量定位于高尔基体和溶酶体，具备调控溶酶体功能和自噬的亚细胞基础（图6G-I）； 3. TRPM2抑制剂ACA和2APB可完全模拟度洛西汀的作用，显著增加OGD细胞的SQSTM1/p62累积，且与度洛西汀联合处理无叠加效应，证实度洛西汀通过抑制TRPM2离子通道，实现对自噬流的阻断（图6J-N）。 图6 抑制 TRPM2 可调控自噬流进程 (A)共聚焦 Z 轴堆叠图像的 XZ 切面投影，展示正常培养条件（对照）、OGD 处理 15 h、OGD 联合 10 μM 度洛西汀处理的 Neuro-2a 细胞中 LAMP1 的染色结果，图右侧为落射荧光标尺；(B) 直方图为门控 Neuro-2a 细胞中 LAMP1 的平均荧光强度（MFI）定量结果（圆点代表单个细胞）、单个细胞的平均 LAMP1 阳性斑点数、LAMP1 阳性斑点的平均大小（圆点代表单次共聚焦采集）；(C) 共聚焦 Z 轴堆叠图像的 XZ 切面投影，展示正常培养条件（对照）、OGD 处理 15 h、OGD 联合 10 μM 度洛西汀处理的 Neuro-2a 细胞，成像前细胞经 100 nM 溶酶体探针（LysoTracker）孵育 40 min；(D) 直方图为溶酶体探针阳性斑点的平均数量与大小定量结果（圆点代表单次共聚焦采集）；(E) 共聚焦 Z 轴堆叠图像的 XZ 切面投影，展示正常培养条件（对照）、OGD 处理 15 h、OGD 联合 10 μM 度洛西汀处理的 Neuro-2a 细胞中 SQSTM1/p62 与 LAMP1 的共染色结果；(F) 直方图为 SQSTM1/p62 阳性斑点的平均数量、SQSTM1/p62 与 LAMP1 的皮尔逊相关系数定量结果（圆点代表单次共聚焦采集）；(G) 实时荧光定量 PCR 检测 TRPM2 在体外培养 7 天的原代神经元、正常 / 缺血小鼠大脑半球、Neuro-2a 细胞中的 mRNA 表达水平；(H) Neuro-2a 细胞中 TRPM2 的共聚焦 Z 轴堆叠图像 XZ 切面投影；以及 TRPM2 分别与高尔基体标志物 GOLGA2/GM130、LAMP1、内质网标志物 KDEL 的共染色共聚焦最大投影图像，皮尔逊相关系数定量结果见 (I) 图；(J) CCK8 实验检测 ACA 与 2APB（10 nM~2 mM）对 Neuro-2a 细胞活力的影响，半数最大抑制浓度（IC50）估算值：ACA≈370 μM，2APB≈790 μM；(K) 正常培养条件（对照）、OGD 处理 15 h、OGD 联合 10 μM 度洛西汀、OGD 联合 20 μM ACA、OGD 联合 10 μM 度洛西汀 + 20 μM ACA 处理的 Neuro-2a 细胞中，SQSTM1/p62 的共聚焦最大投影图像；(L) 直方图为单个细胞的 SQSTM1/p62 阳性斑点数定量结果；(M) 正常培养条件（对照）、OGD 处理 15 h、OGD 联合 10 μM 度洛西汀、OGD 联合 30 μM 2APB、OGD 联合 10 μM 度洛西汀 + 30 μM 2APB 处理的 Neuro-2a 细胞中，SQSTM1/p62 的共聚焦最大投影图像；(N) 直方图为单个细胞的 SQSTM1/p62 阳性斑点数定量结果。 八、体内验证度洛西汀的脑缺血神经保护作用 体外已明确度洛西汀的自噬调控机制，需在体内动物模型中验证其对脑缺血的保护作用，同时验证 “早期自噬抑制发挥神经保护” 的核心假设，评估其治疗窗、适用人群和体内自噬调控效应。 实验设计 缺血后自噬激活时程验证：构建小鼠光化学栓塞（PT）远端脑缺血模型，在造模后 24h、72h、120h，通过 Western blot 检测缺血 / 对侧皮层的 LC3-II 水平，TTC 染色验证梗死灶，明确自噬的激活时程。 度洛西汀体内药效实验： 核心药效：PT 造模后 10min，给雌性小鼠每日 2 次腹腔注射度洛西汀（10mg/kg/ 次，日总剂量 20mg/kg），持续 3 天，通过 TTC 染色、尼氏染色检测梗死体积； 治疗窗验证：造模后 4h 延迟给药，评估其临床适用性； 老年动物验证：在 1 岁龄老年雄性小鼠中采用相同给药方案，验证其在老年缺血模型中的药效； 功能预后评估：在雄性小鼠中通过平衡木实验检测运动功能，MRI 检测梗死体积； 神经炎症评估：免疫组化检测梗死周边区 GFAP + 活化星形胶质细胞的数量。 体内自噬调控验证：造模 3 天后，取缺血 / 对侧皮层，Western blot 检测 LC3-II、SQSTM1/p62、BECN1、p-RPS6KB/p70S6K 等自噬标志物；TEM 检测梗死周边区神经元的自噬囊泡数量。 对照实验：侧脑室注射经典自噬抑制剂 3-MA，验证早期自噬抑制的神经保护作用；同时测试 NU7441 的体内药效，排除非特异性作用。 实验结果 1. PT 脑缺血后，缺血侧皮层的 LC3-II 水平在 24h 和 72h 显著升高，证实缺血后早期自噬被过度激活，为早期自噬抑制的治疗策略提供了病理基础； 2. NU7441 体内给药无法减小梗死体积，无神经保护作用，因此后续研究完全聚焦度洛西汀； 3. 度洛西汀的体内核心药效： 年轻雌性小鼠：度洛西汀治疗后梗死体积较对照组显著减小约 50%，造模后 4h 延迟给药仍可显著减小梗死体积，具备较宽的治疗窗（图 7A-E）； 老年雄性小鼠：度洛西汀同样可显著减小梗死面积，证实其在老年缺血模型中仍有优异药效，而老年人群是脑卒中的高发群体（图 7F-G）； 功能预后：度洛西汀可显著改善雄性小鼠平衡木实验中的运动能力，提升运动表现，同时显著减小 MRI 检测的梗死体积； 神经炎症：度洛西汀可显著降低梗死周边区GFAP+活化星形胶质细胞的数量，减轻缺血后的胶质增生和神经炎症（图 7H-K）。 图 7 度洛西汀治疗可减小脑梗死体积 (A) 实验时间线：光化学栓塞（PT）脑卒中造模后立即给予小鼠度洛西汀治疗（10 mg/kg，每 12 h 给药 1 次）；(B) 溶媒 / 度洛西汀处理的对照组小鼠、造模后 72 h 取材的 PT 模型小鼠（溶媒处理组 n=6，度洛西汀 10 mg/kg 每 12 h 给药组）的 2 mm 厚大脑冠状切片 TTC 染色结果；(C) 缺血体积定量直方图（单位：mm³，结果以均值 ± 标准差表示）；(D) PT 脑卒中造模后，溶媒处理组、度洛西汀 10 mg/kg 每 12 h 给药组雌性小鼠大脑冠状切片的尼氏染色结果；(E) 沿大脑前后轴每 300 μm 取材切片的缺血面积定量直方图（单位：mm²），右侧直方图为曲线下面积计算结果；(F) PT 脑卒中造模后，溶媒处理组、度洛西汀 10 mg/kg 每 12 h 给药组1 岁龄雄性小鼠大脑冠状切片的尼氏染色结果；(G) 沿大脑前后轴每 300 μm 取材切片的缺血面积定量直方图（单位：mm²），右侧直方图为曲线下面积计算结果；(H、J) 雌性小鼠 (H)、1 岁龄雄性小鼠 (J) 脑组织的 GFAP 免疫组织化学染色结果；(I、K) 直方图为缺血区周边皮层中 GFAP 阳性细胞的平均数量定量结果，图 I、K 中圆点代表用于定量的单张冠状切片。 4. 体内自噬调控验证：度洛西汀治疗后，缺血侧皮层的LC3-II和SQSTM1/p62水平显著升高，与体外自噬通量阻断的表型一致；TEM结果显示，度洛西汀治疗后梗死周边区神经元中含自噬囊泡的细胞比例升高，进一步证实其在体内阻断了自噬通量（图8A-H）。 5. 3-MA 侧脑室注射可显著减小 PT 模型的梗死体积，直接证实早期自噬抑制在脑缺血中发挥神经保护作用，与度洛西汀的作用机制完全契合。 图8 度洛西汀在PT脑卒中模型小鼠脑组织中抑制自噬 (A) 皮层梗死区示意图，虚线标注了用于蛋白质免疫印迹实验的同侧与对侧皮层取材区域；(B) PT 脑卒中造模后，经溶媒或度洛西汀（10 mg/kg 每 12 h 给药）处理 3 天的雌性小鼠，对侧与同侧皮层组织中 MAP1LC3/LC3 与 ACTB/β- actin的蛋白质免疫印迹结果；(C) 定量直方图；(D) 上述同批次小鼠对侧与同侧皮层组织中 SQSTM1/p62、BECN1 与 ACTB/β- actin的蛋白质免疫印迹结果；(E、F) 分别为 SQSTM1/p62 (E)、BECN1 (F) 的定量直方图（以相对于溶媒组的均值比 ± 标准差表示）；(G) 上述同批次小鼠对侧与同侧皮层组织中磷酸化 RPS6KB/p70S6K 与 ACTB/β- actin的蛋白质免疫印迹结果；(H) 定量直方图；(I) PT 脑卒中造模后，Atg5f/+雄性小鼠（n=6）、Atg5 条件性敲除（atg5 cKO）雄性小鼠大脑冠状切片的尼氏染色结果；(J) 沿大脑前后轴每 300 μm 取材切片的缺血面积定量直方图（单位：mm²），右侧直方图为曲线下面积计算结果；(K) Atg5f/+与 atg5 cKO 雄性小鼠脑组织的 GFAP 免疫组织化学染色结果；(L) 缺血区周边皮层中 GFAP 阳性细胞的平均数量定量结果，圆点代表用于定量的单张切片。 九、遗传学模型佐证自噬抑制的神经保护作用 药物的体内作用可能存在脱靶效应，需通过基因编辑手段，特异性敲除神经元中的自噬关键基因，从遗传学层面验证 “抑制兴奋性神经元的自噬可减轻脑缺血损伤” 的核心科学问题，为度洛西汀的作用机制提供最直接的遗传学证据。 实验设计 构建条件性基因敲除小鼠：将 Atg5flox小鼠与 SLC17A6/Vglut2IRES-Cre/+小鼠杂交，获得在谷氨酸能兴奋性皮层神经元中特异性敲除自噬关键基因 Atg5 的 cKO 小鼠，同窝 Atg5f/+小鼠作为对照。 在 30 日龄的 cKO 和对照小鼠中构建 PT 脑缺血模型，造模 3 天后，通过尼氏染色检测梗死面积，免疫组化检测梗死周边区 LC3 和 GFAP 的表达。 实验结果 1. 成功构建 Atg5 cKO 小鼠，皮层中 ATG5 表达显著下调，梗死周边区神经元的 LC3 免疫阳性信号显著低于对照小鼠，证实兴奋性神经元的自噬被成功阻断； 2. Atg5 cKO 小鼠的梗死面积较对照小鼠显著减小，同时梗死周边区 GFAP + 活化星形胶质细胞数量显著降低，与度洛西汀治疗的表型完全一致。该结果从遗传学层面直接证实：特异性抑制兴奋性皮层神经元的自噬，可显著减轻脑缺血损伤，发挥神经保护作用，完美佐证了度洛西汀的核心作用机制（图 8I-L）。 十、人脑类器官模型验证度洛西汀的转化价值 啮齿类动物模型与人脑存在种属差异，需在人源 3D 脑类器官模型中验证度洛西汀的作用，为其临床重定位提供更贴近人体的转化证据。 实验设计 1. 用人诱导多能干细胞（iPSC）分化的神经前体细胞（NPCs）构建8周龄的人脑类器官，通过SOX10诱导实现少突胶质细胞成熟，使其包含神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多种人脑细胞类型，模拟人脑的结构和细胞组成。 2. 对人脑类器官进行OGD处理24h，同时加入10μM度洛西汀，通过Western blot检测自噬相关标志物（LC3、SQSTM1/p62、ATG5）、凋亡标志物cleaved CASP3，以及缺氧标志物HIF1α、自噬上游调控分子ULK1的磷酸化水平。 实验结果 1. 成功构建了包含成熟神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的人脑类器官；OGD处理可显著激活类器官的自噬通量（LC3-II升高、SQSTM1/p62降低、ATG5升高），同时上调HIF1α、激活凋亡通路，完美模拟人脑缺血的病理过程； 2. 度洛西汀处理可显著逆转OGD诱导的自噬过度激活，降低LC3-II、升高SQSTM1/p62水平，同时抑制凋亡标志物cleaved CASP3的上调，证实度洛西汀在人源脑组织中同样可抑制缺血诱导的自噬通量，并发挥抗凋亡、神经保护作用，为其临床转化提供了关键的人源模型证据。 十一、研究结论与科学/转化意义 （一）核心结论 1. 本研究通过虚拟筛选+ 体外功能筛选，从6839个生物活性化合物中，鉴定出FDA已批准药物度洛西汀是有效的自噬抑制剂，在低微摩尔浓度下即可阻断缺血应激下的自噬通量； 2. 首次阐明度洛西汀调控自噬的分子机制：通过抑制TRPM2阳离子通道，阻断缺血诱导的自噬通量，抑制神经元中过度激活的自噬，进而发挥神经保护作用； 3. 全面的体内实验证实，度洛西汀在年轻雌雄小鼠、老年小鼠的脑缺血模型中，可显著减小梗死体积、改善运动功能、减轻神经炎症，且延迟给药仍有保护作用；Atg5条件性敲除小鼠从遗传学层面证实，抑制兴奋性神经元的自噬是其神经保护的核心机制； 4. 人脑类器官模型验证了度洛西汀对人源脑组织缺血损伤的保护作用，为其临床重定位提供了完整的临床前证据。 （二）科学意义 1. 解决了自噬在脑缺血中作用的长期争议，明确了缺血早期过度激活的自噬会加重神经元损伤，早期抑制自噬可实现显著的神经保护，为脑缺血的自噬调控研究提供了重要的理论依据； 2. 揭示了TRPM2-自噬轴在脑缺血损伤中的关键作用，为缺血性脑卒中的药物研发提供了新的靶点。 （三）转化意义 度洛西汀是已在临床广泛使用十余年的药物，其安全性、药代动力学特征、临床不良反应均已被充分验证，本研究为其重定位用于缺血性脑卒中的治疗提供了全面的临床前数据，大幅缩短了新药研发的周期和成本，为缺血性脑卒中患者提供了极具潜力的新治疗策略。 参考文献： Alice Viotti , Claudia Molinaro , Jessica Perego , Andrea Fossaghi , Chiara Parravicini , Eliana Lauranzano , Antonella Borreca , Marco Piccoli , Luigi Anastasia , Susanna Manenti , Annamaria Finardi , Alessandra Mandelli , Michela Matteoli , Ivano Eberini , Paola Panina , Gianvito Martino & Luca Muzio (2026): Duloxetine ameliorates cerebral ischemic injury by inhibiting autophagy, Autophagy, DOI: 10.1080/15548627.2026.2641616

引言 胶质瘤是成人最常见的原发性颅内恶性肿瘤，预后差，治疗效果不佳。遗传学、表观遗传学和蛋白质组学景观以及单细胞RNA谱的集体分析已经确定了多个具有假定预后或预测意义的分子亚群。然而，胶质瘤进展的地方性问题加剧了预后不良。 2024年6月3日，上海交通大学冯海忠、李彦欣及美国西北大学Shi-Yuan Cheng共同通讯在Advanced Science 在线发表题为“TRIM24 Cooperates with Ras Mutation to Drive Glioma Progression through snoRNA Recruitment of PHAX and DNA-PKcs”的研究论文，该研究发现表观遗传调节剂TRIM24被确定为胶质瘤进展的驱动因素，其中TRIM24过表达促进HRasV12间变性星形细胞瘤(AA)进展为上皮样GBM (p-GBM)样肿瘤。TRIM24与HRasV12共转染还可诱导肿瘤蛋白p53基因(TP53)敲低的人神经干细胞(hNSCs)发生Ep-GBM样转化。此外，TRIM24在临床Ep-GBM标本中高表达。通过单细胞RNA测序(scRNA-Seq)，发现TRIM24过表达影响肿瘤内异质性和肿瘤微环境。 从机制上讲，HRasV12激活磷酸化的RNA输出适配器(PHAX)，上调U3小核核RNA (U3 snoRNAs)以募集Ku依赖性DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)。过表达的TRIM24也被PHAX招募到U3 snoRNAs上，从而促进了TRIM24在S767/768残基的DNA-PKcs磷酸化。磷酸化的TRIM24诱导表观基因组和转录因子网络重编程，促进Ep-GBM样转化。用小分子抑制剂NU7441靶向DNA-PKcs，与替莫唑胺协同降低Ep-GBM的致瘤性，延长动物生存期。这些发现为研究Ep-GBM样转化的表观遗传调控提供了新的见解，并为Ep-GBM患者提供了潜在的治疗策略。 胶质瘤的进展受遗传和非遗传因素的相互作用控制。在遗传因素中，MAPK/PI3K信号的失调、EGFR的扩增、TGF-β/NF-κB的激活都被证明与胶质瘤的进展和肿瘤异质性有关。Harvey Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog (HRas)是RAS蛋白家族的一员，在胶质母细胞瘤(GBM)中高度活化。HRasV12突变联合肿瘤蛋白p53基因(TP53)突变或其他基因改变可引起高度异质性脑肿瘤；然而，潜在的机制尚不清楚。 在表观遗传调节因子中，组蛋白读取器是具有“读取”组蛋白修饰并选择性结合特定组蛋白翻译后修饰(PTMs)的结构域的蛋白质。TRIM24是tripartite motif (TRIM)家族的成员，通过组合Plant Homeo-domain (PHD)和Bromo-domain (BRD)结合到组蛋白PTMs (H3K4me0/H3K23ac)的特异性特征。TRIM24是66种癌症类型中鉴定的568种癌症驱动基因之一，已被证明在乳腺癌、前列腺癌和胃癌等几种人类癌症中异常表达和激活。 TRIM24不仅通过激活Sox2表达促进胶质瘤干细胞(GSCs)的自我更新能力和侵袭性生长，而且在EGFR驱动的GBM肿瘤发生中作为STAT3的转录共激活因子发挥作用，因此也被确定为GBM进展的重要因素。此外，TRIM24作为E3泛素连接酶靶向p53降解，是巨噬细胞极化所必需的。TRIM24在小鼠乳腺上皮中的条件性过表达可诱导化脓性乳腺癌的自发发展。然而，TRIM24在胶质瘤进展和异质性中的作用有待进一步研究。 TRIM24驱动胶质瘤异质性的工作模型（Credit: Advanced Science） DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)是一种多效丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，在发育和癌症中起关键作用。DNA- pkcs被广泛研究的作用是作为DNA双链断裂(DSB)通过非同源末端连接(NHEJ)修复的关键调节剂。在NHEJ中，Ku70/Ku80异源二聚体结合到DSB末端并招募DNA-PKcs形成DNA-PK全酶。除DNA外，Ku异二聚体还在核糖体生物发生过程中驱动DNA-PKcs在RNA上的组装。DNA-PKcs的异常表达或激活已被确定与多种血液学和实体肿瘤(包括胶质瘤)的不良预后密切相关。NU7441对DNA-PKcs的药理抑制降低了颅内GBM异种移植物肿瘤的生长，并使GBM异种移植物对放疗敏感。因此，DNA-PKcs在胶质瘤中是一种潜在的靶向性致瘤蛋白激酶。 综上所述，该研究提出了表观遗传因子TRIM24在胶质瘤进展和Ep-GBM样转化中的新作用。还揭示了TRIM24通过HRasV12激活的PHAX和Ku依赖性DNA-PKcs与snoRNAs结合的新功能。该研究的细胞和小鼠模型将有助于进一步研究Ep-GBM的病理生理和治疗作用。这项研究的结果可能为更好地理解GBM的异质性和Ep-GBM的进展提供了一步，从而推进临床治疗策略。 原文链接 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202400023 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“iNature” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述