Pseudomonas aeruginosa(Beijing Wante'Er Biological Pharmaceutical Co Ltd)

摘要：合成生物学改变了我们对生物系统的认识。这一领域的新兴技术影响着许多科学和工程学科。传统上，合成生物学方法通常旨在开发成本效益高的微生物细胞工厂，从可再生资源生产化学物质。基于此，合成生物学对环境的直接有益影响来自于减少我们对石油的依赖。然而，合成生物学开始在环境保护中扮演更直接的角色。工业和农业释放的有毒化学物质危害环境，破坏生态平衡和生物多样性。这篇综述强调了合成生物学方法可以通过提供能够感知和响应特定污染物的修复系统来帮助环境保护。讨论了基于基因工程微生物和植物的修复策略。此外，还概述了计算方法，这些方法促进了合成生物学工具在环境保护中的设计与应用。 1.引言 根据世界卫生组织（WHO）最近的一份报告，环境风险因素导致大约25%的人类死亡，相当于每年有1260万人死亡。各种类型的环境污染物通常广泛分散且难以识别和定位。对于大多数污染物来说，缺乏成本效益高的修复技术。合成生物学有望提供新的工具，用于污染监测和有效且针对性的修复。人类在地面上的工业活动、石油泄漏、不受控制的塑料使用以及危险废物（如电子废物）的填埋，导致大量不同污染物的释放，例如重金属、多氯联苯（PCBs）、多环芳烃（PAHs）、挥发性有机碳（VOCs）和多溴联苯（PBBs）进入土壤和沉积物。主要污染物如持久性有机污染物（POPs）可以通过受污染的农产品进入我们的食物链和健康系统，因为它们比在水中溶解更容易被固体颗粒吸收。更重要的是，不断增长的全球人口和食物需求强调了修复污染场地的重要性，以获取更多的农作物耕作土地。 合成生物学是应用工程、科学和技术来编辑生物体的遗传物质，以便使它们能够执行新功能。这些工程生物体可以为我们当前的环境挑战提供强大的解决方案。使用合成生物学工具，已经工程化了微生物来感知、量化和报告特定环境污染物的存在。这些生物传感器，在本文的第二节中进行了回顾，提供了简单且成本效益高的监测水和土壤质量的技术。它们正在成为一种可行的替代当前使用的检测方法，这些方法通常昂贵、局限于配备昂贵仪器的复杂实验室，并需要高级技术专业知识。使用基于合成生物学的更简单的传感器，社区和个人可以经济快速地监测水和土壤质量以满足他们的当地需求。在这篇综述中，我们描述了最常用的合成生物传感器。它们的功能、优势和挑战在（图1）中进行了讨论。 图1. 综述结构概述。 在综述的第三节中，我们专注于生物修复。介绍了可以降解持久性化学物质的合成工程微生物的概述。我们描述了用于生物修复应用的模型和非模型微生物的遗传工程。我们强调了CRISPR技术在用于生物修复的遗传工程古菌和细菌中的有效使用。讨论了各种先进的生物修复新技术，包括生物膜工程、人工微生物群落、基因驱动、昆虫工程以及酶和蛋白质工程。 我们还提供了针对主要土壤污染物类别，包括重金属、农药、烃类和塑料的生物修复最新趋势的概述。用于生物修复的遗传工程微生物的环境安全性在这一领域至关重要。因此，讨论了与遗传工程微生物应用相关的关键风险，即与本地微生物群落的基因组级相互作用、对非目标微生物群落的选择压力以及抗生素抗性基因的无意传播。在生物修复部分的第二部分，讨论了多种植物修复技术，包括植物提取、植物稳定化、根际过滤和植物挥发。提供了一个详尽的植物基因列表，这些基因已知参与不同重金属和除草剂的植物修复。 综述的第四节描述了促进合成生物学在环境保护中应用的计算方法。计算模型是探索微生物群落内可能的代谢和其他相互作用的有价值的工具。这些建模方法可以促进设计相对复杂的策略，用于工程或/和生物增强微生物群落，以增强生物修复特定污染物的能力。 总结来说，在这篇综述中，我们介绍了应用于生物修复的合成生物学方法，包括预测毒性和降解途径、基因组编辑、代谢工程、合成生物传感器系统、构建工程微生物群落中的合成遗传电路，以及实施计算模型，允许社区级干预。 2.构建生物传感器的合成生物学工具  微生物已经进化出能够隔离、泵出或代谢性地使大量毒素失活的能力。这些固有机制是合成生物学应用的起点，旨在工程化更优越的新微生物用于生物修复。随着基因组编辑技术的进步，我们能够使细胞执行新功能的能力也随之提高。这种能力，结合了对自然界中新型毒素介导系统的阐明，允许将这些系统引入模型生物体，从而产生了先进的生物传感系统。在这里，我们强调了几个最近的例子，并讨论了改进生物传感技术的方法。 2.1.微生物全细胞生物传感器 微生物全细胞生物传感器（MWCBs）是具有遗传元件的分析性生物装置，该元件作为传感器，能够识别分析物或毒素，并与报告蛋白一起，能够产生可量化的输出信号。这个信号可以使用廉价的分光光度计测量，甚至可以通过肉眼观察，这增加了MWCBs与传统使用光谱学和色谱法相比的优势。这些微生物通常在其基因组或质粒上进行修改，以携带需要的基因，以将细胞对目标分析物的响应与报告蛋白结合起来。根据报告蛋白的表达类型，MWCBs可以被分类为组成型或诱导型系统。 组成型生物传感器具有由于编码它们的基因的组成表达而具有高基础信号的报告者。这个信号可以由于测试样本的毒性变化而按比例降低，这是由于细胞代谢或细胞活性的变化（图2（a））。尽管这种类型的MWCBs不太具体，但它有利于确定水、土壤或其他环境中复杂样本的毒性。在诱导型MWCBs中，细胞被工程化以通过在诱导型启动子下改变报告蛋白的表达来识别不同的化合物（图2（b））。在这种情况下，启动子的激活取决于识别分析物或一些中间体的调节蛋白。选择理想的启动子和涉及的调节蛋白是关键的，需要了解宿主和响应特定分析物的基因。然而，与组成型MWCBs相比，诱导系统的优势包括高灵敏度、特异性、模块性和高吞吐量原位检测。 图2. 根据报告基因表达分类的微生物全细胞生物传感器。(a) 组成型MWCBs由于报告基因的组成性表达而显示出高信号。信号随着分析的毒性或有毒物质浓度成比例地降低。(b) 在诱导型MWCBs中，报告信号缺失或具有低基础水平。启动子的激活取决于结合分析物或中间体的调节蛋白，形成可以启动报告基因表达的复合体。 几种MWCBs，主要是细菌，已经被开发并成功应用于监测环境污染（表1）。这类生物传感器中的第一个之一是用于检测水中和土壤环境中存在的多环芳烃（PAH）的萘的传感器。通过将控制生物发光蛋白荧光素合成的lux基因插入到编码假单胞菌荧光菌的邻苯二酚羟化酶的nahG位点，可以检测土壤中芳香烃的污染。这种策略已经通过在Acinetobacter ADPWH_lux宿主菌株中表达相同的萘降解操纵子nahAD和操纵子salAR和luxCDABE进行了重建。克隆在质粒中的nahAD操纵子使细胞能够通过产生邻苯二酚来响应萘。这种信号代谢物可以通过诱导操纵子salAR和luxCDABE来检测（图3）。 图3. 萘代谢概述，与邻苯二酚相关的salAR操纵子诱导。 这种新的报告系统显示出更高的选择性，因为它不会被其他多环芳烃（PAHs）激活。它还表现出高灵敏度，能够响应低至0.01毫摩尔萘的浓度。由于邻苯二酚是大多数PAHs代谢中的中心分子，这种新方法提供了通过用相应的PAH操纵子替换质粒来构建对不同PAHs有反应的几种生物传感器的可能性。使用流行的DNA组装方法进行质粒构建，如金门或吉布森组装，可以有效地构建新的合成基因回路，允许快速检测和监测污染环境。 其他在水和土壤中丰富的有毒化合物是重金属，包括但不限于镍（Ni）、镉（Cd）、砷（As）、铅（Pb）和铜（Cu）（表1）。MWCBs可以用于金属检测，尽管特异性仍然是一个挑战。例如，区分化学相似的金属，如Co和Ni，一直很麻烦。然而，最近使用只对Ni有反应的少数调节蛋白开发了一种用于检测饮用水中高水平Ni的发光大肠杆菌传感器。为此，在金属调节蛋白RcnR Ni/Co（抑制剂）上进行了定点突变，以增加对Ni的特异性。其中一个突变体C35A RcnR，完全废除了对Co的反应，导致对Ni的灵敏度降低。为了克服这个问题，删除rcnA（一种Ni外排泵）和表达介导Ni摄取的转运蛋白，如pNik，提高了Ni检测的灵敏度和特异性。其他重金属全细胞生物传感器也使用了相同的原理来检测Cd。砷和铅。最近，在这个相同的宿主中开发了一种新型生物传感器，使用汞抗性启动子（Pmer）和汞抗性调节因子（MerR）来感知环境中的汞，并通过激活紫罗兰色素作为报告因子来报告（图4）。与基于荧光蛋白（eGFP）的典型传感器相比，紫罗兰色素的响应时间更快，为5小时而不是8小时。 图4. 用于感知Hg(II)的汞抗性调节因子操纵子。荧光报告基因和紫罗兰色素生物合成模块被组装在启动子下。 除了细菌传感器，一些酿酒酵母生物传感器也已构建，用于检测有机分子和重金属，特别是铜离子，因为它们具有可诱导的CUP1启动子，该启动子在表达系统中广泛使用。CUP1启动子与报告基因的融合激活，允许检测Cu2+离子，使用GFP时的检测阈值为低至0.5微米，使用LacZ时为0.5毫摩尔。但是，由于工业废水或海水可能是复杂和污染的基质，细胞活性可能会受到影响，给这些单一报告因子带来较少的稳健性和灵敏度。下一代MWCBs在单个细胞中表达两个报告因子，一个专门响应金属浓度，另一个作为细胞活性的内部对照而组成性表达，可以构建和使用，以校正由于细胞毒性而丢失的信号。一个具有两个荧光素酶的双系统和最近两个荧光蛋白响应Cu离子，具有更高的灵敏度和特异性，允许在10−8到10−3 M范围内检测后者。最后，基于ADE2缺失创建了一种更简单、更稳定的酵母传感器，它产生红色菌落，因为嘌呤中间体的积累。利用这一现象，S. cerevisiae菌株在CUP1启动子下表达嘌呤途径的第二个基因ADE5,7，能够按1-100微米范围内的比例检测Cu离子。通过创建一个简单的颜色变化测试，可以由肉眼阅读，无需专业设备，这个生物传感器在受Cu污染的自然水样中成功测试，展示了其潜力。 尽管最近开发了生物传感器，但它们在商业产品中的应用示例非常少。这部分与它们通常有限的特异性和选择性以及将它们现场应用的可行性（便携性、生物容器、分析时间和成本）有关。然而，通过提高我们对细胞代谢和生理学的知识以及通过遗传工程的改进，这些限制可以被克服。以下部分将讨论两组分调节系统（TCRS）和无细胞提取物（CFE）生物传感器的最新进展。 两组分调节系统（TCRS）主要在原核生物和一些真核生物中发现，其中细胞感知环境变化并显示调节响应。TCRS的一般机制包括组氨酸激酶受体（HK）和响应调节因子（RR）。HK蛋白识别信号并激活保守组氨酸残基的ATP依赖性自体磷酸化。然后，这个磷酸基团转移到RR中的天冬氨酸残基，允许其结合到特定启动子序列，激活或抑制目标基因。由于几个TCRS可以感知广泛的信号，包括有机化合物和金属，它们作为生物传感器的潜在应用已经得到了广泛的研究。例如，EnvZ/OmpR系统，大肠杆菌中最研究的TCRS之一，通过调节膜孔蛋白OmpF和OmpC的表达来响应渗透压变化。不同HK和渗透压感应器EnvZ之间的嵌合体已经构建，增加了细胞对感知分子的响应。一个能够识别延胡索酸的HK DcuS与EnvZ的催化域的融合，以及一个ompC-GFP报告因子，足以创建一个厌氧延胡索酸生物传感器（图5（a））。 图5.(a) 在大肠杆菌中，负责感知延胡索酸的组氨酸激酶(HK) DcuS与EnvZ的催化域融合形成了一个嵌合蛋白。在ompR的磷酸化过程中，DcuSZ激活ompC操纵子以表达GFP。(b) CusS感知Cu离子，随后是HK域和OmpR，激活CusSR。这导致微生物表面产生Cu离子结合肽。以及(c) ZraS感知Zn离子，随后是HK域和OmpR，激活ZarSR。这导致微生物表面产生Zn离子结合肽。 与自然的DcuS/R TCRS相比，这个新系统提供了增强的输出信号。同样，细胞可以被工程化以在其表面展示蛋白质以吸收金属。通过将各自的RR融合到OmpC，开发了一个锌和铜吸附系统，即使在低浓度（锌的0.001毫摩尔）下也能发挥作用。有关更多信息，请参见图5（b）和5（c）。 感知和吸收系统的结合可以启用有毒金属或其他目标化合物的监测和去除，增加了传感器的功能。未来的工作预计将阐明传感器的作用机制，这将有助于它们的工程化，以改善它们的感知范围和灵敏度。 2.2.基于无细胞系统的生物传感器 CFE生物传感器（也称为无细胞转录/翻译-TXTL系统）可以感知、响应并介导环境中的污染物。它们在功能上与MWCBs相似；然而，它们完全独立于细胞过程，基于隔离所需的遗传电路来感知和响应。使用CFE生物传感器消除了质粒丢失和遗传不稳定性的风险，以及在部署区域释放时需要生物安全的风险。这些生物传感器也适用于高通量检测。这项技术的一个极好例子是一项研究，使用CFE生物传感器检测莠去津，这是一种在地表和井水样本中检测到的农业除草剂，已成为环境的威胁。 CFE和其他类型的生物传感器在它们可以检测的化学品范围方面有限制，这可以通过将代谢途径与基于转录因子的网络配对来克服。生物信息学工具可以用来识别合成途径，将不可检测的分子转化为可检测的配体，工程化模块化CFE生物传感器，以设计用于广泛的应用。这种策略使用快速和优化的CFE检测了苯甲酸、苯甲酰乙酸和可卡因（见图6）。这种方法也可以应用于金属检测。以前，基于在革兰氏阴性细菌中发现的Hg响应型MerR转录激活因子，开发了检测汞的生物传感器。使用这个电路，最近工程化了一个基于纸张的CFE传感器，其中MerR在存在Hg（II）离子的情况下通过mer操纵子激活sfGFP的表达。该系统检测到受污染水中的6微克/升Hb（II）离子。 图6. 工程化模块化CFE生物传感器的设计。它概述了一个级联系统，该系统结合了多个模块，定义为代谢传感器模块、传感模块和输出模块。在这个例子中，BenR，一个从传感器质粒中组成性表达的转录因子，在有苯氧酸存在时结合到PBen启动子上，从而启动输出质粒中sfGFP的转录。为了扩大其化学检测范围，设计了一个新的传感器模块，使用HipO和CocE酶分别将苯甲酰甘氨酸和可卡因转化为苯甲酸，展示了系统的可扩展性。 CFE生物传感器的进一步发展导致了RNA基组分在调节和输出中的使用。为环境氟化物开发了一种新型基于核糖开关的CFE生物传感器，用于点对点应用（图7（a））。这项技术的基础是一种来自Bacillus cereus的氟化物敏感核糖开关CrcB，它调节CrcB的表达，即氟化物外排泵。这个调节RNA在CFE传感器中被用来控制sfGFP的表达。这个基于RNA的CFE系统对氟化物的检测灵敏度足以检测环境保护局定义的最大容纳水平2 ppm。此外，为了感知水污染，使用了一种荧光RNA，而不是蛋白质，作为输出（图7（b））。RNA输出传感器通过配体诱导激活（ROSALIND）使用一种高效的RNA聚合酶（T7噬菌体RNAP）、变构蛋白转录因子（aTF）和DNA转录模板来调节这些结构的最终输出：一个诱导荧光的RNA适体，产生最后一个信号。目标污染物的存在，在这种情况下，有机分子和金属，诱导了aTF的动员，解除了RNAP延伸的阻塞，并允许产生称为三通连接二聚体西兰花（3WJdB）的适体。商业RNA结合染料，如DFHBI-1 T，激活了RNA的荧光，用作检测方法。作者进一步通过使用RNA反馈系统来增加ROSALIND的灵敏度，从而提高了有毒化合物的检测限制。 图7. 基于RNA组分在(a)调控和(b)输出中的示例。(a) 控制sfGFP的CFE氟化物生物传感器示意图。基于RNA核糖开关的生物传感器系统可应用于现实环境。(b) T7噬菌体RNAP以及适体和三通连接二聚体西兰花(3WJdB)可以激活DFHBI-1 T荧光。 RNA系统的使用使得可以开发RNA反馈系统，为新控制变量优化检测限制。这些RNA系统引入了新的控制元素，提供了更高的正交性、增加的灵敏度，并能够反转转录因子响应。CFE系统中转录因子的浓度可以调整，以增强这些RNA系统的功能。此外，RNA系统的模块化可以适应感知各种化合物，如四环素、小分子和金属。 许多用于生物传感的系统都具有模块化和可工程化的遗传组件。工程化方法为这些生物传感系统提供了“即插即用”的效用，允许高通量、高工程化和便携性，以及容易的优化。尽管与无细胞提取物（CFEs）相关的主要限制是它们在工业规模生产和部署的高成本，但目前裂解系统的进展使它们成为一个更可行的选择。CFE传感器能够可靠检测的污染物范围广泛且日益增加，表明它们可能成为监测环境污染的主流工具。 3.合成生物学工具在基因工程中的应用  建立一个遗传工程系统需要适当的底盘、基因编辑和控制及监测遗传重编程的工具。在合成生物学帮助下的生物修复的最新趋势是应用非模式生物作为宿主、CRISPR作为编辑工具，以及遗传电路作为前后工程工具。基于代谢途径的可访问性和实验室实验的便利性，微生物被分为模式和非模式类型，第一类被优先用于大多数合成生物学工作。然而，由于非模式生物在基于独特代谢途径的选择性污染物降解、碳源利用和对极端条件的天然抗性方面的独特能力，它们在生物修复研究中的应用最近已成为焦点。尽管非模式生物的基因调整存在相当大的限制，因为高基因组GC含量，但科学界通过发现和发展新的遗传部件（如报告基因、穿梭载体、核糖体结合位点和启动子），提供了更有效的基因表达和操纵。以下部分讨论了用于生物修复的特定类别的合成生物学工具，包括基因驱动和CRISPR启用的工具、遗传电路、酶和蛋白质工程，以及一些新的生物修复技术。 3.1.基因驱动和CRISPR启用的工具 在生物修复中新采用的一种策略，可以应用于大规模污染，是基因驱动，这导致在整个微生物群落或单一物种群体中传播特定优选基因。以前，水平基因转移被利用来清理受石油衍生物污染的场地。这是通过将携带有效降解基因（alma、xylE、p450cam）的大肠杆菌菌株接种到污染的沉积物中来完成的。此后，本地微生物群落获得了相关基因，并在场地上清除了石油烃。将降解基因转移到当地微生物群落是有利的，因为外来物种不会干扰可能的生态系统。 在包括TALEN、ZFN和CRISPR在内的各种基因组编辑技术中，它们作为人工分子剪刀在特定位点切割DNA，CRISPR已被证明最有效和直接，特别是对于古菌和细菌系统。最重要的好处是它能够应用于多个位点，并在实现共同工程目标方面具有高效性，包括插入、删除、替换和位点突变。CRISPR工具包主要应用于模式微生物，如假单胞菌和大肠杆菌。它的应用也扩展到了非模式生物，如红色诺卡氏菌TH、睾酮菌和无色杆菌HZ01。最近，为极端微生物，包括嗜热菌、酸菌和盐菌开发了各种基于CRISPR的遗传改造系统，这些微生物可以在使用这些类型的微生物的生物修复研究中发挥关键作用。CRISPR也已应用于生物表面活性剂产生菌，以改善芳香烃和农药降解的生物电动力学修复系统。 CRISPR干扰（CRISPRi）是一种工程工具，用于下调不良基因的表达，并调节代谢通量，以过度产生有利产品。相反，CRISPR激活（CRISPRa）工具使生物体能够上调所需的基因。例如，报告了CRISPRi工具的应用，创建了非模式木质纤维素细菌（Rhodococcus opacus PD630）中第一个目标基因抑制系统。CRISPR在生物修复中的应用，用于增强生物去除、耐压性和优化的生物降解途径，总体上是稀缺的，未来值得更多关注。CRISPR技术在生物修复中的早期应用之一是目标基因敲除和敲入，这有助于研究人员验证特定基因的作用和功能。一个显著的例子是最近的研究，他们使用Thermo-Cas9工具进行目标敲除，证实了砷酸盐抗性基因（TtarsM）对嗜热菌（Thermus thermophilus HB27）解毒系统的贡献。这些类型的目标敲除也是优化非模式生物中CRISPR编辑效率的极好工具，这反过来为CRISPRi和CRISPRa提供了进一步途径调整的机会，以及多重基因组编辑。 使用CRISPR技术对废物转化为增值产品的研究得到了更深入的追求。在木质纤维素废物的增值中，基于CRISPR的木质素酶的蛋白质工程已被引入为酶过度生产的最有前途的技术。另一个从CRISPR中受益的废物生物转化领域是将温室气体如CO、CO2和CH4（也称为C-1气体）发酵成各种增值产品。许多醋酸菌的应用在大规模上受到它们在C-1气体上的低生长速率和产量的负担。CRISPR介导的基因编辑最近显示出克服这一限制的希望。Clostridium ljungdahlii和Eubacterium limosum是两种主要经历CRISPR介导基因编辑的醋酸菌。例如，使用两个启动子（Pthl、ParaE）表达Cas9和sgRNA，以及从Clostridium ljungdahlii中删除四个基因对生长速率以及从C-1气体发酵中形成醋酸和乙醇都有有益的影响。CRISPRi工具箱也应用于Clostridium ljungdahlii，以增强温室气体发酵为丁酸并减少碳通量进入乙醇生产的侧途径。 CRISPR基因修改的一个主要挑战是脱靶编辑，这发生在由于目标位置的序列相似性而在不需要的位置进行DNA切割。关注这一背景至关重要，特别是在开发用于生物修复目的的基于CRISPR的基因驱动时，以防止对自然生态系统产生不良影响的变化。为此，已经开发了许多策略来确保基于CRISPR的遗传工程和基因驱动的安全性（见表2）。 3.2.遗传电路 类似于电路，遗传电路可以从构成分子部件设计和构建：报告基因、代谢基因、启动子、复制子和选择标记。这些可以用来改变细胞行为，增强代谢产出，或监测工程后的代谢活动。适当遗传元素的可用性对于构建此类遗传电路至关重要。例如，报告系统和可诱导启动子的缺乏限制了使用遗传电路工程醋酸菌以改善将空气污染物转化为增值产品。因此，表征新的和有效的遗传部件对于有效的遗传重编程至关重要。例如，为Cupriavidus metallidurans CH34开发了高效诱导性和组成性启动子，这是一种多功能的化学自养生物，具有在芳香化合物降解、从废水中产生生物电和生物矿化贵金属方面的应用，有助于控制蛋白质生产和优化CRISPR编辑效率。遗传电路的应用也可以与CRISPRi结合使用，构建转录逻辑门，通过电路输出结果控制细胞行为，例如糖消耗。在醋酸菌中实施这一策略已被用于将代谢活动与环境变化联系起来，例如pH变化和生长基质浓度变化。 3.3.酶和蛋白质工程 复杂结构环境污染物的生物处理，例如造纸和纸浆废水中的木质素、农药、芳香烃和塑料，依赖于微生物降解酶的强大活性。除非通过基因操作来操纵它们的表达，否则这些酶在自然界中产生的量是不足的。目前，不同的工具被用于遗传工程生物修复系统中的酶优化，包括合理设计、半合理设计和定向进化。通过对羧酸酶酶的活性位点中功能基团的替换进行合理重构，提高了一种高毒性酚衍生物（4-羟基苯乙烯）的生物降解率40%，同时将立体选择性提高了39倍。另一方面，依赖于随机突变的非结构基础方法——定向进化，已经开发出新的功能，例如在真菌中木质素酶的极端pH抗性，这些在生物修复生物精炼中有应用。在过氧化物酶体中定向工程化蛋白质表达也被认为是建立酵母合成甲酸营养的最好方法。这在甲酸营养微生物，特别是合成甲醇消耗酵母（合成甲酸营养菌）如解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的生物碳捕获过程中尤为重要。除了上述方法，重组DNA技术和异源表达也被用来加强大规模酶的生产和纯化，当具有污染物降解能力的基因在微生物宿主中表达时。通过定点突变改进了活性和底物范围。对不可培养环境样本的宏基因组分析也帮助研究人员发现了具有特定功能的新型降解酶基因。 3.4.快速优势突变筛选和选择 开发了一种新的筛选方法，可以快速识别适应性实验室进化（ALE）后的优势突变体。这可以促进后续的逆向工程和构建超耐受和污染物降解菌株。传统上，在菌株逐步适应有毒物质或次优生长条件后，进行全基因组测序以揭示遗传变化。然而，ALE期间出现的多重突变使得定位受影响的基因问题重重且耗时。在快速优势突变筛选和选择（RAMSES）方法中，在指数生长期向培养物中添加突变DNA，结果DNA通过同源替换并入染色体。然后在增加的选定压力下使用转化菌株。因此，优势突变体出现并促进了生长。一组科学家利用这种方法在暴露于高浓度香草酸（一种木质素衍生的芳香族化合物）后的木质素降解细菌（Acinetobacter baylyi ADP1）中表征了有益突变。他们进一步利用有益突变（在基因hcaE、hcaK中）对细菌进行工程化，以提高对香草酸的耐受性（图8）。 图8. 阿克曼菌ADP1中可能的芳香族酸转运系统示意图（蓝色：转运蛋白，绿色：孔蛋白）。虚线箭头指的是多个步骤。 4.生物修复应用的最新成就  4.1.新的生物修复技术  生物修复研究始于研究必要的现场技术，如生物增强、生物通风、生物曝气和场外方法，如堆肥、土地耕作、生物堆积和生物反应器。这些方法主要应用于未经改造的生物体，以减轻环境污染。后来，研究人员开始评估新的天然基酶、不同分离的微生物、生长优化和应用简单的基因编辑方法的能力。当前的合成生物学努力通过采用生物膜工程和合成微生物群落等新技术，成功地推动了生物修复的界限。 4.1.1.生物膜工程 生物工程生物膜是生物修复中的一条最新研究线，旨在减少自然界中有毒金属、烃类和农药的影响，并克服天然生物膜的限制。通过整合信号通路、代谢工程途径和胞外聚合物（EPS）重新排列，可以设计合成生物膜。生物膜的再生能力允许它们可持续使用，EPS组成的可调性使其能够针对不同的生物修复目的发挥特定功能。生物浸出（重金属从固体基质中的溶解）、金属腐蚀抑制和微生物燃料电池（MFCs）处理废水是一些传统的生物修复应用，生物膜工程可以进一步改进。例如，建立了一个选择性汞解毒系统，其中汞检测器（MerR启动子）在大肠杆菌中组成性表达。然后通过合成纳米纤维（称为curli）动态隔离游离汞。此外，通过用镧系元素结合标签修改curli纤维，制造了一种具有选择性吸收稀土元素（Tb3+）能力的功能性生物膜。这些研究示例说明了如何利用生物工程生物膜从废水和固体废物中选择性回收重金属。合成生物膜的未来环境研究方向涉及其在更大规模上的试验、响应回路的优化，以及从EPS蛋白到其他生物膜组分如多糖和核酸的工程扩展。 4.1.2.合成微生物群落 通过在人工选择的微生物群落中寻找理想特性，可以显著帮助生物修复。合成微生物群落涉及具有理想特性的特定菌株的共培养。在这种设置中，每种微生物可以部分参与降解途径。因此，可以避免对单一菌株及其相关代谢负担的过度工程化。此外，了解微生物群落成员之间的合作效应可以开辟一条发现新型酶和生物降解途径的途径，从而实现更高的污染物去除率。使用工程微生物群落，可以同时修复多种废物，并使用危险废物作为原料生产附加值产品。这可以通过将生物降解产物转化为单体单元来实现，这些单体单元可以用作生物合成另一种产品的原料。例如，乙二醇，一种常见的化学污染物，被用作原料，并通过工程化的假单胞菌菌株转化为生物塑料（聚羟基烷酸酯（PHA））。研究人员还成功利用了一种难降解塑料废物——聚氨酯（PU）的水解产物（己二酸、乙二醇和1,4-丁二醇）来喂养假单胞菌衍生物的混合培养物，并生产出附加值产品，如鼠李糖脂。另一项研究报告了使用基于酵母的群落同时生产生物燃料和从木质纤维素材料中去除活性偶氮染料的可能性。这项研究中的合成酵母群落显示出比每个成员的单一培养更高的酶活性和更高的还原率。其他例子包括通过合成微生物群落将纤维素转化为有机酸的整合生物过程。人工选择的微生物群落也已应用于石油和酸性矿山排水的生物修复。这无疑是合成生物学为生物修复研究带来的最重要的进展之一，因为它通过建立循环经济和工业生态模型，在许多工业过程中实现了零废物目标。 微生物群落的稳定性，在生态和进化上，是该领域中的实际挑战之一。最近引入了各种在线和离线监测和控制混合培养物种群动态的测量技术。应用传播策略评估两个人工构建的细菌群落的可重复性和功能保持是积极的例子之一。用于工程合成微生物群落的工具箱，包括群体感应信号分子、诱导剂和共生相互作用生成，最近已经回顾。最近在共培养方法上的改进，如空间链接的微生物群落（SLMC），为构建具有不兼容生理要求的合成微生物群落提供了机会（例如，将嗜酸菌与碱杆菌和需氧菌与厌氧菌共培养），这在使用传统技术时是不可能的。SLMC涉及工程培养基环境而不是微生物菌株，并将不同的微生物在相互连接的模块内共培养。SLMC使不兼容菌株之间的代谢物交换成为可能，并在选择群落成员方面提供了更多的灵活性。然而，控制每个模块中的种群规模和通量交换是具有挑战性的，这限制了这项技术的具体应用。 4.1.3.土壤和农药的生物修复 土壤解毒的物理和化学途径，如土壤挖掘和基于溶剂的洗涤，可能通过意外打断土壤微生物组、营养循环和有机物储存，对土壤质量产生负面影响。因此，将生物修复作为污染管理中低成本、节省劳动力、能源和化学品的方法的发展至关重要。在本节中，将概述主要土壤污染物生物修复的最新趋势（见表3）。 • 重金属 有多种方法可以减轻和中和重金属对环境的威胁。可持续、环保的选择包括生物浸出（提取和溶解）、生物吸附、生物还原（纳米颗粒生物合成）、生物矿化（沉淀和稳定化）、植物修复（植物）以及新出现的方法，如结合肽和铁载体（Pollmann等人，2018年）。这些过程大规模应用的一个常见限制是耗时长和金属去除不足。因此，合成生物学家开始通过修改生物体系统来解决挑战。提高所选菌株对重金属的耐受性是提高过程速率和效率的常见做法。提高耐受性的一种方法是插入抗性基因。最近引入了几种增加微生物对铜耐受性的工程策略。其他努力包括寻找遗传重编程所需的能力遗传元素，这对于主要的金属食用细菌（Acidithiobacillus spp.）来说严重受限。已经鉴定了一种基于荧光素酶活性的有效报告基因，可以应用于所有Acidithiobacillus spp.，以监测基因表达和调控。以前的研究者还寻找了其他类型的微生物底盘，如异养生物、蓝藻和甲烷营养菌，以实施遗传工具。合成生物学工具箱在金属生物回收中的应用仍处于起步阶段。进一步提高上述微生物过程可以为金属污染的绿色有效修复和从危险固体废物（如电子废物）中回收金属提供前所未有的机会。 • 烃类 合成生物学对烃类生物修复的影响日益增加。烃类包括多环芳烃（PAHs）、石油及其衍生物、六氯环己烷（HCH）、芳香染料、氯代烷、多氯联苯（PCBs）和有机卤化物。通过转基因生物增强PAHs等化合物的生物降解策略包括：寻找生存和溶解基因以及与降解相关的酶基因，以及调整基因表达、增加生物催化剂活性和应用新的降解途径。最近，合成生物学工具已成功用于操纵大肠杆菌中的基因表达，以优化芳香污染物的生物修复和在两种嗜热细菌中同源和异源过表达硝基烷氧化酶（NOEs）。能够降解聚氨酯（PU）的微生物包括一些细菌菌株，如Comamonas、Pseudomonas、Bacillus、Acinetobacter、Corynebacterium，以及真菌种类，如Aspergillus、Pestalotiopsis、Cladosporium、Fusarium、Penicillium。Aspergillus种类在PU解聚中表现出最有希望的能力。负责PU分解的微生物酶主要包括水解酶类型（蛋白酶（肽断路器）、酯酶、脲酶和酰胺酶（酰胺断路器））。 • 塑料 微生物对塑料的净化是一个由各种微生物（包括放线菌、藻类、细菌和真菌）进行的酶驱动过程。合成生物学中的不同方法，如宏基因组学、克隆和计算方法，已被用于增强Pseudomonas、Escherichia和Bacillus物种在塑料解聚的酶催化能力。大多数塑料生物降解工程研究都集中在修改编码有效降解酶的基因上。Pseudomonas种类在为克隆到其他细菌宿主中提供有效酶方面非常有助益。然而，非细菌宿主最近也引起了显著的关注。一项新研究报告了成功利用Phaeodactylum tricornutum作为藻类遗传宿主及其低成本生长条件进行聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的生物降解（更多信息，见图9（a））。这是通过在遗传宿主中表达Ideonella sakaiensis中的关键酶（PETase）完成的。PET在过去20年中一直是生物修复研究者研究最多的塑料，因为其具有挑战性的解聚和难以水解。最近，通过分子对接和结合模式分析鉴定的氨基酸残基的突变，对一种Cutinase酶的热稳定性和活性进行了操作，实现了超过90%的PET瓶样品生物降解（33倍于之前发现的酶）。为了评估垃圾填埋场中的微生物群落如何裂解聚醚聚氨酯（PE）-PU塑料，一项新的宏基因组方法（邻近连接基）与物理和化学分析一起进行（图9（b））。结果揭示了每个物种的降解基因和酶，提供了每个物种如何增强和促进塑料生物降解的见解。一篇综述文章提供了在本地菌株中鉴定的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）水解酶的列表。 图9.(a) （上）AP_SP-PETase-FLAG蛋白示意图，以及（下）PETase-GFP表达显示蛋白定位在内质网。(b) 培养后BP8细胞附着在聚醚聚氨酯丙烯酸酯上的扫描电子显微镜分析。 • 农药 近年来，为了提高农药生物修复，已经检查了不同的策略。重点一直放在人工选择的群落上，利用适应性基因丢失、代谢负担分割、酶工程和群体感应来增强农药去除。最近详细回顾了工程化微生物群落的不同机制和策略以及这类系统的示例。在最近的一项研究中，有机磷水解酶（OPH）酶被工程化以提高有机磷化合物（OPCs）的降解，这是一类广泛使用的农药。使用定点突变来增强OPH水解酶的立体选择性。如蛋白质融合、固定化和化学修饰等工程方法提高了催化性能、酶稳定性和底物亲和力。在某些情况下，可以将完整的生物降解途径引入到新的菌株中。Zhao等人通过DNA组装器的途径组装和通过反选择系统进行的染色体整合，使用一种新的生物降解途径构建策略，实现了γ-六氯环己烷（γ-HCH）（一种有机氯农药）和1,2,3-三氯丙烷（TCP）（一种有毒溶剂）的完全去除。这被引入到Pseudomonas putida KT2440中。最近一篇综述文章收集了对酯酶酶进行的研究、异源基因表达的应用，将来自植物和动物的潜在酯酶引入微生物中，以及它们在有机磷化合物、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯这三类主要农药的生物降解中的作用。 4.2. 昆虫工程用于生物修复 昆虫工程是最新呈现的生物修复技术之一，被视为工程微生物的可行替代方案。灭菌，作为一种简单有效的生物安全控制方法，可以为增强生物修复提供安全的程序化生物体。昆虫的强大消化系统有助于在没有预处理和消毒需求的情况下进行粗废物的增值。易于扩大规模、最小的土地使用和可管理的基础设施安装是这项技术的其他好处。因此，利用昆虫作为生物工厂来生产工业必需的生物分子，如酶和脂质，被建议为未开发的废物增值机会。为了评估这个想法，最近在一种模型昆虫（果蝇）中表达了来自Trametes trogii的真菌漆酶酶。经过工程改造的苍蝇在其饲料中去除了50%的双酚A。转基因昆虫的冻干粉可以在水中脱色90%的靛蓝染料。这些结果表明，转基因昆虫作为酶生产和现场生物修复的新底盘具有潜力。 植物可以通过一种称为植物修复的过程转化或消除环境污染物。许多重金属污染的场所可以从使用具有增加金属稳定化或提取能力的植物基因型中受益，这些植物用于土壤修复和植物修复。此程序使用包括植物提取、植物稳定化、根际过滤和植物挥发在内的各种技术（见图9）。在植物提取中，植物从水体、沉积物以及土壤中提取重金属，并将它们积累在地面以上的部分。因此，收割植物可以从环境中去除重金属。植物稳定化是将重金属固定在地下金属耐受性植物中并减少其在土壤中的生物有效性的过程。在根际过滤中，植物根部吸收、浓缩并从受污染的水中沉淀有毒金属。植物挥发作用是植物根部利用污染物，将其转化为气态，并释放到大气中。 在植物提取中，金属被植物吸收，移动，然后集中在地面组织中。积累高水平重金属的植物被称为超积累植物。这些超积累植物被广泛用于两种不同分类的植物提取：植物提取螯合剂辅助或诱导植物提取，以及长期或持续植物提取。尽管对使用EDTA的螯合辅助植物提取的应用有显著兴趣，但提议使用对环境伤害较小的可生物降解螯合剂，如乙二胺二琥珀酸盐（EDDS）（见图10（a）），这有利于螯合剂在植物提取后的降解。有毒离子可以保留在污染的基质中，并在根际的植物稳定化过程中固定在根部。该过程可以由像植物与细菌内生菌的伙伴关系的微生物群落促进（见图10（b））。一种表达拟南芥金属硫蛋白基因mt4a的复合百脉根植物。相比之下，一种Ensifer medicae菌株表达由结瘤启动子nifHp驱动的假单胞菌铜抗性基因copAB，用于与植物共同接种。这种双重共生系统是Cu植物稳定化的示例。 图10. 用于处理重金属污染场地的植物修复技术包括植物提取、植物稳定化、根际过滤和植物挥发。(a) 在可生物降解螯合剂存在下的植物提取，(b) 在内生菌存在下的植物稳定化，(c) 通过将重金属隔离到液泡中的根际过滤，(d) 在根瘤菌存在下的植物挥发。与图a-d相关，不同植物修复技术中使用的相关基因列在每项技术上方，红色圆圈代表重金属污染物。(e) 参与砷（红色）、镉（蓝色）和铜（黄色）吸收和转运功能的基因列在每个标记功能旁边。 在根际过滤过程中，污染物也可以通过根部吸收、浓缩和沉淀。例如，表达假单胞菌CopC基因（编码Cu结合的周质蛋白CopC）并将其靶向到液泡的转基因烟草毛状根（CuHR-V），可能导致Cu超积累毛状根并减少毒性压力症状（见图10（c））。植物生物质在植物提取和根际过滤后积累了有毒金属，需要收割。热解是最具前景的热化学技术，用于从重金属污染的植物生物质中大规模回收热能和能量。含金属的燃烧植物材料在足够数量时可以用于金属回收的生态催化剂中，降低使用当前采矿程序提取金属的整体环境影响。然后，在挥发过程中，金属可以通过植物生物转化为气态形式并释放到大气中。例如，在根瘤-豆共生体中表达的莱茵衣藻As(III) S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶（arsM）基因揭示了砷的甲基化和随后的挥发（见图10（d））。它突出了豆-根瘤菌共生体在砷生物修复中的潜在用途。 使用植物修复有几个优点，包括：（i）它在经济上可行，因为它由太阳能驱动；因此，它易于管理，安装和维护成本低，（ii）它对环境友好，同时减少环境和生态系统对污染物的暴露，（iii）它适用于大规模场地，（iv）它防止金属渗漏和侵蚀，同时稳定重金属，从而降低污染物传播的风险，（v）它可以通过向土壤释放有机物质来提高土壤肥力。然而，几个限制因素限制了这项技术的效率，包括：（i）土壤中重金属的生物有效性低，例如，土壤的pH值、有机物、氧气、湿度和其他因素，（ii）植物生物量生产低，（iii）缺乏有效的污染生物量处理方法。因此，选择具有高生长速率和生物量、强大的吸收和积累重金属能力的合适植物将是高效植物修复过程的关键要素（见表4）。此外，遗传工程的进步加速了植物修复技术的发展，正如我们接下来讨论的。 • 参与不同重金属植物修复的基因 参与金属吸收、运输和隔离的基因过表达或失活可以赋予植物增加的植物修复能力。通过根部从土壤中吸收金属、与配体和螯合剂形成复合物、在液泡中沉积以及长途运输到芽中，所有这些潜在机制都可以被控制以增加植物组织中的金属积累。金属转运蛋白和金属结合螯合剂是最常用的用于操纵植物金属代谢的基因；然而，在接下来的部分中，我们还将回顾其他参与植物修复的基因，这些基因按其应用进行分类。 砷植物修复。在响应As胁迫时，植物将其隔离到液泡中，然后从根部移动到芽中。敲除砷酸盐响应MYB1转录因子（OsARM1）（CRISPR/Cas9产生的突变体）可以提高对As(III)的耐受性，但过表达增加了对As(III)的敏感性。当As(III)浓度低（2μM）时，OsARM突变体中更多的As从根部运输到芽中，而当As(III)浓度高（25μM）时，根部在OsARM1过表达系中收集更多的As，这意味着OsARM1转录因子调节水稻中As的摄取和从根部到芽的转运。拟南芥中的砷酸盐还原酶2基因（AtACR2）被引入烟草基因组（Nicotiana tabacum，var. Sumsun），减少了土壤中的砷含量。虽然转基因植物根部的砷含量显著高于野生型（WT）植物。此外，水稻中As(V)还原酶（OsHAC4）的突变可以减少根部的As(V)保留，As(III)的外排和芽中As的积累。然而，当水稻过表达它时，情况正好相反。因此，OsHAC4通过As(V)还原解毒，然后是As(III)的外排。此外，由于磷酸盐（Pi）化学与As(V)相似，土壤中的As(V)主要通过质膜磷酸盐（Pi）转运蛋白进入植物细胞。拟南芥中的主要液泡磷酸盐转运蛋白（AtVPT1）参与As(V)耐受，同时有助于液泡Pi的隔离。Nodulin 26类内质膜蛋白OsNIP3;2被证明参与了侧根对As(III)的吸收。然而，它对芽中As积累的贡献有限。Yanshan Chen等人在拟南芥和烟草中表达了As(III)抗运输蛋白ACR3（PvACR3;1）。转基因拟南芥在根部的As保留更多，但在芽中比WT少。因此，PvACR3;1可以提高根部的As保留，同时通过将As(III)隔离到液泡中减少芽和/或谷物中的As。 镉植物修复。植物和某些微生物含有植物螯合素，这是在重金属存在下通过植物螯合素合酶活性从谷胱甘肽酶中酶促产生的。植物螯合素合酶（PCS）基因被发现在重金属植物修复中特别有效。这些发现丰富了高等植物中由植物螯合素合酶介导的镉解毒的原始模型。在另一项研究中，将甘蓝植物螯合素合酶基因转化到A. thaliana AtPCS1突变体cad1–3中，表明了一个高效的转基因系在镉修复中高效。Vicia sativa PCS基因（VsPCS1）可以将镉保留在细胞质中而不是液泡中。Fan等人鉴定了两个桑树植物螯合素合酶基因，并将其转化到A. thaliana和N. tabacum中。转基因拟南芥种子的芽和根中的Zn2+/Cd2+浓度高于WT。因此，它们被认为是重金属植物修复的有希望的遗传资源。 金属硫蛋白是一类在多种生物和植物中发现的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质/多肽，它们通过与必需或非必需金属结合来维持细胞内稳态（Fasani等人，2018年）。来自盐生植物盐地碱蓬的第二类金属硫蛋白基因SsMT2被克隆到拟南芥中，积累了更多的Cd2+但较少的Na+。 黄条类（YSL）转运蛋白家族转移与植物铁载体或烟碱胺（NA）螯合的金属离子，参与各种矿物元素的吸收、转运和分配。拟南芥过度表达Miscanthus sacchariflorus黄条类（MsYSL1）基因表现出对镉的抗性。它伴随着根长增加，根中Cd、Zn和Mn的水平降低，以及在镉胁迫条件下Cd、Fe和Mn的转运比率提高。因此，涉及运输多种金属-NA的MsYSL1可能参与镉解毒，同时调节其他金属离子的重新分配。转基因拟南芥表达景天属植物金属转运蛋白自然抗性相关巨噬细胞蛋白（SaNramp6）也表现出高镉积累水平。转基因烟草植物持续表达金合欢属植物重金属ATP酶（PjHMT），一种ATP驱动的重金属泵，有效地积累和耐受镉。肉桂醇脱氢酶（CAD）催化苯丙素木质素生物合成途径中的最后一步，参与胁迫抗性过程。在拟南芥中过度表达景天肉桂醇脱氢酶增加了镉的耐受性和积累，通过在胁迫条件下将镉吸收并固定到木质化细胞壁上。因此，除了植物螯合素合酶、金属硫蛋白和转运蛋白外，参与木质素生物合成的基因对镉修复也很有用。 汞植物修复。通过带有ATP结合盒（ABC）家族基因的植物遗传转化可以影响重金属的流动性；因此，过度表达ABC基因的植物可以增强如Hg等金属的转运。Hg是环境中高生物毒性的重金属污染物。拟南芥和杨树中过度表达颤杨ATP结合盒（ABC）转运蛋白基因（PtABCC1）可以提高Hg的耐受性和积累。 • 参与除草剂植物修复的基因 除草剂的过度使用可能导致许多环境问题。细胞色素P450酶是一个超家族的成员，也包括血红素单加氧酶。P450在代谢各种内源性底物方面发挥作用。细胞色素P450酶被发现在除草剂植物修复中具有独特的生物应用。除草剂异丙尿嘧啶被表达在拟南芥中的人类细胞色素P450-1A2代谢。与此同时，WT在大于50μM剂量的异丙尿嘧啶显著阻碍了生长。有趣的是，拟南芥中人类P450-1A2的表达也可以增强对林尿嘧啶除草剂的耐受性和解毒。除了人类P450在植物修复中的功能外，人参CYP76B93在拟南芥中的过度表达可以提高对除草剂绿麦隆的抗性。此外，当人参衍生的CYP736A12在拟南芥中过度表达时，它涉及绿麦隆和异丙尿嘧啶的耐受性。广泛使用的除草剂乙草胺可以被转基因拟南芥合成CndA降解和耐受，CndA是细菌中乙草胺N-脱烷基酶系统CndABC的氧酶组分。CndA催化的乙草胺N-脱烷基化过程的代谢物被排出细胞外，可能被土壤微生物进一步降解。总的来说，使用细胞色素P450用于水和土壤中除草剂残留物的植物修复可能是有益的。 5.环境合成生物学的基于模型的工具  与合成生物学方法一起运行的计算方法在生物修复研究中发现了不同的应用。操纵生物降解途径被介绍为提高微生物大规模净化废物能力最有希望的方式之一。这些类型的研究研究通常涉及多个科学领域，如基因组学、蛋白质组学、生物信息学、分子建模和分子动力学模拟。生物修复中常见的计算机技术包括酶和污染物的分子对接、分子动力学模拟和计算机毒理学。明尼苏达大学编制了一个包含543种细菌菌株及其相关的降解污染物的列表。这种类型的数据库可以是有帮助的，特别是对于计算机模拟和选择正确的生物修复策略。 合成生物学利用各种分子和计算技术生产符合工业标准的酶。为了最大化基因表达和蛋白质生产，可以工程化调控和遗传元素，例如启动子、终止子和结合序列，以影响微生物代谢。分子对接也用于生物修复研究，以探索污染物与酶结合位点之间的有利相互作用，形成具有最小结合能的稳定复合物。虽然分子对接本身不被视为合成生物学的一部分，但它在指导生物修复策略的设计中发挥作用。已经提供了各种分子对接和生物降解途径预测软件的列表。 合成生物学和代谢工程显著促进了生物修复过程的发展。它们是我们能够提高用作生物降解剂的各种化学品生产的领域。环境合成生物学的努力需要被引导到系统生物学工具，特别是代谢模型。环境系统生物学提供了有关不同条件下不同生态系统中微生物群落网络内相互作用的宝贵信息。随着组学数据和基因组方法的进步，这些信息变得更加有吸引力，这些方法是无培养的。使用无培养技术，如宏基因组学和宏转录组学，研究人员可以直接分析环境样本中的遗传物质，并捕捉更广泛的微生物多样性，包括以前无法培养的物种。这种对微生物群落组成和动态的全面了解可以更准确地评估生物修复过程。这使研究人员能够开发模拟模型，更有效地预测特定污染物的生物降解，并设计策略构建针对给定物质生物修复量身定制的微生物群落。因此，环境系统生物学中无培养数据的使用通过提供更全面、准确和生态相关的微生物相互作用和功能的理解，增强了生物修复过程的发展。 迄今为止，科学家们使用传统方法常常忽视了高通量技术的潜力，因此未能获得微生物群落的机制性见解并确定它们的功能。包括蛋白质组学、通量组学、代谢组学和转录组学在内的高通量数据，与基因组学和宏基因组学相结合，为进行更全面的研究以揭示参与生物修复过程的微生物的潜在机制提供了希望。最近一篇综述文章提供了一个详细的列表，列出了多年来用于除草剂生物修复的不同基因组和转录组技术以及蛋白质组和代谢组工具。这就是机器学习方法可以指导我们对现有数据的看法的地方。不同的生物修复过程使用了各种方法，包括深度神经网络、径向基函数、多层感知器和决策树。 作为基于约束的模型，通量平衡分析（FBA）在计算机上被广泛用于分析基因组规模的代谢网络。通过最大化一个期望的目标函数，例如网络中特定反应的通量，FBA使用线性规划预测在给定环境条件下代谢反应的最优通量分布。它利用基因组规模的代谢模型（GEMs）来考虑代谢反应的化学计量和约束，如营养物质的可用性或能量产生速率。GEMs作为FBA的基础，通过全面表示代谢网络及其相关的细胞功能，解开不同微生物甚至群落中的基因型-表型关联。 在生物修复的背景下，基于约束的模型可以帮助识别潜在的生物降解途径，并预测参与污染物降解的微生物群落的生长速率和效率。它们可以被用来设计优化的微生物群落，以有效生物修复特定污染物，通过预测不同微生物物种之间的交叉喂养相互作用。将高通量数据与基于约束的建模相结合，使FBA成为理解和优化不同生态系统中生物修复过程的关键工具。例如，Pseudomonas putida的GEMs在识别降解广泛污染物的基本基因和途径方面发挥了重要作用，有助于设计优化的微生物群落以有效生物修复。Bacillus megaterium的GEMs阐明了参与氰化物生产的基本代谢途径，有助于理解其从电信印刷电路板废物中生物修复金的潜力。此外，蓝藻的GEMs已被用于工程菌株以有效降解污染物。表5提供了参与各种生物修复过程的不同有机体生成的GEMs的列表。 基于FBA应用的原则，已经开发了优化微生物菌株的模型。计算工具，包括但不限于OptKnock、OptStrain和OptReg，可以用于生物修复中的代谢工程。OptKnock专注于特定生物修复过程的基因删除策略。相比之下，OptStrain采用基因挖掘方法，从不同菌株中提取有价值的基因，并将它们整合到特定的GEMs中，构建具有增强生物修复能力的优化微生物菌株。另一方面，OptReg使研究人员能够操纵基因调控，正面或负面地微调参与生物修复过程的代谢途径和酶活性。研究人员可以通过使用这些计算工具，定制微生物菌株以实现卓越的生物降解能力，使生物修复过程更加有效和可持续。 在有严格数据可用的情况下，GEMs可以用来精确描述复杂的细胞行为。在这方面，重建确立良好的代谢网络至关重要。尽管已经开发了几种自动和半自动重建和填补空白的算法，但到目前为止，它们都未能与手动细化的好处相匹配。因此，在发布GEM之前，始终建议执行手动审查过程。 已经开发了各种工具和数据库来研究参与生物修复的代谢途径。这些工具有助于生成健壮和准确的生物修复模型。13C代谢通量分析伴随着同位素标记实验是识别基因组规模网络细胞内瓶颈的另一种有力策略。Zhang等人通过Paracoccus denitrificans Z195揭示了TCA循环和ED途径在好氧反硝化和碳去除过程中的重要性。使用13C MFA，可以定义策略来调查碳转化与碳可用性之间的关联，以在生物修复期间过度产生所需的代谢物。 数学建模和计算生物学不仅在理解微生物代谢方面发挥重要作用，而且它们还可以指导研究人员在合成生物学实验的不同方面确定适当的策略。在开发了自动识别基因回路瞬态动态行为的自动化生物模型选择系统（BMSS）之后，引入了一个新的Python包，BMSS2，它有助于模型选择和发展，用于关注DBTL循环的合成生物学研究。蛋白质序列活性关系（ProSAR）模型是计算工具，将蛋白质序列与其活性或适应度联系起来。它们可以协助酶工程，以提高霉菌毒素生物修复中解毒酶的效率。此外，还有几个生物信息学框架可用于研究和解释不同的组学数据。 分子动力学模拟、计算机毒理学、分子建模和对接等新领域正在用于代谢工程，以提高过程的效率。分子对接技术可以帮助预测污染物在生物降解阶段的命运。这些工具也可以用来设计构建合成微生物群落的策略。借助这些工具，我们可以提高微生物的效率并生产更高质量的化合物。 6.前景  合成生物学已经证明了其能力，可以彻底改变环境科学领域，并且许多正在进行的努力正在被用来解决挑战并开发可靠和有效的生物系统。为了克服与生物传感器灵敏度和稳定性相关的困难，建议使用不同的机器学习工具来探索新模式，以改善生物传感器的性能。还有报道称，使用纳米材料可以改善生物传感器的稳定性。生物修复的一个重大瓶颈是当前策略可以降解的污染物范围有限。此外，生物修复可能缓慢且效率低下，这使得它在某些应用中不切实际，生物增强可以帮助通过将外源微生物引入污染环境中来克服这些限制。宏基因组研究也可以帮助加速新酶和微生物的鉴定。因此，将计算方法与实验方法相结合对于产生更强大结果至关重要。 植物修复在有效性和可扩展性方面受到限制，这是由于植物生长相对较慢，加上适合的植物种类有限，以及植物中不可预测的基因表达。为了应对这一挑战，需要新的基因组编辑技术和整合计算建模和高通量数据。 尽管仍然需要解决重大挑战，但合成生物学有潜力解决并限制环境损害，同时将其转变为环境安全和可持续性。需要更多的杰出努力来加速从当前传统方法向合成生物学方法的转变。由于大多数环境损害需要很长时间才能显现，因此对环境修复的投资应该具有长远的视角。随着合成生物学方法的发展，我们期望工程化更多的微生物和植物，以更有效地感知、量化和针对特定的环境污染物。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。