Measles Vaccine,Live(Shanghai Institute of Biological Products Co., Ltd.)

中文摘要 目的   研究在特定的储存条件下，细胞工厂工艺生产的麻疹病毒原液和含麻疹成分疫苗中麻疹病毒滴度随温度、时间的变化规律。 方法   按照细胞工厂工艺分别制备3批麻疹、腮腺炎和风疹病毒原液，将麻疹病毒原液置于2～8 ℃保存21 d和–60 ℃以下保存15个月进行稳定性分析，并将同批次原液分别用于配制6批麻疹减毒活疫苗（measles attenuated live vaccine，MV）、麻疹-腮腺炎联合减毒活疫苗（measles and mumps combined attenuated live vaccine，MM）和麻疹-腮腺炎-风疹联合减毒活疫苗（measles，mumps and rubella combined attenuated live vaccine，MMR），对上述18批疫苗进行（25±2） ℃保存6个月加速稳定性试验及2～8 ℃保存30个月长期稳定性试验。检测原液以及成品的麻疹病毒滴度，分析不同产品中的麻疹病毒在不同储存温度下的稳定性，并应用Minitab 17分析软件预估原液和成品稳定期。 结果   3批麻疹病毒原液于2～8 ℃保存21 d和–60 ℃以下保存15个月，麻疹病毒滴度最低值分别为5.5和5.8 lgCCID50/ml，均符合≥5.3 lgCCID50/ml的质量标准。18批疫苗于（25±2） ℃保存6个月，MV、MM和MMR的麻疹病毒滴度最低值分别为4.0、4.7和3.4 lgCCID50/ml；2～8 ℃保存30个月，MV、MM和MMR的麻疹病毒滴度最低值分别为4.4、4.5和3.8 lgCCID50/ml。上述成品稳定性试验中的麻疹病毒滴度均符合各产品的质量标准；应用分析软件预估的原液和成品稳定期均远超各产品批准效期。 结论   细胞工厂工艺的麻疹病毒原液以及3种含麻疹成分疫苗中的麻疹病毒的稳定性良好。 正文 麻疹是传染性最强的人类传染病之一，它由麻疹病毒引起，在流行地区呈季节性发病。接种含麻疹成分疫苗 （measles-containing vaccine，MCV）是预防麻疹的唯一有效手段。沪-191麻疹减毒株由上海生物制品研究所有限责任公司（上海公司）分离自1例2岁患儿的全血标本，经减毒后建株。用沪-191株生产的麻疹减毒活疫苗（measles attenuated live vaccine，MV）至今已在我国应用近 60年，超过20亿剂，为我国控制和消除麻疹做出了巨大贡献。目前上海公司生产的MCV有MV、麻疹-腮腺炎联合减毒活疫苗（measles and mumps combined attenuated live vaccine，MM）、麻疹-腮腺炎-风疹联合减毒活疫苗（measles， mumps and rubella combined attenuated live vaccine，MMR）。 随着细胞工厂在各类疫苗生产中的广泛使用，麻疹病毒原液的生产工艺也由传统的转瓶工艺变更为细胞工厂工艺，并用于制备3种MCV产品。本研究通过对3批麻疹病毒原液以及用其配制的MV、MM和MMR各6批进行加速稳定性试验及长期稳定性试验，研究麻疹病毒滴度在特定储存条件下随温度、时间变化的规律，为探讨麻疹病毒原液和含麻疹成分疫苗产品在储存及运输等特定环境下的稳定性提供支持。 1 材料与方法 1.1 细胞与毒种 原代鸡胚成纤维细胞由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供的无特定病原体级鸡胚制备，人二倍体细胞MRC-5株购自美国典型培养物保藏中心。麻疹病毒沪-191减毒株和腮腺炎病毒S79减毒株均由上海公司建株，风疹病毒BRD-Ⅱ减毒株由北京生物制品研究所有限责任公司提供。 1.2 主要试剂及仪器 乳蛋白水解物、MEM培养基购自美国Gibco公司，199培养基购自北京清大天一生物技术有限公司，细胞工厂购自赛默飞世尔科技(中国)公司。 1.3 麻疹病毒原液及含麻疹成分疫苗的制备 按照细胞工厂工艺分别制备3批麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液和风疹病毒原液，使用上述3种病毒原液分别配制MV、MM和MMR各6批，每批病毒原液配制3种疫苗各2批。 1.4 麻疹病毒原液稳定性试验 将麻疹病毒原液保存于2～8 ℃进行加速稳定性试验，分别于0、7、14和21 d取样检测病毒滴度。将麻疹病毒原液保存于-60 ℃以下进行长期稳定性试验，分别于0、1、2、3、6、9、12和15个月取样检测病毒滴度。 1.5 MCV中麻疹病毒的稳定性试验 将MV、MM和MMR各6批置于（25±2） ℃进行加速稳定性试验，分别于0、1、2、3及6个月取样检测麻疹病毒滴度。将MV、MM和MMR各6批置于2～8 ℃进行长期稳定性试验，于0、3、6、9、12、18、24及30个月取样检测病毒滴度。 1.6 统计学方法 参照人用药品技术要求国际协调理事会指导原则Q1E《稳定性数据评价》附录B中的“B.2 单因素、完整设计研究的数据分析 ”对药物有效期的评价方法，用Minitab 17软件对麻疹病毒滴度在特定储存条件下随温度、时间变化的规律进行稳定性分析，拟合线性回归模型，并推测不同产品在特定储存条件下的稳定期。 2 结果 2.1 麻疹病毒原液稳定性 对3批麻疹病毒原液分别在2～8 ℃和-60 ℃以下储存的病毒滴度进行稳定性研究分析发现：加速稳定性试验中，7 d内病毒滴度相对稳定，下降幅度≤0.1 lgCCID50/ml；21 d后最大降幅为0.6 lgCCID50/ml，最低值为5.5 lgCCID50/ml，95%置信区间为5.3~6.0 lgCCID50/ml，高于5.3 lgCCID50/ml标准下限（图1A）；长期稳定性试验中，最初2个月病毒滴度下降幅度≤0.1 lgCCID50/ml，15个月后病毒滴度最大降幅仅为0.3 lgCCID50/ml，最低值为5.8 lgCCID50/ml，95%置信区间为5.7~6.1 lgCCID50/ml，高于标准下限（图1B），充分支持麻疹病毒原液于-60 ℃以下保存不超过12个月的企业标准规定。 将3批麻疹病毒原液在2～8 ℃的稳定性数据拟合线性回归模型，根据麻疹原液标准下限5.3 lgCCID50/ml，推导出麻疹病毒滴度（y）与时间（x）的线性方程：y=6.15-0.021x，推测稳定期为32.9 d；在-60 ℃以下的拟合线性方程：y=6.01-0.016x，推测冻存原液稳定期为32.6个月。回归分析法显示，在2种温度条件下3批麻疹病毒原液拟合回归的截距和斜率均相同，各推导出相同线性方程。 2.2 MCV中麻疹病毒稳定性 2.2.1　MV成品　对6批MV成品分别在（25±2） ℃和2～8 ℃储存的麻疹病毒滴度进行稳定性研究分析发现：加速稳定性试验中，储存6个月的麻疹病毒滴度最大降幅为0.6 lgCCID50/ml，最低值为4.0 lgCCID50/ml，病毒滴度95%置信区间为4.1~4.4 lgCCID50/ml，高于3.3 lgCCID50/ml标准下限（图2A）；长期稳定性试验中，至18个月产品有效期，麻疹病毒滴度的95%置信区间为4.5~4.7 lgCCID50/ml，最低值为4.5 lgCCID50/ml，最大降幅为0.2 lgCCID50/ml；至24个月，滴度的95%置信区间为4.3~4.5 lgCCID50/ml，最大降幅为0.5 lgCCID50/ml；30个月滴度最低值为4.4 lgCCID50/ml，最大降幅为0.3 lgCCID50/ml，95%置信区间也在4.4~4.6 lgCCID50/ml，高于3.3 lgCCID50/ml标准下限（图2B）。 通过回归分析，6批MV在（25±2） ℃的储存条件下，病毒滴度以每月0.075 lgCCID50/ml的速率递减，预计14.5个月下降至产品标准下限值；而在2～8 ℃储存条件下，病毒滴度以每月0.010 lgCCID50/ml的速率递减，预计稳定期为114.8个月。 2.2.2　MM成品　对6批MM成品分别在（25±2） ℃和2～8 ℃储存的麻疹病毒滴度进行稳定性研究分析发现：加速稳定性试验中，6个月麻疹病毒滴度最大降幅仅为0.3 lgCCID50/ml，最低值为4.7 lgCCID50/ml，病毒滴度95%置信区间为4.7~5.0 lgCCID50/ml，高于3.4 lgCCID50/ml的标准下限（图3A)；长期稳定性试验中，至18个月产品有效期，麻疹病毒滴度的95%置信区间为4.8~5.0 lgCCID50/ml，最低值为4.8 lgCCID50/ml，最大降幅为0.2 lgCCID50/ml；至24个月，滴度的95%置信区间为4.8~4.9 lgCCID50/ml；30个月麻疹病毒滴度最低值为4.5 lgCCID50/ml，最大降幅为0.5 lgCCID50/ml，95%置信区间为4.6~4.8 lgCCID50/ml，高于3.4 lgCCID50/ml的标准下限（图3B)。 通过回归分析，MM在（25±2） ℃的储存条件下，麻疹病毒滴度以每月0.017 lgCCID50/ml的速率递减，预计49.8个月下降至产品标准下限值；在2～8 ℃，病毒滴度以每月0.009 lgCCID50/ml的速率递减，预计稳定期为151.8个月。回归分析法显示6批MM在 2～8 ℃条件下拟合回归的截距和斜率均相同，推导出同一线性方程。 2.2.3　MMR成品　对6批MMR成品分别在（25±2） ℃和2～8 ℃储存的麻疹病毒滴度进行稳定性研究分析发现：加速稳定性试验中，6个月麻疹病毒滴度最大降幅为0.6 lgCCID50/ml，最低值为3.4 lgCCID50/ml，病毒滴度95%置信区间为3.4~3.7 lgCCID50/ml，高于3.3 lgCCID50/ml标准下限（图4A)；长期稳定性试验中，至18个月产品有效期，麻疹病毒滴度的95%置信区间为3.9~4.1 lgCCID50/ml，最低值为3.9 lgCCID50/ml，最大降幅为0.2 lgCCID50/ml；至24个月，滴度的95%置信区间为3.8~4.0 lgCCID50/ml；30个月滴度最低值为3.8 lgCCID50/ml，最大降幅为0.4 lgCCID50/ml，95%置信区间为3.8~4.0 lgCCID50/ml，高于3.3 lgCCID50/ml的标准下限（图4B)。 通过回归分析，MMR在（25±2） ℃的储存条件下，麻疹病毒滴度以每月0.069 lgCCID50/ml的速率递减，预计6.7个月下降至产品标准下限值；在2～8 ℃储存条件下，麻疹病毒滴度以每月0.006 lgCCID50/ml的速率递减，预计稳定期为86.1个月。 3 讨论 WHO明确规定疫苗稳定性研究是保证疫苗质量的重要前提。前期研究显示上海公司细胞工厂工艺生产的MV单次收获液、原液和成品的关键指标与转瓶工艺生产相似，且批间一致性更优。本研究对3批细胞工厂生产的麻疹病毒原液进行加速稳定性试验及长期稳定性试验，3批麻疹病毒原液于2～8 ℃保存21 d和﹣60 ℃以下保存15个月，麻疹病毒滴度均符合≥5.3 lgCCID50/ml质量标准。用上述3批麻疹病毒原液配制MV、MM和MMR各6批，并进行加速和长期稳定性试验，数据显示（25±2） ℃保存6个月后和2～8 ℃保存30个月后，3种MCV中的麻疹病毒滴度均符合质量标准。 同时使用人用药品技术要求国际协调理事会推荐的数据评价方法，应用Minitab 17软件对3批麻疹病毒原液以及3种MCV中的麻疹病毒的稳定性进行预估。Minitab 17统计分析软件可以对稳定性数据进行趋势分析，建立模型、进行假设检验等，帮助识别产品性能随时间变化的模式，进一步帮助推导出产品稳定期。应用Minitab 17软件对3批麻疹病毒原液在2种温度下的稳定性进行预估，麻疹病毒原液在2~8 ℃的稳定期为32.9 d，在-60 ℃以下的稳定期为32.6个月，后者明显超出目前-60 ℃以下保存12个月的批准有效期。含麻疹免疫原的3种MCV的配制点不同，MV、MM和MMR各6批的成品中麻疹病毒起始滴度范围以x̅±2s表示分别为（4.70±0.12）、（4.98±0.08）和（4.03±0.30） lgCCID50/ml，应用Minitab 17软件对各6批的3种MCV中的麻疹病毒在（25±2） ℃加速稳定性数据进行稳定期估测，MM为49.8个月、MV为14.5个月、MMR为6.7个月；对2～8 ℃的长期稳定性数据进行稳定期估测，MM为151.8个月、MV为114.8个月、MMR为86.1个月，均远超目前2～8 ℃保存18个月的批准有效期。同时还开展了同批次麻疹病毒原液效期末产品配制研究，稳定性数据与本次研究数据差异无统计学意义。 综上所述，麻疹病毒原液制备由传统转瓶工艺变更为细胞工厂工艺后，3种MCV中的麻疹病毒在2～8 ℃储存条件下都非常稳定，从而确保了疫苗有效期内麻疹病毒抗原的有效性和长期稳定性。在开展麻疹病毒稳定性研究的同时亦对上述联合疫苗中的腮腺炎、风疹病毒等各组分进行了稳定性研究，结果显示各组分稳定性均符合质量标准。 我国于1965年成功研制麻疹减毒活疫苗，于1978年将其纳入国家计划免疫。2000—2009年，麻疹平均发病率为6.8/10万，2010年全国进行麻疹强化免疫，2012年发病率降至0.46/10万。2016年，麻疹预防已经转向使用含麻疹免疫原的联合疫苗，各地全面提高MCV常规免疫，确保以乡为单位目标儿童2剂MCV全程接种率均>95%，及时接种率>90%。2016—2019年我国适龄儿童第1剂MCV（MCV1）接种率达到98.59%~99.56%，第2剂MCV（MCV2）接种率为98.47%~99.42%。为提高针对流行性腮腺炎的免疫保护，自2020年6月起，我国8月龄儿童接种的麻疹-风疹联合减毒活疫苗调整为MMR，实施8月龄和18月龄各接种1剂次 MMR。2021、2022年报告麻疹病例均为552例，报告发病率（每100万）分别为0.392、0.391，达到有麻疹疫情报告数据以来的历史最低水平，在有效的MCV和MCV1、MCV2高覆盖率的协同作用下，目前我国正在接近消除麻疹。 从全球范围来看，尽管通过强有力的常规免疫接种、战略性补充免疫接种活动（supplementary immunization activity，SIA）和疫苗免疫监测，许多国家已经接近或实现消除麻疹。然而，自2016年以来，麻疹在局部地区又重新出现，显示了这些成就的脆弱性，消除麻疹任重而道远。WHO-联合国儿童基金会对免疫覆盖率的估计显示，从2015年到2019年，全球MCV1的覆盖率稳定在85%。至2019年，WHO报告非洲和东地中海地区国家的覆盖率中位数为60%，仍然远远低于消除麻疹所需的95%或更高水平。故而提供质量有保证的MCV，加强常规免疫接种并持续开展高质量的SIA将有助于实现全球和区域消除麻疹的目标。后续，将开展细胞工厂工艺变更后MMR在8~12个月龄健康儿童中的Ⅳ期临床研究，进一步评价该产品的有效性和安全性。 作者 沈谊清1  杨文震2  马雷钧3  郁佳俊4  周锋1  张芹1  许乐燕1 1上海生物制品研究所有限责任公司疫苗二室，上海  201403；2上海生物制品研究所有限责任公司，上海  201403；3上海生物制品研究所有限责任公司质量检定室，上海  201403；4上海生物制品研究所有限责任公司质量保证部，上海  201403 通信作者：许乐燕， Email：xuleyan@sinopharm.com 引用本文：沈谊清, 杨文震, 马雷钧, 等. 细胞工厂工艺的麻疹病毒原液及成品疫苗中麻疹病毒稳定性研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 197-202.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230912-00009 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。