NX-213

核酸适配体（Aptamers）是一类合成的单链寡核苷酸，能够以高亲和力和特异性结合靶标，实现精准且可编程的功能调控。然而，低生物稳定性（Biostability）仍是治疗性适配体的关键成药性瓶颈。体内酶促不稳定性构成了主要的药代动力学屏障，阻碍了系统暴露量、组织分布和持续的靶标占据，而这些正是体内疗效的关键决定因素。因此，通过耐酶修饰进行理性化学稳定化已成为适配体药物开发的基石策略。在这篇综述中，研究人员系统地分类了当前的稳定化方法，涵盖两个互补的设计维度：局部水平修饰（包括末端修饰、糖环修饰、骨架修饰和碱基修饰）和全局结构水平工程（包括Spiegelmers、环化修饰和多价组装）。此外，研究人员讨论了持续的转化挑战，以阐明一个连贯的框架，用于设计具有高生物稳定性的适配体，在实现增强的耐核酸酶性的同时，兼具良好的药代动力学特性、高靶标结合亲和力和特异性。1. 引言 适配体是合成的单链DNA或RNA寡核苷酸，折叠成确定的三维构象，能够以高亲和力和特异性结合分子靶标（最常见的是蛋白质）。与主要依赖序列互补碱基配对的反义寡核苷酸或siRNA不同，适配体通过结构依赖的分子识别发挥作用：发夹、内部环、连接点、假结和G-四链体等三级基序协同作用，产生成型的结合表面，能够区分靶标上的细微物理化学特征。由于它们可以近似抗体样的靶标结合，同时完全可化学编程并通过固相合成制造，适配体常被描述为“化学抗体”。适配体发现的主要方法是指数富集配体系统进化（SELEX），通过结合、分选和扩增的迭代循环，从高度多样化的随机库中富集稀有的靶标结合序列。自从引入以来，SELEX已成熟为标准化的工作流程，受益于筛选设计的改进（例如更严格的反选）、加速富集追踪的分析读数以及自动化友好的形式。这些发展扩展了可及的靶标空间，并促进了对治疗干预相关的多种可溶性蛋白质、受体和其他生物分子靶标的适配体生成。从药物开发的角度来看，适配体占据了小分子和大分子生物制剂之间的独特利基市场。与小分子类似，它们可以通过可扩展的化学合成生产，具有强批间一致性和对组成的精确控制。它们的核酸支架支持位置定义的模块化化学工程，能够在预定位点安装官能团、接头、成像标签或药物有效载荷。同时，像单克隆抗体一样，适配体可以通过构象编码的识别表面实现纳摩尔甚至皮摩尔的结合亲和力及卓越的选择性。原则上，这种可编程性、可制造性和高性能结合的组合理想地使适配体成为细胞外阻断、受体调节、靶向递送和多特异性治疗组装的配体。尽管有这些概念上的优势，适配体的治疗转化一再受到内在开发性瓶颈的限制，这些瓶颈限制了持久的体内活性。最常提到的挑战包括：（i）由于生物体液和组织中的核酸酶介导的降解导致的有限生物稳定性；（ii）由低分子量和高度亲水性驱动的快速清除（特别是肾脏过滤）；（iii）重塑生物分布并减少游离的、靶标可及浓度的非特异性相互作用；以及（iv）与某些序列、化学性质或配方相关的情境依赖性免疫刺激或其他安全性责任。虽然这些因素的相对重要性因适应症、给药途径和靶标生物学而异，但不足的体内持久性往往是最直接的障碍，因为序列完整性的丧失或活性折叠的破坏会迅速消除靶标结合并缩短药理有效暴露窗口。因此，提高稳定性不仅仅是下游优化；它通常是将强体外结合转化为持久的体内药效学和临床实用给药方案的先决条件。在过去的二十年中，已经开发了多种稳定修饰方法来改善适配体的体内性能，从化学改变到高阶构建体工程。然而，这些适配体稳定性修饰并非互换：它们可以重塑折叠、结合行为、暴露、安全性和可制造性，使得修饰元素的选择和组合成为关键的实践挑战。在本综述中，研究人员回顾了适配体稳定性修饰策略，重点放在设计逻辑和转化权衡上。研究人员首先简要概述了关键的开发性挑战，并解释了稳定性约束如何塑造给药可行性和治疗窗。随后调查了主要的适配体稳定性修饰类别，包括末端、糖、骨架和碱基水平的化学修饰，接着是基于架构的方法，如环化和耐核酸酶正交设计。在相关情况下，讨论了稳定性修饰选择如何与暴露、生物分布和安全性考虑相互作用，并强调了指导修饰策略选择的实用决策点（例如RNA与DNA支架、预期的核酸酶环境、靶标停留时间要求和可制造性约束）。目标是提供一个结构化和可操作的框架，帮助研究人员从“高亲和力结合剂”转变为具有改善体内稳健性的适配体构建体，从而为治疗转化提供更清晰的路径。 2. 低生物稳定性是治疗性适配体的关键成药性瓶颈 低生物稳定性仍然是治疗性适配体的关键成药性瓶颈。尽管适配体在体外可以实现高亲和力和特异性，但它们在体内的功能取决于在生理条件下维持序列完整性和结合 competent 的三级折叠。因为适配体识别是构象驱动的，对于某些线性寡核苷酸模式可能耐受的部分降解，对于适配体可能是功能灾难性的：在结构上关键的环、连接点或稳定茎处的切割可能触发全局展开并迅速丧失靶标结合。因此，低生物稳定性往往是从体外筛选出的结合剂转化为体内活性治疗药物构建体时最早和最严格的障碍。 2.1 核酸酶介导的降解途径 治疗性适配体差生物稳定性的主要机制驱动因素是生物体液和组织中的核酸酶介导的降解。内切核酸酶切割内部的磷酸二酯键，而外切核酸酶则从3'和/或5'末端逐步修剪寡核苷酸。这些过程在体内同时发生，产生的截短片段可能无法维持适配体所需的结构基序和高亲和力识别。重要的是，核酸酶的攻击不需要很广泛就能消除功能：单个内部切割或适度的末端修剪就可以破坏长程三级接触并破坏活性折叠。RNA适配体通常比DNA适配体更脆弱。除了丰富的RNase活性外，2'-羟基的存在增加了固有的骨架不稳定性，并可能促进加速降解的切割反应。DNA适配体缺乏2'-OH，因此倾向于表现出改善的内在稳定性，但它们仍然易受DNase影响，并且根据序列背景和折叠拓扑结构，仍可能经历快速降解。因此，低生物稳定性是跨越适配体支架的普遍限制，其严重程度由化学成分（RNA与DNA）和产生核酸酶可及位点的结构特征共同决定。 2.2 结构-稳定性耦合与生物功能的丧失 适配体的一个决定性特征是结构与功能的紧密耦合：亲和力和特异性源于核苷酸精确的排列。这种耦合使适配体对降解特别敏感。末端截断可以移除稳定茎和共轴堆叠的碱基配对元件；内部切割可以破坏组织结合界面的环结构和多螺旋连接点；局部不稳定可以传播到全局构象重排。因此，降解的功能影响可能是非线性的——特别是对于结构敏感的适配体（例如采用茎环构象的适配体），其中即使是微小的化学损伤也可能导致结合亲和力不可预测的丧失、结合动力学改变或特异性降低。这种结构-稳定性关系解释了为什么提高耐核酸酶性通常是维持适配体在复杂生物基质中活性并启用治疗上有意义的靶标结合的先决条件。 2.3 转化意义：为什么稳定性修饰嵌入在先进构建体中 由于未修饰的适配体易于发生快速核酸酶降解，稳定性修饰通常在治疗设计中早期集成，而不是作为后期优化处理。在实践中，推进到临床前晚期开发或临床评估的适配体很少是“裸”寡核苷酸；相反，它们是结合了稳定性修饰元件的工程化构建体，旨在体内保持活性折叠和维持靶标亲和力。一个典型的例子是Pegaptanib（Macugen），首个FDA批准的适配体治疗药物，其类药物行为依赖于集成的修饰堆栈而非天然序列本身。更广泛地说，现实世界的转化设计经常采用多种互补的稳定性修饰，反映了一个实际原则：强健的耐核酸酶性通常需要针对外源和内源核酸酶途径的组合保护，同时保持结合的结构决定因素。为了将这些转化示例与上述机制基础联系起来，表1总结了已批准和有代表性的临床阶段适配体治疗药物以及每个构建体中使用的主要稳定性修饰堆栈。 3. 增强适配体耐核酸酶性的稳定性修饰策略 基于第2节讨论的有限适配体生物稳定性的核酸酶驱动机制，本节总结了适配体稳定性修饰策略，这些策略在保持结合 competent 折叠的同时增强抗降解能力。研究人员专注于两个互补的设计层：（i）内在化学修饰和末端保护，直接降低核酸酶敏感性；（ii）构建体水平的工程——如末端偶联、环化、手性反转和多价组装——主要通过空间位阻屏蔽和构象约束来提高稳定性。因为这些干预措施也会影响折叠、结合动力学和可开发性，实际目标是组装一个兼容的修饰堆栈，在不损害靶标识别的情况下最大化生物环境中的功能持久性。 3.1 末端稳定性修饰和末端偶联 末端稳定性修饰主要通过掩盖游离的3'/5'末端来保护适配体免受外切核酸酶介导的修剪，通过小的端帽或通过末端偶联在末端产生空间位阻。 3.1.1 生物素修饰 用生物素（维生素B7）修饰3'末端是一种广泛使用的策略。在这种策略下，生物素提供对抗适配体核酸酶活性的空间保护，并促进适配体的亲和纯化和检测。3'-生物素赋予稳定性的主要机制是空间位阻效应。血清3'-外切核酸酶如蛇毒磷酸二酯酶需要与游离的3'-羟基形成特定的立体化学匹配才能启动水解反应。通过柔性接头（如三甘醇）连接的生物素基团将破坏这种酶-底物界面。3'-生物素的防护作用在体外实验中显著。Shum等人开发了针对SARS冠状病毒解旋酶的非G-四链体DNA适配体（NG8），并对其3'-生物素修饰进行了研究。结果显示，3'-生物素修饰可以增强其抗3'-外切核酸酶的稳定性，并保持修饰前的特异性和解旋酶抑制活性。与未修饰的变体相比，3'-生物素修饰使NG8在5%和10%胎牛血清中分别保持稳定31小时和16小时，而未修饰的适配体仅持续16小时和6小时，持续时间翻倍。链霉亲和素由于其与生物素的非共价相互作用具有极高的亲和力和稳定性，因此被用来增强3'-生物素修饰适配体的空间位阻效应。同时，分子量的增加也可以有效降低肾脏清除率。Dougan等人为两种针对人α-凝血酶的DNA适配体分别开发了3'-生物素和3'-生物素-链霉亲和素修饰方法，并在体外和不同动物模型（小鼠和兔子）中进行了验证。3'-生物素-链霉亲和素不仅在体外显示出良好的抗血液核酸酶活性，而且大大降低了其在体内的降解效率。与未进行生物素-链霉亲和素修饰的适配体相比，降解效率降低了10到20倍。同时，它们对凝血酶的亲和力得以保留。 3.1.2 3'–3'连接修饰 3'–3'连接也可以称为倒置脱氧胸苷（idT）修饰。IdT修饰涉及在寡核苷酸的3'端添加一个倒置的胸苷帽，防止3'-OH基团的暴露，从而保护适配体末端不被外切核酸酶消化。IdT是目前最常见的修饰，这种修饰常用于上市适配体药物Macugen和临床阶段的适配体候选药物中。因此，idT修饰在适配体药物的转化中是不可或缺的。这种方法最初由Shaw等人报道，应用于11-mer寡核苷酸序列的修饰，显著提高了其在血清中的稳定性。该方法使用修饰的控制孔玻璃（CPG）载体。初始3'端核苷的5'-羟基连接到固体载体上。下一个核苷亚磷酰胺将与暴露的3'-羟基偶联，启动经典的3'→5'链延伸反应，并以3'–3'连接的方式终止适配体的“尾部”。Ortigao等人随后将这种3'-倒置核苷酸策略扩展到反义寡核苷酸（ASO），证明了在人血清中稳定性的改善。一致地，Dass等人将idT封端应用于33-mer DNAzyme，观察到血清稳定性显着增强，半衰期从未修饰构建体的70分钟增加到22小时。它还增强了DNAzyme进入细胞的能力。与单一3'-生物素修饰的适配体NG8相比，单一idT修饰的NG8显示出更强的抗外切核酸酶能力。 3.1.3 修饰核苷封端修饰 修饰核苷通常在SELEX之前通过化学合成掺入寡核苷酸序列中以赋予抗内切核酸酶切割的能力。然而最近，3'末端的SELEX后修饰已成为特异性防止3'→5'外切核酸酶降解的强大策略。Kasahara等人系统评估了几种桥接核苷酸（BNA）类似物，包括锁核酸（LNA）和苯基取代的BNA（具有2'-CH(Ph)OCH2–4'桥），对凝血酶结合适配体TBA1的酶稳定性的影响。在强效3'外切核酸酶蛇毒磷酸二酯酶（VPD）中，LNA封端使TBA1的稳定性比未修饰对照增加了3.6倍；这种改善在人血清中也得到证实，稳定性增加了1.5倍。苯基取代的BNA封端提供了更强的保护，在VPD和人血清中的稳定性分别比未修饰的TBA1增加了27倍和3.3倍。这种增强的保护可能是由于苯基体积较大引起的空间位阻，但这种增加的立体化学位阻也影响了末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的酶连接，需要更高的合成要求。值得注意的是，这些BNA修饰的引入不影响适配体与其靶标的结合亲和力。最近，Wen等人报道了一种新型修饰核苷eTNA，它结合了倒置dT和TNA的结构特征。在eTNA中，3'-氧直接与磷酸骨架相连，而糖构型反转，形成一种构象受限的反向胸苷帽。当应用于DNA适配体时，eTNA封端提供了卓越的生物稳定性：在VPD中72小时内未检测到降解，而未修饰的适配体在几分钟内完全降解；在50%人血清中，适配体的半衰期从27.6分钟延长至24.2小时。重要的是，在相同条件下，eTNA优于idT，稳定性增加了2.3倍——表明其作为下一代3'-保护基的优越性。 3.1.4 聚乙二醇化（PEG）修饰 PEG修饰通常被认为是限制寡核苷酸肾脏滤过率的常见策略。因为它显着增加了寡核苷酸分子的分子量，这种修饰通常发生在5'-端。在血清稳定性方面，PEG也被认为对适配体具有抗外切核酸酶的保护作用。高分子量PEG链创造了水合的、空间拥挤的物理屏障，热力学上排除核酸酶接近易感的磷酸二酯骨架，从而抵抗来自5'-端的外切核酸酶降解。Hoffmann等人首次将单个线性PEG偶联到氨基修饰的手性反转RNA适配体NOX-E36，并验证了其更好的耐核酸酶活性。Haruta等人开发了一种新的双分支聚乙二醇化方法，称为对称分支2-氰乙基-N,N-二异丙基磷酰胺PEG化（sbC-PEGylation）。该方法应用于靶向IL-17A抑制剂的RNA适配体17M-382和17M-200-S1的5'末端。小鼠的药代动力学研究表明，与未修饰的适配体和仅经双分支PEG偶联修饰的适配体相比，sbC-PEG化的聚合物在小鼠和猴子的血液循环中表现出更好的稳定性。这可能是由于引入的sbC片段诱导了更显着的空间位阻，抑制了核酸酶降解。最近，Zhang团队报道了一种包含高度分支PEG修饰的聚丝氨醇磷酸二酯（PSP）聚合物辅助压缩（pac）适配体。它是一种以PEG链为主干的刷型聚合物。DNA适配体HD1经PSP pac修饰后在小鼠体内的药代动力学显示，PSP pac HD1在血液中的持续时间显着长于游离HD1。总体内药物暴露量（AUC0→∞）的差异为16倍，并且避免了传统线性PEG修饰引起的免疫原性。这种修饰方法在保证安全性的同时提高了适配体药物的性能。 3.1.5 脂质修饰 胆固醇偶联是研究最广泛的基于脂质的适配体稳定性修饰之一。其主要价值在于提高耐核酸酶性：胆固醇部分与人血浆中分离的低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）相关联，产生空间屏蔽，减少了核酸酶接近，特别是在易感的末端，从而减缓了外切核酸酶驱动的修剪。作为一个实际结果，增强的耐核酸酶保护通常反映在生物基质中持久性的改善，并且在许多情况下伴随着体内循环半衰期的延长。Smidt等人首次证明胆固醇修饰的寡核苷酸锚定到人血浆分离的LDL和HDL表面。与未偶联形式相比，胆固醇偶联导致大鼠血浆半衰期增加了约10倍，并且修饰后的寡核苷酸在大鼠血清中也表现出延迟降解。Aliyu等人进一步使用三甘醇（TEG）接头（COL-TEG）实施了胆固醇策略，将其连接到靶向血红素的DNA适配体OKA_24的3'端和OKA_26的5'端。两种胆固醇-TEG偶联物在保持并结合性能改善的同时，在血清中显示出改善的耐核酸酶性。除了胆固醇，二酰甘油（DAG）也被探索作为一种基于脂质的稳定性修饰，但它通常需要外源性脂质稳定系统。在该设计中，DAG作为膜锚，将适配体插入脂质体双层中，这在物理上屏蔽了寡核苷酸免受核酸酶攻击。Willis等人通过超声处理将DAG-NX213纳入脂质体，应用于靶向VEGF的RNA适配体NX213。在RNase T1挑战下，大约三分之一的脂质体相关DAG-NX213保持受保护，而游离DAG-NX213被完全切割。在体内，这种耐核酸酶屏蔽转化为改善的持久性：DAG-NX213显示出比裸NX213更长的半衰期，并且脂质体包裹进一步降低了游离DAG-NX213的血浆清除率。 3.1.6 半乳糖基化修饰 糖基化修饰寡核苷酸的策略代表了当前主动组织靶向治疗的前沿研究。其中，偶联有三价N-乙酰半乳糖胺（Tri-GalNAc）结构的siRNA、ASO和适配体等药物已被证明可以以高亲和力特异性靶向肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）。这种靶向糖基化修饰已应用于上市药物。同时，在这些成功的药物递送中，还发现碳水化合物的引入可以提高寡核苷酸抗核酸酶的稳定性。Tan的团队开发了一种新颖的糖基化策略，设计并合成了四种糖核酸模块。通过Sonogashira交叉偶联反应，将糖苷部分连接到适配体不同位置的尿嘧啶环上，形成了糖核酸适配体（GNAA）。该策略应用于靶向PTK7蛋白的DNA适配体Sgc8，并在体内外评估了其稳定性。结果显示，在3'和5'端进行糖基化修饰可以显着提高DNA适配体的血清稳定性，同时保持其结构和高亲和力。其中，GalNAc的末端修饰显示出比未修饰的Sgc8高14倍的稳定性，在四种修饰中表现最佳。小鼠体内代谢效应和肿瘤靶向能力的检测证实，其活性和安全性未受糖基化策略干扰。在作用机制方面，分子动力学模拟揭示了3'修饰GalNAc的Sgc适配体与外切核酸酶I（EXO1）之间的相互作用机制。在这种修饰下，Sgc适配体与EXO1残基的碱基相互作用数量从未修饰Sgc适配体的6个减少到3个。末端糖基化结构降低了适配体3'端与外切核酸酶I活性位点之间的结合能，降低了适配体与核酸酶的结合亲和力，增强了适配体抗酶降解的能力。作为一种简单、经济高效的新策略，GNAA有潜力被引入更多的适配体和核酸药物中。 3.2 糖环修饰 糖环修饰是适配体工程中增强其抗核酸酶能力、提高热稳定性和改善整体药代动力学特性的关键方法。这些改变靶向核糖部分，通常赋予结构刚性或灵活性，优化生物环境中的结合亲和力和耐久性。 3.2.1 2'-F、2'-NH2和2'-OMe修饰 核糖2'位的修饰——最常见的是2'-氟（2'-F）、2'-氨基（2'-NH2）和2'-O-甲基（2'-OMe）——是增强抗核酸酶介导降解的最广泛使用的适配体稳定性修饰。从机制上讲，这些取代取代了天然的2'-羟基，这是许多RNase识别和利用的关键结构特征，从而减少有效的酶-底物相互作用并减缓骨架切割。作为一个实际好处，改善的耐核酸酶性增加了生物基质中的功能持久性，并且通常伴随着更长的表观血清半衰期。在这些化学修饰中，2'-F取代经常用于加强耐核酸酶性，并且当适当定位时，还可以稳定某些结构基序（包括G-四链体）。在报道的凝血酶适配体中，2'-F的掺入与胎牛血清中降解抗性的增强有关，在某些情况下还显示出改善的结合性能。同样，2'-NH2取代据报道可显着改善针对人中性粒细胞弹性蛋白酶和血管内皮生长因子的适配体的血清稳定性，这与2'化学在抑制核酸酶敏感性中的作用一致。2'-OMe修饰对于SELEX后优化特别有吸引力，因为它可以在保持结合性能的同时显着提高耐核酸酶性，并且通常与2'-F结合在临床优化的设计中（例如抗VEGF适配体）。值得注意的是，不同的2'化学可能在免疫谱上有所不同；例如，在某些背景下，2'-F报告有较高的先天免疫激活风险，而2'-OMe通常被认为免疫学上更沉默。 3.2.2 4'-硫代修饰 4'-硫代修饰涉及将糖环中的4'-氧替换为硫，显着增强对RNase的抗性而不损害结合特异性。这种改变已应用于使用4'-硫代UTP和4'-硫代CTP的体外筛选过程，产生了具有优越稳定性的硫代RNA适配体。一个显著的例子是4'-硫代修饰的抗凝血酶适配体，与未修饰的RNA相比，其对RNase A的抗性增加了50倍，同时具有高亲和力结合（Kd= 4.7 nM）。优化的筛选进一步将亲和力提高到7.2 nM，证明了该修饰在生成针对凝血酶等治疗靶标的生物稳定适配体方面的效用。 3.2.3 锁核酸（LNA） 锁核酸（LNA）在2'-氧和4'-碳原子之间引入亚甲基桥，将核糖限制在3'-内构象，从而提高热稳定性和抗降解性。这种刚性结构增加了双链熔解温度（Tm）和耐核酸酶性，使LNA成为适配体治疗的理想选择。在使用突变T7 RNA聚合酶的筛选中，LNA-T和LNA-A的掺入（通常与2'-F嘧啶结合）产生了靶向流感血凝素和人CD40配体的适配体，具有低纳摩尔亲和力，并且在37°C下于25%人血清中放置4天后降解极少（<20%）。然而，高LNA含量是序列依赖性的，环中的修饰可能对稳定性贡献较小。LNA在某些情况下还存在肝毒性风险。 3.2.4 解锁核酸（UNA） 解锁核酸（UNA）破坏了核糖环中的C2'–C3'键，引入了无环灵活性，促进了构象调整并促进了诱导契合结合机制。这种修饰降低了双链热稳定性，但增强了适配体的适应性，改善了某些靶标的亲和力。在31-核苷酸抗凝血酶DNA适配体（RE31）中，在T15位置掺入UNA-C产生的Kd值为0.43 nM，显着优于未修饰的1.34 nM，UNA-A、UNA-U和UNA-G变体也有类似的增益（0.68–0.76 nM）。因此，UNA可作为微调含G-四链体适配体稳定性和结合的工具，尽管它可能破坏某些结构中的三联体形成。 3.2.5 苏糖核酸（TNA） 苏糖核酸（TNA）具有简化的四碳糖（苏糖），其中磷酸骨架直接连接到3'碳，赋予比DNA或RNA更强的抗酶消化能力。这种修饰支持沃森-克里克碱基配对，同时提高生物稳定性，使TNA适用于适配体嵌合体。酶抗性测定显示TNA探针抵抗困扰DNA对应物的降解，避免了检测应用中的假阳性信号。通过聚合酶在DNA寡核苷酸的3'末端延伸TNA产生嵌合体，这些嵌合体高度抗外切核酸酶I，其中tGTP延伸产物显示出可变但改善的耐久性。此外，TNA比RNA表现出更大的酸稳定性，在酸性条件下具有较慢的脱嘌呤速率。 3.2.6 阿拉伯糖核酸（ANA）和2'-F-ANA（FANA） 阿拉伯糖核酸（ANA）及其2'-氟衍生物（FANA）是具有2'取代基处于“向上”（阿拉伯糖）构型的立体异构体，不同于天然的“向下”（核糖）形式。这些修饰增强了耐核酸酶性和热稳定性，同时在与RNA杂交时能够激活RNase H，这对于基因沉默疗法很有价值。ANA/RNA杂交体作为RNase H的底物，促进靶标切割。FANA特别能与RNA强力杂交，诱导RNase H介导的降解，并显示出高血清稳定性；硫代磷酸酯FANA常用于反义寡核苷酸。FANA适配体靶向HIV-1整合酶和逆转录酶，表现出低纳摩尔亲和力和构象刚性，应用于抑制病毒活性。 3.3 磷酸二酯键修饰 磷酸二酯键修饰是一类主要的适配体稳定性修饰，通过改变磷酸骨架来增强耐核酸酶性，通常通过取代非桥接氧原子或用耐核酸酶的正交替代物替换天然连接。通过减少核酸酶的识别和切割，这些骨架变化改善了生物稳定性，并可以间接支持生物基质中更长的功能持久性。代表性方法包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯取代，以及通过点击化学引入的全连接替换，如三唑骨架，可在筛选期间或作为SELEX后优化实施。 3.3.1 甲基膦酸酯 甲基膦酸酯（MP）修饰将磷酸基团中的一个非桥接氧原子替换为甲基取代基，从而改变骨架化学，从而降低核酸酶的识别和切割。因此，MP连接通常用于增强抗核酸酶介导的降解，特别是针对外切核酸酶驱动的修剪。在实际系统中，改善的耐核酸酶性通常反映在血清中持久性的增加；例如，