RT-110 (Rani Therapeutics)

本文要点 目前没有任何抗骨质疏松药物RCT将跌倒作为主要预设终点。所有跌倒数据均来自不良事件报告或事后分析，证据层级均低于药物骨折终点数据。读这些数据需要先清楚这个前提。 地舒单抗（5项RCT汇总，10,036例）和罗莫索珠单抗（6项RCT荟萃分析，7,990例）均有统计显著的跌倒降低信号：地舒单抗HR 0.79，罗莫索珠单抗RR 0.80。信号一致，但来源均是事后分析或不良事件数据，尚无法用于驱动临床选药。 特立帕肽在骨折后功能恢复研究中显示TUG时间改善，在T2DM患者中的探索性分析显示跌倒风险评分改善。VERO试验中严重跌倒事件无显著差异。机制上PTH1R在肌肉卫星细胞中有表达，间歇性PTH在动物模型中改善肌肉功能，但人体跌倒终点数据不足。 唑来膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸：目前没有跌倒终点数据，既不支持降低也不支持升高跌倒风险。 指南层面，AACE/ACE将"高跌倒风险或跌倒致伤史"列为极高骨折风险标准之一，推荐优先使用合成代谢药物——但这是通过影响骨折风险分层来影响选药，不是因为某种药物本身能防跌倒。跌倒维度影响的是"用什么强度的药"，而不是"在同等强度里选哪种药"。一个从来没被系统回答过的问题 骨质疏松门诊的选药逻辑，通常沿着一条固定的轨道走：骨密度T值多少，FRAX概率多少，有没有既往骨折，有没有禁忌症，然后做决定。 在这条轨道上，跌倒风险的位置是模糊的。作为骨折风险的修正因素它存在，但它有没有资格直接影响药物选择——换句话说，有没有哪种抗骨质疏松药物在降低骨折风险之外，还能额外降低跌倒风险——这个问题从来没有被系统回答过。 不是因为不重要，而是因为证据的形态让这个问题很难被干净地回答。证据的结构性缺陷 在理解各类药物的跌倒数据之前，有一件事需要先说清楚。 所有抗骨质疏松药物RCT的主要预设终点是骨折，没有例外。跌倒数据在这些试验里的处理方式有两种：一是作为不良事件被动采集，二是在骨折试验完成后做事后探索性分析。 这两种来源都有根本性的局限。不良事件报告依赖受试者主动告知研究者，漏报率高、报告偏倚不可控；事后分析面对多重比较校正不足、选择性报告的问题；不同试验对跌倒的定义和采集方式不一致，汇总分析的异质性难以消除。Chotiyarnwong等2020年地舒单抗汇总分析的作者自己也明确指出：这些结果需要在以肌肉功能或跌倒为主要终点的研究中进一步确认。 这不是挑剔细节，而是理解接下来所有数据的前提。方向性信号有价值，但当前证据层级不支持在两种药物骨折预防效果相当的情况下，因为跌倒数据而做出选药决策。双膦酸盐：跌倒数据几乎缺位 阿仑膦酸和利塞膦酸是目前使用最广泛的一线抗骨质疏松药物，但它们的大型注册RCT（FIT、VERT等）未系统采集跌倒数据。在现有文献中，没有任何针对这两类药物的跌倒终点分析。 唑来膦酸是唯一有零星跌倒数据的双膦酸盐。HORIZON-RFT（2,127例髋部骨折后患者）的不良事件报告显示，安慰剂组跌倒报告率11.4%，唑来膦酸组9.7%，数值上有利于唑来膦酸，但这是不良事件记录而非预设终点，差异未做统计检验。Greenspan等2015年在181例衰弱长期护理机构老年女性中进行的RCT则出现了相反的信号：治疗组多次跌倒者比例更高（49% vs 35%），但校正基线衰弱程度后差异消失——说明这个信号很可能来自基线不平衡，不是药物效应。 从作用机制看，双膦酸盐的靶点是破骨细胞，通过抑制骨吸收保护骨量。与肌肉功能、神经肌肉协调或平衡系统之间没有直接的生物学联系。目前没有任何理由期待双膦酸盐降低跌倒风险，也没有证据说它会升高跌倒风险。这是空白，不是结论。地舒单抗：信号一致，机制有趣，证据层级仍低 地舒单抗的跌倒数据是目前所有抗骨质疏松药物中样本量最大的。Chotiyarnwong等2020年汇总了5项安慰剂对照RCT（共10,036例），包括FREEDOM试验及其他试验。结果：地舒单抗组跌倒发生率5.2%，安慰剂组6.5%，HR 0.79（95%CI 0.66-0.93，P=0.006），统计显著。 这个信号有多可靠？结合机制来看，比双膦酸盐的空白数据更有生物学依据。Bonnet等2019年在《临床研究杂志》（JCI）发表的研究提供了迄今最直接的机制数据：在RANKL过表达的小鼠中，肌肉质量和力量同步下降；OPG（内源性RANKL抑制剂）和地舒单抗均可逆转这一表型。机制涉及RANKL抑制后肌肉胰岛素敏感性改善、葡萄糖摄取增加，以及肌肉组织中肌肉抑制素（myostatin）和炎症基因表达下调。在同一项研究的人体数据中，地舒单抗3年治疗改善了四肢瘦体重和握力，而双膦酸盐未观察到类似效应。 这是骨骼肌中RANKL轴参与肌骨串扰的直接证据，发表在高质量期刊，设计严谨。 但2025年的一项RCT（201例长期护理机构老年人）泼了冷水：地舒单抗未能显著改善任何肌肉健康指标，包括四肢肌量、握力、椅子站立、步速和SPPB评分。这个阴性结果与JCI的阳性结果直接矛盾，提示地舒单抗的肌肉效应可能受到人群特征或给药背景的影响，而非普遍存在。 地舒单抗的跌倒数据目前的定位：大样本事后分析信号方向一致（HR 0.79），机制假说有动物和部分人体数据支持，但2025年RCT阴性。不能作为选药的主要依据，但如果患者同时因其他原因适合使用地舒单抗（骨折风险极高、肾功能受损等），这个潜在的附加获益可以作为参考信息告知患者。特立帕肽：功能恢复证据最有说服力，直接跌倒终点仍不足 特立帕肽的情况与地舒单抗不同。它的跌倒相关证据不来自大规模事后分析，而来自功能终点测量——特别是在骨折后患者中的TUG测试数据。这个证据形态在逻辑上更接近"改善神经肌肉功能"，而不只是跌倒事件的被动计数。 VERO试验（1,360例严重骨质疏松女性，特立帕肽 vs 利塞膦酸）中，严重跌倒事件作为安全性指标被报告：特立帕肽2.2% vs 利塞膦酸2.8%，差异无统计显著性（P=0.60）。这个结果没有提供支持，但也不是阴性——样本量不足以检测跌倒的组间差异，这个比较本来就没有统计把握度。 功能恢复数据来自骨折后的RCT，这里的证据质量相对更高。Malouf-Sierra等2017年在224例转子间骨折后患者中比较特立帕肽与利塞膦酸，TUG测试在6、12、18和26周均显著快于利塞膦酸组（差异-3.2至-5.9秒，P=0.045），同期髋部疼痛评分也更低。TUG改善5秒以上，在第一篇系列文章里已经说过，这不是小数字——TUG≥12秒的患者MOF风险是正常者的2.4倍，5秒的差异在功能临界区附近意味着实质性的风险变化。Nieves等2022年在35例骨盆骨折后患者中的2期RCT也显示特立帕肽组功能评分和TUG在2-3个月时显著优于安慰剂。 机制层面的依据同样值得一提。PTH1型受体（PTH1R）在骨骼肌中有表达，尤其在肌肉卫星细胞中高表达。动物实验显示，间歇性PTH给药（与特立帕肽的给药方式一致）在卵巢切除小鼠中消除了雌激素缺失导致的握力下降和运动能力减弱，通过Wnt/β-catenin通路调节肌母细胞增殖和分化。持续过量PTH（如原发性甲旁亢）反而损害肌肉——这个对照恰好支持间歇性给药的特殊性，与特立帕肽的临床使用逻辑一致。 需要说清楚的是，Prasad等2025年的T2DM专项研究（129例绝经后T2DM女性）的探索性分析显示唑来膦酸、地舒单抗和特立帕肽三种药物均显著改善了跌倒风险评分（FRAS），对照组无改善——这个结果说明抗骨质疏松治疗整体上可能改善跌倒相关指标，但三药之间无直接比较，不能用于区分哪种更优。 特立帕肽的跌倒相关证据目前的定位：骨折后功能恢复的RCT数据是最有说服力的部分，机制假说有合理的生物学基础。AACE/ACE 2020年指南将高跌倒风险列为极高骨折风险标准之一，推荐此类患者优先使用合成代谢药物（特立帕肽、罗莫索珠单抗）——但这里的逻辑是跌倒史推高了骨折风险分层，从而触发了合成代谢药物的适应症，而不是因为特立帕肽能防跌倒所以选它。两个推理路径的终点相同，但依据不同，临床医生需要清楚其中的区别。罗莫索珠单抗：汇总信号最强，机制最不清楚 在现有数据里，罗莫索珠单抗的跌倒信号在统计上是所有药物中最一致的。Singh等2022年的系统综述和荟萃分析（10项RCT，11,869例）显示跌倒发生率降低OR 0.87（95%CI 0.78-0.96）；Kobayashi等2024年的荟萃分析（6项安慰剂对照试验，7,990例）显示RR 0.80（95%CI 0.68-0.93）。两项独立荟萃分析结论一致，样本量也不小。 但这个信号的机制解释是空白。 Wnt信号通路在骨骼肌中的基础研究是存在的：Wnt/β-catenin信号调节肌母细胞增殖、融合和肌纤维稳态；Wnt7a-Fzd7信号通过Akt/mTOR通路直接诱导肌纤维肥大；运动诱导的Wnt激活在成年和老年小鼠中均激活卫星细胞。但罗莫索珠单抗的靶点是硬化蛋白（sclerostin），通过抑制硬化蛋白来激活Wnt通路促进骨形成——这条通路是否延伸至肌肉组织，目前没有直接的临床证据。 罗莫索珠单抗跌倒降低的更可能解释，是它通过快速改善骨骼结构和力学强度，间接减少了原本因轻微创伤触发的骨折相关功能丧失和制动，从而降低了后续跌倒的累积风险——而非对肌肉的直接效应。第三篇系列文章里的韩国真实世界研究（50例，12个月罗莫索珠单抗治疗）已经显示SMI无显著变化，支持这一判断。 罗莫索珠单抗在使用时还需要注意其心血管安全性黑框警告（心肌梗死或卒中后1年内禁用）。高跌倒风险患者通常年龄较大、合并症较多，心血管疾病的基础患病率更高，这个禁忌在这一人群中需要系统性筛查。 罗莫索珠单抗的跌倒数据定位：荟萃分析信号一致，样本量较充分，但数据来源仍是不良事件汇总分析；机制不明，目前无直接肌肉效应证据。使用罗莫索珠单抗的指征来自骨折风险分层，跌倒信号可以作为参考信息，不能作为选药依据。活性维生素D：证据争议参见本系列前文 活性维生素D（骨化三醇、阿法骨化醇）的跌倒预防证据在本系列第二篇已完整梳理：少量小型RCT显示跌倒风险降低约19-22%，方向阳性，但证据量（3项RCT，不到800例）远低于普通维生素D补充的数百项研究；标准剂量普通维生素D补充在低偏倚风险研究中跌倒预防效果消失；高剂量无效甚至有害。 在与抗骨质疏松药物联用的背景下，活性维生素D的角色主要是CKD相关钙磷代谢管理和甲旁亢的二线治疗，其跌倒预防效果如果存在，更可能是这类患者的附带获益，不建议作为主要适应症单独开具。证据分层总结 药物 跌倒效应数据 数据来源 证据层级 临床参考价值 唑来膦酸 数值略低（9.7% vs 11.4%），无统计检验 不良事件报告 极低 不考虑跌倒维度 阿仑膦酸/利塞膦酸 无数据 — 无 不考虑跌倒维度 地舒单抗 HR 0.79（P=0.006），5项RCT，10,036例 事后分析 低 方向阳性，机制有支持，不驱动选药 特立帕肽 TUG改善-3.2至-5.9秒（骨折后RCT） 次要/探索性终点 低-中 高跌倒风险+合成代谢适应症时可参考 罗莫索珠单抗 RR 0.80（两项荟萃分析一致） 荟萃分析（不良事件） 低 信号一致，机制不明，注意CV禁忌 活性维生素D 降低19-22%（3项小RCT） 预设终点，但样本极小 低 不作为主要适应症开具跌倒维度如何进入选药逻辑 这是这篇文章最想说清楚的一点。 对所有骨质疏松患者，选药的首要框架仍是骨折风险分层：T值、FRAX概率、既往骨折史、跌倒史、合并症和药物禁忌。这个框架在跌倒数据出现之前就已经成立，在跌倒数据出现之后，框架本身没有改变。 跌倒史在AACE/ACE指南中的角色，是把患者推入"极高骨折风险"的分层——一次跌倒致伤史足以触发这一分层，从而推荐使用合成代谢药物。这是跌倒维度影响选药的正确路径：它影响的是风险分层，风险分层影响的是治疗强度和药物类别，而不是在同等强度的药物之间做选择。 在这个框架之内，跌倒相关的附加证据（地舒单抗HR 0.79，罗莫索珠单抗RR 0.80，特立帕肽TUG改善）可以用来做什么？ 可以用来在骨折风险相近、多种药物均适用的情况下，作为决策参考信息之一告知患者——但需要同时告知这些数据的证据层级和局限性。不应该用来作为在两种骨折预防效果相当的药物之间做选择的主要依据。 还有一件事需要重申：无论选哪种抗骨质疏松药物，跌倒预防的主体手段都是非药物干预——运动处方、FRIDs审查、家居改造评估、跌倒评估工具的定期使用。没有任何一种抗骨质疏松药物的跌倒证据强到可以替代这些手段，更不能替代第一篇里说的5分钟门诊评估流程。几个现实 特立帕肽在国内的费用是这篇文章绕不开的实际问题。多项中国成本效益分析显示，特立帕肽的增量成本效益比（ICER）远超中国常规支付意愿阈值，年药物费用约6-7万元；序贯治疗方案（特立帕肽2年+唑来膦酸3年）的ICER接近170万元/QALY，仅在费用大幅降低且患者年龄≥80岁时才接近成本效益阈值。这意味着即使特立帕肽的跌倒相关证据比现有数据更强，它的实际可及性在中国门诊中也是主要的约束条件。指南推荐和临床可行之间的这段距离，在讨论高跌倒风险患者的选药时需要被正视。 罗莫索珠单抗的心血管黑框警告在国内高龄骨质疏松患者群体中需要系统性筛查。中国骨质疏松患者的平均就诊年龄较大、合并心脑血管疾病的比例较高，心肌梗死或卒中后1年内禁忌的要求在这个人群里意味着使用前需要常规询问心血管事件史。 国内目前骨质疏松药物使用格局以双膦酸盐为主体，生物制剂覆盖有限。在双膦酸盐跌倒数据几乎缺位的背景下，这意味着大多数骨质疏松患者的跌倒管理责任，几乎完全落在非药物干预上。这不是坏事，因为非药物手段的跌倒预防证据本来就比任何药物都强——Cochrane综述支持的运动干预降低跌倒率23-42%，数据层级远高于任何抗骨质疏松药物的跌倒分析。写在最后 "这个药能不能防跌倒"——这个问题值得被认真对待，也值得被诚实回答。 诚实的答案是：有方向性信号，没有足够强的证据。地舒单抗和罗莫索珠单抗的汇总数据值得关注，特立帕肽的骨折后功能恢复数据有临床意义，双膦酸盐的跌倒数据是空白。但所有这些数据的证据层级，都不支持在当前临床决策中以跌倒维度来驱动选药。 这个领域需要的下一步是显而易见的：以跌倒或肌肉功能为主要预设终点的抗骨质疏松药物RCT。目前NCT06643780（地舒单抗 vs 唑来膦酸，osteosarcopenia，跌倒为次要终点）和ROLEX-DUO（罗莫索珠单抗+运动，肌肉功能为主要终点）正在进行，未来几年会有更清晰的答案。 在那之前，管理好跌倒风险最有效的手段，仍然是前三篇讲的那些事——评估、审查处方、训练肌肉。参考文献 Chotiyarnwong P, McCloskey E, Eastell R, et al. A pooled analysis of fall incidence from placebo-controlled trials of denosumab. J Bone Miner Res. 2020;35(6):1014-1021. Singh S, Dutta S, Khasbage S, et al. A systematic review and meta-analysis of efficacy and safety of romosozumab in postmenopausal osteoporosis. Osteoporos Int. 2022;33(1):1-12. Kobayashi T, Hara M, Shimanoe C, et al. Efficacy and safety of romosozumab: a meta-analysis of placebo-controlled trials. J Bone Miner Metab. 2024;42(5):492-502. Lyles KW, Colón-Emeric CS, Magaziner JS, et al. Zoledronic acid and clinical fractures and mortality after hip fracture. N Engl J Med. 2007;357(18):1799-1809. Greenspan SL, Perera S, Ferchak MA, Nace DA, Resnick NM. Efficacy and safety of single-dose zoledronic acid for osteoporosis in frail elderly women. JAMA Intern Med. 2015;175(6):913-921. Prasad TN, Flora SS, Bhadada SK, Yadav U, Pal R. Anti-resorptive and anabolic therapies improve falls risk assessment score (FRAS) in postmenopausal women with type 2 diabetes mellitus. Osteoporos Int. 2025. doi:10.1007/s00198-025-07599-7                                                                                                            . Kendler DL, Marin F, Zerbini CAF, et al. Effects of teriparatide and risedronate on new fractures in post-menopausal women with severe osteoporosis (VERO). Lancet. 2018;391(10117):230-240. Malouf-Sierra J, Tarantino U, García-Hernández PA, et al. Effect of teriparatide or risedronate in elderly patients with a recent pertrochanteric hip fracture. J Bone Miner Res. 2017;32(5):1040-1051. Nieves JW, Cosman F, McMahon D, et al. Teriparatide and pelvic fracture healing: a phase 2 randomized controlled trial. Osteoporos Int. 2022;33(1):239-250. Wong RMY, Wong PY, Liu C, et al. RANK-ligand inhibition to combat sarcopenia with underlying osteoporosis: a study protocol for a randomized, double-blind, double-dummy, active-controlled trial. Trials. 2025;26(1):269. El Miedany Y, Gaafary ME, Toth M, et al. Is there a potential dual effect of denosumab for treatment of osteoporosis and sarcopenia? Clin Rheumatol. 2021;40(10):4225-4232. Rupp T, von Vopelius E, Strahl A, et al. Beneficial effects of denosumab on muscle performance in patients with low BMD. Osteoporos Int. 2022;33(10):2177-2184. Haeri NS, Perera S, Greenspan SL. Impact of denosumab on muscle health in older adults in long-term care. Bone. 2025;198:117552. Bonnet N, Bourgoin L, Biver E, Douni E, Ferrari S. RANKL inhibition improves muscle strength and insulin sensitivity and restores bone mass. J Clin Invest. 2019;129(8):3214-3223. Sheng OC, Wu WT, Peng CH, et al. Therapeutic advantage of teriparatide in very elderly patients with proximal femoral fractures. BMC Musculoskelet Disord. 2024;25(1):288. Ureña P, Kong XF, Abou-Samra AB, et al. Parathyroid hormone (PTH)/PTH-related peptide receptor messenger ribonucleic acids are widely distributed in rat tissues. Endocrinology. 1993;133(2):617-623. Kimura S, Yoshioka K. Parathyroid hormone and parathyroid hormone type-1 receptor accelerate myocyte differentiation. Sci Rep. 2014;4:5066. Fujimaki T, Ando T, Hata T, et al. Exogenous parathyroid hormone attenuates ovariectomy-induced skeletal muscle weakness in vivo. Bone. 2021;151:116029. Romagnoli C, Brandi ML. Muscle physiopathology in parathyroid hormone disorders. Front Med. 2021;8:764346. Camacho PM, Petak SM, Binkley N, et al. American Association of Clinical Endocrinologists/American College of Endocrinology Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Treatment of Postmenopausal Osteoporosis—2020 Update. Endocr Pract. 2020;26(Suppl 1):1-46. Harris K, Zagar CA, Lawrence KV. Osteoporosis: common questions and answers. Am Fam Physician. 2023;107(3):238-246. You R, Mori T, Ke L, et al. Which injected antiosteoporotic medication is worth paying for? A cost-effectiveness analysis in China. Menopause. 2021;29(2):210-218. Li N, Zheng B, Liu M, et al. Cost-effectiveness of antiosteoporosis strategies for postmenopausal women with osteoporosis in China. Menopause. 2019;26(8):906-914. You R, Liu J, Ke L, et al. Cost-effectiveness of sequential teriparatide/zoledronic acid compared with zoledronic acid monotherapy for postmenopausal osteoporotic women in China. Front Public Health. 2022;10:794861.名词缩写表 缩写 全称 FRAS 跌倒风险评估评分（Falls Risk Assessment Score） FRAX 骨折风险评估工具（Fracture Risk Assessment Tool） ICER 增量成本效益比（Incremental Cost-Effectiveness Ratio） PTH 甲状旁腺激素（Parathyroid Hormone） PTH1R 甲状旁腺激素1型受体（Parathyroid Hormone Type 1 Receptor） QALY 质量调整生命年（Quality-Adjusted Life Year） RANKL 核因子κB受体激活蛋白配体（Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand） RCT 随机对照试验（Randomized Controlled Trial） TUG 起立行走测试（Timed Up and Go Test）

Acta Pharm Sin B. (IF=14.6)| “黑马”分子的诞生：5-甲氧基补骨脂素如何拨开骨松迷雾，重启骨骼再生信号 大家好，小编今天给大家要带来的是在Acta Pharmaceutica Sinica B上发表的High-efficient discovering the potent anti-Notum agents from herbal medicines for combating glucocorticoid-induced osteoporosis. [Acta Pharm Sin B. 2025 Aug;15(8):4174-4192.]一文。 Doi: 10.1016/j.apsb.2025.06.004                                     1、研究背景 糖皮质激素性骨质疏松是长期使用糖皮质激素（如地塞米松）导致的常见继发性骨病，其发病机制与成骨细胞凋亡及 Wnt 信号通路受抑密切相关。Notum 作为一种负向调控 Wnt 信号的关键羧酸酯酶，可通过水解 Wnt 蛋白的棕榈油酸链阻断信号转导，已被证实为 GIOP 的潜在治疗靶点。尽管部分中药在临床上对骨质疏松有确切疗效，但其活性成分及抗 Notum 机制尚不明确。因此，本研究旨在开发一种高效筛选体系，从常用中药中发掘强效 Notum 抑制剂，并深入探究其抗 GIOP 效应与分子机制。 2、研究方法 研究团队首先通过分子对接模拟，理性设计并合成了一种近红外荧光底物 DO（DDAO 辛酸酯），该底物可被 Notum 特异性水解并释放 660 nm 荧光信号，用于构建高通量生化筛选体系。利用该体系对 100 余种临床常用中药提取物进行抗 Notum 活性筛选。对活性最强的补骨脂进行 UHPLC Q Orbitrap HRMS 全成分解析，并结合分子对接虚拟筛选与细胞水平验证，锁定关键活性成分。随后通过酶动力学、定点突变、细胞成骨分化实验以及地塞米松诱导的骨质疏松小鼠模型，系统评估候选化合物的药效、安全性及作用机制。 3、研究结果 3.1 近红外荧光底物 DO 的理性设计与性能表征 研究团队基于 Notum 催化腔结构特征，设计并合成了七种 DDAO 脂肪酸酯类候选底物。分子对接显示，DDAO 辛酸酯（DO）的羰基碳与 Notum 催化残基 Ser232 距离小于 5 埃，预示其可被高效水解。实验验证表明，DO 在 Notum 作用下可快速释放强近红外荧光产物 DDAO，20 分钟内荧光信号增强 15.5 倍，且信号在 pH 7.02 至 11.75 范围内保持稳定。DO 水解遵循经典米氏动力学，Km 值为 0.19 μmol/L，Vmax 为 1.13 μmol/min/mg Notum。已知 Notum 抑制剂 ABC99 可剂量依赖性地抑制 DO 水解，证实该底物适用于抑制剂高通量筛选。 3.2 补骨脂提取物在中药筛选中展现出最强 Notum 抑制效应 利用 DO 底物构建的荧光生化筛选体系，研究团队对 100 种临床常用中药提取物进行了抗 Notum 活性检测。在单剂量 100 μg/mL 条件下，补骨脂提取物对 Notum 的抑制最为显著，残余酶活性仅为 1.66%。进一步测定显示，补骨脂提取物以剂量依赖方式抑制 Notum 活性，IC50 值为 6.98 μg/mL。抑制动力学分析表明，补骨脂提取物对 Notum 的抑制呈可逆竞争性特征，Ki 值为 4.28 μg/mL，提示其活性成分可能通过占据催化腔发挥作用。 3.3 基于高分辨质谱的补骨脂全成分谱分析 为全面揭示补骨脂中的化学成分组成，研究采用 UHPLC Q Orbitrap HRMS 技术在正负离子模式下对补骨脂提取物进行全局分析。通过比对标准品、文献数据及天然产物数据库，共鉴定出 83 个化学成分，涵盖香豆素类、黄酮类、二氢黄酮类、查尔酮类及多酚类等多种结构类型。该成分谱为后续虚拟筛选及活性成分锁定提供了全面的化学空间基础。 3.4 虚拟筛选与生化验证锁定补骨脂中关键抗 Notum 成分 分子对接模拟显示，补骨脂中 83 个化学成分与 Notum 催化腔的结合自由能存在显著差异，其中异补骨脂素、补骨脂素、香豆雌酚、5 甲氧基补骨脂素和 8 甲氧基补骨脂素五种成分的预测结合能均低于 -9.0 kcal/mol。DO 底物生化验证结果表明，上述五种成分均对 Notum 有抑制作用。其中三种呋喃香豆素类成分活性尤为突出，5 甲氧基补骨脂素 IC50 为 18.73 nmol/L，异补骨脂素为 72.67 nmol/L，补骨脂素为 107.60 nmol/L。以另一底物 OPTS 复测亦获得相近 IC50 值，确证其强效抑制活性。 3.5 5-甲氧基补骨脂素在体内展现出优越的安全性 鉴于抗骨质疏松药物需长期服用，研究对三种强活性呋喃香豆素进行了体内安全性比较。健康小鼠连续 14 天灌胃给予高剂量 200 mg/kg 化合物后，5 甲氧基补骨脂素组未见死亡，体重正常增长，血清 ALT、AST、CK、CREA 等脏器损伤标志物与对照组无显著差异，心、肝、脾、肺、肾病理切片均无异常发现。相反，补骨脂素与异补骨脂素组均出现体重下降、血清转氨酶升高及多器官组织学损伤，表现为心肌排列紊乱、肝细胞间隙增宽及炎细胞浸润等典型毒性改变。 3.6 5-甲氧基补骨脂素对 Notum 的抑制机制及促成骨分化效应 抑制动力学实验揭示，5 甲氧基补骨脂素以竞争性方式抑制 Notum 水解 DO 及 OPTS，Ki 值分别为 23.54 nmol/L 与 15.10 nmol/L。分子对接显示其紧密嵌入 Notum 催化腔，与 Trp128 和 Phe268 形成强 π-π 堆积及疏水相互作用。定点突变实验证实，Trp128 突变为甘氨酸后 Notum 几乎丧失水解活性，Phe268 突变则使 5 甲氧基补骨脂素抑制效力下降 67 倍。细胞层面，地塞米松处理显著降低 MC3T3 E1 细胞 ALP 活性与钙结节形成，而 5 甲氧基补骨脂素以剂量依赖方式逆转上述抑制效应，且其作用强度优于同剂量补骨脂素与异补骨脂素。 3.7 5-甲氧基补骨脂素激活成骨细胞 Wnt/β-catenin 信号通路 在 mRNA 水平上，地塞米松显著上调 MC3T3 E1 细胞中 Notum 与 GSK3β 表达，并下调 β-catenin、OPN 及 RUNX2 表达。5 甲氧基补骨脂素干预后，上述基因异常表达均被显著逆转。蛋白印迹实验进一步证实，地塞米松诱导的 Notum 与 GSK3β 蛋白高表达受到抑制，而活性 β-catenin、总 β-catenin、OPN 及 RUNX2 蛋白水平得以恢复。结果表明 5 甲氧基补骨脂素通过抑制 Notum 解除对 Wnt 信号的负调控，进而促进成骨分化相关转录程序。 3.8 5-甲氧基补骨脂素改善骨质疏松小鼠血清成骨标志物 在地塞米松诱导的骨质疏松小鼠模型中，5 甲氧基补骨脂素（20 和 40 mg/kg）灌胃治疗五周后，虽未完全逆转模型动物体重下降，但血清中四项骨形成标志物水平均显著回升。具体而言，模型组血清碱性磷酸酶、I 型胶原 C 端肽、骨钙素及骨保护素水平均较正常组显著降低，而 5 甲氧基补骨脂素与阳性对照药甲状旁腺激素均能有效提升上述指标，提示其在整体动物水平具备促进骨形成的药效学效应。 3.9 Micro-CT 分析证实 5-甲氧基补骨脂素改善骨微结构 股骨 Micro-CT 三维重建图像显示，地塞米松模型小鼠股骨远端与中段均呈现骨小梁稀疏、皮质骨变薄等典型骨质疏松改变。定量分析表明，5 甲氧基补骨脂素治疗组小鼠股骨远端及中段的骨小梁厚度、皮质骨厚度、骨体积分数及骨密度均较模型组显著增加。该结果直观地证明 5 甲氧基补骨脂素能够有效拮抗糖皮质激素所致的骨微结构破坏，维持骨骼力学承载能力。 3.10 骨组织病理学、动态骨形成及 Notum 表达定位 股骨远端 H&E 染色切片显示，模型组骨小梁明显减少变细，而 5 甲氧基补骨脂素治疗组骨小梁结构趋于正常。双标荧光动态观察表明，模型组新生骨形成近乎停滞，5 甲氧基补骨脂素组则可见清晰的双标线间距增宽，提示新骨沉积活跃。免疫荧光染色进一步揭示，地塞米松显著上调皮质骨与松质骨区域 Notum 蛋白表达，5 甲氧基补骨脂素治疗则使皮质骨中 Notum 荧光信号显著减弱，恢复至正常水平附近。以上组织学证据从多维度确认了 5 甲氧基补骨脂素对骨质疏松病理过程的体内干预效果。 4、研究讨论 讨论部分指出，Notum 是调控 Wnt 信号的关键药物靶点，而现有抑制剂大多活性有限或安全性不佳。本研究通过构建基于近红外荧光底物的高通量筛选平台，成功从补骨脂中发现多个天然呋喃香豆素类 Notum 抑制剂。值得注意的是，5 甲氧基补骨脂素因其代谢途径倾向于生成稳定无毒的羟基化产物，避免了呋喃环活化所致的肝毒性，这为其优良的安全性提供了合理解释。研究还提示，未来可通过结构优化或骨靶向递送系统进一步提升其治疗指数，并拓展其在肝再生等其他 Wnt 相关疾病中的应用前景。 5、研究结论 该研究成功构建了一种集生化、分析、计算与药理学于一体的高效筛选平台，用于从中药中快速发现天然 Notum 抑制剂。研究首次揭示补骨脂中的呋喃香豆素类成分——特别是 5 甲氧基补骨脂素——具有强效 Notum 抑制活性及优良的安全性。5 甲氧基补骨脂素通过竞争性抑制 Notum 活性，激活 Wnt/β catenin 信号通路，促进成骨分化，并在动物模型中显著改善糖皮质激素诱导的骨丢失。该工作不仅为抗 GIOP 药物研发提供了新的先导化合物，也验证了所建筛选体系在中药活性成分发现中的高效性与实用性。 6、研究亮点与意义 该研究的一大亮点在于理性设计并应用了首个针对 Notum 的近红外荧光底物 DO，有效克服了中药自身荧光背景干扰，实现了对复杂提取物的直接高通量筛选。另一亮点为系统整合多种技术手段，从百种中药中精准锁定活性成分，并首次阐明了补骨脂抗骨质疏松作用的 Notum 靶向机制。此外，研究通过详尽的体内外实验明确了 5 甲氧基补骨脂素相较于结构类似物的显著安全优势，为其临床转化提供了关键依据。 该研究为从中药宝库中高效发掘靶向 Notum 的抗骨质疏松药物提供了可复制的技术路径与成功范例。所发现的 5 甲氧基补骨脂素作为一种天然来源、安全有效的新型 Notum 抑制剂，有望成为治疗糖皮质激素性骨质疏松的候选药物。同时，研究深化了对补骨脂传统功效的科学理解，为中医药现代化研究与精准靶向药物开发树立了标杆。 编辑：原华清