GNR-084

T细胞双特异性抗体(T-BsAb)是一类新型的肿瘤免疫治疗药物，能同时与靶细胞上的肿瘤相关抗原和T细胞上TCR复合体的CD3亚单位结合。在过去的十年里，许多T-BsAb已经被开发出来用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤。其中，blinatumomab已成功用于治疗CD19阳性的恶性肿瘤，并已被FDA批准为急性淋巴细胞白血病(ALL)的标准治疗。2022年10月25日，FDA批准了强生BCMA/CD3双抗teclistamab上市，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤。这显示了T-BsAb在治疗癌症方面极具潜力。然而，目前在许多临床试验中，T-BsAb的疗效仍然不令人满意。为了进一步提高T-BsAb的治疗效果，更好地了解影响治疗效果的因素是至关重要的。本文我们就已确定的影响T-BsAb疗效的因素和提高T-BsAb疗效的新策略做一个简单介绍。影响T-BsAb疗效的因素免疫检查点分子和共刺激分子免疫检查点抑制剂在多种类型的癌症中显示出优异的临床疗效，是过去十年免疫治疗的重大突破。检查点分子，如PD-1和CTLA-4，可通过多种机制减弱T细胞活化，抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫，其在T-BsAb治疗中的作用也已被广泛研究。Aszlo等人报道称，在AMG330(CD33x CD3 BsAb)存在下，AML细胞系表达检查点分子(PD-L1和L2)会降低T细胞的杀伤活性。经BsAb治疗后，可以诱导PD-L1的表达，阻断PD-1/PDL-1可以增加AMG330介导的AML细胞杀伤。这种效果在E：T比较低的情况下最为突出。当E：T比为1：5时，阻断PD-L1可使AMG 330介导的杀伤增加14%，而当E：T比为1：1时，则不能观察到。因此，检查点阻断可能对肿瘤负荷高、T细胞数量低(体内E：T比率低)的患者特别有帮助。Meermeier等人采用同基因多发性骨髓瘤小鼠模型，在体内研究了BCMA x CD3 BsAb，发现IFN-γ上调了PD-L1等检查点配体，并在BCMA x CD3 BsAb治疗的第二周发现几乎所有肿瘤细胞上都有PD-L1的表达。与此同时，T细胞上的PD-1也增加，其他检查点分子如KLRG1和LAG3也有类似的趋势。这些结果表明，随着时间的推移，T细胞功能衰竭，BCMA x CD3 BsAb的反应减弱。在对blinatumomab治疗耐药的ALL患者中，发现白血病细胞PD-L1的表达增加。将blinatumomab与PD-1和CTLA-4抑制相结合的1b期临床试验的初步结果已经被报道。尽管病例数量有限，但在经过大量治疗的复发/难治性ALL患者中，达到80%的CR，与单药blinumomab治疗的40%-50%的CR率相比具有很大提高。T-BsAb绕过APC激活T细胞，在许多情况下，靶肿瘤细胞不表达共刺激分子。因此，T-BsAb诱导的T细胞反应的一个独特特征是缺乏共刺激。4-1BB是经典的共刺激分子。APVO603(CD123 BsAb)的临床前研究表明，补充4-1BB和OX40激动剂抗体可以显著提高体外对靶肿瘤细胞的杀伤作用。Chiu等人报道，在前列腺癌的小鼠同基因模型中，4-1BB激动剂可以提高PMSA x CD3 BsAb的抗肿瘤效果，特别是在肿瘤负荷较高的情况下。4-1BB激动剂可以促进T细胞的持续激活，从几个小时到几天。持续的T细胞激活也会促进细胞毒效应T细胞的增殖，但不会促进调节性T细胞的增殖。因此，在4-1BB刺激下，效应T细胞的数量、功能和CD8+/Treg比率都有所改善，这转化为显著增强的抗肿瘤效果。OX40可能是另一个显著影响T-BsAb治疗结果的关键共刺激分子，已被发现与4-1BB协同作用增强T细胞免疫。研究证明白血病细胞株中OX40L的表达水平与blinatumab的细胞毒作用呈正相关。T细胞的转运与瘤内T细胞的浸润基于T-BsAb的免疫治疗成功的一个关键是T细胞的存在，并且这些T细胞已经迁移到肿瘤部位。T细胞向肿瘤的运输依赖于肿瘤中趋化因子与T细胞上表达的趋化因子受体之间的相容性。临床研究证据表明，富含T细胞的肿瘤对检查点抑制剂的免疫治疗更有效果，而浸润性T细胞较少的肿瘤可能对这种治疗无效。因此，T细胞在肿瘤内的浸润状态可能是决定T-BsAb治疗结果的关键因素。Belmontes等人在多个小鼠同基因肿瘤模型中发现，瘤内T细胞浸润是预测T-BsAb治疗效果的关键因素。“冷” T细胞对T-BsAb反应较差，与PD-1抑制剂或4-1BB激动剂联合治疗可使T细胞局部显著增殖，使肿瘤成为免疫热点，克服对T-BsAb治疗的耐药性。IFN-γ也可以刺激肿瘤微环境中的细胞以分泌趋化因子，例如CXCL-9，-10和-11。这些趋化因子随后与CXCR3的相互作用，向肿瘤部位招募更多的T细胞。Tebentafusp临床试验的相关研究也证实通过CXCL10-CXCR3轴招募T细胞的重要性。Tebentafusp是一种双特异性融合蛋白，可将CD3+T细胞重定向至gp100(一种黑色素瘤相关抗原)细胞，已被批准用于治疗晚期葡萄膜黑色素瘤。当T-BsAb治疗血液瘤时，肿瘤内的T细胞浸润也被发现可以预测良好的临床结果。Odronextamab(CD3 X 20BsAb)已在临床试验中用于治疗复发/难治性B细胞性非霍奇金淋巴瘤患者。据报道，较高的肿瘤浸润性T细胞(TIL)与较好的ORR相关。对于另一种CD20单抗Glofitamab，临床相关性分析显示，在获得CR的患者中， CD8+TIL细胞的比例有升高的趋势。Mosunetuzumab，也是一种CD20 BsAb，临床试验同样发现， CD8+肿瘤浸润性T细胞在应答者中较高。Treg细胞和髓系抑制细胞(MDSC)Treg细胞在预防自身免疫性疾病和限制炎症过程的损害方面发挥着关键作用。然而，它们也限制了有益的免疫反应，是肿瘤细胞逃逸免疫系统攻击的主要机制之一。T-BsAb诱导所有T细胞亚群的全局激活。因此，Treg细胞的激活可能影响T-BsAb治疗的疗效。Treg细胞抑制免疫反应的一个主要机制是通过颗粒酶-穿孔素途径杀死免疫细胞，如APC细胞。然而有趣的是有研究发现，表达EGFRvIII的肿瘤细胞，EGFRvIII x CD3 BsAb可以有效地激活Treg细胞，能够杀伤表达EGFRvIII的肿瘤。因此T-BsAb治疗有可能绕过Treg介导的抑制，并将那些激活的、肿瘤浸润性Treg细胞转变为效应细胞，以杀死肿瘤细胞。在一项结合了功能研究和单细胞转录组分析的体外研究中，研究发现，与Treg细胞相比，激活的CD8T细胞和传统的CD4T细胞的频率越高，blinatomab介导细胞毒性则更强。其他几项使用同基因小鼠肿瘤模型的体内研究也表明，Treg细胞与CD4或CD8T细胞比率的降低与T-BsAb的卓越疗效有关。Treg细胞的频率也被发现与接受blinatumomab治疗患者的临床结果相关。对参加临床试验(MT103-206,211,311)的42名ALL患者进行回顾性相关性研究发现，所有对blinatumomab有反应的患者的Treg明显少于那些没有反应的患者。Blinatumomab能激活Tregs分泌高水平的IL-10，并对blinatumomab刺激的常规T细胞的增殖和细胞毒活性有很强的抑制作用。髓源性抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)也是主要的免疫抑制细胞类型。已发现它们通过产生免疫抑制因子，诱导Treg和检查点分子的表达，从而抑制T细胞向肿瘤的渗透，并诱导T细胞功能障碍。因此，这些髓系细胞类型也可以在抑制T-BsAb诱导的抗肿瘤免疫反应中发挥关键作用。有研究已经证明，去除MDSC或TAM增强了T-BsAb的抗肿瘤效果，其中TAM的去除是最有效的。肿瘤细胞对T细胞杀伤的内在抵抗肿瘤细胞逃避免疫攻击的另一个主要机制是对T细胞介导的细胞毒的内在抵抗。研究发现，IFN-γ信号影响肿瘤细胞对T-BsAb介导的杀伤的敏感性。将表达HER2的肿瘤细胞与HER2 x CD3 BsAb以及T细胞共同培养，然后选择在多轮T-BsAb杀伤中存活的肿瘤细胞。转录组分析显示，耐药肿瘤细胞在IFN-γ信号通路缺陷，JAK2的表达明显减少。在用Golimumab(CD20 X CD3 BsAb)治疗淋巴瘤患者的一项相关研究中，分析了预处理活检样本的基因表达和突变情况，以确定与治疗反应相关的生物标记物。研究发现，在未能达到完全缓解的患者中， MYC上调和TP53下调。T53突变状态也显示出与不良预后相关。这些基因突变会影响T细胞的募集并抑制T细胞的激活，从而对T-BsAb治疗产生抵抗。具有自噬、T细胞共刺激、细胞凋亡途径、染色质重塑和细胞因子信号转导功能的其他癌细胞固有基因也可以改变肿瘤细胞对BsAb介导的杀伤的反应性,尤其是受到BID、BCL2L1和CFLAR等参与细胞死亡和凋亡途径等基因改变的影响。抗原逃逸靶抗原表面表达缺失是肿瘤细胞逃逸T-BsAb免疫治疗的一个主要机制。研究发现，对于接受odronextamab (CD20 X CD3 BsAb)治疗的淋巴瘤患者，在治疗失败的患者中靶抗原CD20丢失的发生率很高。在疾病进展的患者中，11名患者中有9名患者在治疗后发现CD20表达缺失。肿瘤负荷、T细胞数量和E/T比值许多blinatumomab临床研究发现，肿瘤负荷是影响临床结果和治疗效果的关键因素。CD33xCD3 (AMG330)和CD123xCD3 (Vibecotamab) T-BsAb治疗的AML患者的临床结果发现，较低的肿瘤负荷，也预示着更好的临床效果。E：T比值，也是T-BsAb疗效的预测因素。例如，对于接受blinatumomab治疗的患者，发现在血液或骨髓中具有记忆/干细胞表型的T细胞的频率较高的患者具有更好的临床反应。提高T-BsAb治疗效果的策略检查点抑制剂和共刺激分子激动剂修饰signal 2检查点分子阻断作为癌症患者的独立免疫疗法已经取得了巨大的成功。BsAb诱导T细胞活化后，可诱导PD-1等检查点分子的表达，并被认为是主要的耐药机制之一。blinatumomab联合PD-1和/或CTLA-4阻断在复发/难治性ALL患者中耐受性良好，在参加I期试验的6名患者中取得了优异的CR 80%。因此已经有许多临床试验将检查点分子阻断与T-BsAb治疗相结合，主要用于治疗淋巴系统恶性肿瘤。T-BsAb本身并不为T细胞提供共刺激信号(signal 2)，靶细胞通常不表达或低水平表达共刺激分子。因此，通过共刺激分子激动剂产生的额外signal 2是增强T-BsAb疗效的是一种方法。然而，由于副作用和毒性，尤其是细胞因子释放综合征，是一个令人担忧的问题。众所周知，CD28激动剂会引起危险的细胞因子风暴。针对4-1BB的高亲和力激动剂已在多种实体肿瘤中显示出单剂临床疗效。然而，它伴随着致命的肝脏毒性的风险。为了减轻过度毒性，研究人员将重点放在了双特异性策略上。CD28和4-1BB的激动剂抗体已被构建成与靶(如CD20)结合臂一起的双特异性平台，用于靶向输送到肿瘤部位。这些共刺激BsAb与T-BsAb一起在临床前研究中进行了测试，并证明了增强的疗效和安全性。一些共刺激BsAb已进入临床试验，但大多数仍处于早期阶段。T-BsAb的优化设计另一种提高疗效和治疗窗口的方法是优化BsAbs的设计。T-BsAb通过将TCR复合体交联并在T细胞和靶细胞之间形成免疫突触来激活T细胞。随后，穿孔素和颗粒酶通过这个突触传递，从而导致靶细胞被杀死。这一过程可以受到多种因素的调节，包括结合臂长度、连接子设计和CD3与靶抗原结合位点之间的灵活性、对CD3和靶抗原的亲和力/价态等。其中一个因素是T-BsAb对CD3和靶抗原的亲和力。天然的免疫反应，T细胞识别低亲和力的抗原肽-MHC复合体(Kd值约为1-100 µM)。一般抗体对其同源抗原的亲和力通常要高得多，Kd在nM范围内。虽然T-BsAb与CD3和靶抗原的结合亲和力较高与T-BsAb的体外效力呈正相关，但这也伴随着T细胞产生的细胞因子的增加以及细胞因子释放综合征的风险增加。理想情况下，设计良好的T-BsAb应该能够在不引起过度产生炎性细胞因子的情况下，对靶细胞产生足够的细胞毒作用。对于T细胞来说，杀伤细胞活性的激活阈值比产生细胞因子的激活阈值低得多。Blinatumomab的CD3结合臂是从OKT3主干发展而来的，其Kd降低到µM范围。Xencor和MacroGenics等公司也开发了基于另一种CD3抗体(SP34)的CD3结合臂。这些新型的CD3结合臂对CD3的亲和力都相对较低，希望使T-BsAb在保持较强细胞毒作用的同时，引起较少的细胞因子释放。CD3与靶抗原的相对亲和力也影响T-BsAb在体内的分布。对靶抗原具有较高亲和力的T-BsAb优先与癌细胞结合，这种亲和力缺口使与T细胞的游离BsAb结合最小化，从而减少了T细胞的抗原非依赖性激活同时保持对靶肿瘤细胞的有效杀伤。CD3分子上的特定结合部位也会影响T细胞的激活。CD3是TCR/CD3复合体的一部分，由γ，δ，ε和ζ亚基组成。大多数CD3抗体主要与CD3ε单位结合。Tenebrio开发的CD3 binder以中等亲和力优先与具有的CD3εδ异源二聚体结合。其在保持对靶细胞的显著细胞毒性的同时，显示出更低的细胞因子产生水平。此外，该 BsAb优先结合CD8T细胞，而不是Treg细胞。检查点分子如PD-1和CTLA-4的上调也少得多。T-BsAb连接的T细胞和靶细胞之间的适当间隔距离对于有效的T细胞激活和靶向杀伤是至关重要的。Blinatumomab显示出比许多其他在同一时代开发的CD19靶向BsAb更好的杀伤效果，其设计的一大优势被认为是能够使T细胞和靶细胞更接近，从而加速免疫突触的形成和细胞毒分子的转移。T-BsAb诱导的免疫突触间距由三个因素决定：1)CD3表位到T细胞膜的距离，2)T-BsAb结合臂的距离，3)TAA表位到靶细胞膜的距离。对于针对某一抗原的BsAb，通常1)和3)是固定的。通过改变T-BsAb的结构，可以在一定程度上调节BsAb结合位点的双臂间距。不同形式的BsAb在两个结合臂之间也有其典型的距离。例如，diabodies的结合臂距离相对较短，为3-6 nM，而基于IgG的BsAb的两个结合臂之间的距离约为9-15 nM。最近，Chen 等人很好地证明了T细胞和靶细胞膜之间的间隔对T-BsAb的效力有重要影响。他们选择BCMA作为靶抗原，其中BsAb结合BCMA的表位靠近细胞膜(2.5 nM)。通过添加EGF-like结构域(每个3 nM)作为刚性间隔物，他们创建了BCMA-EGF杂化分子。研究发现，基于Ig G的BsAb(结合臂之间为9-15 nM)比基于Diabody的BsAb(结合臂之间3-6 nM)具有更好的疗效。但是，随着EGF间隔区的增加，BCMA表位到膜的距离增加，基于Ig G的BsAb的效价降低，而基于Diabody的BsAb的效价提高。而且这对细胞毒性和细胞因子产生的影响是不同的。因此，通过改进BsAb的设计，设计靶细胞和T细胞之间的最佳间距，有可能减少细胞因子的分泌，同时保持对靶细胞的强细胞毒性。减轻肿瘤负荷，提高E：T比值如前所述，肿瘤负荷是预测T-BsAb临床疗效的另一个关键因素。在T-BsAb治疗过程中，T细胞可以起到系列杀伤作用，破坏多个靶细胞。然而，在与靶细胞长时间接触后，T细胞最终会功能障碍或无能。因此，前期通过细胞减量治疗来减轻肿瘤负担有助于提高E：T比，从而提高T-BsAb治疗的临床疗效。对于大多数类型的肿瘤来说，“减积手术”需要化疗，但这也可能杀死T细胞而对E：T比率产生负面影响。然而，从小鼠模型中发现，只要肿瘤对化疗更敏感，早期细胞减少可以提高T-BsAb的疗效。此外，化疗可通过优先清除免疫抑制细胞类型，如Treg细胞，来促进免疫治疗。对于某些恶性肿瘤，靶向治疗或免疫治疗可以是一种替代方法，在对T细胞数量和功能的负面影响最小的情况下，实现显著的肿瘤缩小甚至缓解。Inotuzumab ozogamicin是一种针对大多数ALL表达CD22的 ADC药物。在临床试验中，单一药物inotuzumab和blinatumomab的序贯治疗已被证明具有良好的疗效和安全性。同样，在几个临床试验中，酪氨酸激酶抑制剂已被用于Ph阳性ALL的前期去除，然后再开始用blinatumomab治疗。对于多发性骨髓瘤患者，在不损害T细胞免疫的情况下，有更多的选择进行减积手术。CD38抗体、蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物(IMiDs)都是标准的治疗方案。蛋白酶体抑制剂和CD38抗体对T细胞免疫的影响比化疗要小得多。已发现来那度胺和泊马度胺等IMiDs在多发性骨髓瘤临床前模型中可以增强BCMA BsAbs的效力。因此，骨髓瘤患者可以在不显著损害T细胞免疫的情况下实现显著的肿瘤细胞减少甚至完全缓解。目前，有多项将IMiDs或蛋白酶体抑制剂与BCMA BsAb相结合的临床试验正在进行中。修饰肿瘤微环境中的因子不同类型的肿瘤可以在TME中使用不同的机制来抑制T细胞免疫。因此，重要的是确定要干预的关键介体。Gal-1是TME干预的理想靶点之一，因为它在许多类型的癌症中过度表达，并被发现抑制T-BsAb介导的杀伤。几种Gal-1药物已经在临床前肿瘤模型中证明了有效性。在这些药物中，OTX008在体外和体内都显示出抗癌作用，并已在晚期实体瘤的临床试验中进行了评估。GM-CT-01是Gal-1和Gal-3的抑制剂，已进入I期和II期临床试验，并在转移性结直肠癌患者中显示出适度的单药疗效。TME内另一个有希望的免疫治疗靶点是IDO1，它已被发现会影响T-BsAb的疗效。到目前为止，许多IDO1抑制剂已经开发并在临床试验中进行了测试。虽然Gal-1和IDO抑制剂的单药疗效不佳，但这些试剂可以与T-BsAb协同作用，克服TME内的耐受机制，显著提高治疗效果。Treg是免疫抑制TME的另一个关键因素，已被发现对T-BsAb的临床疗效有重要影响。许多针对Treg的免疫治疗方法已经开发出来， Treg细胞高表达IL-2的高亲和力受体CD25。Denileukin diftitox，一种IL-2和白喉毒素的融合蛋白，可以在动物模型中耗尽Treg细胞，并已在几个临床试验中进行了测试。CCR4是另一种由激活的效应Treg细胞表达的分子，靶向CCR4可以减少肿瘤侵袭Treg细胞的频率，提高抗肿瘤免疫能力。CCR4抗体(如Mogamulizumab)和小分子抑制剂(如FLX475)已进入临床试验，并在患者中观察到Treg耗竭。Foxp3是Treg细胞最特异的标志物。虽然Foxp3是一种细胞内蛋白，不能被抗体所识别，但由MHC分子呈递的Foxp3肽表位可以被T细胞特异性识别。已经开发出一种T细胞受体模拟抗体(Foxp3-#32)，它在HLA A*02：01的背景下识别Foxp3衍生的表位，并在临床前研究中证明了耗尽Treg细胞的能力。AZD8701是Foxp3的反义寡核苷酸，在肿瘤模型中被发现可以抑制Treg细胞的免疫抑制，并已进入晚期实体瘤的临床试验(NCT04504669)。由干IFN-γ启动的肿瘤炎症信号在通过CXCL10/CXCR3轴募集细胞毒性T细胞方面起着至关重要的作用。IFN-γ的全身治疗是毒性的，已经开发和优化了几种方法来促进IFN-γ的局部递送，包括脂质体、聚合物凝胶、基因疗法等。此外，促炎刺激剂如Toll样受体激动剂可通过天然免疫系统诱导局部产生IFN-γ。小编小结T-BsAb是治疗癌症最有前景的免疫治疗策略之一。虽然已经取得了重大成功，然而T-BsAb的疗效仍然有待进一步提高。通过研究影响T-BsAb疗效的因素，我们可以更深入地了解  T-BsAb治疗耐药的潜在机制，从而设计新一代的治疗策略来进一步提高疗效。参考文献Factors Affecting the Cancer Immunotherapeutic Efficacy of T Cell Bispecific Antibodies and Strategies for Improvement.Targeting T cells to tumor cells using bispecific antibodies.T cell-engaging therapies — BiTes and beyond.

胰腺癌属致命恶性肿瘤之一，死亡率居世界第七位，主要分为胰腺导管腺癌（PDAC）和胰腺神经内分泌肿瘤。胰腺癌具有高度转移倾向，大部分患者诊断即为晚期，其化疗耐药性和特殊的肿瘤微环境会影响治疗效果，不可通过手术切除的局部晚期胰腺癌患者（LAPC）生存率小于5%。晚期常出现腹痛、恶心、中背痛、体重减轻、阻塞性黄疸、胃肠道 (GI) 出血、静脉血栓栓塞 (VTE)等相关症状。目前临床上针对LAPC患者常使用放化疗（CRT）结合吉西他滨等药物治疗，而转移性PDAC患者使用FOLFIRINOX（亚叶酸、5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂）能有效延长生存期。除了常规治疗手段，近来免疫疗法特别是溶瘤病毒疗法备受关注。近日，Frontiers in Oncology杂志刊登了题为《An Extensive Review on Preclinical and Clinical Trials of Oncolytic Viruses Therapy for Pancreatic Cancer》的研究综述，详细阐述了胰腺癌进展的分子机制以及总结了2000年以来已发表的溶瘤病毒疗法临床研究。胰腺癌细胞基因突变及分子机制研究发现，胰腺癌中大量聚集癌症干细胞（CSC），可能导致化疗耐药，肿瘤转移和复发，而产生CSC富集现象与上皮间充质转化（EMT）相关。针对各类胰腺癌进行全基因组测序分析，报告显示平均每个胰腺癌患者有63个突变，相关信号通路在大部分肿瘤中被阻断。“关于EMT-MET上皮细胞由于细胞黏附分子(如E-钙黏蛋白)表达减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白（Vimentin）为主的细胞骨架，转变为间充质细胞，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质等能力。癌细胞在EMT激活后获得侵袭特性，从而导致癌细胞转移。当癌性间充质细胞到达（转移部位）时，会再次经历间充质-上皮转化 (MET)，以恢复上皮表型。miRNA失调MicroRNAs (miRNAs) 是小的非编码RNAs（20-25 nt），可调节靶mRNA的翻译。许多表达失调的miRNA与胰腺癌进展相关，如肿瘤转移、肿瘤耐药、癌症干性。过表达上调：过表达miR-301通过抑制胰腺癌细胞中E-cadherin的表达来调节EMT并导致吉西他滨耐药；过表达miR-296-5p靶向并下调BOK（凋亡调节基因），促进EMT、癌症侵袭和耐药性；过表达miR-103/107、miR-9、miR-181a促进EMT相关信号传导。干扰下调：胰腺癌细胞中Let-7和miR-200家族miRNA表达下调，抑制 Notch信号传导。在发现了 Let-7 和 miR-200 的下调；miR-148a、miR-141、miR-200家族、miR-216a、miR-217和miR-375等其他miRNA在胰腺癌中表达水平降低。K-Ras基因突变K-Ras蛋白是一种小GTPase转导蛋白，通过将外部信号传递到细胞核来调节细胞分裂。其在酪氨酸激酶激活后被激活，表皮生长因子 (EGF)与其受体结合，为表皮生长因子受体 (EGFR)。活化的K-Ras与GTP结合并通过MAPK和P13K/Akt引导的级联将活化信号转导到细胞核，从而调节细胞转化。致癌K-Ras基因突变使K-Ras因GTP水解被抑制而永久激活，导致对化学疗法产生抗性。在胰腺癌患者中，K-Ras基因突变高度发生且参与肿瘤形成发展，可作为重要治疗靶点。近日，一种直接共价靶向G12C突变体KRAS的策略揭示了潜在的动态药物结合位点，其他直接抑制K-Ras的基于结构的药物设计项目正在进行中。P13K信号通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号级联激活与生长因子刺激和细胞因子有关。细胞因子通过高亲和力细胞表面受体酪氨酸激酶(RTK)进入癌细胞，P13K下游信号通过进一步激活其他信号通路介导各种致癌功能，如癌细胞代谢、生长和运动。在PDAC和K-Ras构建的胰腺癌小鼠模型中P13K/Akt被激活，控制黏蛋白（MUC1）介导的放化疗法抗性。由此，MUC1-P13k信号的调节可作为胰腺癌的有效治疗靶点，使用P13K特异性抑制剂和下游信号分子衰减剂可尝试治疗PDAC患者。MAPK信号通路丝氨酸-苏氨酸激酶（MAPK），参与与各种细胞活动，如增殖、分化、转化和凋亡相关的细胞内信号传导，包括ERK（细胞外信号调节激酶）、JNK（c-Jun NH2-末端激酶）和p38。MAPK信号通路的中断显著加快了胰腺癌的进展。靶向MAPK信号下游基因可能使胰腺癌治疗效果提高。TGF-β信号通路转化生长因子-β（TGF-β）包含TGF- β、骨形态发生蛋白(BMP)和激活素/抑制素，调节细胞迁移、分化、增殖、凋亡和EMT等功能，在胰腺癌癌症初期通过阻止细胞周期进程和促进细胞凋亡表现肿瘤抑制特性，在癌症晚期阶段通过增强转移表达肿瘤促进特性。在靶向TGF-β的临床前试验中，与免疫检查点抑制剂联合使用时，靶向药物疗效改善。 缺氧信号通路在各种实体瘤中可以观察到缺氧介导的治疗抗性和生物学变化导致肿瘤转移率增加。肿瘤细胞通过刺激某些对氧敏感的信号通路进行反应，包括缺氧诱导因子1/2 (HIF1/2)信号通路和未折叠蛋白反应(UPR)，缺氧信号级联的变化导致新血管形成，最终导致肿瘤侵袭。胰腺癌中缺氧区域与不良预后和肿瘤发展有关，可作为胰腺癌恶性肿瘤的潜在治疗靶点。Wnt信号通路Wnt信号通路是一种进化保守的调控通路，包括非经典平面细胞极性(PCP)通路、非经典 Wnt/钙通路和经典通路，主要在细胞增殖、分化和存活中起作用。在胰腺癌中，该通路通过调节EMT、血管生成、细胞凋亡、干性和肿瘤微环境来促进癌变，瘤内经典Wnt配体过表达，通路持续激活也与胰腺癌耐药性有关。Notch信号通路Notch信号通过配体与Notch受体的结合而激活，显著促进细胞增殖、存活和分化。在癌症中，通过表达EMT标志物来促进细胞运动和侵袭特性，且会根据细胞环境发挥肿瘤抑制和致癌双重作用。胰腺癌中，Notch过表达，起致癌作用，信号通路的再激活也与胰腺癌的发生和进展有关，因此可作为胰腺癌有效生物标志物和治疗靶点。溶瘤病毒疗法癌症免疫疗法通过增强机体免疫系统识别和破坏癌细胞，溶瘤病毒（OVs）疗法作为一种新型的靶向免疫疗法，通过裂解作用选择性地消灭癌细胞，从而产生抗肿瘤免疫。由于肿瘤细胞内信号通路失调，使得病毒对异常的肿瘤细胞具有靶向选择性，而抗病毒信号传导的主要蛋白质编码基因突变导致的功能不完全丧失，有助于肿瘤细胞中的病毒复制，中断的信号传导也受到抑制以提高溶瘤病毒治疗的效果。研究表明，将相关信号通路抑制剂与溶瘤病毒协同作用，增强了病毒的细胞毒性，在癌症治疗中良好的临床治疗效果。（图为溶瘤病毒设计各通路靶点的应用汇总）腺病毒腺病毒是是非包膜双链DNA病毒，具有二十面体衣壳，55种血清型，通过柯萨奇和腺病毒受体（CAR）进入细胞。设计工程化腺病毒旨在提高抗肿瘤疗效和癌细胞选择性。临床前试验：① 溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24-vIL2使用具有携带Ad5型核酸和Ad3-Fiber的病毒基因组骨架，编码vIL-2、IL-2免疫调节变体蛋白。62%的小鼠模型显示出长期存活率以及免疫反应的激活。② 溶瘤腺病毒AdNuPAR-E-miR222-S外包被聚乙二醇化寡肽修饰的聚β-氨基酯，避免中和抗体产生，通过干扰miR-222在胰腺癌细胞中表达，有效控制了PANC-1肿瘤小鼠模型进展。③ 重组腺病毒DNX-2401易在具有缺陷P16 / RB / E2F通路的细胞中复制，有效抑制胰腺癌细胞系中肿瘤细胞的进展。在I期临床试验中显示针对脑癌的有效结果。临床试验：单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒是包膜双链DNA病毒，具有二十面体衣壳，通过HVEM、nectin1、nectin2受体进入细胞，常用的工程化疱疹病毒有T-VEC, G207, HF10, HSV1716和OrienX010。临床前试验：① 具有突变ICP6基因的Myb34.5单纯疱疹病毒1型（HSV-1），在过表达β-myb基因的胰腺肿瘤细胞中显示有效的复制，与吉西他滨低剂量组合治疗小鼠模型，能够有效减小肿瘤大小。② 重组单纯疱疹病毒HSVGM-CS缺失3个基因（γ134.5，ICP47和ICP6），过表达GM-CSF。在基于胰腺癌细胞系的测试中发现，甲氨蝶呤（MTX）影响HSV-1在肿瘤细胞中的复制；5-氟尿嘧啶（5-FU），伊立替康（CPT-11），细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与HSV-1联合用药改善了病毒复制并增加HSV-1的活性。临床试验：呼肠孤病毒呼肠孤病毒是非包膜分节段双链RNA病毒，对人体具有非致病性，通常选择性感染K-Ras、BRAF、EGFR突变的肿瘤细胞并复制。临床前试验：① 呼肠孤病毒（Reolysin）与硼替佐米（BZ）联合治疗胰腺癌，体外和体内测试发现增强了癌细胞凋亡，抗癌反应水平高。② 重组呼肠孤病毒rS1-mmGMCSF表达小鼠GM-CSF，临床前胰腺癌小鼠模型试验显示改善了免疫细胞（DC、 T细胞）全身抗肿瘤活性。③ 呼肠孤病毒与CD3-双特异性抗体（CD3-bsAbs）分别给药胰腺癌模型，病毒显著增强（CD3-bsAbs）抗肿瘤疗效，诱导了非注射远端病变的消退。临床试验：牛痘病毒牛痘病毒是包膜双链DNA病毒，设计工程化牛痘病毒增强胰腺癌细胞特异性裂解作用。临床前试验：① 牛痘病毒mpJX-594（mpJX）联合抗程序性死亡受体-1抗体（PD1）在小鼠胰腺神经内分泌肿瘤模型中提高抗肿瘤免疫反应，细胞凋亡水平增加，增殖减少。② 重组牛痘病毒VVL-21表达B5R和白细胞介素-21（IL-21）基因，在胰腺癌转移性小鼠和仓鼠模型中全身给药VVl-21与α程序性细胞死亡蛋白1（α-PD1），免疫细胞中CD8+T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞活性水平增加。③ 重组牛痘病毒VV-ING4表达生长抑制剂ING4基因。在胰腺癌小鼠模型中测试VV-ING4单独使用发现其有效诱导癌细胞毒性和凋亡，与吉西他滨联合治疗中，VV-ING4改善吉西他滨抗癌疗效。④ 重组牛痘病毒vvdd-tdtomato-hGMCSF表达GMCSF基因，在免疫功能正常的仓鼠上测试，表达牛痘病毒的GMCSF有助于通过中性粒细胞和巨噬细胞的激活和侵袭完全清除皮下胰腺病变。临床试验：细小病毒细小病毒是非包膜单链DNA病毒，可降低胰腺癌细胞中IG和HERV的水平，减弱细胞先天免疫。临床前试验：① 腹膜转移的胰腺癌小鼠模型中，在肿瘤内注射H-1PV导致肿瘤减少，同时注射IFNγ，进一步改善了机体免疫反应。② 携带细胞趋化因子IL-2、MCP-3/CCL7和IP-10/CXCL10的细小病毒在胰腺癌异种移植中抗肿瘤疗效显著，表达IL-12的细小病毒比其他两种变体表现出更强的抗肿瘤反应。临床试验：麻疹病毒麻疹病毒是包膜单链负义RNA病毒，通过信号传导淋巴细胞活化分子（SLAM）受体或CD46受体进入细胞。临床前试验：① 重组麻疹病毒MeV-CD-FmiRTS148a表达5-氟胞嘧啶及前体，在胰腺癌异种移植模型中瘤内注射，治疗的小鼠显示出肿瘤大小减小，无进展生存期延长。少量MeV与吉西他滨联合给药，肿瘤体积减小大于50%。② 麻疹病毒MV-EGFPmtd编码miRTS（miR-122，miR-7和miR-148a），在体外和体内测试发现MV-EGFPmtd的高靶向胰腺癌细胞。水疱性口炎病毒水疱性口炎病毒是包膜非分段负义RNA病毒，优先在肿瘤细胞中感染复制。临床前试验：① 混合水疱性口炎病毒（VSV-FH）替换了麻疹病毒包膜蛋白F、H，通过突变K174E和E238K，降低了肿瘤对VSV的耐药性。② 重组VSV-ΔM51变异体通过下调IFN信号传导，并联合小分子抑制剂，显著消除了胰腺癌细胞中VSV耐药性。新城疫病毒新城疫病毒是包膜单链负义RNA病毒，通过病毒内吞作用或质膜融合进入细胞，对人类不具有致病性。因癌细胞过表达I型IFN、Bcl-xL和小GTPase，NDV选择性地在癌细胞中感染和复制。临床前试验：① 在小鼠低表达TGF-β模型中静脉注射NDV，发现肿瘤有效减少，无进展生存期延长。② 在异种移植模型肿瘤内注射rNDV-F3aa，显示肿瘤消退和抗肿瘤细胞毒性。小结溶瘤病毒疗法通过工程化插入外源基因或miRNA提高了胰腺癌治疗的有效性、特异性和安全性，特别是跟吉西他滨联合给药时，能显著降低吉西他滨的高剂量毒性，同时得到有效的临床结果。针对胰腺癌细胞中受损通路的有效靶点，设计特异的溶瘤病毒将是一种安全且有前景的治疗方式。（图为吉西他滨与重组或天然溶瘤病毒联合治疗相关的临床前研究汇总）