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中科院大类分区:医学 1区该大类分区的期刊数量:1451 中科院小类分区:BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY 生化与分子生物学 1区NEUROSCIENCES 神经科学 1区PSYCHIATRY 精神病学 1区 是否TOP期刊:是 期刊全称:Molecular psychiatry 期刊简称:Mol Psychiatry ISSN:1359-4184 影响因子:10.4  Xu G, Yuan M, He H, et al. NLRP3-mediated trained immunity of microglia is involved in the recurrence-like episode of depressive disorders. Mol Psychiatry. 2026;31(4):1958-1969. doi:10.1038/s41380-025-03344-y ————————————————————————————————————————一、期刊介绍：Molecular Psychiatry（《分子精神病学》） Molecular Psychiatry 创刊于 1996 年，由 Springer Nature 出版集团旗下的 Nature Portfolio 发行，是精神病学领域最具影响力的专业期刊之一。 影响因子（JIF）：10.4；五年影响因子：11.8；JCI：2.21 分区：精神病学（Psychiatry）Q1，在 288 本精神病学期刊中排名第 7 位（约前 3%） 中科院分区：医学 1 区 Top（常年位于 Top 期刊行列）二、通讯作者介绍 本文有三位共同通讯作者，分别来自电子科技大学生命科学与技术学院和四川大学华西医院，体现了"神经免疫基础研究 + 脑影像/大数据 + 临床精神病学"的交叉团队结构。 ——————————————————————————————摘要 复发性重性抑郁与更高的发病率、自杀行为以及日益加重的神经认知缺陷相关。小胶质细胞介导的神经炎症过程深度参与抑郁症的病理生理机制。在应激作用下，小胶质细胞可以通过表观遗传重编程形成"训练免疫"（trained immunity），从而增强其对后续损伤刺激的神经炎症反应。本研究在动物模型中探讨了如下问题：既往的抑郁样行为发作是否与小胶质细胞的训练免疫相关——这种训练免疫会提高小鼠对应激的易感性，从而导致抑郁样行为的复发。 研究发现，在海马区，当初次慢性温和应激（CMS）诱发的抑郁行为恢复之后，与促炎反应相关基因的染色质可及性持续升高、H3K4me3（组蛋白 H3 第 4 位赖氨酸三甲基化）标记持续增强——尽管此时小胶质细胞并未持续激活，神经炎症也已消退。此外，初次 CMS 使 NLRP3 基因启动子区域的 H3K4me3 沉积增加；当小鼠再次暴露于为期 2 周的亚阈值应激（reCMS）时，会损害成年海马神经发生并产生应激敏感化，导致抑郁样行为复发，而特异性敲低海马小胶质细胞中的 NLRP3 可以逆转这一过程。使用 H3K4me3 抑制剂阻断 H3K4me3 介导的 NLRP3 激活，能够挽救初次 CMS 造成的神经发生损伤，并改善小鼠对应激再暴露而升高的易感性。 综上，初次 CMS 通过表观遗传重编程诱导了 NLRP3 依赖性的小胶质细胞训练免疫，使小鼠对后续应激更易感，从而促成抑郁样行为的复发。本研究的发现可能为预防和治疗抑郁症复发提供一种前景性的策略。引言 重性抑郁障碍（MDD）是一种常见且易复发的精神健康问题，具有高自杀率和高致残率 [1]。超过 50% 的患者在初次发作康复后会再次出现 MDD，且后续发作往往更加严重，进而发展为慢性甚至终身性疾病 [2]。临床研究已经证实，既往 MDD 发作史是抑郁症复发最重要的危险因素之一 [3, 4]。重大负性生活事件通常被认为与 MDD 的首次发作显著相关，但其与后续复发的关联逐渐减弱，这一现象可由"应激敏感化"（stress sensitization）理论加以解释 [5, 6]。既往研究提示，慢性应激引起的小鼠抑郁样发作可能通过神经炎症信号的中介而加剧应激易感性，从而提高抑郁样行为复发的易感性 [7, 8]。近期研究表明，小胶质细胞等先天免疫细胞对其所经历的免疫学事件保有"记忆"，这一现象被称为"训练免疫"或"先天免疫记忆" [9]。训练免疫是指先天免疫细胞的一种功能状态：在初次暴露之后，细胞对后续刺激的炎症反应增强，并伴随长期的表观遗传重编程。这一过程在某些神经系统疾病中发挥关键作用 [10, 11]。表观遗传调控通过 DNA 甲基化、组蛋白修饰或非编码 RNA 等机制介导基因与环境的相互作用，并参与抑郁症的反复发作 [12, 13]。因此，训练免疫的特性为研究复发性抑郁症的分子机制提供了一个全新视角。 小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻免疫细胞，在先天免疫反应中具有高度可塑性，并在训练免疫的形成中发挥关键作用 [14, 15]。在既往免疫刺激之后，小胶质细胞会保留对过去炎症事件的"记忆" [11, 16]。表观遗传修饰在染色质上——尤其是在炎症相关基因上——的沉积，会导致细胞对第二次挑战的反应增强 [10, 17]。组蛋白 H3 第 4 位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）是训练免疫中的关键表观遗传标记，它与炎症反应相关基因启动子处的染色质开放相关联，从而促进基因表达，参与神经精神疾病的发病机制 [10, 15]。然而，H3K4me3 介导的小胶质细胞训练免疫在复发性抑郁症病理生理中的作用仍知之甚少。 NOD 样受体蛋白 3（NLRP3）是先天免疫系统中关键的胞内传感器，能够探测危险信号并通过组装和激活 NLRP3 炎症小体作出应答 [18, 19]。多项研究表明，NLRP3 炎症小体介导的小胶质细胞激活和神经炎症是抑郁样行为以及人类 MDD 的重要促成因素 [20–22]。已有研究揭示，NLRP3 介导了高脂饮食诱导的先天免疫细胞训练免疫并触发动脉粥样硬化进展 [17, 23]。然而，NLRP3 在小胶质细胞训练免疫形成以及导致抑郁样行为复发的分子敏感化过程中的功能，仍 largely 未被探索。 因此，本研究旨在检验：慢性应激暴露是否诱导小胶质细胞训练免疫，从而提高小鼠对后续应激的易感性并诱发新一轮抑郁样发作。本研究还考察了小胶质细胞 NLRP3 在训练免疫中的作用，以及 H3K4me3 在应激敏感化中对训练免疫的介导机制，为预防和治疗抑郁症复发提供一种前景性策略。材料与方法动物 C57BL/6J 背景小鼠购自重庆恩斯维尔生物科技有限公司（Byrness Weil biotech Ltd），Cx3cr1-CreER C57BL/6J 小鼠购自 Jackson 实验室。未使用统计学方法估算样本量，样本量依据既往研究确定（行为学测试 n ≥ 8，基因操作实验 n ≥ 5，分子实验 n ≥ 4）。本研究所有动物（22~24 g，8 周龄，雄性）均在标准条件下饲养（25 °C，12 小时光暗循环，湿度 50%~70%），自由摄食饮水（特别说明除外）。所有方法与动物操作程序均经电子科技大学动物实验伦理委员会批准（批件号：10614-20220826-24499）。应激暴露模型 动物接受为期 4 周的慢性温和应激（CMS）方案，每天随机施加 2~3 种应激源，随后进入 2 周或 4 周的应激恢复期，之后再暴露于为期 2 周的简短 CMS（reCMS）。应激源包括：昼夜颠倒（24 h）、禁水（12 h）、禁食（12 h）、夹尾（5 min）、污浊垫料（24 h）、强迫游泳（5 min）、束缚（2 h）、鼠笼倾斜（45°，24 h）、频闪光照（12 h）、潮湿垫料（24 h）以及无垫料（24 h）。为避免小鼠对既往应激源产生习惯化，第二轮应激方案做了轻微调整，加入了一些新应激源，包括冰面行走（5 min）和移除木屑（12 h）。 分组定义：Ctrl 组小鼠不接受任何应激；CMS 组小鼠仅接受 4 周初次 CMS；reCMS 组小鼠仅接受后续 2 周 CMS；CMS-reCMS 组小鼠先接受 4 周 CMS，经 2 周恢复期后再暴露于 2 周 CMS。Ctrl、CMS、reCMS 和 CMS-reCMS 组小鼠均在第 8 周进行行为学检测后处死，用于后续分子与细胞生物学实验。同样地，CMS-r0 或 Ctrl-r0 组小鼠接受或不接受 4 周初次 CMS，均在第 4 周处死；CMS-r1 或 Ctrl-r1 组小鼠接受或不接受 4 周初次 CMS 并恢复 1 周，均在第 5 周处死；CMS-r2 或 Ctrl-r2 组小鼠接受或不接受 4 周初次 CMS 并恢复 2 周，均在第 6 周处死。药物给药 药物给药细节见补充信息。行为学测试 小鼠糖水偏好实验（SPT）按既往描述进行 [24]。SPT、悬尾实验（TST）、自主活动实验（LAT）和旷场实验（OFT）的详细描述见补充信息。AAV 构建与立体定位注射 AAV 制备（AAV-shNlrp3 或 AAV-SC）及体内病毒注射的详细描述见补充信息。免疫荧光、蛋白质免疫印迹与 RNA 分析 免疫荧光、Western blotting 与 RNA 分析细节见补充信息。成年小胶质细胞分离 按既往方法 [25] 从小鼠海马分离成年小胶质细胞。小鼠经戊巴比妥钠麻醉后以预冷 PBS 灌注，小心剥离海马组织（同组 5 只小鼠的海马混合为 1 个样本），随后使用单细胞悬液制备仪（RWD，中国，#DSC-200）机械与酶解制备单细胞悬液。随后用 30% Percoll 缓冲液去除碎片（400 × g 离心 10 min），细胞沉淀依次用含 0.5% BSA 的 PBS 洗涤并重悬。然后按照厂商说明，使用 CD11b（小胶质细胞）磁珠（130-093-634，Miltenyi Biotec，德国）和 MACS 分选器分离小胶质细胞。活的小胶质细胞随即用于 CUT&Tag 或 ATAC-seq 实验。CD11b 磁珠分选后海马小胶质细胞的纯度（约 87%）采用小胶质细胞特异性标志物 Tmem119（53-6119-82，Invitrogen，美国）经流式细胞术检测。ATAC-seq、CUT&Tag 及分析 ATAC-seq 和 CUT&Tag 的文库构建方法详见补充信息。RNA 测序与分析 RNA 测序主要参照本实验室既往研究方法 [26]。简言之，按照厂商说明使用 Trizol（CAS#9109，Takara，日本）提取小鼠海马总 RNA（同组 2 只小鼠的海马混合为 1 个样本，每组 2~3 个独立样本）。提取的 RNA 经 DNase I（TaKara，日本）去除基因组 DNA 后，用 ND-2000（NanoDrop Technologies，美国马萨诸塞州）定量。随后取 1 μg 总 RNA，使用 Illumina（美国加利福尼亚）TruSeq™ RNA 样品制备试剂盒建库，经 TBS380 定量后在 Illumina NovaSeq 6000 上进行双端测序（2 × 150 bp 读长）。RNA 测序与分析由苏州 PANOMIX 生物医药科技有限公司完成。原始序列读段经 FastQC 质控（去除接头序列和低质量读段后获得 clean data）。随后用 STAR 2.5.2b 版将质控后的读段比对至 GRCm38 小鼠参考基因组，排序并转换为 BAM 文件。使用 featureCounts 统计比对到各基因的读段数，以 TPM（每百万转录本）法定量各转录本表达水平。随后使用 DESeq2 鉴定差异表达基因（DEGs），标准为 P 值 < 0.05 且 |log2FoldChange| > 1。此外，使用 Metascape 对 DEGs 数据进行基因本体（GO）功能富集分析以进一步探索。统计分析 所有数据以均值 ± 标准误（SEM）表示，使用 GraphPad Prism 8.0 分析。本研究结果均为三次独立实验的代表性结果。组间差异采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）继以 Tukey 多重比较检验，或双尾非配对 Student t 检验评估。统计学参数详情亦见各图及图注。p < 0.05 视为差异有统计学意义，表示为 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。数据点偏离均值超过两个标准差时作为离群值剔除。动物与样本由独立研究人员随机分配至各实验组。行为学测试与免疫荧光数据分析过程中，实验人员对分组保持盲法。结果初次 CMS 诱导的小胶质细胞高反应性与小鼠对后续应激易感性增加相关 为探究慢性应激诱导的既往抑郁发作对小鼠后续应激易感性的影响，我们参照了既往聚焦于抑郁症复发的动物模型研究 [27, 28]。小鼠先接受 4 周 CMS 以诱导抑郁样发作（补充图 S1a–S1f），经 2 周恢复后再接受亚阈值应激（reCMS，2 周）（图 1a）。显然，经历过初次 CMS 的小鼠对亚阈值应激表现出更强的易感性，表现为糖水偏好降低、悬尾实验（TST）不动时间延长、旷场实验（OFT）中央区停留时间缩短（图 1b）。各组小鼠的自主活动（LAT）和旷场总行程均正常，提示小鼠行为能力受损并非源于自发活动异常（图 1b）。此外，个体行为轨迹（各阶段个体 SPT 与 TST 变化）同样显示出初次抑郁样发作所触发的应激易感性（补充图 S1g–S1h）。鉴于小胶质细胞介导的神经炎症过程在 MDD 发病中的关键作用 [29, 30]，我们观察了海马小胶质细胞的形态与炎症细胞因子表达水平。与 reCMS 小鼠相比，CMS-reCMS 小鼠小胶质细胞形态出现明显变化且细胞数量增多（图 1c, f）。Sholl 分析数据显示，CMS-reCMS 小鼠小胶质细胞呈阿米巴样表型：分支减少、临界半径减小、突起最大长度缩短（图 1e, f）。此外，与 reCMS 小鼠相比，CMS-reCMS 小鼠海马中促炎细胞因子（IL1β、IL6、TNFα）显著升高，而抗炎细胞因子（TGF-β、Arg-1）降低（图 1g）。相关性分析显示，这些促炎因子与行为学指标之间存在强相关（图 1h）。同时，我们将恢复期延长至 4 周，观察到初次 CMS 诱导的小鼠应激易感性仍然存在（补充图 S2a–2b）。经历延长恢复期的小鼠在再暴露于应激时同样表现出小胶质细胞高反应性和加重的海马尾炎症（补充图 S2c–2e）。 为进一步探究小胶质细胞在应激易感性中的作用，我们对小鼠海马进行了转录组分析。与上述结果一致，与其他组相比，CMS-reCMS 小鼠出现了明显的全转录组变化（图 1i–k），而其他三组之间仅有轻微变化，表明 reCMS 本身不足以引起小鼠海马的转录组谱改变（图 1j）。基因本体（GO）分析显示，CMS 小鼠再暴露于 reCMS 后，主要上调的变化涉及"趋化因子信号通路""参与炎症反应的细胞因子产生调控""小胶质细胞迁移的正向调控"等免疫调节相关条目（图 1k）。这些结果表明，经历过初次 CMS 的小鼠在再暴露于亚阈值应激时表现出更严重的小胶质细胞介导的炎症反应，从而增加了对新一轮抑郁样发作的易感性。初次 CMS 诱导海马小胶质细胞持久的表观遗传重编程，但不伴随持续的神经炎症谱与行为改变 基于上述结果，我们试图验证初次 CMS 是否触发了小胶质细胞训练免疫从而促进小鼠应激易感性。为排除初次 CMS 诱导小胶质细胞持续炎症反应这一可能性，我们探究了 CMS 小鼠在再暴露于应激之前行为是否已恢复（图 2a）。如预期，CMS 小鼠静息 2 周后抑郁样行为恢复正常（图 2b, c，补充图 S3d）。同样，CMS 小鼠海马炎症细胞因子表达水平以时间依赖方式回落至稳态水平（图 2d），该结果也间接证实了初次 CMS 暴露后转录组谱的恢复（图 1j）。免疫染色与 Sholl 分析（分析细胞形态）结果显示，初次 CMS 诱导的海马小胶质细胞激活形态在恢复 2 周后回到静息状态，小胶质细胞数量也恢复正常（图 2e–h，补充图 S3a–3c）。令人惊讶的是，小胶质细胞即使仅静息 1 周即已恢复正常形态。这些发现提示，CMS 小鼠对后续应激的易感性并非归因于小胶质细胞的持续炎症反应。 表观遗传重编程是先天免疫细胞训练免疫的分子基础 [10, 14]。为证实"初次 CMS 触发小胶质细胞训练免疫"这一设想，我们对海马小胶质细胞进行了转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）（图 2i，补充图 S3e）。有趣的是，我们发现即使从初次 CMS 恢复 2 周后，海马小胶质细胞的全基因组染色质可及性仍明显增加（图 2l, n，补充图 S3f）。值得注意的是，GO 富集分析显示这些差异可及性区域（DAR）主要涉及"先天免疫反应激活""神经炎症反应""NF-κB 信号通路""趋化因子信号通路"等（图 2m），与既往研究结果一致 [31]。转录因子（TF）富集分析发现 PU.1 和 NF-κB 结合位点明显富集（图 2n）。PU.1 是公认在小胶质细胞激活中起核心作用的转录因子 [32]，NF-κB 则深度参与炎症反应 [33]。这些发现提示，初次 CMS 在海马小胶质细胞中诱导了持久的表观遗传印记，但并不伴随持续的神经炎症谱和行为改变。初次 CMS 在海马小胶质细胞炎症反应相关基因上诱导持久的 H3K4me3 标记 H3K4me3 作为先天免疫细胞训练免疫的关键表观遗传标记，可在细胞暴露于初始应激时标记于炎症反应相关基因的启动子上 [10, 14]。为确认初次 CMS 是否诱导 H3K4me3 富集的持续增加，我们检测了 SET1/MLL 家族及其保守核心亚基的表达，包括 KMT2F/G（亦称 SETD1a/b）、KMT2A–D（亦称 MLL1–4）和 wdr5——它们可将甲基基团沉积到组蛋白赖氨酸残基上以调控 H3K4me3 与基因转录 [34]。小鼠接受初次 CMS 处理后，海马中 KMT2A、KMT2B、KMT2F 和 wdr5 的 mRNA 水平显著升高（图 3a，补充图 S4a）；同时 H3K4me3 蛋白水平也升高（图 3b）。ATAC-seq 分析也证实，组蛋白甲基化相关基因的染色质可及性增加（图 3c），与图 2m 所示 GO 分析结果一致。 接下来，我们进行了全基因组 CUT&Tag 分析，以观察初次 CMS 恢复 2 周后、或初次 CMS 期间给予 H3K4me3 抑制剂处理后海马小胶质细胞 H3K4me3 沉积的变化。所用抑制剂 WDR5-0103 是 SET1/MLL 组蛋白甲基转移酶（HMTs）的抑制剂，可竞争性结合 SET1/MLL 在 wdr5 上的结合位点，从而有效拮抗其催化活性 [35]（图 3d–g，补充图 S4b–S4e）。初次 CMS 明显且持久地增强了小胶质细胞中 H3K4me3 峰的富集，而 WDR5-0103 处理可逆转这一效应（图 3d，补充图 S4e）。H3K4me3 标记增加的基因主要与炎症反应、模式识别受体（PRR）与炎症小体信号通路、迁移和吞噬作用相关（图 3f, g）。综上，这些发现提示初次 CMS 诱导了小胶质细胞促炎反应相关基因启动子区域 H3K4me3 富集的持续增加。NLRP3 介导的训练免疫参与抑郁样行为的复发样发作 既往研究已确定，小胶质细胞 NLRP3 炎症小体对应激诱导的 PRR 配体的反应参与抑郁症的发病机制 [36, 37]。本研究探究了 NLRP3 是否在小胶质细胞训练免疫中发挥作用，进而参与抑郁样行为的复发样发作。与促炎细胞因子的变化一致，初次 CMS 诱导海马 NLRP3 的 mRNA 与蛋白表达水平升高，静息 2 周后回落至稳态水平（图 4c，补充图 S5c）。免疫荧光共染结果也显示，海马 NLRP3⁺ 小胶质细胞因初次 CMS 而增加，恢复 2 周后回落至基础水平（补充图 S5a–b）。有趣的是，NLRP3 信号相关基因的染色质可及性与 H3K4me3 富集在初次 CMS 处理后仍然持续增强（图 4a, b），这使得小鼠再暴露于应激时，小胶质细胞的反应性提高，促进 NLRP3 转录以调控炎症反应（图 4d, e, g, h），最终导致抑郁样行为的复发样发作。海马 NLRP3 蛋白表达水平与小鼠抑郁样行为复发之间的强相关性进一步证实了这一点（图 4f）。 为进一步证实我们的假设，我们通过注射 AAV-shNlrp3 特异性敲低 Cx3cr1-CreER 小鼠海马小胶质细胞中的 NLRP3，观察 CMS 诱导的应激易感性是否减轻（图 4i，补充图 S6a–6c）。结果发现，AAV-shNlrp3 减轻了 CMS-reCMS Cx3cr1-CreER 小鼠的促炎过程（Nlrp3、TNFα、IL-6、IL-1β 和 IL-18 的 mRNA 表达水平）及其增强的应激易感性（图 4j–m，补充图 S6h）。此外，注射 AAV-shNlrp3 后，CMS-reCMS Cx3cr1-CreER 小鼠小胶质细胞的数量增加和形态改变均得以恢复（补充图 S6d–6e）。 既往研究报道，应激诱导的中枢神经系统炎症细胞因子失衡可损害神经发生，促进抑郁症的病理进程 [29, 38]。此外，先前的前瞻性研究表明，抑郁症复发与患者海马体积丢失相关 [39]。因此，我们探究了 NLRP3 介导的神经炎症是否损害成年海马神经发生，进而促成小鼠的应激敏感化。我们观察了海马齿状回颗粒下层（SGZ）的神经发生，发现 AAV-SC Cx3cr1-CreER CMS 小鼠再暴露于应激时神经元分化明显减少——表现为 BrdU⁺/DCX⁺ 细胞数量减少——而特异性敲低海马小胶质细胞 NLRP3 可逆转这一现象（补充图 S6f–6g）。总体而言，我们的数据支持 NLRP3 在小胶质细胞表观遗传重编程介导的抑郁样行为复发样发作中的关键作用。抑制 H3K4me3 通过削弱 NLRP3 介导的神经炎症，减轻神经发生受损与抑郁样行为的复发样发作 为明确表观遗传重编程在应激敏感化中的作用，小鼠腹腔注射 H3K4me3 抑制剂 WDR5-0103，以干扰 NLRP3 依赖性小胶质细胞训练免疫的形成（图 5a）。当 CMS 小鼠再暴露于应激时，WDR5-0103 给药显著减弱了海马小胶质细胞 NLRP3 与炎症细胞因子的升高表达（图 5b, c, e, f, i）。相关性分析显示，H3K4me3 与 NLRP3 之间存在正相关；此外，H3K4me3 和 NLRP3 均与小鼠糖水偏好呈负相关，与 TST 不动时间呈正相关（图 5d）。值得注意的是，与其他组不同，CMS 小鼠的 H3K4me3 与 NLRP3 及行为学指标无相关性，这是由于其表达持续升高所致。免疫染色与 Sholl 分析结果显示，再暴露于应激时，抑制 H3K4me3 缓解了初次 CMS 诱导的海马小胶质细胞高激活表型（图 5g, h，补充图 S7a–S7d）。更重要的是，海马小胶质细胞数量的增加也被 H3K4me3 抑制所削弱（图 5h，补充图 S7b）。 随后我们观察了成年海马神经发生的变化，发现 CMS 小鼠再暴露于应激时 SGZ 区 BrdU⁺/DCX⁺ 细胞数量减少，而抑制 H3K4me3 可逆转这一变化（图 5j, k）。此外，抑制 H3K4me3 也阻止了小鼠抑郁样发作的复发（补充图 S7e）。这些结果表明，小鼠再暴露于应激时，初次 CMS 通过诱导 NLRP3 依赖性小胶质细胞训练免疫加重了成年海马神经发生损伤，从而增加小鼠对新一轮抑郁样发作的易感性，而这一过程可通过抑制 H3K4me3 加以逆转。 图 1｜初次 CMS 诱导的小胶质细胞高反应性与小鼠应激易感性增加相关。a 小鼠重复应激诱导抑郁行为复发样发作的实验示意图。Ctrl 组不接受任何应激；CMS 组仅接受 4 周 CMS；reCMS 组仅接受 2 周 CMS；CMS-reCMS 组先接受 4 周 CMS、经 2 周恢复后再暴露于 2 周 CMS。各组小鼠均于第 8 周处死。b 小鼠抑郁样行为（n = 10, 9, 10, 11）。c 海马齿状回（DG）、CA1、CA3 区小胶质细胞标志物 Iba1 免疫染色，DAPI（蓝色）染核。标尺：大图 100 μm，小图 10 μm。d DG、CA1、CA3 区 Iba1⁺ 细胞密度（上）、小胶质细胞胞体面积百分比（中）、Iba1⁺ 面积百分比（下）定量（n = 5, 6, 6, 5）。e, f 海马小胶质细胞 Sholl 分析代表性图像（e）与交叉点数量（f）（n = 5, 6, 6, 5 只小鼠）。reCMS 组 vs. CMS-reCMS 组。g RT-PCR 检测海马促炎细胞因子（IL1β、IL6、TNFα）与抗炎细胞因子（TGF-β、Arg-1）mRNA 表达（n = 6, 4, 5, 5 只小鼠）。h 海马促炎细胞因子（IL1β、IL6、TNFα）mRNA 表达与小鼠糖水偏好（或 TST 不动时间）的相关性。i RNA-seq 得到的 CMS-reCMS 组 vs. reCMS 组海马差异表达基因（DEGs，P < 0.05 且倍数变化 ≥ 2）火山图。j 四组小鼠海马差异基因表达热图（每样本 2 只小鼠，每组 2~3 个样本）。k CMS-reCMS 组 vs. reCMS 组海马上调 DEGs 的 GO 富集分析。数据说明：组间比较采用双因素 ANOVA 继以 Tukey 检验。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；n.s.，无显著性。 图 2｜初次 CMS 诱导海马小胶质细胞持久的表观遗传重编程，但不伴随持续的神经炎症谱与行为改变。a 小鼠 CMS 恢复实验示意图：Ctrl-r0/CMS-r0 组于第 4 周处死；Ctrl-r1/CMS-r1 组于第 5 周处死；Ctrl-r2/CMS-r2 组于第 6 周处死。b CMS 恢复 2 周后小鼠的糖水偏好、TST 不动时间与 OFT 中央区停留时间（n = 10, 11）。c CMS 恢复 2 周后小鼠体重变化（n = 11, 14）。d CMS 后不同时间点小鼠海马促炎（IL1β、IL6、TNFα）与抗炎（TGF-β、Arg-1）细胞因子基因表达热图（n = 5, 6, 6, 6, 5, 5）。e 海马 CA1、CA3、DG 区 Iba1 免疫染色，DAPI 染核。标尺：大图 100 μm，小图 10 μm。f–h CA1、CA3、DG 区小胶质细胞胞体面积百分比（f）、Iba1⁺ 面积百分比（g）、Iba1⁺ 细胞密度（h）定量（n = 5, 5, 6, 5, 6, 6）。i CMS 恢复 2 周后小鼠海马成年小胶质细胞 ATAC-seq 实验示意图（每样本 5 只小鼠，每组 2 个样本）（BioRender 绘制）。j, k CMS-r2（j）与 Ctrl-r2（k）组小鼠 ATAC-seq 读段在所示基因组区域的分布饼图。l 转录起始位点（TSS）上下游 3 kb 范围内 ATAC-seq 读段密度热图。m CMS-r2 vs. Ctrl-r2 小鼠海马小胶质细胞 ATAC-seq 数据上调 DARs 的 GO 富集分析。P：通路；MF：分子功能；BP：生物学过程；CC：细胞组分。n 基于 HOMER 的 CMS-r2 小鼠海马小胶质细胞 ATAC-seq 峰中前 10 位富集转录因子识别序列。数据说明：组间比较采用双尾非配对 t 检验。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；n.s.，无显著性。 图 3｜初次 CMS 在海马小胶质细胞炎症反应相关基因上诱导持久的 H3K4me3 标记。a RT-PCR 检测 Ctrl-r0 与 CMS-r0 小鼠海马 SET1/MLL 家族成员 KMT2A、KMT2B、KMT2F 和 Wdr5 的 mRNA 表达（n = 6, 6）。双尾非配对 t 检验，*p < 0.05。b Western blotting 检测 Ctrl-r0 与 CMS-r0 小鼠海马 H3K4me3 蛋白水平（n = 5, 5）。双尾 Mann-Whitney 检验，*p < 0.05；n.s.，无显著性。c KMT2B、KMT2F 和 Wdr5 基因座 ATAC-seq 测序轨迹的基因组浏览器快照。CMS 恢复 2 周小鼠海马小胶质细胞中可及性显著增加的区域（P < 0.05）（每样本 5 只小鼠，每组 2 个样本）。d 来自 Ctrl-r2、CMS-r2 和 CMS-wdr5-r2 组小鼠海马小胶质细胞的 H3K4me3 CUT&Tag 热图与谱线图（CMS-wdr5-r2 组小鼠同时接受 CMS 与 H3K4me3 抑制剂 WDR5-0103 处理，随后恢复 2 周）。信号绘制于蛋白编码基因 TSS（TSS ± 3 kb）区域。e Ctrl-r2（蓝）、CMS-r2（红）与 CMS-wdr5-r2（灰）组小鼠 CUT&Tag 读段在所示基因组区域分布的聚类条形图。f, g CUT&Tag 数据中 CMS-r2 vs. Ctrl-r2（f）或 CMS-r2 vs. CMS-wdr5-r2（g）靶基因 H3K4me3 结合峰升高的 GO 富集分析。 图 4｜NLRP3 介导的训练免疫参与抑郁样行为的复发样发作。a, b Ctrl-r2 与 CMS-r2 组小鼠海马小胶质细胞 NLRP3 及 NF-κB 家族基因（Rela 和 Nfkb1）基因座的 ATAC-seq（a）与 CUT&Tag（b）测序轨迹基因组浏览器快照（每样本 5 只小鼠，每组 2 个样本）。c RT-PCR 与 Western blotting 分别检测 Ctrl-r0、CMS-r0、Ctrl-r1、CMS-r1、Ctrl-r2、CMS-r2 组小鼠海马 NLRP3 的 mRNA 与蛋白表达（mRNA：n = 5, 6, 6, 6, 6, 6；蛋白：n = 4, 4, 4, 4, 5, 5）。双尾非配对 t 检验（右）。*p < 0.05；***p < 0.001；n.s.，无显著性。d, e RT-PCR 与 Western blotting 分别检测重复应激暴露小鼠海马 NLRP3 的 mRNA 与蛋白表达（mRNA：n = 5, 4, 5, 5；蛋白：n = 5, 5, 5, 5）。双因素 ANOVA 继以 Tukey 检验（左），*p < 0.05；***p < 0.001；n.s.，无显著性。f 重复应激暴露小鼠海马 NLRP3 蛋白表达水平与糖水偏好（或 TST 不动时间）的相关性。g 重复应激暴露小鼠海马 Iba1（红）与 NLRP3（绿）免疫染色，DAPI 染核。标尺：大图 50 μm，小图 10 μm。h 海马 NLRP3⁺ 小胶质细胞百分比定量（每组 n = 5 只小鼠）。双因素 ANOVA 继以 Tukey 检验。***p < 0.001；n.s.，无显著性。i Cx3cr1-CreER 小鼠海马小胶质细胞特异性敲低 NLRP3 的实验示意图。j 接受 reCMS 或 CMS-reCMS 处理的 AAV-SC Cx3cr1-CreER 小鼠与 AAV-Nlrp3 Cx3cr1-CreER 小鼠的糖水偏好、TST 不动时间与 OFT 中央区停留时间（每组 n = 9 只小鼠）。双因素 ANOVA 继以 Tukey 检验。*p < 0.05；***p < 0.001；n.s.，无显著性。k–m RT-PCR 检测接受 reCMS 或 CMS-reCMS 处理的 AAV-SC 与 AAV-Nlrp3 Cx3cr1-CreER 小鼠海马 NLRP3（k）、促炎细胞因子（IL1β、IL6、IL-18、TNFα）（l）与抗炎细胞因子（TGF-β、Arg-1）（m）的 mRNA 表达（每组 n = 5）。双因素 ANOVA 继以 Tukey 检验。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；n.s.，无显著性。 图 5｜抑制 H3K4me3 通过削弱 NLRP3 介导的神经炎症，减轻神经发生受损与抑郁样行为的复发样发作。a 实验设计示意图。b, c H3K4me3 抑制剂 WDR5-0103 处理小鼠海马 NLRP3 与 H3K4me3 蛋白水平的免疫印迹（c）与定量分析（b）（n = 6, 6, 5, 5, 4 只小鼠）。d 海马 NLRP3 与 H3K4me3 蛋白表达水平的相关性；NLRP3 蛋白表达与小鼠糖水偏好（或 TST 不动时间）的相关性；H3K4me3 蛋白表达与小鼠糖水偏好（或 TST 不动时间）的相关性。e RT-PCR 检测海马 NLRP3 mRNA 表达（n = 5, 5, 6, 5, 6 只小鼠）。f 海马 Iba1（红）与 NLRP3（绿）免疫染色（右）及 NLRP3⁺ 小胶质细胞百分比定量（左）。DAPI 染核。每组 n = 5 只小鼠。标尺：大图 200 μm，小图 30 μm。g 海马 DG 区 Iba1 免疫染色，DAPI 染核。标尺：大图 100 μm，小图 10 μm。h DG 区 Iba1⁺ 细胞密度、Iba1⁺ 面积百分比、小胶质细胞胞体面积百分比定量（n = 5, 6, 6, 6, 6 只小鼠）。i RT-PCR 检测海马促炎细胞因子（IL1β、IL6、IL-18、TNFα）与抗炎细胞因子（TGF-β、Arg-1）mRNA 表达（每组 n = 5 只小鼠）。j, k SGZ 区 DCX 表达与 BrdU 掺入的代表性荧光显微照片（j，标尺 30 μm），以及 DCX⁺ 细胞、BrdU⁺ 细胞、DCX⁺-BrdU⁺ 细胞密度和 BrdU⁺ 细胞中 DCX⁺-BrdU⁺ 细胞百分比的定量（每组 n = 6 只小鼠）（k）。数据说明：组间比较采用普通单因素 ANOVA 继以 Tukey 检验。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；n.s.，无显著性。 图 6｜本研究揭示的抑郁障碍复发样发作机制示意图。既往抑郁发作通过 H3K4me3 介导的表观遗传重编程，在小鼠海马触发 NLRP3 依赖性的小胶质细胞训练免疫，从而提高小鼠对亚阈值应激的易感性，导致抑郁样行为的复发样发作。该图由 BioRender 绘制。讨论 本研究首次揭示了小胶质细胞训练免疫在抑郁样行为复发中的作用，总结见图 6。我们观察到，经历过初次 CMS 的小鼠再暴露于亚阈值应激时表现出更严重的抑郁样行为，同时小胶质细胞呈现高反应性表型。研究发现，初次 CMS 诱导了小胶质细胞的训练免疫——而非持续的神经炎症——这一过程由涉及 H3K4me3 的表观遗传重编程所介导，从而提高了小鼠对后续应激的易感性。此外，NLRP3 参与训练免疫的形成，加剧小鼠再暴露于应激时的神经发生损伤，而敲低海马小胶质细胞中的 NLRP3 可逆转这一过程。抑制 H3K4me3 通过削弱 NLRP3 介导的神经炎症，挽救了初次 CMS 诱导的神经发生损伤，并改善了小鼠的应激易感性。 长期以来，免疫记忆被认为是适应性免疫应答的独有特征。然而，在包括小胶质细胞在内的先天免疫细胞中发现的"训练免疫"挑战了这一教条 [9, 14, 40]。小胶质细胞的训练免疫已在多种神经精神疾病和衰老中得到研究 [11, 15, 41]。既往抑郁发作史是人们对新发作越来越易感的关键因素，其间先天免疫细胞被表观遗传改变所重编程。初始刺激被认为可促进小胶质细胞持续激活，并在再刺激时加剧炎症反应 [8, 42]。然而值得注意的是，"预激"（primed）的小胶质细胞如何动态、持续地评估并响应其局部微环境信号，尚不清楚。本研究中，经历过初次 CMS 的小鼠仅表现出炎症介质的短期变化，而表观遗传重编程保持稳定——这一证据提示初始应激诱导的是小胶质细胞的训练免疫而非预激（priming）[10, 14, 43, 44]。这一机制似乎与小鼠应激易感性增加相关，而后者可能进而诱发新的抑郁样行为发作。 训练免疫中的表观遗传重编程已被频繁报道。组蛋白修饰（包括 H3K4me3、H3K4me1 和 H3K27ac）的表观遗传控制导致编码促炎细胞因子（如 IL-6、IL-1β 和 TNF）基因的染色质长期开放，这是训练免疫的分子基础 [10, 45]。与本研究一致，环境应激诱导的抑郁发作与基因座上 H3K4me3 沉积的改变密切相关 [12, 46]。我们发现，初次 CMS 触发了促炎反应相关基因座上 H3K4me3 富集的持续增加。同时，这些发现延伸了临床研究的报道：在死于自杀的 MDD 患者脑内，发现了显著上调的 H3K4me3 修饰和更高比例的激活态小胶质细胞 [46, 49]。 小胶质细胞在调控脑内炎症过程中发挥关键作用。受到应激时，小胶质细胞主要表达模式识别受体（PRR）以响应损伤相关分子模式（DAMPs，亦称警报素）[50, 51]。NLRP3 作为一种胞质 PRR，可感知应激触发的 DAMPs（如 ATP），随后激活的 NLRP3 与接头蛋白 ASC 和效应蛋白 pro-caspase-1 组装成炎症小体，促进 IL-1β 和 IL-18 的成熟 [18]。本研究同样发现，初次 CMS 诱导 NLRP3 与促炎细胞因子升高，随后回落至稳态水平；但小胶质细胞中 NLRP3 处的 H3K4me3 富集与染色质可及性持续增强，这使得再暴露于应激时，NLRP3 可迅速感知 DAMPs 并激活 NLRP3 炎症小体，导致小鼠对后续应激的易感性增加。 在信号转导之前，NLRP3 与初级促炎细胞因子的转录需要 DAMPs 激活 NF-κB [52]。我们的海马小胶质细胞 ATAC-seq 与 CUT&Tag 分析也揭示，NF-κB 结合位点处染色质持续解凝缩，且 NF-κB 家族基因座上 H3K4me3 沉积增加。因此，再暴露于应激源时，NF-κB 可能迅速诱导 NLRP3 的转录。炎症过程参与抑郁症复发的病理生理机制 [53]。本研究揭示了 NLRP3 在初次 CMS 诱导的小胶质细胞训练免疫中的作用。 有抑郁病史的个体对未来抑郁发作表现出明显更强的易感性，这可能源于应激敏感化 [54, 55]。应激敏感化模型阐明，抑郁发作提高了对应激的敏感性，从而可能降低诱发抑郁症状所需的应激阈值 [27, 56]。在我们建立的重复 CMS 模型中，初次 CMS 诱导的小鼠抑郁样行为在静息 2 或 4 周后恢复正常，但接受初次 CMS 的小鼠对亚阈值应激表现出更高的易感性，并出现后续抑郁样行为发作。应激诱导的小胶质细胞促炎倾向表型可能损害成年海马神经发生，进而促成行为异常。神经发生受损已知参与抑郁症复发的病理生理机制 [38, 39]。同时，海马是对应激有害效应高度敏感的脑区，其中观察到的成年神经发生与复发性抑郁样发作的易感性相关 [28]。我们发现，小鼠再暴露于亚阈值应激时，CMS 通过诱导 NLRP3 依赖性小胶质细胞训练免疫加重神经炎症反应，损害成年海马神经发生；抑制 H3K4me3 可逆转这一过程，并伴随行为学改变。 本研究存在一些局限性，值得进一步探究。其一，为控制激素对表观遗传的影响，本研究目前仅限于雄性小鼠。鉴于雌激素调控 H3K4me3 活性 [57, 58]，孕酮调控抑郁症中小胶质细胞 NLRP3 炎症小体激活 [59, 60]，未来工作应系统比较不同性别间的应激敏感化机制。其二，尽管 ATAC-seq 与 CUT&Tag 的样本混池是技术条件所限，但这一方法本身掩盖了小胶质细胞的个体异质性。我们发现既往应激经历诱导的小胶质细胞训练免疫增强了小鼠对亚阈值应激再暴露的易感性；临床数据表明，疾病复发与免疫-炎症通路的激活显著相关 [22]，尽管这些外周免疫通路在很大程度上可预测脑内小胶质细胞激活与神经炎症，但外周炎症反应是否也应被纳入研究和考量，仍值得探索。其三，虽然本研究有效捕捉了核心抑郁样表型（快感缺失、行为绝望），未来使用该模型的研究应纳入小鼠认知行为评估。最后，尽管 CMS 被认为是研究抑郁发作的经典动物模型，仍有必要使用其他动物模型研究抑郁症的复发。 本研究结果表明，既往应激事件通过 H3K4me3 调控塑造了小胶质细胞的长期训练免疫。小胶质细胞 NLRP3 依赖性炎症过程使动物对应激更加脆弱。抑制 H3K4me3 可阻断 NLRP3 依赖性小胶质细胞训练免疫，挽救应激诱导的神经发生损伤，并减轻小鼠抑郁样行为的复发样发作。训练免疫是治疗抑郁发作复发之免疫机制的新型药物靶点。数据可用性 本研究报道的 RNA-seq、ATAC-seq 和 CUT&Tag 数据已存放于 NCBI BioProject，主登录号为 PRJNA1203027。本文未报告原创代码。致谢 本研究中图 2i 和图 6 由 BioRender 绘制（Gaojie, X. (2025)，https://BioRender.com/o51n420 和 https://BioRender.com/nryc5ul）。本工作得到国家自然科学基金（项目号 82430124、82401796）、四川省科技计划项目（项目号 2025ZNSFSC0573、2025ZNSFSC1718）以及四川大学华西医院学科卓越发展 1·3·5 工程（ZYJC21004）的资助。作者贡献 徐高洁设计研究、完成大部分实验与数据分析并撰写论文。袁敏岚、李欣宇和刘刚彩完成动物模型建立。吴自强、张晓梅和杨倩完成动物行为学检测。易锦和颜浩完成 ATAC-seq 与 CUT&Tag 分析。陈玉香和林山宇完成 qPCR 分析。何慧、张进强和 Michael Maes 修订论文。游自立、张伟和陈华富构思研究并撰写论文。全体作者均已阅读并批准论文终稿。利益冲突 作者声明无利益冲突。附加信息 补充信息：网络版包含补充材料，见 https://doi.org/10.1038/s41380-025-03344-y。通信与材料索取请联系张伟、陈华富或游自立。 —————————————————————————————— 新市桥南边的天空