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在做细胞增殖分析（CFSE/CellTrace Violet 等）时，很多科研伙伴是不是常常遇到这样的问题：分裂代太多、峰分不清？代群和功能标记（如 CD69、IFN-γ）难以关联？每次分析都要重新画门、复制设置？批量样本无法快速复用分析流程？ 其实，使用 「ModFit LT + WinList」 的组合，可以一次性建立完整的增殖模型，并通过 「FCOM + NStat」 实现 「不同代之间的功能状态可视化和统计分析」。 ModFit LT 与 WinList 提供了强大的工具，用于深入分析细胞增殖实验的数据。只需几次鼠标点击，ModFit LT 即可完成复杂的 「最小二乘拟合（least squares analysis）」，并揭示增殖实验背后的关键生物学信息，包括： 「Proliferation Index（增殖指数）」 「Non-proliferative fraction（未增殖细胞比例）」 「Precursor frequency（前体细胞频率）」 「各分裂代群体的百分比」 这些分析结果可以导出并用于其他软件进行进一步的数据处理或统计分析。 接下来是 WinList 的强大配合——「NStat 分析区域（NStat regions）」 可以导入来自 ModFit LT 的增殖结果，并按照细胞增殖分析的各代群体自动进行划分和统计。这一增强功能为更高级别的联合分析创造了条件，例如结合表型标记、活化指标、细胞功能等进行多维数据解析。 本教程将展示这些新特性，并以一个 「CFSE 染色样本（含多个标记）」 作为示例进行详细讲解。整体流程概览 从 ModFit LT 的 「Cell Tracking Wizard（细胞增殖向导）」 开始…… ……并将这些结果导入 「WinList」，开启对细胞增殖行为的全新、多维度探索。 「🔬【知识补充：增殖指数 PI、前体频率 PF 等参数的意义】」 参数 说明 典型用途「Proliferation Index（PI）」 平均分裂次数，衡量总体增殖能力 药物筛选、免疫细胞活化「Non-proliferative fraction」 从未分裂过的细胞比例 判断免疫应答程度「Precursor frequency（PF）」 最终所有分裂细胞的祖细胞比例 T 细胞免疫功能、细胞治疗研究「各代细胞比例」 0、1、2、3…代 细胞动力学趋势分析 对于免疫学、肿瘤学、免疫治疗（如 CAR-T、DC、NK 细胞）研究，这些参数具有非常重要的参考价值。 「ModFit LT + WinList = 精准增殖拟合 + 多维标记分析」能实现真实科研中更复杂的细胞功能评估。开始使用 首先，我们将在 「ModFit LT」 中使用 「Cell Tracking Wizard（细胞增殖向导）」 来完成增殖分析，并导出其结果。随后，我们将在 「WinList」 中设置 「NStat 区域」，以导入 ModFit LT 的增殖代数信息，实现进一步的多维分析。 为完成本教程，你需要同时使用 「ModFit LT」 和 「WinList」 软件，其中 「WinList 版本必须 ≥ 9.0」 才支持该增强功能。 「CFSE（Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester）」是一种常用于标记活细胞的增殖染料： 初始染料浓度高 → 代表 「未分裂的母代细胞」 每一次细胞分裂 → 染料在两子细胞间 「平均分配」 因此信号强度每代减少约 「50%」 形成清晰的 「多代峰形（Generation peaks）」 这种“强制性二分”的染料特性，使 CFSE 成为分析 T 细胞活化、免疫治疗、药物响应等实验的黄金标准。 而 ModFit LT 可以对这些代峰进行精确数学拟合并输出完整增殖指标；WinList 可以在此基础上结合多标记表型进一步解读，是科研中最常见的组合工具。操作步骤 • 启动 「WinList」 并跳过初始提示窗口。• 启动 「ModFit LT」 并同样跳过初始提示窗口。• 在 ModFit LT 中点击 「Open FCS」，进入 「WinList 程序目录中的 Samples 文件夹」。• 选择 「CFSE sample.fcs」 文件并点击 「Open（打开）」。 提示：由于软件版本不同，你看到的对话框外观可能与教程示例略有差别，这是正常现象，不影响操作。 • 选择 「“FL1-H-CFSE”」 作为分析参数（即用于绘制直方图的荧光通道）。• 接着，右键点击直方图，选择 「Edit X Parameter（编辑 X 轴参数）」。在 「Transform（数据变换）」 中选择 「Log（对数变换）」，然后点击 「OK」。 「🔬【知识补充：为什么分析 CFSE 时要使用 Log 对数变换？】」 在流式细胞仪数据中： CFSE 的荧光强度跨越多个数量级 每次分裂都会使荧光减半 因此代峰呈指数关系（2ⁿ） 使用 「线性坐标（Linear）」 会使低信号部分压缩到一起，难以区分代数。 而 「Log（对数坐标）」 会将峰形拉开，使代与代之间更清晰，更便于：确定分裂代数 、自动或手动识别峰、拟合增殖模型。 简单理解：Log 能让“挤在一起的峰散开”，便于分析。 X 轴已经显示为 「Log 对数变换」。此时我们 「无需创建任何 gate（门控）」 —— 后续将在 WinList 中完成门控和多维标记分析。 • 点击 「OK」 关闭对话框。• 在 ModFit LT 的 「Home」 选项卡中，选择 「Cell Track Wizard（细胞增殖向导）」。• 在弹出的 Cell Tracking Wizard 对话框中，点击 「Generations（代数设置）」 选项卡，并从下拉菜单中选择 「“Floating”」 作为增殖模型类型。• 点击 「Other（其他设置）」 选项卡，勾选 「Export partition table（导出划分表）」 和 「Prompt for file name（提示输入文件名）」。启用这些选项后，程序将在分析结束后导出增殖代分布数据，并允许你自行命名输出文件。 「🔬【知识补充：什么是 Floating Model？】」 在增殖分析中，ModFit LT 提供两种模型模式： 模式 结构特点 适用场景「Standard 标准模式」 各代峰间距固定为 ½ 关系 峰形规则、代数清晰「Floating 浮动模式」 允许代峰位置和间距自动调整 峰形不规则、信号偏移、样本存在表型差异 因此，「Floating 模型」更适合真实生物样本，例如： 难分染色造成峰间距偏移 T 细胞活化导致荧光衰减不均匀 同时存在不同细胞亚群 多标记联合实验（如 CFSE + activation markers） 它可以使拟合更加灵活、更接近实际生物学行为。 • 最后，点击 「Analyze（分析）」 按钮开始进行分析。• 分析完成后，会弹出 「Choose Location to Save Partitions（选择保存分区文件位置）」 的对话框。• 文件可以保存在任意位置。本教程建议将此导出文件保存在 「桌面」，便于后续在 WinList 中导入。 当你启用了 Cell Tracking Wizard 的 「Export（导出）」 选项时，程序会计算不同细胞分裂代之间的边界，并将这些信息写入导出文件中。这些代界点（Generation boundaries）是模型中 「各高斯分量曲线相交的位置」。 「🔬【知识补充：代界点（Generation Boundaries）是如何定义的？】」 在 CFSE 增殖分析中： 每一代细胞的荧光峰由一个 「Gaussian（高斯峰）」 拟合 邻近两代 Gaussian 曲线相交的点，被定义为 「代际边界」 这个边界用于将直方图分成多个清晰的代区间配置 WinList • 切换到 「WinList」 窗口，点击功能区上的 「Open FCS（打开 FCS 文件）」。• 进入 「WinList 安装目录中的 Samples 文件夹」，选择 「“CFSE sample.fcs”」，点击 「Open」。• 在弹出的 「Create Histograms（创建直方图/散点图）」 对话框中：　— 在 X 轴参数中选择 「CFSE」　— 在 Y 轴参数中选择 「CD69 PE」• 点击 「Add to List」 两次，用于生成 「两个 CFSE vs CD69 PE 的散点图」。• 点击 「OK」 关闭对话框。 「🔬【知识补充：为什么要创建两个相同的 CFSE vs CD69 PE 图？】」 在本教程中，我们将： 「第一个图」应用 WinList 的 「NStat region」，用于按照 「ModFit LT 导出的增殖代界点」 自动划分代群； 「第二个图」用于进一步的 「表型分析（如 CD69 激活状态）」 与 「不同代之间的比较」。 你可以更改刚刚创建的散点图或直方图的显示样式。右键点击图形，选择 「Graphics（图形设置）」，尝试不同的显示选项，找到最适合你数据展示方式的视觉效果。 在本次分析中，我们需要将 「X 轴和 Y 轴」 都设置为 「标准 Log（对数）变换」，而不是 「HyperLog」。这是因为从 ModFit LT 导出的增殖分区信息是以 「Log 单位」 进行计算的，如果使用 HyperLog 显示，将导致分区导入与代界点位置不匹配。 • 将鼠标移动到 X 轴标签 「CFSE」 上，点击出现的小三角标记。在变换列表（Transform）中选择 「Log」。对 「CD69（Y 轴）」 重复相同操作，将其同样设置为 「Log」。 「🔬【知识补充：为什么要使用标准 Log，而不是 HyperLog？】」 变换方式 特点 使用场景「Log」 数值范围均匀展开，尤其适合分裂代峰呈指数规律的数据 CFSE、CellTrace、BrdU、DNA含量分析「HyperLog」 主要用于多色流式中显示极低信号 + 多数量级变化的数据 复杂荧光补偿、多参数面板 在 CFSE 的增殖分析中： CFSE 信号每次分裂减半 代峰结构严格遵循指数规律（2ⁿ） Log 变换可以使代峰间距直观、清晰、规律 而 HyperLog 会对低值进行拉伸、高值压缩，使增殖代峰看起来不均匀，导致：难以观察代峰的真实结构、导入 NStat 分区时区间位置不匹配、影响多代功能标记对比分析 • 点击第一个散点图的标题栏，使其处于激活状态。• 在图形工具栏中点击 「NStat region（NStat 区域工具）」 按钮。• 在弹出的 「NStat Properties（NStat 区域属性）」 对话框中，点击 「Import（导入）」 按钮。 • 导航到 「Desktop（桌面）」，选择导出文件 「CellTrackingWizardPartitions.txt」，然后点击 「Open（打开）」。• 将 「NStat rows（NStat 行数）」 设置为 「1」，并勾选：「Show Vertices（显示边界点）」 、 「Show Results（显示结果）」 、 「Enable gates（启用区域）」• 导入后列数（Columns）应自动为 「10 列」，无需修改。• 点击 「OK」 确认。 「🔬【专业补充：为什么设置 NStat rows 为 1？】」 NStat rows 表示在区域划分中要创建的水平分区数量。 值 含义 使用场景「1 行」 仅按 X 轴（CFSE）进行代际划分 CFSE 增殖分析 多行 同时按 X 与 Y（或其他标记）多维划分 更复杂的功能图谱分析 本教程的目标是：先基于 CFSE 代界点划分代群，再在第二张图上叠加 CD69 表型分析。因此，只需一行分割，不涉及 Y 轴切分。 「勾选三个关键选项的意义:」 选项 作用 使用效果「Show Vertices」 （显示顶点） 显示代界点位置 便于观察和调整「Show Results」 （显示结果表格） 显示各代所占比例统计 可查看代群信息「Enable gates」 （启用区域） 激活区域用于统计和复制 支持后续表型分析 WinList 会根据从 ModFit LT 导入的 「Cell Tracking（细胞增殖）」 信息，自动创建 「NStat 分区（NStat partitions）」，并弹出一个结果窗口，显示各代细胞的统计数据。分离与分析不同代群体 此时，你已经完成了从 ModFit LT 到 WinList 的基本导入过程。接下来，我们将进一步利用 WinList，「探索其他标记在不同增殖代中的表达情况」，实现真正的多维分析。 • 点击第二个散点图的标题栏使其激活，然后点击 「NStat region（NStat 区域工具）」 按钮以创建新的 NStat。• 将 「NStat rows（行数）」 设为 「2」，「NStat columns（列数）」 设为 「1」。• 勾选 「Enable gates（启用区域）」，取消其他选项，点击 「OK」。 现在，其中一张散点图已经包含了基于 「CFSE 代界点」 划分的 NStat 分区（用于区分不同增殖代），而第二张散点图上的 NStat 将用于定义 「CD69 阴性与阳性」 细胞群。 • 用鼠标拖动第二张散点图中 NStat 区域的标签，将其移动到合适位置，使其大致将两个主要群体分开（即 「CD69⁻ 和 CD69⁺」 之间的分界）。 你可以右键点击任意图形，选择 「Graphics」 更改显示样式，以更好地区分两个群体。 「🔬【知识补充：如何判断 CD69⁻ 与 CD69⁺ 的边界？】」 在 CFSE × CD69 PE 的散点图中，常能看到两个明显的聚集群： 左下方密集、低 CD69 信号 → 「CD69⁻ 未激活细胞」 右上方或右侧、CD69 信号高 → 「CD69⁺ 激活细胞」 分界线的设定不需要精确到单细胞层面，而是：找到两群体之间的谷值位置或信号分离最明显的点。这是常见免疫学分析策略，也与 FACS 手动画 gate 的原则一致。 为了更好地 「独立分析和可视化」 每个增殖代群，我们将使用 WinList 中的 「FCOM（Function Combine）」 函数创建新的计算参数。FCOM 可以根据多个 「Gate（门）」 输出一个新的分类参数，使每个细胞都能被标记为所属的代群，从而让我们在不同图形或统计工具中轻松比较各代细胞。 此功能特别适合： 「分离与单独查看每一代群体」 「绘制代群分布趋势图」 「比较不同代的激活或功能状态」 「将代信息与其他标记结合进行统计分析」 它将借助我们刚刚创建的 「NStat 区域（增殖代 + CD69 结构）」 的 gates 作为输入。 接下来，我们将创建多个 FCOM 计算参数，以便逐一分离增殖代。• 点击主功能区上的 「Add Parameter（添加参数）」 按钮。或者，你也可以右键点击数据源区域，在弹出菜单中选择 「Add Parameter（添加参数）」。• 在 「Edit Calculated Parameters（编辑计算参数）」 对话框中，点击 「Add（添加）」。• 在 「Name（名称）」 输入框中输入：「Proliferation（增殖）」。• 将以下公式输入或粘贴到 「Equation（公式）」 编辑框中，然后点击 「OK」： FLOG(FCOM(G1,G2,G3,G4,G5,G6,G7,G8,G9,G10)+0.5)*256/FLOG(1024)+FRND(3)📖 公式解释与原理说明 这段表达式包含多个关键步骤，下面将逐一拆解：1. FCOM 部分：Gate Combination（门组合函数） FCOM(G1,G2,G3,G4,G5,G6,G7,G8,G9,G10) 「FCOM」 是一个 「Gate 组合函数」，用于根据多个门的状态生成数值结果。 如果只有 1 个 gate → 只存在两种情况：在 gate 内 / 不在 gate 内 如果有 2 个 gates → 有 4 种组合 这里有 「10 个 gate」 → 理论上可生成 「2¹⁰ = 1024」 种组合 但是在本分析中：👉 这些 gates 「完全不重叠」👉 每一个 gate 代表一个独立的 「增殖代（Generation）」 因此最终只会产生以下 10 个数值： 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 也就是说，如果画直方图，你会看到 「10 个离散的尖峰（spikes）」，并且 「呈指数间隔」。2. FLOG 部分：Logarithmic Expansion（对数展开） FLOG(FCOM(...)+0.5)*256/FLOG(1024) 由于 FCOM 输出值呈指数规律（倍增），为了让它们 「在图形上均匀分布而非挤在一起」，使用 「FLOG（对数函数）」 来展开数值。 步骤解释： +0.5 用于避免 log(0) 问题 *256 / FLOG(1024) 将结果重新映射到 「0–256 的可显示通道范围」 这样 10 个代群会在直方图上 「线性等间距显示」3. FRND 部分：随机扩展为高斯峰 +FRND(3) 这一项为每个 spike 添加少量随机数，使其从细尖峰变成可视化更友好的 「Gaussian-like 细胞群分布」。 「简单理解：从一根竖线 → 变成可识别的峰形」🎯 总目标 「将增殖代（Gen0–Gen9）转换为可视化、可独立分析的连续变量」 用新生成的 「Proliferation」 参数，我们可以： 将细胞分代绘制为直方图或曲线图 组合 CD69、IFN-γ 等功能标记 比较不同代功能变化 制作更直观的图用于文章或展示 • 在 「Edit Calculated Parameters（编辑计算参数）」 对话框中，再次点击 「Add（添加）」 按钮。• 在 「Name（名称）」 输入框内输入：「CD69 Expression」。将对应的公式输入或粘贴到 「Equation（公式）」 编辑框中，然后点击 「OK」。 (FCOM(G11)+0.5)*256/2+FRND(3) • 点击 「OK」 保存设置。基于增殖代观察 CD69 表达情况 现在，我们已经准备好以更深入、更有洞察力的方式探索这份数据了。能否清晰看到不同增殖代（Generations）之间 CD69 的表达差异？是否可以分别量化各代中 「CD69⁺ 细胞群体」 的表达强度？ 答案是：「当然可以。」 • 在功能区的 「Insert」 选项卡中，点击 「Density plot（密度图）」。这将在数据源视图中生成一个默认的新图形。点击图形的 「X Axis（X 轴）」 标签，选择 「Proliferation」。点击 「Y Axis（Y 轴）」 标签，选择 「CD69 PE」。 此时你会看到每个细胞根据其所属增殖代与 CD69 信号位置排列形成可视化结构。📌 创建另一张图用于分离 CD69⁺ 与 CD69⁻ 群体 • 右键点击刚刚创建的密度图，选择 「Clone（克隆）」。系统会创建一份图的副本。• 将副本图的 「Y Axis」 改为显示 「CD69 Expression（之前构建的计算参数）」。解读图形结果 在图形中，我们能够清楚地看到不同的细胞增殖代群（Generations）在 「X 轴」 上被分离成独立的聚集群。这些代间分离来自于我们之前创建的第一个 「FCOM 计算参数（Proliferation）」。「Parent generation（母代、未分裂群）」 具有 「最高的 CFSE 强度」，因此显示在最右侧。 在左侧的图中，「Y 轴」 显示连续的原始 CD69 表达信号（CD69 PE）。我们可以观察到： 「Parent generation（母代）」 表达 「最高水平的 CD69」 后续的每一代子代细胞（Gen1、Gen2…）呈现 「逐步递减的 CD69 表达」 这表明细胞分裂次数越多，其 CD69 激活状态可能逐渐下降，这是在免疫生物学研究中非常有意义的规律。 在第二张图中，Y 轴显示我们构建的 「CD69 Expression FCOM 参数」。该参数让 「CD69⁺ 与 CD69⁻ 细胞」 被非常清晰地分离开，使我们能够：「通过简单创建区域（regions），轻松统计每一个增殖代中的 CD69 激活细胞比例（CD69⁺）。」让分析流程更高效、更轻松 你已经完成了本教程中最关键的设置步骤。如果将当前配置 「保存为 WinList 的 protocol（协议）或 protocol bundle（协议包）」，那么： ✨ 所有 「FCOM 计算参数」✨ 「NStat 区域设置」✨ 「显示配置与图形布局」 都可以被完整保存，并在后续分析中 「一键调用」，无需重复设置。 今后，当你使用 「ModFit LT 的 Cell Tracking Wizard（细胞增殖向导）」 分析新的数据文件时： 对新样本运行增殖分析 导出新的 partition 文件（代界点信息） 在 WinList 中打开相同的数据分析 protocol 将 partition 文件导入 NStat 区域（如本教程所示） 「所有 FCOM 参数及统计结果自动更新」 🔁 「不需要重新设置分区、参数或图形布局」。

抗体偶联药物 (ADC)由强效小分子细胞毒素通过化学键与单克隆抗体结合，比抗体具有更复杂的结构，相对应的分析方法以及关键质量指标也更多。ADC常用的分析方法包括质谱分析（确定ADC的分子量、药物负载和连接剂类型、偶联位点）、高效液相色谱（评估ADC的纯度和药物负载、有关物质检测）、生物活性测试（如细胞毒性试验，确定ADC的生物活性）、稳定性分析（评估ADC在储存和运输过程中的稳定性）、结合亲和力测定（如表面等离子体共振SPR，测量ADC与目标抗原的结合亲和力）等。今天为大家解读一篇关于ADC分析方法开发的文章。以期为大家在ADC药物质量研究及检测放行和稳定性研究上提供思路参考。1. 前言分析方法是抗体偶联物药物（ADC）研发用于临床试验及商业化的核心要素之一。目前已有多种检测方法应用于产品特性分析、放行检验、稳定性测试以及药代动力学和药效学研究。由于单克隆抗体（mAb）的复杂性，ADC的特性分析除需控制载药比、载药分布及药物相关杂质的方法外，其他主要还是基于单抗药物的分析方法。ADC检测方法的开发远早于非临床和临床研究的启动，并在ADC研发全生命周期中持续优化，在商业化前完成全面验证。鉴于ADC的复杂性，所选方法必须符合特定用途需求，如放行检验、稳定性测试或产品特性分析。方法开发需综合考虑临床研发阶段及ADC特性。相较于单抗，ADC因偶联异质性（即抗体药物偶联比DAR、载药分布、位置异构体）以及未偶联抗体、游离药物等额外产物变体而更具复杂性。本章将重点探讨ADC的放行检验、稳定性研究、特性分析方法及产品属性，特别关注ADC检测方法开发中的特殊考量与挑战（表1）。并将探讨FDA对ADC特异性检测方法的监管要求。表1. ADC关键质量指标 2. DAR值检测载药特性分析包含测定平均抗体药物偶联比（DAR）、载药分布、载药变体及位置异构体的检测方法。DAR是ADC特性分析、放行检验和稳定性测试的关键质量属性之一，用于衡量与单克隆抗体共价连接的细胞毒性剂平均数量。在一定范围内，DAR通常与ADC的效力呈正相关，高DAR值往往意味着更强的细胞毒性。目前主要通过以下分析方法测定DAR：紫外分光光度法、质谱法（MS）、疏水相互作用色谱法（HIC）以及反相高效液相色谱法（RP-HPLC）。用于放行检验和稳定性测试的DAR测定方法选择取决于药物-连接子的理化特性，以及单抗与药物-连接子的偶联化学方式（如赖氨酸侧链胺基、链间二硫键还原后的半胱氨酸巯基、或定点突变引入的半胱氨酸残基）。对于通过硫醚键与单抗半胱氨酸残基偶联的药物，通常采用HIC法测定DAR。通过计算HIC色谱图中各偶联变体的相对丰度，可得出ADC样品中每种偶联组分的DAR值。对于通过抗体赖氨酸残基偶联的药物，则多采用紫外光谱法。该方法通过分别测定药物-连接子和抗体在各自特征波长下的吸光度峰值及消光系数，基于各组分的差分吸光度计算出单抗与药物-连接子的总摩尔浓度，最终获得以"每摩尔单抗结合药物摩尔数"表示的平均DAR值。但该方法存在局限性：其特异性不足的前提是假设游离抗体和游离药物含量极低，且要求ADC样品纯净无干扰组分，同时抗体与药物-连接子的吸收峰需完全分离。其他DAR测定方法包括：通过非变性质谱分析获得的载药分布数据，可对抗体与药物-连接子的各积分峰进行加权峰面积计算，加和所有观测组分的加权峰百分比以获得平均DAR值，但该方法较少用于批放行和稳定性测试。研发阶段会采用多种方法并行测定DAR以确保数据相关性。研究发现紫外光谱法与质谱法测得的DAR值存在不一致性：去卷积质谱获得的平均DAR值通常偏低，原始质谱数据也呈现相同趋势，这表明糖基化ADC的去卷积处理过程也会导致DAR测定值出现偏差。更多关于ADC药物DAR值分析的内容大家可阅读小编之前的文章：3. 载药分布（DLD）即便具有相同平均DAR值的ADC，其单抗上的载药分布也可能存在差异。研究表明，不同载药物种在体内可能具有不同的清除速率。然而，对于特定DAR值下不同载药分布是否会引发活性差异，进而影响临床疗效和安全性，目前尚未有文献记载。现有多种方法可用于表征载药分布，包括疏水相互作用色谱法（HIC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）、等电聚焦电泳法（IEF）等。载药分布分析通常作为产品特性研究。由于目前缺乏数据证明特定DAR值下的载药分布是否会影响临床安全性和有效性，建议在产品放行和稳定性测试中进行该项检测。该测试对于评估生产工艺变更后ADC质量可比性具有重要意义。多种分析方法可用于测定抗体载药分布，方法选择通常取决于药物-抗体连接方式（如赖氨酸连接型ADC与半胱氨酸连接型ADC等）。3.1 赖氨酸偶联的ADC对于通过赖氨酸残基侧链胺基偶联药物的ADC，通常采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）测定载药分布及未偶联抗体水平。ADC样品的制备需在非变性天然条件下进行。分析结果显示的是包含零至数个药物分子的载药物种混合物。若可获得不同DAR值的ADC样品，可通过分析确定平均DAR值与游离抗体含量之间是否存在相关性。通过还原去糖基化ADC的质谱分析，可测定轻链和重链物种的载药分布。结合LC-MS与胰蛋白酶肽段图谱分析，能够定位抗体上与药物-连接子结合的修饰位点。同时可定量每个被修饰赖氨酸的占据百分比。这些分析通常作为产品特性研究的重要组成部分。由于药物-连接子对赖氨酸胺基或蛋白N末端的修饰会降低抗体整体正电荷，采用成像毛细管等电聚焦（iCIEF）进行电荷分析可半定量测定载药分布（方法经适当验证后）。该技术还可通过测量电泳图中最碱性峰的相对丰度，定量检测ADC中存在的未偶联抗体。更多关于ADC药物载药分布及偶联位点分析的内容大家可阅读小编之前的文章：3.2 半胱氨酸偶联的ADC当前药物研发领域中的大多数ADC药物属于半胱氨酸偶联型ADC。该类ADC通过部分还原抗体中原有的四个链间二硫键，使产生的游离巯基与药物-连接子发生偶联反应，形成硫醚键连接的共价复合物。针对这类半胱氨酸偶联ADC，由于存在共价与非共价结合的轻链和重链混合体系，所有完整分析必须在非变性条件下进行以维持IgG重轻链的非共价结合状态。传统LC-MS方法采用的剧烈溶剂条件会破坏抗体轻重链间的非共价结合，因此难以直接用于质谱分析。尽管研究人员通过开发和优化天然质谱法在分析中保留非共价结构，但此法是以牺牲检测灵敏度为代价的。Valliere-Douglass等人开发的天然LC-MS检测方法首次实现：在天然状态下通过新LC-MS方法观察到，去卷积物种的相对强度与正交技术表征的载药分布分数贡献值呈正相关。虽然优化后的LC-MS法可用于分析载药分布，但分析型疏水相互作用色谱法（HIC）更常用于分离和定量半胱氨酸偶联ADC中不同载药量的分布情况。该方法利用药物-连接子与半胱氨酸残基结合后增强的疏水特性，在非变性温和条件下实现分离，保留由共价和非共价结合共同维持的各种载药变体的抗体亚基结构。通过测定各载药变体的DAR值，可根据分离所得分子种类变体的相对丰度计算溶液中的加权平均DAR。该方法可解析每个抗体0-8个药物的载药变体分布：由于每个还原二硫键产生两个巯基，偶数载药变体占比更高（但也观察到奇数载药变体）。若偶联反应设计控制得当，未偶联抗体通常含量较低并可定量。通过加和各载药变体的相对百分比可计算平均DAR值。谱图质量取决于细胞毒性药物的疏水性及目标平均DAR值。除天然质谱法和HIC法外，部分还原ADC的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）也可用于评估药物-连接子在抗体重轻链上的分布，该方法能提供重轻链的载药分布数据用于计算平均DAR，但无法获得单个抗体的载药分布信息。更多关于ADC药物载药分布分析的内容大家可阅读小编之前的文章：4. 位置异构体分析位置异构体分析用于测定半胱氨酸偶联ADC中药物在抗体上的偶联位点。通过疏水相互作用色谱法（HIC）分离含特定药物-抗体比值的组分，并采用毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行进一步分析，可确定各位置异构体的相对丰度。获得的位置异构体群体数据可用于计算载药分布，并验证其与其他方法测得的载药分布实验数据相关性。研究人员开发了一种数学分析方法，通过整合不同DAR物种丰度信息（HIC数据）与未分馏样品的毛细管电泳解离数据，可一次性测定异质样品的位置异构体分布。该结果通过对特定载药物种分离样品的分析得到验证。对基于相同IgG和小分子药物组合的多种ADC分析表明，使用该技术所有分子均显示出高度相似的异构体分布，证明偶联工艺具有稳健性。该方法已用于确定位置异构体相对丰度变化与平均DAR值的关联性：对不同平均DAR值的ADC，CE-HIC分析数据显示异构体分布与平均DAR值存在相关性——较低平均DAR样品中0和2载药变体较多，而较高DAR样品中6和8载药变体占主导。位置异构体分析通常作为产品特性研究的重要组成部分，用于评估生产工艺变更及其对产品质量的影响。更多关于ADC药物位置异构体分析的内容大家可阅读小编之前的文章：5. ADC的浓度ADC浓度的测定是通过测量特定紫外波长下ADC溶液的吸光度，并利用ADC的摩尔吸光系数进行计算获得。ADC的摩尔吸光系数由单克隆抗体（mAb）和药物-连接子共同贡献，可通过紫外光谱仪进行实验测定。抗体的摩尔吸光系数可采用理论值，但需通过实验验证确认。ADC的理论比吸光系数是通过其摩尔吸光系数除以抗体的平均摩尔质量而建立。使用该比吸光系数计算的浓度仅反映ADC的蛋白质组分（即mg/mL蛋白量），不包含偶联药物-连接子的质量。该检测是测定ADC药物制剂强度的关键方法，用于计算临床给患者施用的药物剂量。此项测试在产品放行和稳定性研究阶段均需执行。更多关于ADC药物浓度测定的内容大家可阅读小编之前的文章：6. 药物相关物质药物相关物质是指ADC样品中未偶联的药物相关杂质，主要包括游离药物、游离药物-连接子以及淬灭的药物-连接子。反相高效液相色谱法（RP-HPLC）用于定量ADC中游离药物相关物质的含量：通过有机溶剂萃取ADC样品，使裸抗体和药物偶联抗体共同沉淀，取含未偶联药物相关物质的上清液，在药物-连接子特异性波长下进行RP-HPLC分析。使用杂质对照品对药物相关物质色谱峰进行定量。总药物含量通过原始ADC样品的紫外光谱法直接测定（无需溶剂萃取或沉淀）。该检测在ADC放行和稳定性研究阶段实施。 ADC中的药物相关杂质需通过非临床研究进行定性，但临床批次中的杂质水平有时可根据现有安全性数据予以论证。RP-HPLC法因其成熟的方法学特性，可提供优异的峰形、特异性、重复性、分离度和质量平衡，被广泛用于小分子活性药物成分的分析，适用于含量测定和杂质分析。但开发用于ADC中药物-连接子分析的RP-HPLC方法面临独特挑战：药物-连接子在样品制备过程或色谱柱水相流动相中可能发生降解，导致色谱图中出现假峰从而误导杂质含量结果。因此方法开发通常聚焦于优化样品制备和流动相条件以稳定药物-连接子并最小化降解。分析反应性药物-连接子中间体时，需先研究不同条件（如pH值和温度）下药物-连接子反应的化学动力学，据此优化关键色谱条件——通过反应速率指导选择最佳稀释剂、流动相、pH值和柱温以最小化柱上降解。该方法应开发为稳定性指示方法，同时适用于放行检验和稳定性测试。更多关于ADC药物有关物质分析的内容大家可阅读小编之前的文章：7. 药物偶联对抗原结合的影响监测抗原结合能力的检测对于确保产品效力至关重要。该检测还可用于评估偶联工艺或药物分子本身是否影响抗原结合——根据偶联位点和化学方式的不同，药物可能干扰抗原结合。一项研究通过将DM1偶联至赖氨酸、单甲基澳瑞他汀F（MMAF）偶联至半胱氨酸，评估了相同抗CD22单抗上载药量对抗原结合的影响。研究表明DM1偶联可能干扰抗原结合，估算每个单抗结合1-4个DM1分子即足以对抗原结合产生负面影响。多种检测模式适用于抗原结合分析：当可获得充足重组形式抗原且抗体对重组抗原的识别与细胞表达抗原相似时，常选择ELISA法。即使使用部分纯化的细胞蛋白组分替代纯化抗原也可行，但此类检测需额外设置对照且难以标准化。ELISA法中通常固定抗原或其片段，使溶液中的单抗或ADC与之结合，再采用过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗Ig二抗检测结合产物。但ELISA仅能提供相对结合数据，而表面等离子共振（SPR）技术可测定实际亲和力。SPR的劣势在于需要特殊仪器和专业技能，方法优化具有挑战性：例如极慢的解离速率难以测量，导致无法确定解离常数，此时仍需通过稳态分析（绘制平衡结合水平与分析物浓度关系图）估算亲和力（KD）。此外，相互作用过程中相对常见的构象变化需采用二态拟合模型而非1:1拟合获取KD值，这本身带来新的挑战。需特别注意：SPR测定KD值时溶液中使用单价蛋白（通常为抗原）是必要条件，但目前仍有使用完整单抗溶液的不当实验设计发表。若无法获得纯化抗原，可选择基于细胞的结合分析法。该方法需要表达内源性或转染抗原的合适细胞系，且ADC对细胞的非特异性结合必须较低。由于许多ADC靶向抗原设计为结合后快速内化，必须通过缩短孵育时间、使用固定细胞和/或在0-4°C下操作以最小化抗原-ADC复合物的内化。细胞结合检测可采用板式形式（检测方式类同ELISA，常作为直接结合分析法），也可开发竞争性细胞结合检测（使用铕标记单抗及系列稀释的单抗或ADC），或采用流式细胞术与荧光标记二抗进行分析。任何情况下都需评估浓度依赖性结合以估算样品的相对亲和力。抗原结合检测应纳入ADC的批放行和稳定性监测计划，同时通常作为单抗中间体的效价测定方法。为评估药物或偶联工艺是否影响抗原结合，需平行比较未偶联单抗与ADC的结合能力。8. 细胞杀伤检测ADC的预期作用机制是抗原特异性药物依赖性细胞毒性，因此使用表达抗原的细胞进行体外细胞毒性检测，是放行检验和稳定性研究中至关重要的效价测定方法。细胞增殖和活力检测是评估细胞毒性的首选方法。 细胞增殖可通过直接计数活细胞或间接评估方式测定。间接检测采用核苷酸类似物（包括放射性胸苷或5-溴-2'-脱氧尿苷BrdU），这些物质在S期被活跃复制的细胞摄入。此类检测无法识别存活但未增殖的细胞。尽管细胞增殖检测灵敏度高且可定量，但作为放行或稳定性检测实施存在挑战。细胞活力检测主要分为两类：第一类直接检测凋亡细胞，通常采用碘化丙啶和荧光标记膜联蛋白V共染色，通过流式细胞术区分不同细胞群体——碘化丙啶被晚期凋亡和坏死细胞摄取，而膜联蛋白V可结合早期凋亡细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（晚期凋亡和坏死细胞也结合）。也可通过半胱天冬酶3/7活性检测凋亡细胞，如Caspase-Glo® 3/7检测系统（Promega）通过荧光法测定裂解细胞中的 caspase 3/7活性。凋亡检测能提供丰富信息，但需在精确时间点进行（该时间点需优化），且因低浓度ADC可能无法有效诱导凋亡而灵敏度受限。这些检测适用于特性研究，但用于放行或稳定性检测时存在显著挑战。第二类检测通过代谢标志物间接评估活力，区分活细胞与死细胞。这些标志物包括细胞内ATP、乳酸脱氢酶（LDH）、NADH、蛋白水解酶和氧化还原环境，检测信号与活细胞数量成正比。此类检测灵敏度高、动态范围宽，因此广泛应用。但需注意某些代谢标志物可能受刺激或检测条件调控，不能纯粹反映细胞数量变化。活细胞中四唑盐还原反应结合比色检测被广泛用于测量活细胞数，ADC检测中使用的四唑盐包括MTT、MTS和WST-8。刃天青是另一种氧化还原敏感染料，具有低毒性且允许更长孵育时间，因此频繁使用。上述方法均在单时间点评估细胞毒性。实时动态监测的技术，能评估ADC细胞毒性的时间进程，具有独特优势。由于细胞毒性检测是主要效价测定方法，其精度必须确保不同批次药品的患者给药准确性。此外，批放行接受标准应足够严格，以防止因使用效价高于预期的批次导致患者过量给药。鉴于ADC的潜在毒性，临床剂量递增通常采用小步推进策略：例如若临床剂量递增计划按两倍步进，50–150%的相对效价检测标准（对应三倍范围）可能不够严格。如果因检测限制无法收紧标准，临床研究中附加批次的使用可能受到限制。9. 监测Fc依赖性效应功能的检测方法以表征其潜在作用机制尽管ADC的药物组分引起的细胞毒性是其预期的主要作用机制，但其他机制也可能贡献其效力（图1）。单抗的同种型具有重要影响：对于能够介导Fc依赖性效应功能的同种型，此类活性可能成为体内作用机制的一部分。特别是IgG1抗体能够结合Fcγ受体和C1q，从而可能激活抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）等效应机制。根据靶抗原类型和抗体同种型提出的单抗Fc效应功能潜力分级体系也可应用于ADC。因此，评估ADC中单抗组分是否具有介导Fc相关效应机制的能力至关重要。事实上，多种ADC已被报道具有额外作用机制：T-DM1保留了抗HER2单抗曲妥珠单抗的全部作用机制，包括ADCC、抑制细胞增殖和抑制HER2脱落；另一种靶向CD37的DM1偶联ADC显示出强效的ADCC、ADCP和CDC活性，其中ADCC活性与亲本单抗相当；而通过工程化降低Fcγ受体结合能力的抗CD70 IgG1 ADC，在小鼠肿瘤模型中意外显示出增强的疗效，这可能源于药代动力学特征的改善。监测Fc依赖性效应功能的检测可分为基于细胞和无细胞两类。基于细胞的检测与ADC和单抗检测类似，但ADC需额外设置对照以证明靶细胞毒性非药物相关：传统ADCC检测使用原代NK细胞或PBMC作为效应细胞，而新型检测采用具有高效FcγRIII依赖性杀伤能力的人NK细胞系（使用细胞系可显著降低原代细胞ADCC检测固有的高变异性）。两类ADCC检测中，抗原阳性靶细胞与系列浓度单抗或ADC孵育后，通过测量细胞内标记物（包括铬51、刃天青染料和LDH）的释放来量化细胞裂解。CDC检测采用与ADCC相似的靶细胞和检测方法，但添加人或动物血清作为补体来源。尽管ADCP可能贡献多种单抗的作用机制，但由于难以开发足够特异和敏感的吞噬检测，其潜力很少被评估。一项研究使用原代单核细胞衍生的巨噬细胞作为效应细胞，通过流式细胞术检测靶细胞与效应细胞双阳性事件，证明了ADC的ADCP活性。无细胞检测基于测量单抗与Fcγ受体或C1q的直接结合，可采用ELISA或SPR形式，且ADC与单抗检测方法相同：ELISA通常用于测量C1q结合（已有方法通过固定系列浓度单抗样品，使用HRP标记抗C1q抗体检测可溶性C1q结合）；Fcγ受体结合通常采用SPR评估：将单抗或Fcγ受体直接固定或捕获在传感器上，另一分子置于溶液中。大多数Fcγ受体与IgG结合动力学较快，此类相互作用的KD值通常通过稳态分析估算。这些检测作为特性研究的一部分，使用未偶联单抗、ADC或两者同时检测（从而评估药物偶联的影响）。单抗应表征其Fc相关效应功能：若ADC被认为具有多重作用机制，可能需要在单抗中间体和/或原料药、制剂放行检测中增加效价测定。如果单抗经过工程化改造降低效应功能，应在特性研究中予以证明。在研发早期进行这些研究有助于在关键临床研究时更深入理解作用机制。图1.ADC除药物诱导的细胞毒性外，还可能具有其他作用机制。ADC与靶区细胞表面表达的特异性抗原结合后，会导致药物(黄色星形标记)的内化和药物诱导的细胞毒性。若ADC能通过其Fc片段(蓝色标记)与Fcγ受体结合，则可募集效应细胞通过ADCC或ADCP杀伤靶区细胞。此外，补体系统的募集和膜攻击复合物(MAC)的组装也可能导致CDC。需要评估这些作用机制的实际贡献。10. 免疫原性检测ADC中使用的药物通常分子量过小，自身难以引发免疫反应。但当其与单抗等载体蛋白偶联后，小分子可能触发免疫应答。另一个需要考虑的因素是：疏水性药物可能增加ADC形成聚集体的能力，进而提高免疫原性风险。ADC可能引发针对单抗、连接子或药物部分表位的免疫反应，或针对两个组分交界处形成的新表位产生应答。尽管近年来未报道因单抗免疫原性导致的严重不良事件，但抗产品抗体（APA）可能影响药代动力学并降低疗效。ADC形成免疫复合物的额外风险在于：可能将毒性药物递送至体内非预期部位。brentuximab vedotin的美国说明书报告7%患者产生持续性APA，30%患者呈 transiently 阳性——所有免疫反应均针对嵌合单抗组分。62%的APA阳性患者中检测到中和抗体，两名持续性APA反应患者（1%）因输注反应终止治疗。trastuzumab emtansine的APA阳性率为5.3%（未检测中和APA）。值得注意的是，其免疫原性发生率较曲妥珠单抗治疗患者高出数倍，表明ADC可能比单抗更具免疫原性。ADC免疫原性检测方法与单抗相似。常用解决方案是桥联ELISA或电化学发光法：一个APA分子连接两个产品分子（一个用于固定，另一个用于检测复合物）。ADC进一步偶联制备标记试剂可能带来挑战：相互作用组分可添加或在固定前共同孵育形成溶液复合物。检测优化中使用的阳性对照至关重要：为反映异质性APA应答，多克隆阳性对照抗体优于高亲和力单抗，也可采用代表不同亲和力的一系列阳性对照单抗。抗独特型单抗也可作为阳性对照。此外，必须确保检测方法对产品存在的耐受性。通过引入酸解离步骤（用酸处理血清样本解离产品-APA复合物）可提高检测的药物耐受性。免疫原性检测也可基于SPR分析：SPR检测高亲和力抗体的灵敏度可能低于其他方法，但能有效检测低亲和力抗体（尤其是快速解离抗体）。SPR检测可通过酸处理提高药物耐受性，并能使用一系列同种型特异性抗体直接表征APA的同种型（前提是抗同种型抗体不结合产品）。采用二抗可增强SPR信号并提高检测灵敏度。目前已开发并验证了一种可同步表征APA同种型与结合区域（Fc或Fab）的SPR检测：将生物素化完整托珠单抗、Fc或Fab片段分别固定在不同流动池，注入血清样本后使用同种型特异性抗体检测。该模式可适配ADC以检测针对单抗、连接子和药物组分的APA。对于ADC，评估APA是针对单抗、连接子还是药物组分至关重要。Hoofring等人开发并测试了两种表位评估方法：一种是使用未标记单抗或药物偶联BSA作为竞争剂的竞争法；另一种是在检测步骤使用标记单抗或药物偶联BSA的直接法。通过在过量抗单抗抗体存在下添加低浓度抗药物抗体（或反之）测试两种方法的特异性：发现竞争法会产生假阴性结果，而直接法除在极过量主要表位抗体存在外均具特异性。认识到开发合适免疫原性检测的诸多挑战，FDA支持在产品研发过程中逐步进行方法开发和验证（除非APA相关不良事件风险较高）。在方法开发和验证前，患者样本应在适当储存条件下保存。对于ADC，建议开发能够区分针对单抗和药物组分免疫应答的检测方法。11. 总结鉴于ADC的复杂性，部分质控检测在偶联前的中间体阶段实施更为有效。例如：药物-连接子相关杂质应在药物-连接子中间体阶段进行控制，并完成完整的杂质谱分析。这些杂质可分为可偶联杂质与不可偶联杂质，需采用基于风险的控制策略。对于单抗的特性分析及放行检测，应在单抗中间体阶段和ADC阶段同步进行相关属性测试，通过对比确定偶联工艺是否引起质量属性变化。通常，单抗和药物-连接子中间体的特性分析、放行及稳定性检测方法应与原料药保持一致。基于ADC的复杂性及该领域快速发展的科学技术，本文讨论的分析方法开发策略涵盖制药行业常用技术，但并非适用于所有ADC产品。开发质控检测方法时，应同时参考相关ICH指南。更多关于ADC药物分析方法的内容大家可阅读小编之前的文章：更多ADC药物丰富内容见公众号：研学Biotech