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撰文丨章台柳大多数关于人类海马体神经发生的研究是通过检测从神经干细胞到中间神经祖细胞（INPs）和神经母细胞（统称为神经祖细胞）直至新生神经元等不同阶段中与神经发生相关的蛋白质来开展。多项研究报道，人类齿状回终生都存在神经祖细胞相关标记物的免疫组化证据【1】，而其他研究则指出这些标记物在儿童期后消失【2】，那么人类成年期海马体中是否存在神经发生目前还存在争议。方法学的差异可能是导致这些矛盾结果的原因，虽然这些标记物在其他物种中得到验证，但能否可靠识别人类神经祖细胞仍存疑。单核RNA测序（snRNA-seq）技术可绕过标记物限制，实现跨物种和发育轨迹的比较，为细胞类型和状态提供无偏倚的研究手段。近期针对成人海马体的snRNA-seq研究虽鉴定出未成熟神经元，却未能发现增殖性祖细胞，提示新生神经元可能源于发育期产生的神经元祖细胞的缓慢成熟过程。溴脱氧尿苷（BrdU）标记、碳测年法以及成人齿状回外植体中神经元的有丝分裂生成等证据，均支持成人海马体中存在增殖性祖细胞。然而，增殖性祖细胞及其神经发生轨迹始终未能明确，这成为理解人类成年期海马体神经发生的关键缺失环节。2025年7月3日，来自瑞典卡罗林斯卡医学院的Jonas Frisén团队在Science杂志上发表文章Identification of proliferating neural progenitors in the adult human hippocampus，通过snRNA-seq对从新生儿至成年期的人类海马体进行分析。研究确认了童年早期所有神经祖细胞发育阶段，并在成人样本中运用Ki67增殖标记抗体与机器学习算法，成功检测到增殖性神经祖细胞。转录组数据进一步显示，这些神经祖细胞定位于齿状回区域。这些发现为理解人类成年期神经发生机制提供了重要依据。研究人员首先聚焦于0-5岁的幼年个体人群，因为以往的研究提示该群体中存在大量神经祖细胞。通过对6名儿童（童年组）海马体细胞核进行液滴式snRNA-seq，共获得了115,861个细胞核的数据集，并将主要细胞类型进行人工注释。通过筛选表达小鼠海马体神经发生谱系特征基因的Louvain聚类群，发现这些细胞经重新整合后形成两大集群：一个以星形胶质细胞为主，另一个以颗粒神经元为主。这两个集群通过一条表达细胞增殖标志物MKI67和/或EOMES的细胞链相连接，这些标志物与INPs及神经母细胞相关。RNA速率分析显示，从表达INP标志物的细胞开始，经表达神经母细胞标志物的细胞链，最终到达颗粒神经元集群的分化轨迹，该轨迹与小鼠海马体神经发生的RNA速率模式相似。研究人员进一步将人类儿童数据集和幼年小鼠海马体数据集进行整合分析，发现INPs和神经母细胞等细胞类型呈现完全重叠，而神经干细胞与未成熟神经元等则存在物种特异性差异，提示基因表达存在种间差异。层次聚类分析显示，人类INPs和神经母细胞与其小鼠同源细胞的转录相似度高于其他人类细胞类型，证实了跨物种神经发生细胞的保守性。基于扩散图谱空间的跨物种比对显示，人类与小鼠的神经祖细胞及未成熟神经元共同构成了连续的神经发生轨迹。人类细胞完整重现了小鼠神经发生的特征性过渡阶段，但经典神经发生标志物的动态表达模式存在显著差异：HES6在小鼠中特异表达于INPs和神经母细胞，在人类儿童海马体表达于干细胞和INPs；EOMES在小鼠中特异表达于INPs，在人类儿童海马体表达于INPs和神经母细胞。为识别青少年及成人海马体中的神经祖细胞，研究人员对13-78岁19例个体的全海马体或齿状回样本进行snRNA-seq，其中12例（20-78岁）采用流式分选技术富集神经祖细胞，使用Ki67+细胞核分选效果最为显著。整合童年组数据后，最终构建了包含0-78岁个体402,660个细胞核的数据集，通过无偏聚类与人工注释鉴定了所有主要海马体细胞类型。研究人员训练机器学习算法来鉴定祖细胞，经过验证该策略能以高特异性保守鉴定神经祖细胞。经过机器学习算法分析在青少年及成人海马体snRNA-seq数据集中共鉴定出354个祖细胞。根据表达谱与聚类特征，这些细胞被划分为神经干细胞（青少年12个/成人65个）、中间神经祖细胞INPs（青少年4个/成人71个）和神经母细胞（成人202个）。为深入解析其特性并开展跨物种比较，研究人员将人类数据集与已发表的小鼠、猪和恒河猴海马体snRNA-seq数据整合（以小鼠为参考），发现所有年龄段人类神经祖细胞均沿袭与其他物种相同的神经发生轨迹分布。层次聚类分析显示，青少年/成人的神经干细胞、INPs和神经母细胞与小鼠、猪、恒河猴及人类儿童期对应细胞类型具有最高相似性。伪时序分析证实，小鼠、猪、恒河猴和人类细胞核均显示从神经干细胞经INPs、神经母细胞向颗粒神经元的分化轨迹，且青少年/成人祖细胞沿该轨迹分布，提示成人海马体存在神经发生路径。研究人员采用RNAscope原位杂交技术和单细胞分辨率空间转录组平台Xenium对成人海马体神经祖细胞进行空间定位。将空间定位范围缩小至齿状回颗粒细胞层及其邻近区域后，使用Xenium平台成功定位神经干细胞（共表达NESTIN、SOX2和ASCL1）、INPs（组合表达ASCL1/EOMES/SOX2/SOX11/EZH2/DCX）和神经母细胞（表达EZH2/EOMES/DCX/ST8SIA2等标志物）。通过双平台检测到表达增殖标志物的神经干细胞、INPs和神经母细胞。其中增殖性神经干细胞和INPs常成对或小簇分布，神经母细胞多呈局部聚集模式，提示存在持续细胞分裂和活跃的神经发生过程。虽然NES、EZH2等标志物稳定表达，但EOMES、IGFBPL1等呈现异质性表达，可能反映生物学变异。得益于RNAscope和Xenium的高灵敏度，10例检测样本均成功鉴定出神经祖细胞。总的来说，研究系统鉴定了人类海马体从出生至成年期神经祖细胞的存在，并解析其分子特征。这些细胞在生命早期数量丰富且易于识别，而在青少年及成人阶段则变得稀疏。作为海马体的主要信息门户，齿状回调控着从皮层向海马本体的信息流动——为维持正常功能，颗粒神经元接受来自局部GABA能中间神经元的精细抑制调控，仅少数细胞对激活产生响应。未成熟颗粒神经元在具有增强可塑性的阶段表现出高兴奋反应性，因此即使少量新生神经元也能对海马体功能产生重要影响。原文链接：science.org/doi/10.1126/science.adu9575制版人： 十一参考文献1. A. Ammothumkandyet al., Nat. Neurosci. 25, 493–503 (2022). 2. S. F. Sorrells et al., J. Neurosci. 41, 2554–2565 (2021). 学术合作组织（*排名不分先后）战略合作伙伴（*排名不分先后）·转载须知【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。BioArtMedPlants人才招聘近期直播推荐

OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。文章来源：类器官大师兄化疗是癌症治疗的主要手段之一，通过诱导DNA损伤来杀死癌细胞。然而，DNA损伤修复缺陷可能导致突变积累，进而引发治疗耐药性和继发性恶性肿瘤。结构变异（SVs）是肿瘤进化的重要驱动因素之一，但在化疗后的形成和影响尚未充分研究。此外，化疗诱导的基因组不稳定性可能导致细胞类型特异性的基因表达变化，进一步影响肿瘤的进展和治疗反应。2025年3月4日，发表在PNAS上题为Structural variant and nucleosome occupancy dynamics postchemotherapy in a HER2+ breast cancer organoid model的研究利用单细胞模板链测序（Strand-seq）技术，结合核小体占有率（NO）分析，研究了多柔比星（一种常用的化疗药物）在HER2阳性乳腺癌类器官模型中诱导的基因组结构变异。通过分析459个单细胞的基因组数据，我们发现多柔比星显著增加了大尺度染色体重排的频率，包括复杂SVs、大片段缺失和重复。此外，研究还揭示了不同乳腺细胞类型（如基底细胞、管腔祖细胞和成熟管腔细胞）对多柔比星诱导的DNA损伤的敏感性，并发现核小体占有率的变化与基因表达调控密切相关。这些发现强调了化疗药物对基因组的广泛影响，并为优化癌症治疗策略提供了新的视角。图示描述：1) 建立基于Strand-seq的实验工作流程，研究类器官中药物诱导的基因组重排。图1展示了研究者建立的实验系统，用于研究阿霉素诱导的基因组改变。图中包括实验设计示意图（从三转基因小鼠中提取乳腺细胞，在3D环境中培养，通过强力霉素诱导致癌基因过表达形成肿瘤状态，阿霉素处理后进行单细胞测序）；BrdU浓度优化（选择20 μM为最佳浓度）；EdU标记验证类器官中DNA标记的均匀性；以及阿霉素处理前后结构变异频率对比分析，结果显示，阿霉素处理导致复杂结构变异、大片段缺失和重复等基因组改变显著增加，远超过仅由致癌基因激活引起的水平。图12) 阿霉素处理后结构变异和姐妹染色单体交换频率增加。图2详细分析了阿霉素处理导致的染色体变异特征，包括每个细胞中结构变异数量分布（平均每个基因组有2个体细胞改变，缺失最为常见）；全基因组染色体图谱（显示变异位置与大小，表明各染色体对阿霉素损伤的脆弱性相似）；变异大小分布分析（所有缺失和重复均大于5 Mb，中位长度分别为51.5 Mb和49.8 Mb）；以及姐妹染色单体交换（SCEs）频率比较，显示即使在低浓度阿霉素处理下，SCE频率也显著高于对照组，且结构变异表现出剂量依赖性，这些发现表明阿霉素治疗导致了广泛的基因组不稳定性。图23) 阿霉素相关基因组不稳定性影响乳腺类器官中的所有主要细胞类型。图3探索了不同细胞类型对阿霉素诱导的DNA损伤的敏感性，包括scNOVA基于细胞类型分类器的概念示意图；Strand-seq测量的核小体占位率与ATAC-seq测量的染色质可及性之间的负相关关系（R=-0.87）；三种主要乳腺细胞类型（基底细胞、腔上皮祖细胞和成熟腔上皮细胞）的差异基序可及性热图；以及不同细胞类型中结构变异和SCE频率分析，结果显示，所有三种上皮细胞类型在阿霉素处理后均表现出相似的结构变异和SCE频率，表明它们对阿霉素诱导的DNA损伤和染色体不稳定性具有相似的敏感性。图34) 利用scNOVA识别阿霉素诱导基因组改变的细胞中失调的通路。图4利用scNOVA工具分析了阿霉素处理后基因组改变与核小体占位率变化的关系，包括228个差异核小体占位基因热图（核小体占位水平变化反映基因活性改变）；通路富集分析（显示MAPK、催产素、钙信号和化学因子信号等多个与乳腺癌进展相关的通路受到影响）；非整倍体细胞的差异基因热图；以及相关通路分析（显示Rho循环和高尔基体功能相关基因在基因过度激活中起作用，而MAPK通路基因表现出降低的核小体占位率），这些结果表明阿霉素不仅增加了基因组不稳定性，还导致了核小体占位率的广泛变化，影响了与癌症进展相关的关键基因和通路。 图4全文总结：本研究通过单细胞多组学技术，分析了阿霉素在HER2阳性乳腺癌类器官模型中诱导的基因组结构变异（SVs）和核小体占有率（NO）变化。实验采用TetO-CMYC/TetO-Neu/MMTV-rtTA小鼠模型，构建乳腺癌类器官，并在阿霉素处理后检测到显著增加的染色体重排、大片段缺失和重复。研究发现，阿霉素不仅导致基因组不稳定性，还通过改变核小体占有率影响基因表达，涉及乳腺癌进展的关键通路。此外，所有乳腺上皮细胞类型（基底细胞、腔上皮祖细胞和成熟腔上皮细胞）对阿霉素诱导的DNA损伤表现出相似的敏感性。这些结果揭示了阿霉素对基因组的广泛影响，为优化癌症治疗策略提供了新的视角。类器官时间类器官制作流程：1. 动物与基因分型使用TetO-CMYC/TetO-Neu/MMTV-rtTA品系小鼠（FVB背景），模拟HER2+乳腺癌。小鼠在EMBL海德堡饲养，条件为22℃±2℃、湿度50%±10%，光照07:00-19:00。自由摄取Altromin 1318 P饲料。通过诊断性基因分型确认转基因。2. 小鼠乳腺腺体类器官的3D培养与阿霉素处理组织收集：颈椎脱位处死8-10周龄雌性小鼠，收集10个乳腺腺体。组织消化：在DMEM/F12培养基（含HEPES、青霉素/链霉素、胶原酶和Liberase）中37℃消化过夜，机械破碎后用Trypsin-EDTA处理。细胞分离：离心后重悬于MEBM培养基，上皮细胞附着于胶原涂层板，非上皮细胞去除。类器官培养：10,000个细胞接种于Matrigel中，37℃固化后加入MEBM培养基，每两天换液，7天后用多西环素诱导，阿霉素处理72小时，恢复7天后进行Strand-seq。3. 3D结构的分离凝胶消化：类器官在37℃用胶原酶和Liberase处理2小时，机械破碎。细胞分离：离心、洗涤，用Trypsin-EDTA处理，灭活后离心，重悬于PBS。后续处理：单细胞悬液用于Strand-seq分析。参考文献：Starostecka M, Jeong H, Hasenfeld P, Benito-Garagorri E, Christiansen T, Stober Brasseur C, Gomes Queiroz M, Garcia Montero M, Jechlinger M, Korbel JO. Structural variant and nucleosome occupancy dynamics postchemotherapy in a HER2+ breast cancer organoid model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025 Mar 4;122(9):e2415475122.https://doi.org/10.1073/pnas.2415475122.撰文 | Little FingerEND免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。戳“阅读原文”立即领取OTC2025免费参会名额!