VENT-03

【引言与突破】     在先天免疫的经典通路中，环状GMP-AMP合酶（cGAS）是细胞质双链DNA的关键模式识别受体：结合DNA后催化合成第二信使cGAMP，激活STING并触发I型干扰素应答。cGAS的异常激活与Aicardi-Goutières综合征、自身免疫病、神经退行性疾病乃至COVID-19密切相关，小分子抑制剂VENT-03已进入I期临床，然而现有抑制剂多结合经典正构位点，普遍存在种属特异性或细胞活性远弱于酶活活性的问题——G150的细胞EC50比酶活IC50弱近200倍。这种"效率鸿沟"的根源恰恰在于相分离：cGAS感知DNA时会通过多价互作发生液-液相分离（LLPS），细胞内cGAS浓度可从约10 nM浓缩至约10 μM，凝聚体中的高浓度酶自然需要极高浓度抑制剂才能压制。 近日，在 Nature Communications 上发表了研究论文「De novo design of protein condensation inhibitors by targeting an allosteric site of cGAS」。该研究在解析RU.521与人cGAS共晶结构时意外发现一个紧邻激活环的非经典别构位点，据此从头设计了同时占据别构与正构位点的XL系列抑制剂：它们将激活环锁定在闭合构象，削弱cGAS-DNA互作、抑制凝聚体形成，在分子水平把液-固相分离"降级"为液相分离、在细胞水平直接消除凝聚体，从而以低浓度高效抑制细胞内的cGAS，并与正构抑制剂产生协同效应——为"靶向相分离"的药物研发提供了机制驱动的全新范式。 【核心图文解析】 图1：在h-cGASCD激活环旁鉴定别构位点并设计别构抑制剂XL-3156 作者解析了PF-06928215与RU.521结合人cGAS催化结构域的高分辨共晶结构，以理解不同抑制剂的结合模式，并据此开展基于结构的药物设计。 结果显示，RU.521的两个对映体如"蝴蝶翅膀"般各以50%占有率占据两个不同位点：S型位于经典正构位点，R型则占据一个直接接触激活环（210–220位残基）的非经典位点，该位点距正构位点约11.7埃。由于激活环开放时直接参与DNA结合、闭合时产生空间位阻且能同时破坏二聚体的两个DNA结合位点，作者据此设计出双翼分子XL-3156，其共晶结构证实完美整合了两个对映体的结合模式，同时占据别构与正构位点；而G150仅结合正构位点。此外，RU.521与鼠cGAS的共晶结构显示其仅占据正构位点并通过小鼠特有的C419残基形成共价键——这个常用工具药的种属依赖性共价抑制机制也被首次系统阐明。 图2：别构抑制剂破坏cGAS-DNA互作与相分离 基于别构位点靠近激活环的结构线索，作者假设别构抑制剂通过干扰激活环构象削弱cGAS-DNA互作，进而影响相分离。他们用EMSA检验化合物对DNA结合的影响，用吖啶橙荧光偏振排除DNA嵌入，再用共聚焦成像、浊度测定与DNA凝聚定量实验评估相分离。 结果显示，XL-3156与RU.521显著减少cGAS与DNA的结合且不嵌入DNA，G150无此效果；两者剂量依赖地抑制cGAS-DNA凝聚体形成（DNA凝聚测定EC50从对照的300 nM升至约780至870 nM），而G150在100 μM下毫无作用——这类别构抑制剂被命名为蛋白凝聚抑制剂（PCI）。 图3：XL-3156通过降低相分离程度诱导凝聚体从LSPS向LLPS形态转变 细致观察发现XL-3156处理后凝聚体形态发生有趣变化，作者遂在低盐条件下放大比较不同蛋白浓度与化合物处理下的凝聚体形态，并用FRAP与融合实验验证其液态属性。 结果显示，对照组始终形成纤维状固样聚集体，而XL-3156组在低蛋白浓度形成规则的圆形液滴、高浓度转为凝胶样——抑制剂把液-固相分离（LSPS）"降级"为液相分离（LLPS）；XL-3156组的荧光恢复更快、液滴可融合，全长cGAS的结果一致。据此提出物理模型：较弱的cGAS-DNA互作驱动LLPS、较强互作驱动LSPS，别构抑制剂通过占据特定位点选择性削弱互作，而非像高盐那样非特异抑制。 图4：cGAS激活环对PCI抑制相分离至关重要 为证明激活环是PCI作用的支点，作者对激活环残基（V218、K219）与正构位点残基（S435、Y436）做定点突变，构建截短激活环的Δloop突变体，并用1微秒分子动力学模拟监测激活环构象。 结果显示，V218E显著降低成凝并使两个PCI失效，利于疏水互作的V218M/F增强RU.521的抑制效果，正构位点突变也削弱PCI效应；Δloop突变体成凝能力不变但PCI几乎完全失效——激活环闭合构象产生的空间位阻是抑制凝聚的必要条件。MD模拟进一步确认XL-3156结合态下激活环维持闭合构象，与共晶结构与突变实验三方互证。 图5：XL系列化合物与h-cGASCD的结合 以XL-3156共晶结构为指导，作者开展先导化合物优化：先引入羧基与K362、R376形成盐桥（XL-3117），再经生物电子等排与氟化改造得到苯并噻唑骨架化合物，最终在苯环不同位置引入三氟甲基得到XL-3157、XL-3158与XL-3159，并用共晶结构、微尺度热泳与分子动力学比较各化合物的结合模式。 结果显示，XL-3158综合性质最优，微尺度热泳测得解离常数7.19 μM；虽因溶解度不足未能获得共晶，但分子对接与1微秒MD模拟显示其结合模式与XL-3156一致，且通过更强的氢键与静电互作比XL-3156更稳定地维持激活环闭合构象——这解释了其更高的结合亲和力。 图6：XL-3158在细胞中抑制cGAS相分离 为验证PCI在细胞环境中的效果，作者在鼠cGAS敲除的L929细胞中建立Tet-on EGFP-h-cGAS全长稳转系，转染荧光标记DNA后用共聚焦观察凝聚体，并以FRAP确认其液态属性。 结果显示，未处理时h-cGAS与DNA共定位形成点状凝聚体且呈液态（细胞内为LLPS，与体外LSPS不同）；20 μM XL-3158显著减少点状凝聚体数量，而G150无效——PCI在细胞环境中直接消除了cGAS-DNA的LLPS。 图7：别构PCI的细胞效能与作用机制 作者用酶活测定与细胞IFN报告实验对比XL-3158与G150，计算酶活IC50与细胞EC50的比值，并用不同比例的联用实验检验协同效应，同时用cGAMP与Poly(I:C)激活通路做选择性对照。 结果显示，酶活层面G150远强于XL-3158（IC50分别为0.06与11.1 μM），但两者细胞EC50几乎相同（约10 μM）；IC50/EC50比值G150仅0.6%、XL-3156高达93.7%——PCI几乎无效率损耗。机制模型清晰呈现：凝聚使cGAS局部浓度升至约10 μM，正构抑制剂需要极高浓度才能压制浓缩的酶，而PCI通过抑制凝聚把游离cGAS维持在低浓度，低剂量即可高效抑制；据此预测的联用协同也在实验中证实（XL-3158占比越高协同越显著）。选择性对照表明XL-3158只抑制DNA诱导的通路，对下游cGAMP或RNA通路无影响，跨种属方面对鼠cGAS同样有效。 图8：XL-3158减轻雨蛙素诱导的急性胰腺炎 鉴于cGAS-STING通路在急性胰腺炎（AP）进展中的关键作用，作者先评估了XL-3158的口服药代动力学，再在雨蛙素诱导的AP模型中检验疗效。 结果显示，XL-3158口服生物利用度64.2%、半衰期4.07小时；25 mg/kg口服给药显著降低胰腺与体重比，H&E染色显示水肿、炎症浸润与实质坏死明显改善，血清淀粉酶、脂肪酶与TNF-α、IL-6水平均下降——PCI展现出作为药物候选的体内疗效。 【主编方法论笔记】 这篇文章提供了"从偶然结构发现到机制驱动药理策略"的完整范本。起点是共晶结构中的意外——RU.521的R型对映体占据非经典位点，作者没有止步于结构报道，而是敏锐地将其转化为可设计的别构位点，再用双翼分子整合两个位点实现真正的从头设计。方法论上最精彩的是对"凝聚体作为药理靶点"的定量论证：传统研发只看酶活IC50与细胞EC50，本文引入DNA凝聚测定与IC50/EC50效率比这一指标，把凝聚造成的局部浓度效应转化为可量化、可比较的药理学参数，并用CompuSyn联用实验验证了模型预测。此外，Δloop截短体证明激活环必要性、V218系列突变证明结合位点特异性、吖啶橙实验排除DNA嵌合、cGAMP与Poly(I:C)通路对照证明靶上选择性——每一层结论都钉在证据链上。 【团队点评与思考】 这项工作的概念突破在于提出"蛋白凝聚抑制剂（PCI）"这一药物类别：不直接抑制酶的催化活性，而是通过稳定激活环闭合构象、阻止凝聚体形成，釜底抽薪地降低细胞内有效酶浓度，为cGAS乃至所有可发生相分离的靶蛋白提供了新的干预维度。需要留意的是，PCI的酶活IC50远弱于正构抑制剂，若缺乏细胞与体内数据很容易被误杀，这提醒药化团队在评价相分离靶点时应把凝聚测定纳入常规筛选流程；别构位点与激活环的跨物种保守赋予了XL系列跨种属活性，但也需警惕保守位点的脱靶风险。未来若能解析PCI-凝聚体的高分辨结构并阐明凝聚体破坏后底物可及性的变化，这一策略有望推广到其他核酸感受器与相分离疾病靶点。 “生物相分离研究”公众号致力于为您拆解前沿文献的设计巧思。如果您在实验设计中有任何疑惑，欢迎在评论区留言与我们探讨交流！ 【通讯作者简介】 Yechun Xu（中国科学院上海药物研究所）：课题组长期从事基于结构的药物设计与靶标结构生物学研究，在cGAS等核酸免疫通路靶点的小分子调控方面有系统工作。Wenfeng Zhao（中国科学院上海药物研究所）：从事药物化学与结构药理学研究。 【参考文献】 Zhao W, Chen G, He J, Shen X, et al. De novo design of protein condensation inhibitors by targeting an allosteric site of cGAS. Nat Commun. 2025;16:5140. 原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-60297-0 【文末摘要】 解析RU.521与人cGAS共晶结构发现激活环旁别构位点，据此从头设计XL系列凝聚抑制剂：锁定激活环闭合构象、削弱cGAS-DNA互作并消除细胞凝聚体，以IC50/EC50效率比93.7%实现低剂量高效抑制，与正构抑制剂协同并在胰腺炎模型中有效，值得精读！ 【关于我们课题组】 本课题组由王亮研究员（博士生导师、国家重点研发计划青年首席科学家）领衔。团队长期聚焦生物大分子相分离与染色质高级结构调控，并系统性提出了“凝聚体病 (Condensatopathies)”理论框架。目前，课题组依托多项国家级重点基金，深入解析异常相分离在重大疾病（如神经系统疾病）中的致病机理，并致力于探索靶向干预与溶解异常凝聚体的全新策略。团队核心科研成果已多次发表于Nature（两篇）、Molecular Cell（两篇）、Cell Research等国际顶尖期刊。 欢迎海内外同行及优秀学子交流加盟！(联系邮箱：wanglian15@tsinghua.org.cn)【生物相分离交流群】 本群专注分享前沿文献、讨论最新研究、传递会议动态。 诚邀领域内学者、研究生加入，共同交流进步。 入群请添加管理员微信，备注“姓名+单位+研究方向”。 管理员微信：qyayy20240306，wxy15239005165，QDYJ-79【相分离科研服务平台】   【纠错反馈与说明】 为持续优化内容质量，修正疏漏错误，本内容支持长期纠错更新。若您发现文中存在文字错误、信息偏差、内容遗漏，或有内容优化、补充修改建议，可通过✅专属邮箱反馈：597617882@qq.com、2098925899@qq.com。我们会定期核查反馈，核实后及时修订更新内容，感谢您的指正与支持。