Nerve growth factor(Pharmacia & Upjohn)

重组人源神经生长因子介绍神经生长因子（Nerve Growth Factor, NGF）是最早发现和最典型的神经营养因子，同时也是影响神经系统最重要的生物活性分子之一。人神经生长因子（Human Nerve Growth Factor, hNGF）是在人体中发现的一种对正常神经细胞具有营养作用，同时对损伤神经修复机能起调节作用的生物活性因子。NGF不仅可以维持交感神经和感觉神经的生存和功能，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向，还能对促进大脑的发育、神经系统的生长，以及损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用（图1）。图1 生长因子作用机制图示完整的hNGF分子由α、β、γ三个亚基组成，其中β亚基（β-NGF）是唯一具有生物学活性的亚基。β亚单位通过非共价链结合而构成活性二聚体，其中，6个半胱氨酸残基之间由二硫键相连，若二硫键结构不正确，NGF将丧失其生物活性。β-NGF对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达，均具有重要的调控作用。目前，NGF 及其受体已成为临床镇痛药物开发的重要靶点，β-NGF已被开发成治疗外周神经损伤的药物，用于治疗神经中毒、周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面神经炎，以及神经损伤（包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤等中枢及外围神经系统的损伤）等神经系统疾病。β-NGF也是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子（图2）。图2 神经生长因子（NGF）在调节中枢神经系统疼痛信号中的作用[1]目前商品化的NGF为鼠源性神经生长因子（mNGF），且mNGF与hNGF基因序列相比高度同源（>90％），从下颌下腺分离的mNGF和从胎盘分离的hNGF已成功用于临床，主要用于治疗视神经损伤。除此之外，NGF也对毒性神经病变、外周神经病变和面部神经病变等疾病有疗效。然而，这类动物源性蛋白制品常常具有较高的免疫原性，容易引起人体内的抗原反应，甚至会危及生命。而天然hNGF分布于人体的脑、神经节、虹膜、心脏、脾和胎盘等组织，数量有限，且其中hNGF含量低，分离纯化极其困难，通常无法直接提取获得。因此，利用基因工程技术制备重组人神经生长因子，是解决上述问题的一个主要途径。重组人源神经生长因子的表达利用基因工程技术，以微生物为载体，大批量生产外源蛋白，具有广阔的应用前景。到目前为止，已有多项研究利用哺乳动物细胞、昆虫细胞和大肠杆菌等系统，成功表达出人β-NGF。在上述表达系统中，人们对大肠杆菌的遗传背景和生化特性了解得相对透彻，大肠杆菌本身具备容易操作、生长迅速、营养需求简单等优点。同时，大肠杆菌表达系统具有表达水平高、生产成本低和便于工业化生产等优势，成为制备重组人神经生长因子的首选。但是这一系统本身也存在着若干缺陷：①缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工过程，如剪切、糖基化和二硫键形成等；②表达的蛋白多以包涵体形式存在，需要经过复杂的复性步骤才能恢复蛋白构象和活性；③较多的背景杂蛋白，纯化工艺复杂；④真核生物和原核生物所偏好的密码子存在差异，部分真核基因在大肠杆菌表达系统中表达量极低，甚至不表达。有研究发现，人β-NGF在大肠杆菌中的表达量不高，而且生物活性极低，主要是由于β-NGF基因及其蛋白的结构特殊，导致其难以在大肠杆菌系统中有效表达。一方面，β-NGF基因中使用了较多的大肠杆菌稀有密码子，导致β-NGF基因在大肠杆菌中表达量不高。另一方面，β-NGF蛋白难以在缺乏翻译后加工修饰系统的大肠杆菌中形成正确的结构，最终导致基于大肠杆菌表达系统的β-NGF蛋白生物活性极低，甚至没有活性。基于上述问题，有研究报道了一种重组人神经生长因子β亚基基因，并提供了利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法。该序列位于人神经生长因子β亚基成熟肽基因序列上游，两序列由肠激酶切割位点连接。分子伴侣可帮助人神经生长因子β亚基（以包涵体形式表达）在体外形成正确的构象，并且能在复性后通过肠激酶的切割作用被去除，从而释放出与天然β-NGF氨基酸序列完全一致，且具有较高生物学活性的成熟肽。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞作为使用最为广泛的哺乳动物细胞表达系统之一，常用于重组NGF的表达研究，重组NGF被表达并分泌到细胞外，以游离形式（与天然形态类似）存在于上清液中。相较于大肠杆菌系统，CHO系统不仅具有良好的翻译后修饰能力，还支持大规模生产NGF。在真核细胞中表达，更有利于得到活性较高和更接近自然状态的β-NGF蛋白，具体优点如下：①能够加工表达的蛋白质，如空间构型的折叠、糖基化和磷酸化等；②可识别和除去外源基因中的内含子，进一步剪切加工为成熟的mRNA；③转染目的基因的真核细胞可冻存，复苏后能稳定表达活性目的蛋白。目前，使用真核系统大规模表达、纯化NGF已有成熟工艺，而用原核系统表达的重组人源人神经生长因子（rhNGF）多因不能正确折叠而使生物学活性只有mNGF五十分之一，通常首选真核表达系统来克服蛋白错误折叠等问题。近年来，研究人员通过构建具有前导序列的NGF来帮助其体外复性，虽然复性率有所提高，但产物需经限制酶切后才能获得成熟NGF，后续处理难度相对增加。综合两种表达体系可知，哺乳动物表达系统具有分泌正确装配、折叠与糖基化等特点，更适合表达NGF。韩晓枫团队在COS-7细胞中对NGF进行了瞬时表达，结果表明表达产物具有生物活性，但是无法实现NGF的稳定、长期表达，建议只作为瞬时表达宿主细胞。而CHO细胞具有利于二硫键形成的细胞环境。姜静团队对比了来源于E .coli和CHO表达系统的rhβ‑NGF，发现采用原核系统表达的NGF多以不溶性包含体形式存在（可能是游离蛋白而非跨膜蛋白），这为NGF能否在细胞表面表达存在很大的不确定性本是否。相比之下，通过将NGF的核酸序列与适当的铰链区和跨膜区的核酸序列串联后导入CHO细胞，就可以在重组CHO细胞表面上稳定表达NGF，使NGF存在于细胞表面而非分泌到培养液中，同时确保NGF经过恰当的翻译后加工（包括正确折叠、糖基化等），从而保持天然构象和活性。重组人源神经生长因子的纯化来源于CHO系统的rhNGF中往往含有变异体，如细胞内分泌过程中翻译后修饰、分泌后氨基酸残基侧链发生化学反应，或肽链降解而形成的一系列蛋白。rhNGF在体内以前体形式合成，由于弗林蛋白酶或激素酶原转化酶加工不完全，会产生完全或部分前体。除前体外，由于真核细胞特性，还会产生诸如N端截断（由于翻译后加工导致N端部分氨基酸缺失的序列分子）、氧化、脱酰胺、异构、C末端截断和异常（由于翻译后加工导致结构异常、二硫键异常、异常氧化等变体的统称）等变异体。常规的层析方法能够除去许多工艺相关杂质（如宿主细胞蛋白及核酸等），但是很难除作为产品相关杂质的rhNGF变异体。这些变异体通常与成熟rhNGF一同产生，两者理化性质相近，为大规模纯化增加了难度。目前纯化rhNGF的报道主要包括：1. 史权威团队采用阳离子交换及分子筛两步方法制备了纯度大于98%的rhNGF，但该阳离子交换步骤仅用于清除宿主细胞蛋白等过程杂质；2. 专利CN106478801A采用阳离子交换及疏水层析制备了纯度大于99%的rhNGF，该阳离子交换主要用于捕获产品，目的是清除宿主细胞蛋白等工艺相关杂质；3. 专利CN1268639C利用高效阳离子交换，以线性洗脱方式分离rhNGF氧化、异构、脱酰胺等变体；4. 还有研究通过分析rhNGF及其变异体的理化性质，发现在弱阳离子交换色谱条件下，N端截断及异常变体具有更低的等电点，可采用阶段升高电导率的方法清除变体。想要从包括发酵液、裂解的细菌或哺乳动物细胞中大规模纯化NGF，制备性分离获得具有药物纯度和高产量（基本上不含变体）的rhNGF满足临床需求难度较高，需要一种有效的方法来选择性地从其变体和其它分子、以及pI高的其它多肽中分离出NGF。有研究报道了一种使用疏水作用层析（HIC）来纯化NGF的方法，可以将成分不同或错折叠形成的分子与目标蛋白分开，除去在疏水性上不符合要求的变体，包括经部分加工的前体序列、含有糖基化成熟或前体的形式以及错误折叠和部分折叠的变体。除此以外，另一种制备性阳离子交换层析纯化NGF的方法也被广泛应用，该方法可将电荷变体（如氧化、异天冬氨酸和脱酰胺形式）从成熟的NGF蛋白中分离出来，采用HIC和阳离子交换层析制备的NGF产物基本不含加工和电荷变体。小编总结综上所述，未来有关NGF的研究及应用发展可能主要在如下几个方向：首先，随着基因工程制备rhNGF技术工艺的逐步成熟，最终可实现规模化生产水平。rhNGF因其特性和较高的分子同源性，生产规模不受原料限制，且无动物来源的致病病毒污染，具有更大的发展潜力。我们将重点研究如何优化发酵和纯化条件，获得稳定高效的表达途径，最终高效实现规模化生产。其次，近期文献资料显示，国外相关研究的热点逐渐转向NGF的二肽模拟物，部分学者认为，NGF的二肽模拟物可作为治疗神经损伤的候选药物，具有更加广阔的发展和应用前景。合作意向y目前，甲贝医药针对NGF项目已建立完整的构建、表达、纯化及制剂开发流程，欢迎感兴趣的合作伙伴前来沟通，共同开发。图3 甲贝医药的一站式表达、纯化及制剂开发流程对接人：徐先生，18616852990 微信号：参考来源：[1] https://mosmedpreparaty.ru/news/14000本文不具有任何投资建议和医学意见点击“阅读原文”，填写问卷，前10名有奖~