靶向蛋白质降解（targeted protein degradation, TPD）策略是利用小分子诱导靶标蛋白与E3泛素连接酶相互接近，进而引发泛素化降解，主要包括双功能分子（Proteolysis-Targeting Chimeras, PROTACs）和单价分子胶降解剂（molecular glue degraders, MGD）。天然产物及其类似物为降解剂开发提供了新方向，而伪天然产物（pseudo-natural product）通过重组天然片段，既保留了天然产物的生物学相关性，又拓展了新的化学空间，为TPD领域提供新的化学骨架。IDO1（indoleamine-2,3-dioxygenase 1）是一种血红素结合酶，可催化色氨酸（Trp）代谢为犬尿氨酸（Kyn），降低细胞内色氨酸的浓度，从而抑制T细胞的活性，发挥免疫抑制作用。来自德国马普所的研究团队发现了一类伪天然产物iDegs，既能抑制IDO1活性，又能增强IDO1的降解作用。
研究人员通过对包含157,332个小分子的化合物库进行筛选，发现了在IFN-γ刺激的BxPC3和SKOV-3细胞中，iDeg-1抑制Kyn生成的IC₅₀值分别为0.83 μM和1.1 μM。进一步实验表明，iDeg-1能够以剂量依赖的方式降低IDO1的蛋白水平，在10 μM浓度下处理24小时可使IDO1蛋白最大降低45%。为探究其降解机制，研究证实iDeg-1的降解作用依赖于泛素-蛋白酶体系统。此外，通过串联泛素结合实体（tandem ubiquitin binding entity, TUBE）实验发现，iDeg-1能迅速诱导IDO1的多聚泛素化，其中以K48连接的泛素链为主，并鉴定出K389为其关键的泛素化修饰位点，上述数据表明iDeg-1可通过泛素-蛋白酶体途径特异性诱导IDO1的降解。
他们通过细胞热转移分析（cellular thermal shift assay, CETSA）证实，iDegs能在细胞内直接与IDO1结合，可提高IDO1的热稳定性。基于初步构效关系研究，他们发现了活性更高的衍生物iDeg-2与iDeg-3。在IFN-γ刺激的BxPC3细胞中，iDeg-2和iDeg-3分别使IDO1蛋白水平降低55%和62%，降解效率优于iDeg-1（降低42%）。此外，三者均能在体外部分抑制IDO1的酶活性。经纳米差分扫描荧光法（nano differential scanning fluorimetry, nanoDSF）检测，这些化合物能够稳定重组人IDO1蛋白。IDO1以无血红素的apo形式及结合血红素的holo形式存在。紫外-可见光谱分析显示，在iDegs存在时，holo-IDO1的特征Soret吸收峰降低，证明该类化合物能够竞争性置换血红素辅因子，并以不同的亲和力优先结合apo-IDO1。
共晶结构分析表明，iDegs结合于IDO1的血红素结合位点。其中，苯基氨基甲酸酯占据远端血红素区域的疏水口袋A，吡咯烷和磺酰基嵌入血红素结合口袋，单萜骨架延伸至口袋D，而叔丁基苯基则位于溶剂暴露的口袋B。iDegs通过大量疏水相互作用、氨基甲酸酯氮原子与S167羟基间的水桥氢键、磺酰基氧原子与H346的氢键实现稳定结合。
iDeg-1和iDeg-2结合诱导了IDO蛋白构象重排：在iDeg-1结合结构中，C末端K螺旋电子密度减弱，但其B因子较高，提示动态性增强；而在iDeg-2结合结构中，K螺旋的电子密度完全缺失。这种缺失并非晶体堆积效应所致，因为抑制剂apoxidole与IDO1的复合物在相同空间群和晶胞参数下仍显示清晰的K螺旋密度。结构叠加分析进一步发现，与iDeg-2或apo-IDO1抑制剂linrodostat结合的IDO1相比，其螺旋B、C、F、H和J均发生重新定向，J螺旋在iDeg复合物中也发生显著重构。在已报道的IDO1结构中，K螺旋通常被F、J、H螺旋及E-F环紧密包裹。然而，在iDeg结合状态下，J螺旋内多个氨基酸的累积位移削弱了其与K螺旋的相互作用。具体而言，H346的显著旋转和平移使J螺旋C末端向结合口袋方向位移，残基R343、F270和T395也采用非典型构象。由于F、J、H螺旋及E-F环的协同重排，其与K螺旋间的相互作用被破坏，可能增加K螺旋的构象柔性，从而解释其电子密度缺失现象。此前报道的IDO1抑制剂均未引起类似构象变化，表明iDegs结合后的构象重排代表了一种新颖且独特的结合模式。
为鉴定iDegs诱导IDO1降解的E3连接酶，研究人员利用CRISPR-Cas9筛选系统，对1301个泛素相关基因进行了功能筛选。结果表明，cullin-RING连接酶复合物CRL2^KLHDC3（包括CUL2、RBX1、ELOB/C和KLHDC3）是IDO1降解所必需的。值得注意的是，CRL2^KLHDC3也参与了基础状态下IDO1的周转，表明该E3连接酶参与了IDO1的天然降解调控。通过TurboID技术进一步验证，iDegs处理增强了IDO1与KLHDC3之间的相互作用。
机制上，KLHDC3通过识别IDO1羧基末端的降解信号（C-deg）发挥功能。人IDO1的C末端EG序列符合KLHDC3识别的特征，即末端甘氨酸残基。体外结合实验显示，IDO1的C末端肽段能以高亲和力与KLHDC3结合，而将末端甘氨酸突变为赖氨酸则丧失了结合能力。体外重构的泛素化实验证实，CRL2^KLHDC3能特异性介导IDO1肽段的泛素化，但对突变体无效。在细胞中，IDO1 C末端甘氨酸突变增加其蛋白丰度，而将EG优化为更佳的RG则促进降解。这些结果表明IDO1是KLHDC3的天然底物，其降解依赖于C末端甘氨酸构成的降解信号。
进一步对iDegs化合物进行功能评估。其中，iDeg-6在酶活抑制（IC50 = 16 nM）和诱导降解（DC50 = 6.5 nM）均表现最佳。深入的作用机制研究表明，iDeg-6的降解功能严格依赖于CRL2^KLHDC3E3泛素连接酶复合物及其neddylation修饰过程，敲除KLHDC3或突变其底物识别关键位点均可完全阻断降解发生。
通过体外生化重建实验，他们明确了其分子机制：iDegs通过竞争性取代血红素，将IDO1稳定在易于被E3连接酶KLHDC3识别的脱辅基构象，从而促进其泛素化降解。与此相反，血红素或传统抑制剂则通过稳定IDO1的C端螺旋结构，阻碍了KLHDC3的结合。这一构象调控作用的强度与化合物在细胞中的降解效力直接相关。
该研究揭示了IDO1蛋白稳态的调控机制：apo-IDO1是E3连接酶KLHDC3的天然底物，可被快速降解；而结合血红素后的holo-IDO1则逃逸降解。进一步研究发现，其他抑制剂会稳定IDO1蛋白、增加其丰度，而iDegs则将其锁定在易降解构象来促进降解。功能实验表明，iDeg-6不仅能降解IDO1，还可有效抑制其促进肿瘤迁移的非酶功能，展现出优于传统抑制剂的治疗潜力。
综上，针对IDO1这一具有重要临床意义但传统抑制剂屡屡受挫的靶点，本研究发现了iDegs能通过E3连接酶CRL2KLHDC3介导的天然降解途径，有效诱导IDO1的泛素化降解。相较于结构复杂、需双靶点的PROTAC分子，iDegs属于结构更简单、类药性更优的单分子降解剂，在药物开发中也具有显著优势。
参考文献
Hennes, E., Lucas, B., Scholes, N.S. et al. Monovalent pseudo-natural products supercharge degradation of IDO1 by its native E3 KLHDC3. Nat. Chem. (2026). https://doi.org/10.1038/s41557-025-02021-5
声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！
长按关注本公众号
粉丝群/投稿/授权/广告等
请联系公众号助手
觉得本文好看，请点这里↓
