2024年8月29日，苏州大学叶娜和中南大学程岩团队在Journal of Medicinal Chemistry上在线发表了题为“Structure–Activity Relationship Studies of Substituted 2-Phenyl-1,2,4-triazine-3,5(2H,4H)-dione Analogues: Development of Potent eEF2K Degraders against Triple-Negative Breast Cancer”的文章。作者基于hits I4和C1的2-苯基-1,2,4-三嗪-3,5（2H，4H）-二酮骨架进行结构优化，通过SAR分析发现了化合物36可以显著抑制TNBC细胞系MDA-MB-231和HCC1806的存活率、增殖和迁移，对eEF2K蛋白具有高结合亲和力，并有效诱导其降解。此外，在MDA-MB-231细胞异种移植小鼠模型中，36具有与紫杉醇相当的肿瘤抑制作用，没有明显的毒性，表明化合物36可以开发为TNBC治疗的潜在新疗法。三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，复发可能性高，总体预后差，占已确诊乳腺癌的15-20%。化疗仍是目前TNBC标准治疗的主要手段，因TNBC异质性高，对激素疗法和针对ER、PR和HER2的靶向疗法反应较低。化疗耐药性的出现也给TNBC的治疗带来了挑战。因此，开发新的有效疗法作为治疗TNBC的有效选择迫在眉睫。真核细胞伸长因子2激酶（eEF2K）是唯一依赖于Ca2+和钙调素的非典型α-激酶，也被称为Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶III（CAMKIII）。eEF2K在细胞应激和缺氧、营养耗竭等不利条件下被激活。这使它能够使其下游蛋白eEF2磷酸化，从而阻止核糖体转运并抑制蛋白质合成的延长步骤，最终维持能量平衡并适应微环境挑战。eEF2K活性异常与肿瘤发生、侵袭和转移的增强有关。eEF2K在不同类型的癌症中高度过表达，包括乳腺癌、胶质瘤、胰腺癌、脑癌和肺癌。在TNBC患者中也观察到了eEF2K的表达失调。药理抑制eEF2K可抑制肿瘤进展并提高癌症免疫疗法的疗效。因此，eEF2K是TNBC的一个新兴治疗靶点。目前，针对eEF2K的调节剂报道较少，已报道的eEF2K抑制剂在体外表现出显著抑制eEF2K酶活性的作用，但它们对各种癌症细胞类型的抗增殖功效相对有限，因此阻碍了体内验证研究（图1A）。新型高效的eEF2K的抑制剂亟待开发。图1. 已报道的eEF2K调节剂的结构作者基于A-484954的吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮框架的骨架跳转设计策略，以及随后对初始hit I4的初步优化，发现了一种eEF2K单价降解剂C1（图1B）。I4较低的抗增殖效力和C1中存在的不稳定酯基限制了其进一步的临床转化。因此，在本文中，作者通过分子对接预测C1和I4与eEF2K蛋白的结合模式（图2A-B），设计并合成了四个系列的I4和C1衍生物（图2C），在其2-苯基-1,2,4-三嗪-3,5(2H,4H)-二酮支架上探索更多的化学空间，并在药物化学方面建立eEF2K降解剂的结构-活性关系（SARs），最终提高化学稳定性和抗癌疗效。图2. C1和I4与eEF2K蛋白的结合模式及新型eEF2K降解剂的设计 SAR分析表1. 系列I化合物的抗肿瘤活性表2. 系列II化合物的抗肿瘤活性表3. 系列III和IV化合物的抗肿瘤活性在合成的一系列结构衍生物中，化合物36显示出最显著的MDA-MB-231细胞抑制活性，IC50 = 43.71 nM。SPR分析表明化合物36与eEF2K的结合力很强，且与浓度有关，KD值为330 nM。化合物36对TNBC细胞具有强效抑制作用通过CCK-8试验测试化合物19和36对其他六种乳腺癌细胞的抗癌活性。如图3A所示，与其他亚型乳腺癌细胞株相比，36对TNBC细胞株MDA-MB-231和HCC1806表现出更强的效力，在菌落形成试验中优于19（图3B）。36以剂量依赖的方式诱导MDA-MB-231和HCC1806细胞的显著凋亡（图3C）。Western印迹分析发现，PARP和Bax的裂解水平升高，PARP、Bcl-2和XIAP的水平降低（图3D），进一步证明36诱导了MDA-MB-231和HCC1806细胞的凋亡。图3. 化合物36可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡化合物36能有效阻断上皮细胞向间质转化和细胞迁移 eEF2K是上皮细胞向间质转化（EMT）的介导因子，EMT是促进细胞迁移和侵袭的重要机制。通过Western印迹分析检测了化合物36对EMT标记的影响。如图4A所示，化合物36处理导致E-cadherin表达增加，N-cadherin和波形蛋白表达减少，阻止了TNBC细胞的EMT。通过细胞伤口愈合试验评估了化合物36对TNBC细胞迁移的影响。如图4B所示，化合物36能显著抑制细胞迁移。图4. 化合物36抑制细胞迁移化合物36通过泛素-蛋白酶体系统诱导eEF2K降解作者检测了化合物36对eEF2K蛋白表达的影响，发现36能以剂量依赖的方式有效降低MDA-MB-231和HCC1806细胞中eEF2K蛋白水平（图5A）。化合物36在TNBC细胞中诱导的eEF2K下调效应与其对癌细胞的抑制作用呈正相关。细胞热转移试验表明，用36处理会增加eEF2K的热稳定性，这表明36与eEF2K蛋白结合（图5B），与之前的SPR结果一致。此外，根据36的分子对接结果，构建的携带eEF2K氨基酸突变（Phe8、Leu10、Cys146）的HEK-293T细胞，其中两个苯基环和核心与C1重叠良好（图6A-B）。同样，细胞热转移实验表明，Phe8、Leu10和Cys146氨基酸的突变损害了eEF2K蛋白在36存在下的热稳定性，表明eEF2K与化合物36之间的相互作用被破坏（图6C）。图5. 化合物36能有效诱导eEF2K蛋白降解图6. 化合物36能与eEF2K蛋白特异性结合接着，作者进行了冲洗实验以评估36诱导eEF2K降解的持续时间。图5C显示，培养基冲掉后，eEF2K蛋白持续降解，48 h后由于蛋白的重新合成，eEF2K蛋白恢复，表明36可能是一种长效的eEF2K降解剂。为了验证用36处理的TNBC细胞中eEF2K的下调是否与eEF2K降解的调控有关，作者用MG132和MLN4924处理了细胞。如图5D所示，蛋白酶体抑制剂MG132和E1泛素激活酶抑制剂MLN4924能显著逆转36诱导的eEF2K表达下降，表明36能促进泛素-蛋白酶体途径介导的eEF2K降解。进一步探讨了36对蛋白质稳定性的影响，发现在36的处理下，eEF2K蛋白的周转率明显加快（图5E）。综上所述，36通过促进泛素-蛋白酶体途径介导的降解来下调eEF2K蛋白。为了进一步证实36诱导的肿瘤抑制作用确实是通过靶向eEF2K实现的，作者通过shRNA转染建立了eEF2K稳定敲除（eEF2K-KD）的MDA-MB-231 细胞（图7A）。发现36对细胞存活的影响与敲除eEF2K对MDA-MB-231细胞的影响相当（图7B）。与对照细胞相比，稳定敲除eEF2K的MDA-MB-231细胞对36不敏感（图7C-D）。证实了36的抗肿瘤活性源于其促进eEF2K降解作用。图7. 化合物36对TNBC细胞的抑制作用取决于eEF2K的降解化合物36的药代动力学（PK）特性当静脉注射和腹腔注射剂量为5mg/kg时，36的体内峰值浓度（Cmax值分别为549.3和194.3ng/mL）和暴露量（曲线下面积（AUC）值分别为860.6 和 287.5 h·ng/L）均可接受，半衰期分别为 5.9 和 2.1 h。然而，36的口服吸收可能较差，从而导致口服生物利用度不足（F = 1.5%，表 4），这主要归因于其低水溶性。现阶段通过腹膜内给药来确定其体内药效（F = 33.4%）。表4 化合物36的PK特性化合物36在体内具有强效的肿瘤抑制作用化合物36以剂量依赖性的方式显示出有效的抗肿瘤活性，在5和10 mg/kg剂量时，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为44.79%和59.26%（图8A-D）。此外，剂量为10 mg/kg的36在体内的抗癌活性（TGI ：59.26 vs 52.70%）与TNBC治疗中使用的标准化疗药物PTX相当。免疫组化分析表明，与对照相比，36治疗显著降低了Ki-67的表达（图8E）。此外，用36治疗的肿瘤中eEF2K的表达呈剂量依赖性下调（图8F）。图8. 化合物36显著抑制体内肿瘤生长体内毒性试验表明，在使用36的治疗过程中，小鼠体重没有减轻（图9A）。小鼠各器官的大小/重量或H&E染色检测均未显示出异常，这表明小鼠对5 mg/kg和 10 mg/kg的剂量均有耐受性，能有效抑制肿瘤生长（图9B-D）。进一步检测了一系列肝肾毒性血清生化指标，在异种移植模型中未观察到明显的药物相关毒性（图9E）。图9. 化合物36在体内显示低毒性总结本文基于hits I4和C1的2-苯基-1,2,4-三嗪-3,5(2H,4H)-二酮骨架进行结构优化和SAR研究，发现化合物36对三种TNBC细胞系表现出最强的效力，其IC50值从43.7到585.3 nM。此外，化合物36能明显抑制MDA-MB-231和HCC1806细胞的迁移和凋亡，并与eEF2K蛋白有很高的结合亲和力，能有效地诱导其降解。此外，36在TNBC细胞异种移植小鼠模型中发挥了强大的肿瘤抑制作用，且无明显毒性，有希望成为TNBC治疗的潜在新型疗法。原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c01484 药物筛选中心（暨南大学）对外提供新药筛选服务声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓

免疫疗法临床终止

2021-07-19

·精准药物

Nature子刊：治疗癌症激酶新靶标eEF2K：尚无选择性抑制剂

真核细胞延伸因子2激酶（eEF2K）是α-激酶家族的一个非典型成员，与经典蛋白激酶没有序列相似性。eEF2K在肿瘤发生、发展过程中发挥关键调节作用，在不同癌症中上调并与患者预后不良相关，使得人们对其作为抗癌靶点的潜力越来越感兴趣 . 生物学功能 20世纪80年代末，科学家报道eEF2K为一种结构和功能独特的蛋白激酶，参与钙调蛋白介导的信号传导途径。它的底物eEF2在蛋白质合成的延伸阶段帮助核糖体与mRNAs结合。eEF2高度保守Thr56残基磷酸化，会抑制其活性进而负调节蛋白质合成（图1a）。最近，参与谷氨酰胺稳态和AMPK调节的磷酸酶2A （PP2A）的α4调节亚基也被鉴定为底物。 eEF2K的过度表达与各种实体瘤患者的低生存率相关，包括脑、食管、胰腺、肺癌和三阴性乳腺癌等。抑制 eEF2K 与凋亡和自噬性癌细胞死亡以及VEGF水平和血管生成的降低有关. 此外，最近证明，抑制 eEF2K 与谷氨酰胺酶抑制剂或4EBP1缺失协同抑制三阴性乳腺癌细胞生长。除了癌症，eEF2K还与一些神经系统疾病有关。例如，在阿尔茨海默病（AD）患者死后的脑组织中观察到eEF2的异常过度磷酸化，eEF2K的基因减少抑制了AD相关eEF2的过度磷酸化，改善了AD小鼠模型的记忆缺陷。图1 | eEF2K作为抗癌药物靶点 a) eEF2K信号通路及其伙伴。在癌细胞中，eEF2K活性可以通过抑制翻译延伸来支持细胞在营养缺乏时的存活。b) 选择性eEF2K抑制剂A-484954的结构。化学工具虽然eEF2K不被多靶激酶抑制剂如staurosporine所抑制，也没有完整的蛋白质晶体结构可用，但是有一些化合物被报道为eEF2K抑制剂。最早报道的eEF2K抑制剂之一是咪唑化合物NH125。尽管这种化合物在体外能够抑制eEF2K eEF2K （IC50=0.060μM）并具有很强的抗癌活性，但机制研究发现它实际上诱导细胞中的eEF2磷酸化，与钙调素而不是ATP竞争活性位点；因此，它不是研究抑制eEF2K的抗癌潜力的合适工具。在同一研究中，还报告了通过高通量筛选鉴定一种选择性但较弱的eEF2K抑制剂（IC50=0.28μM），称为a-484954 （图1b）。A-484954降低了细胞中eEF2的磷酸化，但对癌细胞的生长几乎没有影响。到目前为止，还没有发现选择性的eEF2K抑制剂，亟需开发其抑制剂以更好地了解eEF2K作为癌症和其他疾病靶点的潜力。