Methionine

阿尔茨海默症（Alzheimer's Disease, AD）是一种主要影响老年人的神经退行性疾病，全球病例数量不断增加。近年来，肠道菌群失衡被认为与AD的发病机制密切相关，尤其是微生物代谢物对神经炎症的调控作用。然而，目前尚不清楚肠道微生物组和大脑中的神经炎症如何相互作用，或者这些相互作用如何影响大脑功能和认知。 近日，中国中医科学院赵海誉研究团队在Alzheimers Res Ther发表了题为Intestinal endogenous metabolites affect neuroinflammation in 5×FAD mice by mediating "gut-brain" axis and the intervention with Chinese Medicine的研究论文，揭示了肠道微生物群的改变对AD进展的重要影响，特别是在神经炎症和代谢调控方面的作用。研究发现，通过调控“肠脑轴”的代谢产物，可能为AD的治疗提供新的干预靶点。 1. AD进展与肠道菌群的改变 认知缺陷表现 5×FAD小鼠（转基因小鼠，简称Tg-M）在认知功能评估中显示出明显的认知缺陷，尤其在Y迷宫和莫里斯水迷宫（Morris Water Maze, MWM）测试中，定位平台所需时间显著长于野生型小鼠（Wild-Type Mice, WT-M）。 在MWM的探查试验中，Tg-M小鼠在目标象限的停留时间、移动距离和穿越平台的次数均低于WT-M小鼠。此外，尽管通常焦虑水平较高的动物在中心区域的探索时间较短，但Tg-M小鼠在该区域的停留时间是WT-M小鼠的2.4倍，且排泄的粪便量也显著增加。 雌性5×FAD小鼠（转基因小鼠，简称Tg-F）体重较低，表现出更高的死亡率和攻击性，其在认知任务中的表现显著低于同龄的Tg-M小鼠，尤其在MWM测试中潜伏期增加。 图1. AD小鼠认知缺陷和焦虑增加 CNS神经炎症 5×FAD转基因小鼠表现出加速的认知障碍、早期的淀粉样蛋白（Aβ）沉积以及突触退化，尤其在雄性小鼠的海马和皮层区域观察到快速的Aβ斑块积累。 ELISA检测显示，Tg-M小鼠大脑中三种Aβ（Aβ38、Aβ40、Aβ42）的浓度显著高于WT-M小鼠。免疫染色结果表明，5×FAD小鼠的大脑中活化的小胶质细胞和星形胶质细胞数量增加，尤其在Aβ斑块周围，这导致神经炎症和血脑屏障功能障碍。 此外，RT-PCR和Western blot分析发现主要组织相容性复合物II类（MHC-II）和促炎细胞因子（如IL-1α、TNF-α、MCP-1）的表达增加，抑制了小胶质细胞对Aβ的清除功能。与雄性小鼠相比，雌性Tg-F小鼠表现出更严重的神经炎症，其大脑中Aβ、IBA-1和GFAP水平显著提高。 图2. Aβ升高会诱发神经炎症 外周免疫系统变化 5×FAD小鼠在外周免疫系统中表现出明显的功能失调，尤其是Th1（CD3+CD8−INFγ+）、Th2（CD3+CD8−IL4+）和Th17（CD3+CD8−IL17α+）细胞在转基因小鼠（Tg-M）脾脏中的比例显著高于野生型小鼠（WT-M），而调节性T细胞（Treg, CD4+CD25+Foxp3+）的频率则降低。 Th1细胞被认为在阿尔茨海默症（AD）中具有有害作用，其水平升高与小胶质细胞激活、炎症因子表达增加、认知功能受损和突触可塑性紊乱相关。研究发现，尽管Tg-M小鼠的Th1和Th2细胞均有所增加，但Th1/Th2比率下降，表明外周炎症加剧可能导致Th1细胞的升高和Th2细胞的过度分泌，进而引发Th1/Th2失衡。Treg细胞在AD中起到神经保护作用，其暂时耗竭会加速认知障碍并促进小胶质细胞清除Aβ沉积。 图3. AD小鼠脾脏中免疫细胞的水平 抗生素诱导的肠道微生物组扰动影响了认知和神经炎症 抗生素（ABX）诱导的肠道微生物组扰动显著影响了5×FAD小鼠（Tg-M）的认知功能和神经炎症。16S rRNA基因扩增子测序显示，Tg-M小鼠粪便中的α微生物多样性显著增加，而PLS-DA分析揭示其肠道微生物组成发生了明显变化。ABX治疗导致Tg-M小鼠的α多样性急剧下降，并打破了肠道菌群的结构稳态，同时Aβ聚集减少，表明抗生素治疗促进了小胶质细胞的清除功能。 此外，ABX还降低了脑内MHC II类和炎症细胞因子（如IL-1α、TNF-α和MCP-1）的表达，可能重置了小胶质细胞的吞噬功能。ABX显著改善了Tg-M小鼠的认知障碍和焦虑，表现在MWM任务中的学习记忆提升和开放场测试中粪便排泄减少。这些结果表明，“肠脑轴”能够实现双向信息传递，且Tg-M小鼠的功能通路在氨基酸、碳水化合物和能量代谢等方面较WT-M小鼠更为丰富。 图4. 肠道微生物多样性的改变 2. 肠源性代谢物变化与氨基酸、碳水化合物和能量代谢的关系 短链脂肪酸（SCFAs）由肠道微生物发酵膳食纤维产生，调节能量代谢，并在微生物-肠-脑相互作用中发挥重要作用。 在Tg-M小鼠的粪便中，SCFAs产生菌的丰度显著变化，具体表现为有益菌如Erysipelotrichaceae和Bifidobacteriaceae的减少，以及Lachnospiraceae的增加。此外，Tg-M小鼠粪便中的哌啶酸（PA）水平下降，异丁酸（IBA）水平上升。纵向研究显示，Tg-M小鼠在9至11个月期间的粪便SCFAs水平快速增加，表明肠道微生物群的动态变化与SCFAs生成密切相关。 图5. AD小鼠粪便中 SCFA 的改变 3. 肠源性代谢物是肠脑轴的沟通中介 肠源性代谢物通过血液进入全身，影响大脑功能并在阿尔茨海默症等神经疾病中影响认知。使用气相色谱-串联质谱（GC-QQQ-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-QQQ-MS）研究发现，5×FAD小鼠（Tg-M）的大脑中短链脂肪酸（SCFAs）水平与小胶质细胞激活呈正相关，且Tg-M小鼠的粪便、血清和脑组织中IBA水平高于野生型小鼠（WT-M）。 外周血中丙氨酸、色氨酸、牛磺酸等氨基酸水平显著增加，同时大脑中的丙氨酸、甲硫氨酸、GABA等浓度也显著升高。Tg-M小鼠表现出葡萄糖代谢障碍和线粒体功能障碍，PICRUSt分析预测其能量代谢出现障碍。在Tg-M小鼠中，丙酮酸水平显著升高，而柠檬酸和琥珀酸水平则显著降低，且外周和大脑中的代谢物变化趋势一致。这些结果表明，缺氧加重的线粒体功能障碍与Tg-M小鼠中脂质过氧化增加的现象相关。 图6. AD小鼠外周血和脑内源性代谢物的变化 4. 黄连解毒汤（HLJDD）通过调节肠道微生物代谢缓解AD小鼠的神经炎症 在对5个月大的雄性5×FAD小鼠进行六个月的HLJDD治疗后，研究发现其认知障碍和焦虑显著改善，表现为莫里斯水迷宫（MWM）测试中的学习和记忆能力提升，以及开放场测试中排便量减少。 HLJDD通过降低由Aβ和免疫细胞相互作用引发的炎症因子（如IL-1α和INF-γ）分泌，缓解了神经炎症。分析显示，HLJDD重塑了小鼠的肠道微生物结构，增加了SCFA产生菌的丰度，并降低了SCFAs的整体水平。HLJDD组的SCFAs水平与某些细菌群体呈负相关，而与其他细菌群体呈正相关。 此外，HLJDD还提高了粪便中胆碱水平，降低了色氨酸、GABA、牛磺酸和亮氨酸的含量，并通过调节外周免疫细胞（降低Th1和Th2细胞，增加Treg细胞）进一步改善了5×FAD小鼠的神经炎症和认知功能。 小结 总体而言，本研究探讨了肠道微生物群的改变如何影响阿尔茨海默症（AD）的进展，结果显示5×FAD小鼠在认知测试中表现出明显的缺陷，伴随脑中Aβ沉积和神经炎症的加重。 研究发现，短链脂肪酸（SCFAs）产生菌显著减少，而异丁酸等代谢物浓度升高，这些变化与神经炎症和认知功能下降密切相关。同时，外周免疫系统中的Th1细胞比例增加，调节性T细胞（Treg）比例减少，导致免疫失衡。 这些结果强调了“肠脑轴”在AD进展中的关键作用，表明通过调节肠道微生物及其代谢产物可能为AD的干预提供新的治疗靶点，为未来研究与临床应用奠定了基础。 参考文献： Gu X, Fan M, Zhou Y, et al. Intestinal endogenous metabolites affect neuroinflammation in 5×FAD mice by mediating "gut-brain" axis and the intervention with Chinese Medicine. Alzheimers Res Ther. 2024;16(1):222. Published 2024 Oct 14. doi:10.1186/s13195-024-01587-5 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！ 点击下方「阅读原文」，前往生物谷官网查询更多生物相关资讯~

介绍： 聚山梨酯（吐温，PS）是一类两亲性非离子表面活性剂家族，其中，聚山梨酸酯80（吐温80）是生物药物制剂中使用最广泛的“明星”表面活性剂，可防止蛋白质在储存、运输条件变性、聚集、表面吸附以及絮凝作用。吐温80是一种混合物，主要成分是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。 作为常用的药物辅料，市售注射用吐温80主要有MC（多药典级）和CP（中国药典级）两种级别，其主要差异在油酸含量上，见表1。其中，CP级别常用供应商日油和南京威尔，MC级别有JT、Sigma和禾大等。 吐温80可以通过氧化和水解途径降解，见图1，其中水解反应是化学诱导的或酶催化的，氧化反应一般由化学诱导。吐温80作为生物制剂的一种保护剂辅料使用，但也可能影响蛋白质制剂的质量，从而对功效、安全性和稳定性起到不利作用。目前，药品监管部门对吐温80的控制要求越来越严格。 图1 吐温80的主要降解途径 有很多学者对吐温80进行了大量研究，下面从吐温80的优缺点、含量测定方法、以及面临挑战几个方面进行介绍。 吐温80的优点： PS80是生物制剂中最常用的表面活性剂，在大多数商业治疗性蛋白质制剂中用作蛋白质稳定剂。这是由于以下因素： 1）生物相容性高； 2）低毒性； 3）有效的蛋白质稳定作用。即使在低浓度下（生物制剂中常用浓度为0.1-1.0mg/ml），它们也提供了足够的蛋白质稳定性。这是由于PS80的亲水亲脂平衡（HLB）值高和临界胶束浓度（CMC）低，PS80的CMC仅为1.4*10-2g/L。蛋白质具有天然的不稳定性，易受到外部条件的影响，如温度、震荡、剪切力、缓冲体系及离子强度等，甚至自身的蛋白浓度或纯度的改变。其中，所有蛋白质变性降解的问题中，聚集的问题尤为严重。下游的制剂开发中常常使用吐温80作为蛋白的保护剂。聚山梨酯稳定蛋白质的机理，通常认为界面竞争和表面活性剂-蛋白质复合这两种主要机理。 吐温80主要通过界面竞争作用来稳定蛋白质，吐温80的表面活性比蛋白质（即单克隆抗体（mAbs））高很多，因此，吐温80可以竞争性地占据界面位置，抑制蛋白质吸附到气液交界面，进而减少与空气接触造成的氧化或聚集，也有效防止蛋白质在制造过程、样品处理和存储中在界面处展开。 吐温80还可以通过与蛋白质直接相互作用，增加蛋白质的胶体稳定性。抗体可能会通过其分子间输水作用形成聚集体。吐温80可通过与蛋白质表面上的疏水相互作用，从而防止蛋白质聚集甚至颗粒的产生。 吐温80的缺点： 前面提到吐温80其实是一种混合物，市售的预期结构聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯）仅占吐温80总量的20％。如图2所示，异质性主要来来源与工艺相关的副产物杂质，其中不仅含有单酯（预期结构），还含有二酯、多酯，甚至未成酯的脂肪酸链。此外，前面还提到（见图1），吐温80可以发生水解反应及氧化反应导致降解，产生脂肪酸链及氧化物，以上导致对吐温80的表征成为了难点。 图2 吐温80主要的化学结构 吐温80的表征： 吐温80的结构缺乏强发色团，无法直接检测到容易获得的紫外可见光及荧光。目前，很多研究学者已经开发了多种表征方法来控制吐温80的不同性质，表2总结了几种常见含量检测方法的原理及优缺点。然而，由于不同亚种（如未酯化、单酯、多酯）及降解产物（如水解、氧化）对总吐温80含量结果的贡献值存在显著差异，因此用不同原理方法测定的吐温80含量显示出明显的差异。 此外，还采用MS或CAD（其中主要应用色谱与MS联合应用）来分析主要吐温80亚种的组成及降解物，例如小的有机分子，游离脂肪酸等，研究解聚山梨酯降解途径。药典方法、HPLC-ELSD/CAD方法对水解产物较为敏感，HPLC-FMA也可测出样品水解，然而测定吐温80氧化方面上，FMA方法更胜一筹，综合来看，HPLC-FMA方法更适用于PS80含量的检测。截止目前为止，吐温80的表征方法层出不穷，但具有各自方法的优点及弊端，其仍然是一项分析挑战，必要时可采取多种检测方式共同评价。 面临的挑战： 吐温80的水解也就是酯的水解，反应生成的游离脂肪酸链可形成聚集甚至可见颗粒，并且可能与蛋白结合形成脂肪酸-蛋白复合物。在典型的蛋白质制剂pH（4-7）下，吐温80的水解受到限制。有文献表明，酶诱导的吐温80水解是影响产品质量的可见和亚可见颗粒形成的主要原因，实际生产中上游工艺带来的Hcp脂肪酶是催化PS80水解的一个重要因素，其具有与目标蛋白相似的理化性质，因此很难完全去除。即使优化纯化工艺去除Hcp，但远低于检测限的极少量Hcp（ppm级别）也可催化PS80的水解。 吐温80可能被光照、温度，过氧化物、氧气或痕量金属离子等影响因素氧化，氧化位置常见脂肪酸链双键、母核的醚键和部分酯键，降解产物有自由基、过氧化物、游离脂肪酸、短链烷烃、醛、酮、酸等。而生成的过氧化物可能继而引起蛋白质氧化。 泊洛沙姆188（P188）是另一种在蛋白质制剂中用作蛋白质稳定剂的赋形剂，尽管不如吐温80使用广泛。P188因不具备酯键，不会有发生水解的风险，主要通过氧化形式在溶液中降解，形成氧化的聚氧乙烯（POE）和聚环氧丙烷（PPO）。但P188在上市品种中应用局限，可能存在长期放置过程中潜在风险。 因此，推荐使用一些手段减少吐温对蛋白质的负面影响，如2-8℃低温储存、充氮、避光保护；通过上游工艺优化降低Hcp；加入抗氧化剂、金属络合剂等。其中抗氧化剂如甲硫氨酸、赖氨酸、色氨酸等，金属络合剂如EDTA、DTPA等。 参考文献： [1] Characterization of Polysorbate 80 by Liquid Chromatography Mass Spectrometry to Understand Its Susceptibility to Degradation and Its Oxidative Degradation Pathway Journal of Pharmaceutical Sciences 111 (2022) 323−334; [2] Characterization of Polysorbate Ester Fractions and Implications in Protein Drug Product Stability Mol. Pharmaceutics 2020, 17, 2345−2353; [3] Degradation of polysorbates 20 and 80 catalysed by histidine chloride buffer European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 154 (2020) 236–245. 药事纵横投稿须知：稿费已上调，欢迎投稿