Hydrochloric Acid

中文摘要 目的   建立邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生化反相高效液相色谱法（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）并验证，以检测百日咳抗原中间产物中氨基酸的含量。 方法   采用OPA柱前衍生化RP-HPLC检测百日咳抗原中间产物百日咳毒素脱毒液中L-天冬氨酸钠盐、丝状血凝素脱毒液中甘氨酸及黏附素脱毒液中L-赖氨酸的含量，并对该方法的专属性、系统适用性、线性、准确度、耐用性、检测限和定量限进行验证。 结果   OPA柱前衍生化RP-HPLC检测配置溶液，对照品和供试品溶液可见对应的氨基酸色谱峰，供试品溶液的保留时间和峰面积相对标准偏差均小于2.0%。氨基酸浓度在5~100 μg/ml时，浓度与峰面积线性关系良好，检测氨基酸样品的加标回收率均在80%~120%之间。用磺基水杨酸和盐酸稀释剂处理供试品后，2种稀释剂检测值之间的相对误差在±5%范围内。定量限为5 μg/ml，检测限为2 μg/ml。 结论   成功建立了检测百日咳抗原中间产物中氨基酸含量的OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法，该方法的专属性、系统适用性、线性、准确度、耐用性良好。 正文 百日咳是由百日咳鲍特菌感染引起的急性呼吸道传染病，严重时可导致婴幼儿死亡，百日咳疫苗的大规模使用能够显著减少该疾病的发生。根据工艺的不同，百日咳疫苗分为全细胞和无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine, aP），aP由百日咳抗原，包括丝状血凝素（filamentous haemagglutinin，FHA）、百日咳毒素、黏附素及菌毛蛋白等组分组成。在生产过程中，百日咳毒素纯化液经PBS和甘油稀释后，使用L-天冬氨酸钠盐和戊二醛脱毒，得到百日咳毒素脱毒液；FHA纯化液用PBS稀释后，使用甘氨酸和甲醛脱毒，得到FHA脱毒液；黏附素纯化液用碳酸盐缓冲溶液稀释后，使用L-赖氨酸和戊二醛脱毒，得到黏附素脱毒液。目前，关于组分百日咳抗原中间产物中氨基酸含量的衍生化分析方法主要包括异硫氰酸苯酯法、2，4-二硝基氟苯法、邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生化反相高效液相色谱法（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）等。 OPA柱前衍生化RP-HPLC检测技术制备简单、反应迅速、灵敏度高，但需要及时进样。OPA在室温下巯基乙醇环境中，与一级氨基酸反应生成具有强荧光性的异吲哚衍生物。OPA本身不散发荧光，在色谱分离时不会形成干扰峰。OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法使用自动进样器进行在线衍生，可以精确控制衍生反应的时间，有效避免衍生反应时间变化对测定结果的影响。本研究拟对OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法的流速和洗脱程序进行优化，并对百日咳抗原中间产物中的L-天冬氨酸钠盐、FHA脱毒液中甘氨酸及黏附素脱毒液中L-赖氨酸共3种氨基酸的含量进行检测，旨在为类似产品中氨基酸含量的检测提供依据。 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 LC-20AD型高效液相色谱仪、AJS-02色谱柱（规格：150 mm×4.6 mm，3 μm）均购自日本岛津公司；5430R型离心机购自美国Eppendorf公司。 赖氨酸和L-天冬氨酸钠盐均购自美国Sigma公司，甲醇、乙腈均购自德国默克公司，磺基水杨酸和盐酸均购自北京益利精细化学品有限公司，OPA衍生试剂购自日本岛津公司，甘氨酸、磷酸、十二水合磷酸氢二钠和十水合四硼酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司。0.22 μm聚偏氟乙烯〔poly（vinylidene fluoride），PVDF〕滤膜购自天津津腾实验设备有限公司。 1.2 供试品 百日咳毒素脱毒液（批号：20211213）、FHA脱毒液（批号：20211214）、黏附素脱毒液（批号：20211216）均由北京民海生物科技有限公司制备。 1.3 OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法的建立 1.3.1   溶液配制   流动相A：分别称取9.0 g十二水合磷酸氢二钠和9.5 g十水合四硼酸钠，加超纯水溶解，加入0.1 mol/L 盐酸调pH至8.0，加超纯水至2 L，混匀。流动相B：分别量取900 ml甲醇和900 ml乙腈，加超纯水至2 L，混匀。OPA衍生试剂：取OPA衍生试剂A液1支，加入OPA衍生试剂B液60 μl，混匀。稀释剂：取超纯水100 ml，加磷酸500 μl，混匀。对照品溶液：分别吸取不同体积的1 mg/ml L-赖氨酸储备液、1 mg/ml甘氨酸储备液、1 mg/ml L-天冬氨酸钠盐储备液及纯化水，混匀，配制各氨基酸终浓度分别为5、20、40、60、80和100 μg/ml的对照品溶液。系统适用性溶液：分别吸取1 mg/ml L-赖氨酸储备液、1 mg/ml甘氨酸储备液、1 mg/ml L-天冬氨酸钠盐储备液各40 μl及880 μl纯化水，混匀。 1.3.2　供试品溶液处理　使用1.5%磺基水杨酸溶液稀释供试品百日咳毒素脱毒液，稀释15倍；使用1.5%磺基水杨酸溶液分别稀释FHA脱毒液、黏附素脱毒液，均稀释2倍。室温条件下静置2 h，取溶液1 ml，14 000×g离心10 min，取上清液并用0.2 μm PVDF滤膜过滤后注入玻璃样品瓶。平行进样2次。同时将1 ml纯化水注入HPLC玻璃样品瓶作为空白溶剂。 1.3.3　色谱条件　采用OPA柱前衍生化检测法检测供试品溶液，先采用在线衍生法将空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液或供试品溶液进行衍生后进入色谱柱进行分离，具体步骤为：分别取15 μl硼酸盐缓冲液、2 μl供试品或对照品、2 μl OPA衍生试剂和12 μl水、20 μl稀释剂混匀，静置0.5 min后上样。HPLC检测的具体参数设定如下：色谱柱为AJS-02（规格：150 mm×4.6 mm，3 μm），流速1.0 ml/min，检测波长为338 nm，进样量2 μl，柱温40 ℃，流动相包括流动相A和流动相B，具体洗脱程序见表1。 1.4 方法验证 1.4.1　专属性　取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液按照1.3.3方法上样，记录色谱图。可接受标准：空白溶剂中的3种氨基酸不出峰，阳性对照（系统适用性）溶液出现3种氨基酸对应的色谱峰，供试品黏附素脱毒液的色谱图中出现L-赖氨酸对应色谱峰，供试品FHA脱毒液溶液中出现甘氨酸对应色谱峰，供试品百日咳毒素脱毒液中出现L-天冬氨酸钠盐对应色谱峰。 1.4.2　系统适用性　取1.3.1制备好的系统适用性溶液，按照1.3.3的方法连续上样5次，记录L-赖氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸钠盐溶液的色谱图、峰面积及保留时间。可接受标准：各氨基酸保留时间和峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均不高于2.0%。 1.4.3　线性与范围　分别取5、20、40、60、80和100 μg/ml的L-赖氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸钠盐对照品溶液，按照1.3.3的方法上样，进行3次试验。以标准溶液浓度为x轴，氨基酸的峰面积为y轴，建立回归曲线，计算决定系数（R2）。可接受标准：R2≥0.99。 1.4.4　准确度　取FHA脱毒液0.5 ml，分别加入浓度为10、40和70 μg/ml的甘氨酸储备液进行混合；将百日咳毒素脱毒液用1.5%磺基水杨酸稀释15倍后，取0.5 ml分别加入浓度为10、40和70 μg/ml 的L-天冬氨酸钠盐储备液混合；将黏附素脱毒液用1.5%磺基水杨酸稀释2倍后，取0.5 ml分别加入浓度为10、40和70 μg/ml 的L-赖氨酸储备液混合。将以上混合液按照1.3.3的方法进行上样，并按下列公式计算回收率。可接受标准：回收率在80%~120%之间。 1.4.5　检测限和定量限　分别配置2、3、5、10 μg/ml的L-赖氨酸、甘氨酸和L-天冬氨酸钠盐对照品溶液，按照1.3.3的方法进样，确定氨基酸含量检测方法的检测限和定量限。可接受标准：以上检测限检测值的信噪比均大于3，以上定量限检测值的信噪比均大于10，且定量限对应浓度的氨基酸溶液的回收率在80%~120%之间。 1.4.6　耐用性　将供试品百日咳毒素脱毒液、FHA脱毒液和黏附素脱毒液分别用1.5%磺基水杨酸和0.1 mol/L盐酸稀释5倍，按照1.3.3的方法进样后，分析2种稀释剂稀释供试品后检测值之间的相对误差，计算公式如下。可接受标准：2种稀释剂稀释供试品后检测值之间的相对误差在±5%之内。 2 结果 2.1 专属性 如图1所示，空白溶剂中无氨基酸对应色谱峰，阳性对照溶液可见3种氨基酸色谱峰：L-天冬氨酸钠盐对应色谱峰在约2.0 min时出现，甘氨酸对应色谱峰在约9.3 min时出现，L-赖氨酸对应色谱峰在约22.1 min时出现。黏附素脱毒液的色谱图中可见L-赖氨酸对应色谱峰，FHA脱毒液的色谱图中可见甘氨酸对应色谱峰，百日咳毒素脱毒液的色谱图中可见L-天冬氨酸钠盐对应色谱峰，以上结果均符合要求，表明该方法具有良好的专属性。 2.2 系统适用性 结果见表2，系统适用性溶液连续上样5次的L-赖氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸钠盐溶液保留时长的RSD均在0.1%~0.4%之间，峰面积的RSD均在0.2~0.5%之间，均小于2.0%，均符合要求，表明该方法具有良好的系统适用性。 2.3 线性与范围 试验结果发现，L-赖氨酸、甘氨酸、 L-天冬氨酸钠盐3种氨基酸溶液的浓度在5~100 μg/ml时，3次试验标准曲线的R2均大于0.99，符合要求，表明该方法在5~100 μg/ml范围内浓度与峰面积呈现良好的线性关系。 2.4 准确度 通过分析上样结果，发现对百日咳毒素脱毒液进行L-天冬氨酸钠盐加标试验时，3个不同加标浓度10、40、70 μg/ml的回收率分别为101.6%、98.2%和99.0%；对FHA脱毒液进行甘氨酸加标试验时，3个不同加标浓度10、40、70 μg/ml的回收率分别为109.9%、101.0%和99.6%；对黏附素脱毒液进行L-赖氨酸加标试验时，3个不同加标浓度10、40、70 μg/ml的回收率分别为99.8%、98.9%和101.2%。以上回收率均在可接受标准范围内，表明该检测方法的准确度良好。 2.5 检测限和定量限 不同浓度氨基酸溶液检测结果的信噪比见表3。检测结果显示，L-天冬氨酸钠盐、甘氨酸和L-赖氨酸的浓度为2 μg/ml时，所对应的信噪比均大于3，可作为检测限；L-天冬氨酸钠盐、甘氨酸和L-赖氨酸的浓度为5 μg/ml时，所对应的信噪比均大于10，且该浓度3种氨基酸溶液的回收率均在96.8%~104.9%之间，符合要求，将该浓度作为定量限。 2.6 耐用性 结果见表4，2种稀释剂处理供试品后相对误差在﹣2.1%~3.3%之间，在可接受范围内，说明这2种稀释剂稀释供试品后对其中氨基酸含量检测基本无影响，此检测方法的耐用性良好，考虑对高效液相色谱仪及色谱柱的维护，选择使用1.5%磺基水杨酸处理样品更为合适。 3 讨论 氨基酸的检测方法有分光光度法、化学法、色谱法等。其中，氨基酸的高效液相色谱分析方法主要分为直接分析和间接分析2种。直接分析法包括蒸发光散射检测法和高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法；间接分析法有柱前衍生法和柱后衍生法。柱前衍生法分析氨基酸，使用的衍生试剂主要有OPA、异硫氰酸苯酯、二硝基氟苯、9-氯甲酸芴甲酯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯和丹磺酰氯等。本法采用OPA对样品进行柱前衍生后，进行氨基酸检测。 田志伟等的研究中采用OPA柱前衍生法检测人免疫球蛋白中甘氨酸含量，张亿等同样采用OPA柱前衍生法检测复方制剂中盐酸赖氨酸含量。盛凤仙和张幼捷采用OPA柱前衍生法检测人凝血酶制品中甘氨酸的含量，采用手动衍生法；目前尚无疫苗相关产品中多种氨基酸同时检测的方法报道。 本研究结果显示，OPA柱前衍生法检测3种氨基酸（L-天门冬氨酸钠盐、甘氨酸和L-赖氨酸）系统适用性良好；检测限为2 μg/ml，定量限为5 μg/ml；在5~100 μg/ml范围内线性关系良好，R2大于0.99，准确度良好，可应用于百日咳抗原中间产品百日咳毒素脱毒液中L-天冬氨酸钠盐、FHA脱毒液中甘氨酸及黏附素脱毒液中L-赖氨酸含量的同时检测。该法减少了流动相的使用量，降低了系统压力并且提高了工作效率，也为其他生物制品中氨基酸的检测提供了参考。 作者 聂晓齐1,2  杜闪2  朱留强2  王艺霞2  王斌2  张钰东2  邓海清2  尹珊珊2  韩飞1 1沈阳药科大学药学院, 沈阳 110016；2北京民海生物科技有限公司研发四室, 北京 102629 聂晓齐和杜闪对本文有同等贡献 通信作者： 尹珊珊, Email: yinshanshan@biominhai.com； 韩飞, Email: hanfei_spu@163.com 引用本文：聂晓齐, 杜闪, 朱留强, 等. 组分百日咳抗原中间产物中氨基酸含量的邻苯二甲醛柱前衍生化RP-HPLC检测 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(3): 145-150.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230824-00007 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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