CD70 CAR-T (Rekindle Biotech)

【编者荐语】 近日，Blood杂志发表一项基础研究，将 诊断时CD70过表达作为预测滤泡性淋巴瘤复发的生物标志物，并支持进一步开发 CD19-CD70 双靶CAR-T疗法 。 尽管一线免疫治疗可使大多数滤泡性淋巴瘤（FL）患者获得缓解，但仍需更优的生物标志物与治疗策略，以识别并管理复发患者。本研究对接受统一治疗、随访超过 11 年的 FL 患者诊断时的免疫微环境进行了分析，转录谱分析结果显示，复发患者的炎症反应通路富集，包括细胞因子过表达及 CD70 上调 ——CD70 是一种参与免疫激活与炎症反应的分子。 多重免疫荧光验证结果显示，诊断时肿瘤细胞、CD8⁺T 细胞及 CD4⁺滤泡辅助性 T 细胞（T follicular helper, TFH）中均存在 CD70 过表达，且与无进展生存期缩短相关 。功能研究证实，CD70⁺肿瘤细胞增殖能力更强，并可诱导 T 细胞表达 CD70，提示存在维持免疫激活的前馈环路。为靶向上述细胞并优化现有 CAR-T 治疗方案，本研究通过将 CD19-CAR-T 产品 ARI-0001 与基于 CD27 的抗 CD70 CAR 共转导，构建了 CD19-CD70 双靶点 CAR-T 细胞 。双靶点 CAR-T 细胞对 FL、弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）及套细胞淋巴瘤（MCL）的患者来源球状体均表现出更强的体外细胞毒性。在 FL 异种移植模型中，与单靶点 CAR-T 细胞相比， 双靶点 CAR-T 治疗实现了更优的疾病控制，可诱导脾脏与骨髓内肿瘤完全清除。 综上，本研究结果为 CD19-CD70 双靶点 CAR-T 疗法的临床转化提供了扎实的临床前依据，有望改善高危 FL 及其他 B 细胞非霍奇金淋巴瘤患者的预后。 要点 诊断时 FL 细胞、CD8⁺T 细胞及 CD4⁺滤泡辅助性 T 细胞中 CD70 过表达与更差的无进展生存期相关； 在患者来源球状体及小鼠淋巴瘤模型中，CD19-CD70 双靶点 CAR-T 疗效优于 CD19 CAR-T（ARI-0001）; 引言 FL属于高度异质性B细胞恶性肿瘤，多数患者对一线化学免疫治疗可产生缓解，但远期复发风险极高。FL肿瘤进展高度依赖LME，肿瘤体细胞突变可重塑微环境内T细胞、巨噬细胞、基质细胞的表型与丰度。CAR-T已成为复发难治FL标准治疗方案，但近半数患者在治疗三年内出现疾病进展，复发诱因包含CD19表达缺失、肿瘤炎症微环境、免疫抑制微环境三类因素。因此，研究者提出需在肿瘤与微环境交互界面筛选可干预预后标志物，同步开发适配高危患者的新型免疫治疗手段。 CD70是具备临床转化潜力的靶点，全球已开展多类靶向药物研发。抗CD70单克隆抗体Cusatuzumab、多款CD70-ADC已在AML、实体瘤、B/T细胞NHL中开展临床探索，但药物普遍存在活化淋巴细胞毒性问题。细胞治疗赛道中，抗CD70 CAR-T、CAR-NK、γδ T细胞均进入临床登记阶段，已有临床数据证实CD19与CD70靶向疗法联用存在潜在获益，但尚无标准化双靶点CAR-T构建方案与完整FL临床前数据。基于上述背景，研究者开展队列免疫谱分析，锁定复发FL特征性CD70高表达表型，同时构建CD19-CD70双靶点CAR-T，系统对比其与单靶点CAR-T的体内外抗肿瘤活性。 方法 FL患者队列 研究纳入1997-2015年巴塞罗那临床医院32例1-3A级FL患者，所有受试者统一接受免疫化疗，部分联合自体干细胞移植，且基线均达到至少部分缓解。研究剔除3B级FL、胃肠道/皮肤原发FL、复合淋巴瘤、随访组织学转化、一线原发耐药病例，全部受试者留存诊断淋巴结活检标本，完成BCL2重排检测。研究方案符合赫尔辛基宣言规范，经机构伦理委员会审批并收集全部患者知情同意。 其余分子、细胞、动物实验、CAR-T构建、多重免疫荧光、Nanostring转录组、CRISPR基因编辑、PDLS三维模型、NSG异种移植小鼠模型等全套实验流程、试剂参数、检测平台操作细则均收录于补充材料，正文仅展示核心实验设计与数据产出逻辑。 结果 （一）诊断时CD70高表达与复发风险升高相关 研究者选取12例长期无复发、20例随访复发FL患者的诊断活检样本，完成730个免疫相关基因Nanostring转录组检测。共筛选出31组差异表达基因（FDR0.58），复发样本整体炎症相关基因显著上调，免疫杀伤相关通路表达下调（图1A）。预排序GSEA结果证实，复发患者诊断阶段即存在炎症通路富集，BCR信号、I型IFN信号、T细胞毒性、Fcγ吞噬通路活性显著降低（图1B）。CD70是差异基因中兼具预后价值与靶向潜力的关键分子，复发组CD70 mRNA表达水平显著高于无复发组（FC=1.88，FDR=0.0408）（图1C）。Kaplan-Meier生存曲线显示CD70高表达患者PFS存在缩短趋势（p=0.067）（图1D）。FLIP分层分析显示，中高危FL患者CD70表达显著高于低危人群（图1E）。多因素预后模型将CD70、FLIPI、β2M共同纳入变量，CD70与β2M均为独立预测PFS的不良指标。 CD70配体CD27在全部患者样本中表达无明显差异。相关性分析显示CD70 mRNA与CXCL5、CCL20、CCL22、IRF4等促炎、促转化基因呈显著正相关 （图1F）。突变谱关联分析显示，CD70高表达样本肿瘤突变负荷更低；携带CARD11、CIITA、TNFRSF14突变的病例CD70表达显著下调（图1G）。上述三类突变分别调控BCR信号、MHC II表达、T细胞共刺激通路，通路受损会减弱NF-κB介导的免疫激活，间接抑制CD70转录。既往scRNA-seq结论提示EZH2野生型样本CD70表达更高，本队列同样观察到该趋势，但未达到统计学显著水平。整套转录组数据证明，肿瘤基因组特征与LME共同调控诊断阶段CD70表达水平，CD70升高是FL复发的独立预警标志物。 （二）复发患者诊断时肿瘤细胞与特定T细胞亚群CD70/CD27轴存在失调 研究者采用mIF技术对13例患者（8例无复发、5例复发）淋巴结切片进行多色标记，同步定量B细胞、多类T细胞亚群的CD70、CD27膜蛋白表达。肿瘤B细胞层面，复发患者CD70⁺CD20⁺细胞均值为56.2%，无复发组仅20.25%（图2A、图2B）。以35%阳性比例为截断值分层后，CD70高表达组PFS显著劣于低表达组（p T细胞亚群定量结果显示，CD70主要表达于B细胞，但复发样本内CD8⁺、CD4⁺T细胞浸润的CD70阳性比例大幅上升 （图3A、图3B）。细分CD4亚群可见，TFH、Treg、非滤泡Th细胞CD70表达在复发组显著上调，TFR细胞CD70水平在两组间无差异。基于各T亚群CD70表达分层的生存曲线显示，CD8⁺、CD4⁺、TFH细胞CD70高表达均对应更差PFS（图3C上半部分）。 CD27在全部T细胞中基础表达高于B细胞，不同亚群预后关联完全相反。TFH细胞CD27高表达提示不良预后，非滤泡Th细胞CD27低表达提示不良预后；Treg、TFR细胞CD27水平组间无差异（图3B、图3C下半部分）。采用单位面积阳性细胞密度替代阳性比例重复统计，CD70、CD27表达与复发的关联结论完全不变。CD20⁺CD70⁺细胞密度和Treg浸润数量呈中度正相关，说明CD70高表达肿瘤可诱导免疫抑制T细胞募集，形成促瘤微环境。整套mIF数据证实，复发FL的B细胞、效应T、辅助T、调节T细胞共同存在CD70/CD27轴过度激活，该轴失衡是LME免疫抑制、疾病复发的核心特征。 （三）T细胞CD70表达受FL细胞共调控，且CD70直接促进肿瘤增殖 研究者通过CRISPR构建WSU-FSCCL、SC-1两种CD70敲除FL细胞系，和健康供体活化PBMC共培养验证细胞间信号交互（图4A、图4B）。共培养结果显示，野生型CD70⁺FL细胞可显著上调CD4⁺、CD8⁺T细胞表面CD70；CD70敲除肿瘤细胞无法诱导T细胞CD70表达（图4C）。CD27表达变化呈反向趋势，与CD70阳性肿瘤共培养后，CD4、CD8 T细胞膜CD27下调，上清sCD27含量显著上升（图4D、图4E），证实肿瘤CD70结合T细胞CD27后会诱导受体剪切，消耗膜表面共刺激分子，削弱T细胞抗肿瘤效应。 原代FL细胞体外生发环境刺激实验显示，同一患者样本内CD70⁺B细胞EdU增殖阳性比例显著高于CD70⁻细胞（图4F）。为直接验证CD70促增殖功能，研究者使用两条独立sgRNA敲低原代FL细胞CD70（图4G）。敲低组CD70阳性细胞比例大幅下降（图4H），同步伴随B细胞增殖活性显著降低（图4I）。T细胞共培养体系内，肿瘤CD70敲低同样减少T细胞CD70表达、降低sCD27释放、恢复T细胞膜CD27水平。全套体外功能实验证明，肿瘤细胞与T细胞之间存在CD70前馈激活环路：肿瘤高表达CD70促进自身增殖，同时诱导T细胞表达CD70、消耗功能性CD27，双向加重免疫失衡，推动FL进展复发。 （四）CD19/CD70双靶点CAR-T细胞的设计与优化 研究者分别构建scFv型、trCD27配体型两类单靶点抗CD70 CAR-T，和临床成熟ARI-0001 CD19 CAR-T平行对比活性。长期共培养杀伤实验证实trCD27 CAR-T的肿瘤清除、T细胞增殖能力全面优于scFv-CAR（图5A），后续双靶点载体选用trCD27骨架搭配4-1BB共刺激结构域。 CAR-T共转导体系存在慢病毒载体资源竞争、活化T细胞CD70介导自相残杀两大技术难点。 研究者梯度调整CD19-CAR、trCD27-CAR慢病毒配比，确定4:1载体比例可平衡两种CAR在T细胞中的表达丰度（图5B、图5C）。该配比制备的CAR-T总阳性率约50%，单CAR、双CAR亚群分布均衡。扩增培养过程中，trCD27修饰CAR-T会出现轻度自相残杀，伴随IFNγ分泌升高、PD-1/LAG-3检查点上调、T细胞分化加速（图5D、图5E）。 研究者测试两种消除自相残杀方案：扩增阶段加入达沙替尼、制备前敲除T细胞CD70。达沙替尼可提升T细胞扩增倍数，但损伤CAR-T杀伤功能；CD70敲除会抑制T细胞增殖、削弱效应活性（图5F）。两种改良方案均无综合获益，后续双靶点CAR-T全部采用标准共转导工艺。体外杀伤实验显示，双靶点CAR-T识别CD19单阳、CD70单阳、双阳靶细胞的裂解效率与单靶点CAR-T持平，IL-2、IFNγ分泌量更高（图5G）。健康供体、FL患者来源双靶点CAR-T长期共培养体系内，肿瘤持续清除效果、T细胞扩增倍数均优于单一CD19 CAR-T（图5H、图5I、图5J）。载体配比、细胞扩增、体外杀伤系列实验，完成双靶点CAR-T工艺定型，证明双靶点CAR-T无功能损耗，抗肿瘤效应优于单靶点产品。 （五）CD19-CD70双靶点CAR-T在PDLS三维模型中活性更优 研究者搭建FL-PDLS体外三维类器官模型，模拟淋巴结原位肿瘤微环境，分异体CAR-T、自体CAR-T两组验证药效（图6A）。异体CAR-T共培养条件下，双靶点CAR-T特异性肿瘤杀伤、T细胞扩增、细胞因子释放水平与ARI-0001相近；单独CD19 CAR-T处理会诱导FL B细胞CD70表达上调（图6B、图6C、图6D、图6E）。自体CAR-T更贴合临床真实治疗场景，双靶点CAR-T可实现更强肿瘤清除、更多CAR-T扩增、显著抑制肿瘤细胞增殖（图6F）。研究者同步构建DLBCL-PDLS、MCL-PDLS模型重复验证，CD19 CAR-T处理同样上调肿瘤CD70，双靶点CAR-T对两类B细胞NHL的杀伤效果均优于单靶点CD19 CAR-T。三维模型数据证明， CD19单靶点治疗会诱导CD70代偿升高，双靶点同步覆盖两种抗原可规避该逃逸机制，对多类CD70阳性B细胞淋巴瘤均具备体外优势。 （六）CD19与CD70双靶点CAR-T体内抗肿瘤疗效显著优于单靶点 研究者建立两套NSG小鼠FL异种移植模型：第一套为CD19⁺CD70⁺ WSU-FSCCL细胞单移植；第二套为CD19野生型、CD19敲除肿瘤细胞1:1混合移植，模拟临床CD19抗原逃逸复发场景。单一肿瘤移植模型中，治疗第21天全部双靶点CAR-T小鼠达到完全缓解；CD19单靶点组3/5小鼠残留病灶，trCD27单靶点组4/5小鼠存在肿瘤负荷（图7A）。外周血流式检测显示双靶点CAR-T体内持续性更高（图7B）。脏器残留病灶分析证实，所有CAR-T组均可完全清除脾脏肿瘤，仅CD19-CD70双靶点CAR-T能彻底根除骨髓内肿瘤细胞（图7C）。 CD19缺失混合移植模型中，双靶点CAR-T依旧显著抑制整体肿瘤生长，外周T细胞数量远高于CD19单靶点组（图7D、图7E）。治疗终点脏器检测显示，CD19 CAR-T组骨髓、脾脏大量残留CD19阳性与CD19阴性肿瘤细胞；双靶点CAR-T仅少数小鼠脑部存在微量病灶，造血器官肿瘤完全清除（图7F、图7G）。体内实验完整证实，双靶点CAR-T可同时清除CD19阳性、CD19缺失逃逸肿瘤克隆，解决单靶点CAR-T抗原丢失耐药缺陷，骨髓、脾脏深部病灶清除能力更强。 讨论 研究者结合全部队列、体外、体内数据，分层解读CD70预后价值、CD70促瘤机制、双靶点CAR-T转化潜力与现存局限。 第一，队列转录组与mIF数据统一证实，诊断样本CD70高表达是FL独立复发标志物。 CD70升高由肿瘤基因突变谱、LME细胞交互共同驱动，CD70⁺肿瘤可释放多重趋化因子招募Treg，构建免疫抑制微环境，同时通过CD70-CD27轴消耗T细胞共刺激受体，双重削弱机体抗肿瘤免疫。CD70在TFH、Treg、CD8⁺T细胞的异常高表达，进一步放大免疫失衡，持续推动肿瘤增殖与远期复发。 第二，CD19单靶点CAR-T耐药存在多重机制，CD70代偿上调是重要新增逃逸通路。 FL、DLBCL、MCL三维模型均观察到CD19 CAR-T刺激肿瘤CD70表达上升，仅靶向CD19无法阻断该代偿途径，为CD70联合靶向提供理论支撑。既往单靶点抗CD70 CAR-T存在肿瘤覆盖范围窄、单抗原逃逸风险，双靶点CD19-CD70 CAR-T同步覆盖两种肿瘤高表达抗原，大幅降低抗原丢失导致的复发概率。 第三，trCD27配体型CAR相较scFv型具备独特优势 。配体CAR可维持天然CD70-CD27交互模式，降低CAR持续强直信号诱发的T细胞耗竭；4:1慢病毒共转导配比可平衡两种CAR表达，兼顾扩增效率与杀伤活性。尽管trCD27修饰CAR存在轻度体外自相残杀，但该现象对整体扩增、体内药效无实质性负面影响，达沙替尼、CD70敲除改良方案无临床前获益，标准化制备工艺可直接推进临床转化。 第四，本研究存在模型局限性。NSG小鼠无完整功能性免疫系统，无法模拟人体完整LME，无法评估双靶点CAR-T对原位肿瘤-免疫细胞交互网络的重塑效果；暂无同基因FL小鼠模型可开展免疫完整环境下药效验证，该方向仍需后续补充实验。 第五，临床转化前景。全套体外PDLS、体内异种移植数据为CD19-CD70双靶点CAR-T临床开发提供完整临床前证据链。该疗法不仅适配CD70高表达高危FL人群，还可拓展至DLBCL、MCL等CD70阳性复发难治B细胞NHL，弥补现有CD19 CAR-T应答持久性不足的缺陷，具备开展人体临床试验的充足依据。 声明： 尽管本公众号译者对本文进行了二轮审校，以尽力确保内容的准确和完整，但仍然可能存在翻译或理解的不当，请读者以原文为准。如有翻译不当处，您可在公众号对话框中发送反馈，译者会尽快校对并予以回复。尽管竭力避免，但论文翻译可能引入生成式AI的幻觉问题，指导临床实践的内容须以原文为准。 预打样（Proof）稿件内容说明： 部分论文在推送发布时，期刊尚在校稿，所提供的原文为非正式版本。可能存在排版、表述等问题，需以正式版为准。如果在您阅读本文时正式版已发表（至少在本推送发布后3个月以后），您可以在评论区留言，编者将更换PDF源。 文献 ：Ferran Araujo-Ayala, Maria Ros, Raluca Alexandru, Judith Mateos-Jaimez, Alba Rodríguez-Garcia, Marta Giménez-Alejandre, María Villalba-Esparza, Pablo Mozas, Guillem Colell, Salut Colell, Mireia Bachiller, Ferran Nadeu, Andrea Rivero, Ariadna Giro, Daniel J. Hodson, Soumya Poddar, Armando López-Guillermo, Dolors Colomer, Alba Maiques-Diaz, José-Ignacio Martín-Subero, Silvia Beà, Laura Magnano, Mitchell Reed Smith, Álvaro Urbano-Ispizua, Julio Delgado, Manel Juan, Elías Campo, Carlos E. De Andrea, Sonia Guedan, Patricia Pérez-Galán; CD70 Overexpression at Diagnosis Predicts Relapse and supports dual CD19-CD70 CAR-T Therapy in Follicular Lymphoma. Blood 2026; blood.2025032663. doi: https://doi.org/10.1182/blood.2025032663 文献原文： CD70 Overexpression at Diagnosis Predicts Relapse and supports dual CD19-CD70 CAR-T Therapy in Follicular Lymphoma.pdf