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12月21-22日，上海大咖带队，新秀集结！以创新利刃，破内卷之局前言CAR-T细胞疗法在血液瘤治疗中已被认为是最先进、最有效的策略之一，然而在实体瘤治疗中疗效并不显著。其中一个原因主要是由于抑制性细胞因子、低氧环境和活性氧的存在。使肿瘤周围形成不利于T细胞的渗透和发挥作用的肿瘤微环境。结合细胞因子的功能优势，靶向肿瘤细胞的第四代CAR结构已经被开发出来并额外释放有助于T细胞发挥作用的细胞因子。在CAR-T细胞发挥作用过程中，细胞因子在免疫细胞的激活、扩增和亚群的极化中起着关键作用。因此本篇文章主要对细胞因子对CAR-T细胞功能的影响、在CAR-T生产过程中的应用及临床效果进行讨论。强调了细胞因子在细胞治疗中的重要性。作者 | Discovery细胞因子对CAR-T细胞功能的影响肿瘤是一种复杂的组织，除含有肿瘤细胞外，还含有内皮细胞、周细胞、炎症细胞、成纤维细胞以及非细胞成分，如细胞因子、脂类介质和细胞外基质。在肿瘤微环境（TME）中，不同的组分能够通过不同的机制诱导血管生成，促进肿瘤细胞的存活和增殖，并抑制T细胞的抗肿瘤反应。肿瘤浸润性炎症细胞被肿瘤细胞分泌到肿瘤微环境的细胞因子所吸引，首先，它们通过产生活性氧、分泌促炎细胞因子和介导细胞毒作用，构成了对抗肿瘤的初始防线。然而，当这种促炎环境与TME的慢性炎症发展相平衡时，会导致局部组织微环境转变为促进肿瘤生长的状态。TME细胞利用细胞因子的功能，对免疫细胞的增殖、分化、激活、迁移和存活产生负面影响，构成了一个不利的微环境。因此，细胞因子在调节抗肿瘤反应、细胞转化和恶性肿瘤的增殖中扮演着重要的角色。图1：肿瘤微环境中细胞因子的动态变化及其在维持免疫抑制表型中的作用1.1IL-2 and TGF-βTGF-β主要由肿瘤微环境中两种免疫抑制细胞即髓系来源的抑制细胞(MDSCs)和调节性T细胞(Tregs)分泌，诱导促肿瘤反应。Tregs(CD25+Foxp3+)一方面通过分泌TGF-β影响T细胞活性。另一方面通过募集IL-2限制肿瘤微环境中效应性T细胞的扩增。在体内，TGF-β通过抑制穿孔素、颗粒酶和干扰素-γ的表达等多种机制，使CD8+和CD4+T细胞增殖和细胞毒T细胞活性的下调。因此抑制TGF-β在免疫微环境中的抑制作用，对CAR-T细胞发挥高效作用具有重要意义。目前溶瘤腺病毒表达TGF-β受体II-Fc融合蛋白与CAR-T联合治疗乳腺癌模型中已展现加强抗肿瘤效果。图2：溶瘤腺病毒表达TGF-β受体II-Fc融合蛋白与CAR-T联合治疗在乳腺癌模型中效果1.2 IL-6IL-6被认为是肿瘤发生发展过程中的重要细胞因子。研究表明，不同类型癌症(如黑色素瘤、结直肠癌等)患者血清中的IL-6浓度过高与患者的预后不良有关。一项研究表明，shRNA-IL-6基因敲除的ssCART-19细胞在注入小鼠体内后，导致IFN -γ、TNF、IL-2和IL-17A细胞因子水平升高，而IL-10和IL-6水平下降，对抑制荷瘤小鼠有明显的增强效果。但在4周后会在大部分组织器官中出现，因此，说明shRNA-IL-6基因敲除的ssCART-19延长了荷瘤小鼠的存活时间，但具有潜在的免疫毒性。因此，更好地了解和利用细胞因子在肿瘤的生物发生中的作用，对提高CAR-T细胞的治疗效果，变得越来越重要。图3：shRNA-IL-6基因敲除的ssCART-19细胞注入小鼠体内细胞因子变化1.3 IFN-γ干扰素-ℽ是一种有效的促炎剂，除了刺激促炎巨噬细胞和诱导Treg细胞凋亡外，它还对肿瘤细胞具有细胞抑制、抗增殖和促凋亡作用，在细胞免疫和抗肿瘤反应中发挥重要作用。干扰素-ℽ的主要来源是天然免疫细胞、NK细胞和NKT细胞以及获得性免疫细胞、CD4+和CD8+T细胞。IFN-γ除具有抗肿瘤作用，也可以帮助肿瘤逃脱免疫监视，据报道肝癌、乳腺癌和黑色素瘤模型表明，长期低剂量干扰素ℽ可导致肿瘤生长，并诱导与T细胞活性障碍有关的分子PD-L1、PD-L2、CTLA-4和Foxp3的表达。结合IFN-γ的作用，文献报道了IL-6/IFN-γ双敲除CAR-T细胞在体外可减少PBMC释放多种细胞因子，为临床应用提供了一种有希望的策略。图4：IFN-γ逃脱免疫监视作用，促进PD-L1等表达细胞因子调动T细胞实现双重杀伤最近，带有启动T细胞杀伤的细胞因子的新一代CAR-T细胞被开发出来。这些CAR-T细胞被修饰细胞因子生产盒（可诱导的）。将CAR-T细胞的细胞毒性与细胞因子的原位传递联系起来，增强CD8+T细胞的细胞毒作用，绕过肿瘤微环境，更好的调节免疫系统。最初Chmielewski等人设计了癌胚抗原(CEA)特异性的CAR，并修饰表达IL-12分别在体外和体内模型中验证，结果表明CAR-T细胞分泌IL-12后产生更大的炎症反应，提高T细胞的激活，并招募额外的免疫细胞，如抗肿瘤巨噬细胞到肿瘤微环境，显著提高抗肿瘤反应。图5：CAR-T细胞分泌IL-12后显著提高抗肿瘤反应同时，在具有高度免疫抑制肿瘤环境的卵巢癌中，Koneru等发现，CAR-T细胞经修饰表达IL-12后在体外能更好的抑制卵巢癌细胞的增殖并且干扰素-γ的分泌增加。在体内注射后，小鼠存活率明显提升，干扰素-γ分泌增加，显示出更强的抗肿瘤效果。图6：IL-12修饰的CAR-T细胞在体内分泌IFN-γ等细胞因子增加并对肿瘤清除有促进作用此外CAR-T细胞修饰表达IL-7、IL-15、IL-18、IL-22和IL-23等细胞因子也在研究当中，以及多种细胞因子共表达目前也备受关注。巴特拉等在肝癌模型中分别以及联合检测CAR-T细胞修饰表达细胞因子IL-15和IL-21的效果。结果表明，共表达IL-15和IL-21的CAR-T细胞可以有效的对抗肿瘤细胞。联合表达也表现出使CAR-T细胞维持长的存活时间，并且可以维持T细胞因子-1 (TCF-1)的表达，促进T细胞发育和存活。总体而言，CAR-T细胞中融合表达细胞因子会调节肿瘤微环境，招募免疫系统中的其他免疫细胞，促进CAR-T细胞具有更好的持久性和有效性。细胞因子在CAR-T细胞制造过程中的作用CAR-T细胞制造平台包括四个步骤，细胞因子在最终产品的质量和功能中起着核心作用。1. T细胞的分离和富集。CD3+T细胞通常从外周血单个核细胞(PBMC)中获得或者从白细胞分离中获得，并通过淋巴细胞分离液离心法进一步分离。2.具体亚型T细胞富集。使用诸如CD3+、CD4+、CD8+、CD25+的磁珠来实现对特定T细胞亚群的富集，也可通过选择或去除PBMC内的特定T细胞类型，使特定T细胞扩增，并以固定的CD4：CD8比率得到最终的细胞产物。3. 基因转移系统。通常是通过病毒载体将相应的遗传信息转移到T细胞，介导T细胞表面CAR的表达。基于病毒的基因传递系统是常用的基因传递系统，它们可以达到很高的转导效率。4.扩增CAR-T细胞。通过体内培养方法扩增，最后的细胞产品经过工艺末期配方并进行超低温保存。图7：CAR-T细胞生产过程细胞因子对生产CAR-T细胞的T细胞的激活、扩增和质量控制起着重要作用。富集的T细胞在特定的培养基中培养，通常添加IL-2、IL-7、IL-15和IL-21等重要的细胞因子，最常用的两种CAR-T细胞产生策略是基于IL-2或IL-7细胞因子。正如上文所提到的，IL-2通过上调穿孔素、颗粒酶B和干扰素-γ促进终末效应T细胞的增殖和分化，并抑制记忆细胞marker BCL6和IL7RA的表达。因此，IL-2对T细胞培养尤为重要。然而，IL-2也会促进调节性T细胞（Tregs）的扩张，从而抑制CAR-T细胞的抗肿瘤活性。因此IL-2加入的剂要加以摸索。图8：CAR-T细胞生产过程中细胞因子的相互作用此外，IL-7、IL-15和IL-21的加入可以减少CAR-T细胞的终末分化，增加记忆干细胞的数量，提高体内持久性。据报道，单独补充IL-15可以减少耗竭标志物的表达，增加抗凋亡特性，在刺激CAR-T细胞体外扩增、持续存活和肿瘤杀伤方面表现出类似的效果。IL-7/IL-15加入增强CAR-T细胞的激活并产生较少的耗竭marker。CAR-T细胞中加入IL-2或者IL-15会产生更多的促炎因子，在体外表现出较强的肿瘤溶解能力。总之，CAR-T细胞在离体的生产过程中，必须加入特定的细胞因子，目前的研究主要集中于IL-2、IL-7、IL-15和IL-2，但最佳的细胞因子组成以及在CAR-T细胞生成过程中是否加入其他细胞因子要根据患者、肿瘤和临床情况而定。细胞因子释放综合征（CRS）CAR-T细胞的使用被认为是一种有效治疗肿瘤的方法，但CAR-T细胞注入后的副作用在临床中也逐渐表现出来。CRS是目前尚未明确阐明的最突出的副作用,根据临床试验，接受CAR-T治疗的患者中高达90%会出现CRS，一半的患者进展到3-4级，甚至导致死亡。出现CRS后，血清细胞因子水平、炎症标志物普遍升高，同时免疫系统被激活。通常CRS发生在输液后第1天至第14天之间，临床表现可能包括发热、肌肉酸痛、乏力，并可能进展为缺氧、毛细血管渗漏、重要器官功能障碍等，但大多数患者能够自我抵抗这一反应。然而，少数患者需要使用抗IL-6等进行特异性治疗。图9：CAR-T细胞治疗的患者中常见的细胞因子分泌机制和动态变化小结CAR-T细胞疗法已被认为是一种突破性的治疗方法在血液瘤患者中，然而，在实体瘤中的应用仍然有限。然而细胞因子已经被证明与涉及CAR-T细胞治疗的复杂过程有着重要的联系，因此在CAR-T细胞的基础上，融合表达细胞因子或在CAR-T细胞生产工艺过程中加入细胞因子有望突破CAR-T在实体瘤治疗中的局限和增强在血液瘤治疗中的效果。参考文献：[1] He YF, Wang XH, Zhang GM, Chen HT, Zhang H, Feng ZH. 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