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中国药科大学王广基/吕丘仑团队联合英国诺丁汉大学朱哲英团队在Advanced Science（IF：14.1，Q1）上发表了一篇关于深度学习驱动的吡咯喹啉醌在阿尔茨海默病中的神经保护活性探索的文章，“Deep Learning-Driven Exploration of Pyrroloquinoline Quinone Neuroprotective Activity in Alzheimer's Disease”。 研究背景： 阿尔茨海默病（AD）是痴呆症的主要形式，是一种与衰老密切相关的复杂神经退行性疾病。AD的神经病理学特征表现为淀粉样蛋白β (Aβ) 的细胞外沉积和过度磷酸化的Tau蛋白的细胞内聚集。目前，针对Aβ的药物主要有两个局限性：一是疗效有限，不能充分缓解AD患者的临床症状；二是具有显著的毒性和副作用，使其不适合长期使用。因此，迫切需要找到一种强效且低毒的药物，供AD患者日常服用。 尽管目前的治疗重点是靶向Aβ，但包括donepezil和lecanemab在内的现有药物在临床试验中并未显示出一致的缓解AD症状的效果。此外，其中一些药物，特别是lecanemab——一种抗Aβ单克隆抗体治疗药物——由于其明显的毒性和通过血脑屏障（BBB）的渗透性有限而引起了担忧。鉴于AD患者的长期治疗需求，寻找一种口服给药、高效、低毒且靶向替代分子通路的抗AD药物，已促使人们去发现新型、强效且耐受性良好的抗AD化合物。 最近的研究表明，神经炎症和氧化应激在AD的进展中起着关键作用。中枢神经系统中的神经炎症主要由小胶质细胞和星形胶质细胞的反应驱动，增加了促炎细胞因子的水平，导致认知能力下降。脑脊液细胞因子水平升高与AD进展之间存在相关性。这种炎症还会增加活性氧（ROS）的产生，导致氧化应激增强，这在AD患者的大脑中很明显，并影响Aβ的积累和Tau蛋白的过度磷酸化。因此，解决神经炎症和氧化应激对于抗AD疗法的开发至关重要。 许多现代抗AD药物，包括memantine和donepezil，都表现出显著的毒性。流行病学研究强调了化合物，特别是那些源自植物和饮食的化合物，对AD的保护能力。通过清除ROS、调节细胞因子和增强神经抗氧化防御，这些药物为AD提供了具有最小毒性的、有前景的治疗和预防策略。 近年来，深度学习计算模型在制药领域的整合已成为一项重大进步，导致了化合物性质和活性的预测、靶点相互作用的预测、药物筛选、以及新药的创新设计。这些模型提供了巨大的希望，特别是在处理复杂的生物医学数据方面。作为这些模型基础的神经网络，不仅加速了高维化学和生物数据的处理，还揭示了以前隐藏的模式。这促进了药物开发及相关领域的突破性发现。通过在庞大的数据库上训练这些模型，我们可以预测和创建目标分子。这对于识别表现出特定治疗相关特性的化合物具有重要作用。 MIND饮食结合了地中海饮食和DASH饮食的最佳元素，旨在降低痴呆风险。它优先考虑植物、坚果、浆果、鱼和橄榄油，这些都以其潜在的认知益处而闻名。研究日益表明，特定的饮食和营养素可能会延缓阿尔茨海默病相关的认知衰退。然而，大脑受影响的复杂机制仍不清楚。以认知健康为中心的MIND饮食为理解AD发病机制背后的复杂机制开辟了宝贵的途径，并为旨在减轻AD影响的饮食方案奠定了基础。 吡咯喹啉醌（PQQ）被认为是哺乳动物中的一种氧化还原酶辅酶，具有广泛的治疗潜力，从抗炎到神经保护作用。最近的研究强调了PQQ的神经保护特性，包括其穿过BBB的能力、在中风模型中提供保护、以及减少SH-SY5Y细胞中Aβ诱导的毒性。PQQ已显示出对各种神经损伤的保护作用，例如谷氨酸诱导的损伤和6-羟多巴胺诱导的神经毒性。然而，PQQ在治疗AD中的确切作用和分子机制仍然难以捉摸。 在本研究中，我们战略性地利用了深度学习流程的优势结合药理学原理，从食物中鉴定出PQQ，这是一种适合口服的强效低毒化合物。使用全面的分子结构数据集，我们的深度学习模型经过训练可预测BBB通透性以及抗炎和抗氧化特性。我们的研究可能强调了深度学习在利用现有数据识别有前景的治疗化合物方面的潜力，从而为创新的药物发现途径奠定基础方法。展望未来，PQQ可以被视为AD患者的维生素类补充剂，或作为高危人群的预防药物。此外，我们的发现可能会弥合日常饮食习惯与AD治疗意义之间的鸿沟。 研究结果： 基于深度学习的AD药物筛选 为了发现用于AD的新型抗炎和抗氧化药物，我们开发了一系列深度学习模型。每个模型旨在预测特定属性，例如化合物穿过BBB的能力、其抗炎潜力和抗氧化能力。我们利用了一个广泛的数据集，其特征是简化分子线性输入规范（SMILES）表示，用二进制标签标记每个分子，涵盖10个独特的属性，如BBB通透性，以及抗炎和抗氧化特性（图S1a，支持信息）。这些由0或1表示的二进制标签分别表示缺乏或存在特定特征。为了排名目的，我们通过对分子的属性值求和来确定每个分子的累积得分。得分 ≥ 5的化合物被认为具有大量所需的属性，将其定位为进一步评估的主要竞争者。 我们的计算目标是查明用于AD治疗的潜在化合物。我们的双路径建模方法将来自RDKit (https://www.rdkit.org/) 的分子描述符整合到我们的多层感知器 (MLP) 模型集中，该模型专门用于预测BBB和抗炎特性（图1a）。相反，使用DeepChem的MolGraphConvFeaturizer创建的分子图作为图卷积网络 (GCN) 模型的输入，该模型针对抗氧化特性预测进行了优化。受试者工作特征 (ROC) 曲线强调了我们建模选择的有效性。具体而言，MLP模型预测BBB通透性和六种抗炎属性，而GCN模型可以识别三种抗氧化属性（图1b）。此外，深入的性能指标验证了我们模型的能力，混淆矩阵提供了对其分类功效的见解（图1c；图S1b-h，支持信息）。 地中海饮食模式降低AD风险 最近的研究表明，坚持MIND饮食可能与老年人认知功能的增强有关。为了进一步验证MIND的神经保护作用，我们利用全球多个种族报告的数据进行了荟萃分析（图S2a，支持信息）。结果表明，MIND饮食可以预防AD（风险比0.85，95% CI 0.81-0.90，I2 35.1%），表明MIND饮食模式具有提供AD保护的潜力（图1d）。 Figure 1 从饮食模式中鉴定PQQ作为抗AD药物 为了了解MIND饮食如何降低AD风险，我们的主要目标是确定这种饮食模式中有助于降低AD风险的基本成分。根据MIND饮食建议，我们总共累积了208种化合物（表S3，支持信息）。使用我们基于深度学习的筛选框架对这些化合物进行了评估（图2a）。最初，我们评估了BBB通透性，发现208种化合物中有113种不能穿过BBB，剩下95种具有实质性BBB通透性的化合物。在这些化合物中，19种化合物显示出强大的抗炎和抗氧化活性（得分 ≥ 5）（表S4，支持信息）。随后的PubChem搜索改进了我们的选择至12种低毒化合物进行详细分析（图2b）。为了验证我们方法的稳健性，我们使用了t-SNE可视化。可视化描绘了我们的训练数据集与208种MIND饮食衍生筛选候选物之间显著的重叠，强调我们的筛选保持在模型的置信域内（图2c；图S3a-i，支持信息）。值得注意的是，我们的模型识别出柚皮素（naringenin）和橙皮素（hesperetin）具有强大的抗炎和抗氧化能力。相比之下，特定化合物，即CID:102 470 786、CID:102 157 736 和 CID:101 746 085，缺乏此类特性。这与现有文献的一致性突显了我们建模框架的准确性和可靠性。 为了进一步确定MIND饮食中抑制AD发病和进展的关键化合物，我们根据MIND饮食指南对饮食成分进行了分类，并展示了每组的代表性食物项目。使用食物数据库FooDB (https://foodb.ca/)，我们对每个代表性项目进行了详尽的成分分析，从展示的六个项目中鉴定出20种独特的成分（图S2b，支持信息）。在将这20种独特成分与通过深度学习确定的12种无毒化合物进行交叉引用后，PQQ脱颖而出（图2e,f）。这表明PQQ可能是MIND饮食方案中减轻AD风险的关键元素。 Figure 2 AD患者血浆PQQ水平降低 为了进一步建立PQQ水平与AD严重程度之间的相关性，我们测量了血浆样本中的PQQ水平。在招募AD患者后，我们收集了他们的血浆（图3a）。鉴于检测血浆中痕量PQQ的固有挑战，我们采用了使用液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 的标准测量技术（图3b）。值得注意的是，使用基于LC-MS/MS的相对定量——由相应离子对的峰面积表示——我们发现AD患者血浆中的PQQ浓度显著低于健康个体（图3c）。随后的分析表明，PQQ的浓度与AD患者的认知表现指标呈负相关。这表明PQQ水平有随着AD严重程度增加而降低的趋势。这一结果定量地支持了在AD患者中观察到的PQQ水平下降。 Figure 3 PQQ在体内缓解认知功能障碍 为了评估PQQ在改善与AD相关的认知功能障碍方面的治疗效果，我们对Aβ1-42诱导的AD小鼠模型连续14天口服PQQ（图4a）。使用Y迷宫分析评估短期记忆。该测试显示PQQ恢复了Aβ1-42诱导的AD小鼠的自发交替行为，表明在AD小鼠中观察到的短期记忆缺陷得到了显著改善（图4b）。使用莫里斯水迷宫分析进一步检查了空间学习和记忆。三组小鼠之间的游泳速度未观察到显著差异，证实了莫里斯水迷宫结果的可靠性，不受身体活动变化的影响（图4c）。在探索实验（probe trial）期间，与假手术（sham）组相比，AD小鼠通常表现出更长的持续时间和距离来定位目标平台。然而，给予PQQ显著减少了AD小鼠中这些延长的持续时间和距离（图4d,f）。此外，PQQ治疗的小鼠表现出对目标象限的偏好，并且显示出比载体治疗的AD小鼠更直接的通往目标平台的路径（图4e,g）。这些发现表明PQQ有效改善了AD小鼠的空间学习和记忆缺陷。总之，这些行为测试强调了PQQ在缓解小鼠AD相关认知功能障碍方面的潜力。 Figure 4 PQQ对AD小鼠模型突触功能的调节 为了阐明PQQ对认知功能障碍保护作用的潜在机制，我们对有无PQQ给药的AD小鼠脑组织进行了无偏RNA测序 (RNA-seq)（图S4a，支持信息）。PQQ给药后AD小鼠中差异表达基因 (DEGs) 的基因本体论 (GO) 分析证实了PQQ的神经保护作用，这通过与突触组织、轴突发生和抗神经元死亡相关的基因表达增加得到证明（图5a）。突触损伤和磨损是AD的关键特征，与认知功能的恶化密切相关。旨在恢复突触健康和稳定性的治疗策略在影响和调节神经回路活动方面具有重要前景。因此，在AD小鼠中给予PQQ后，突触后致密蛋白95（PSD95，由Dlg4编码）和突触素（SYP）的mRNA和蛋白质水平均升高（图5b,c）。此外，我们在海马体和皮层中都观察到PSD95阳性信号的上调，表明PQQ可能对抗Aβ1-42诱导的突触破坏（图5d；图S4b，支持信息）。长时程增强在调节突触强度方面起着至关重要的作用，并且对于记忆形成和其他认知功能至关重要。在高频刺激后，在Aβ1-42处理的小鼠中观察到平均fEPSP斜率百分比显著降低。这种损伤通过PQQ给药得到了解决，进一步强调了PQQ增强突触功能的能力（图5e）。我们的结果表明PQQ在AD中提供神经保护作用，特别是在减轻突触功能障碍方面。 Figure 5 PQQ在AD小鼠模型中的抗炎和抗氧化作用 PQQ对与抗神经炎症和抗氧化应激反应相关的基因表达产生特定影响，表明其对炎症和氧化应激的潜在影响（图5a）。鉴于AD中主要的小胶质细胞内发生显着的炎症反应，我们使用免疫荧光染色研究了小胶质细胞的状态。值得注意的是，PQQ治疗显著抑制了海马体和皮层中的小胶质细胞活化（图5f；图S4c，支持信息）。此外，实时聚合酶链反应 (PCR) 测定表明，在AD小鼠中给予PQQ后，促炎细胞因子Il1β和Tnfα以及白细胞介素一受体1型 (Il1r1)（几种细胞因子驱动的炎症通路中的关键介质）的水平均降低。 为了研究PQQ的抗氧化功能，采用二氢乙锭 (DHE) 染色检测ROS的产生。给予PQQ后观察到ROS产生显著减少（图5h；图S4d，支持信息）。此外，PQQ增强了AD小鼠中抗氧化基因的表达，包括 NAD(P)H: 醌氧化还原酶 1 (Nqo1) 和谷胱甘肽 S-转移酶 (Gst)，后者是一种关键的氧化应激缓解剂。此外，PQQ给药增加了NRF2的表达，NRF2是关键抗氧化应激反应的中心调节因子（图5i,j）。总之，这些结果表明PQQ的抗氧化作用是通过Nrf2信号轴介导的。 Figure 6 PQQ诱导SIRT1通路的激活 基于我们的初步发现，我们深入研究了AD中PQQ调节的分子通路。SIRT1作为AD模型中具有抗氧化特性的关键基因出现（图6a,b）。为了增强我们模型的稳健性并减轻任何潜在的模型特异性偏差，我们扩展了分析，纳入了来自AD患者前额叶皮层组织的RNA测序数据，可在数据集GSE33000中访问（图6c）。 重要的是，Sirt1 mRNA表达的降低与AD的进展和严重程度相关，表明Sirt1在AD的发生和发展中具有潜在作用（图6d）。随后，我们评估了小鼠皮层中SIRT1的蛋白质水平，并观察到给予PQQ后SIRT1上调，表明PQQ促进了SIRT1信号通路的激活（图6e）。此外，发现PQQ与SIRT1结合，为其激活SIRT1通路的能力提供了额外的证据（图S5a，支持信息）。 为了验证PQQ通过SIRT1信号通路的神经保护作用，我们检查了SIRT1的下游靶点，即信号转导和转录激活因子3 (STAT3)，它是神经炎症中脑部炎症的关键调节因子。乙酰化的STAT3增强STAT3磷酸化，导致炎症介质的释放和炎症级联反应的放大。我们观察到PQQ消除了AD诱导的STAT3乙酰化增加（图6f）。这些发现表明PQQ在AD小鼠中强有力地激活了SIRT1通路。 抑制SIRT1会抵消PQQ的神经保护作用 为了验证SIRT1在PQQ诱导的神经保护中的作用，我们使用DHE染色对Aβ1-42损伤的SH-SY5Y细胞进行了体外实验。虽然PQQ有效地对抗了SH-SY5Y细胞中Aβ诱导的ROS产生，但SIRT1抑制剂EX527降低了PQQ抑制ROS的能力（图S5b，支持信息）。在体内，对PQQ治疗的AD小鼠施用了EX527（图7a）。使用莫里斯水迷宫的行为分析表明，同时接受PQQ和EX527治疗的小鼠表现出受损的导航能力。这从定位目标平台所需时间的增加、在目标象限花费的时间减少以及与仅用PQQ治疗的组相比到达平台的移动距离更长中可以明显看出（图7b-d）。 与仅PQQ组相反，EX527的给药抵消了PQQ诱导的Nrf2、Nqo1和Gst的上调（图7e）。此外，脑切片的DHE染色显示，EX527降低了Aβ1-42诱导的AD小鼠模型中PQQ赋予的抗氧化益处（图S5c,d，支持信息）。EX527治疗还抑制了PQQ诱导的SIRT1通路激活（图S5e，支持信息）。此外，EX527给药阻断了PQQ对突触调节和神经炎症的有益功能（图S5f-h和S6a,b，支持信息）。总之，这些发现突显了SIRT1通路在促进PQQ在AD中的神经保护作用方面的关键作用。 STAT3去乙酰化损害PQQ在AD中的神经保护作用 考虑到STAT3的转录活性发生在其乙酰化之后，我们使用腺病毒递送系统向PQQ治疗的AD小鼠施用了在K679、K685、K707和K709位点失去去乙酰化能力的STAT3显性负性 (STAT3DN) 变体 (K679QK685QK707QK709Q)（图7f）。虽然PQQ减少了AD小鼠的逃避潜伏期和距离，但STAT3DN废除了PQQ的治疗效果（图7g-i）。此外，STAT3DN的表达减弱了对PQQ的抗氧化反应，表现为PQQ治疗的AD小鼠中Nrf2、Nqo1和Gst mRNA水平受到抑制以及ROS积累升高（图7j；图S7a,b，支持信息）。STAT3DN进一步干扰了PQQ驱动的突触改善和AD小鼠神经炎症标志物水平的降低（图S7c-e和S8a,b，支持信息）。这些结果表明，阻碍STAT3乙酰化会抑制 PQQ 提供的神经保护作用的恢复。 Figure 7 PQQ在AD中对CREB通路的调节 我们的数据显示PQQ对基因表达谱具有调节作用。通过进一步验证，我们证实特定基因在PQQ治疗后通过SIRT1介导的通路进行调节。虽然一些基因在PQQ给药后受到SIRT1信号通路的影响，但其他基因不受SIRT1的影响。认识到PQQ通过复杂的信号通路运作以防止AD进展并将SIRT1确定为该网络中的关键节点，我们旨在调查是否有其他因素有助于PQQ给药后的SIRT1介导的神经保护。为了实现这一目标，我们分析了以前的数据集以探索SIRT1与其在AD患者中的相互作用蛋白之间的关系。我们的分析揭示了SIRT1与CREB结合蛋白 (CREBBP) (r = 0.57, p < 0.001) 和环磷酸腺苷 (cAMP) 反应元件结合蛋白1 (CREB1) (r = 0.30, p < 0.001) 之间的关联（图8a,b）。CytoHubba的最大团中心性 (Maximal Clique Centrality) 算法进一步强调了CREB1是PQQ调节网络的中心组成部分（图8c）。 为了研究CREB通路与PQQ的神经保护作用之间的相互作用，我们进行了一系列分子测定。免疫荧光测定表明，PQQ治疗后海马体和皮层中的CREB激活增强（图8d；图S7a，支持信息）。蛋白质印迹证实了在PQQ存在下CREB磷酸化和激活的显著增加（图8e）。重要的是，我们发现SIRT1抑制剂EX527减弱了PQQ诱导的CREB激活（图8f,g；图S7b，支持信息）。 在AD中观察到CREB介导的转录活性改变，并可能导致与疾病相关的认知障碍。为了研究下游CREB1在PQQ给药后的影响，我们基于RNA-seq结果进行了实时PCR测定，证实了PQQ上调了大麻素受体1 (Cnr1) 和CX3C趋化因子受体 1 (Cx3cr1) 的表达（图9a,b）。使用转录因子预测软件 JASPER，我们分析了Cnr1启动子并确定了位于-1536和-776 bp处的两个CREB1结合位点（图9c）。荧光素酶测定表明，与缺乏-1536 bp序列的pGL-Cnr1-600相比，pGL-Cnr1-1400和pGL-Cnr1-1800的荧光素酶活性增加（图9d）。去除该位点 (-1536 bp) 降低了相对于pGL-Cnr1-1400和pGL-Cnr1-1800的荧光素酶活性，表明CREB1可以结合到Cnr1启动子-1536 bp处（图9d）。该位点在物种间表现出保守性，强调了其对Cnr1功能的重要性（图9e）。在HEK293细胞中，CREB1过表达增加了CREB1与Cnr1启动子之间的结合（图9f）。进行染色质免疫沉淀 (ChIP) 测定以评估PQQ是否增强CREB1对Cnr1启动子的结合亲和力（图9g）。 此外，JASPER预测了Cx3cr1启动子上的两个CREB1位点（图9h）。荧光素酶测定证实了CREB1接近位于-1200 bp处的Cx3cr1启动子，这是另一个跨物种高度保守的位点（图9i,j）。CREB1过表达增强了CREB1与Cx3cr1启动子的结合，而PQQ进一步增强了这一过程（图9k,l）。这些发现阐明了PQQ给药不仅增加了这些基因的表达，而且还通过CREB信号通路增强了它们的调节。 Figure 8 Figure 9 总结： 总之，本研究标志着深度学习与药理学研究的重大融合，强调了PQQ作为抗AD药物的治疗前景。通过跨学科领域的整合，加速了药物发现过程，提高了靶向疾病机制的精度并提高了资源效率。我们的发现提倡考虑以PQQ为中心的干预措施，其中可能包括饮食调整以纳入富含PQQ的食物，作为AD管理的积极方法。如图10所示，PQQ的神经保护功效表明，增加PQQ来源（如苹果、纳豆、面包、玉米、猕猴桃和橙子）的饮食可能会在延缓或缓解AD的临床表现方面带来切实的好处。因此，将这些营养元素纳入AD高风险个体的饮食中可能是延缓疾病进展的可行策略。未来的营养指南应建议摄入PQQ以增强认知健康。本研究的见解为进一步研究PQQ的药用价值提供了坚实的基础，并概述了将深度学习与药理学融合以推进药物研发的凝聚策略。 DOI：https://doi.org/10.1002/advs.202308970 如有侵权或错误请联系删除或修改

NLRP3炎症小体是炎症性疾病、代谢性疾病及神经退行性疾病中经过验证的治疗靶点。表观遗传调控因子，尤其是组蛋白去乙酰化酶（HDACs），已成为调控炎症小体启动与激活的关键调节因子。药物化学领域的最新进展为探究NLRP3信号传导机制及其潜在治疗调节提供了新的化学手段。最近发表在《Journal of Medicinal Chemistry》上的综述文章“Crosstalk between NLRP3 Signaling and Histone Deacetylases in Inflammasome-Driven Diseases”深入探讨了表观遗传调控如何影响炎症小体活性，并为炎症相关疾病的治疗提供了新思路。研究背景与意义 自身炎症性疾病通常归因于先天免疫系统的失调，而自身免疫性疾病则主要由适应性免疫反应驱动。然而，炎症/自身免疫状态实际呈现为一个连续谱系，不同疾病可能以自身炎症或自身免疫特征为主导。在这里重点关注先天免疫的关键组分——NLRP3炎症小体，及其在细胞焦亡与炎症小体驱动疾病中的作用机制。细胞焦亡是一种炎症形式的程序性细胞死亡，由炎症小体和炎症性半胱天冬酶的激活所驱动，并受到表观遗传过程的调控。在癌症中，细胞焦亡可通过诱导细胞溶解和炎症来增强免疫反应，从而促进肿瘤免疫治疗。焦亡相关基因的转录水平可以反映肿瘤发生过程中的焦亡状态，并有助于预测患者的预后。除了癌症，细胞焦亡在心血管疾病、自身免疫性疾病和神经系统疾病中也起着关键作用。神经炎症是一个多因素、复杂的过程，依赖于多种类型的胶质细胞和外周免疫细胞，并受到表观遗传改变的影响。在脑损伤发生时，胶质细胞被激活，释放炎症介质并产生活性氧（ROS）。一旦启动，神经炎症过程可能过度激活，导致细胞损伤和神经元功能丧失。表观遗传变化在不改变DNA序列的情况下影响基因表达。DNA甲基化、组蛋白修饰以及微小RNA相关的转录后基因沉默构成了三个关键的表观遗传机制。炎症/自身免疫性疾病的病理生理学与遗传易感性以及暴露于环境所引发的表观遗传修饰密切相关。在本文中，作者深入探讨了组蛋白去乙酰化酶（HDACs）调节NLRP3炎症小体的机制。讨论HDAC抑制作为一种潜在的治疗方法，用于抗炎策略。为此，作者回顾了HDACs在炎症及其他相关疾病中的作用和机制。旨在为炎症相关疾病和药物发现的未来研究提供新思路。希望阐明表观遗传学与NLRP3信号通路之间的相互作用，并期望在药物开发领域开辟新的途径。NLRP3炎症小体的结构与功能 核苷酸结合寡聚化结构域富含亮氨酸重复序列和热蛋白结构域蛋白3（NLRP3），亦称冷热蛋白或NALP3，是NLR家族成员之一。该三联体蛋白由N端热蛋白结构域、中央NACHT结构域及C端富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域组成。 NLRP3炎症小体作为细胞内多蛋白复合物，结构组成如下： 传感器：NLRP3（含PYD、NACHT、LRR结构域） 适配器：ASC（含CARD结构域） 效应器：Caspase-1 经典炎症小体激活遵循连续双步骤机制：首先通过识别外源性或内源性危险信号（包括病原相关分子模式、危险相关分子模式及环境刺激物），启动Toll样受体（TLR）介导的NLRP3炎症小体组分及细胞因子前体（pro-IL-1β与pro-IL-18）的上调。启动步骤完成后，NLRP3炎症小体需次级刺激诱导其寡聚化组装。当NLRP3感受器被激活，中央NACHT结构域发生核苷酸交换，诱导蛋白从球状结构转变为同心十聚体组装。NLRP3募集衔接蛋白ASC形成朊病毒样纤维，随后ASC通过CARD-CARD相互作用结合酶原procaspase-1，最终形成超分子NLRP3炎症小体复合物。经典的炎症小体激活 第一步：启动（Priming） • 通过TLR/IL-1R信号激活NF-κB • 上调NLRP3和pro-IL-1β表达 第二步：激活（Activation） • K⁺外流、ROS等信号诱导 • NLRP3寡聚化与炎症小体组装 • Caspase-1激活 → 切割GSDMD → 焦亡 • 释放IL-1β、IL-18等炎症因子 对NLRP3进行翻译后修饰（PTMs）的诱导作用，可确保其在非活性状态与信号传导活性状态之间保持动态平衡。泛素化、磷酸化及类泛素化等PTMs修饰，发生于炎症小体激活的不同阶段——这些修饰既能在早期触发非转录性启动，也参与后期NLRP3的调控过程。E3泛素连接酶介导的泛素化修饰，可通过蛋白酶体降解或维持NLRP3失活状态来调控炎症小体激活。NLRP3炎症小体的过度激活与多种人类炎症性疾病的发病机制密切相关，这提示NLRP3炎症小体是治疗此类疾病的潜在靶点。因此，NLRP3在先天免疫中的核心作用已成为药物研发领域的热点方向。 目前已有从小分子化合物到复杂天然产物在内的多种物质作为NLRP3抑制剂被深入研究。如抑制肥大细胞IgE介导组胺释放的抗过敏药物曲尼司特（图1），被证实能干扰NLRP3炎症小体组装。通过囊性纤维化跨膜传导调节因子抑制剂筛选发现2-硫代噻唑烷-4-酮衍生物CY-09（图1），能与NLRP3的NACHT结构域结合，干扰其三磷酸腺苷（ATP）结合基序。MCC950（图1），亦称为CRID3或CP-456,773，是最受瞩目的NLRP3炎症小体抑制剂之一。其对骨髓源性巨噬细胞释放IL-1β的半抑制浓度（IC50）为7.5 nM，对人单核细胞源性巨噬细胞的IC50值为8.1 nM。该化合物通过可逆性结合NLRP3蛋白的NACHT结构域，稳定其非活性构象，阻止ATP水解反应，从而有效阻断NLRP3活化过程。尽管该化合物在II期临床试验中因出现肝脏毒性问题而终止研发，但至今仍是研究最深入、特异性最高的NLRP3炎症小体药理研究工具化合物。以MCC950分子结构为基础，结构修饰与优化开发了诸多新型NLRP3抑制剂。此外，蛋白降解靶向嵌合体技术的兴起为靶向调控疾病相关蛋白提供了新策略——通过泛素-蛋白酶体系统促进靶蛋白降解。最近已公开报道了首例靶向降解NLRP3的PROTAC分子（V2，图1）。 图1、NLRP3抑制剂代表性化合物结构及NLRP3降解剂V2结构HDAC家族分类与功能特点 组蛋白去乙酰化酶与组蛋白乙酰转移酶是通过翻译后修饰调控染色质可及性、实现表观遗传基因表达调控的关键酶系。组蛋白去乙酰化酶能去除组蛋白及非组蛋白赖氨酸残基的酰基修饰，导致染色质凝缩与转录抑制。人类18种组蛋白去乙酰化酶亚型可分为四类：I类（HDAC1、2、3、8）、IIa类（HDAC4、5、7、9）、IIb类（HDAC6、10）、III类（SIRT1-7）及IV类（HDAC11）。异常的组蛋白去乙酰化酶表达与多种疾病相关，包括肿瘤、神经退行性疾病、炎症及感染性疾病。在炎症调控领域，组蛋白去乙酰化酶参与关键信号通路与炎症基因表达的调节。最新证据表明，组蛋白去乙酰化酶在NLRP3炎症小体（免疫系统的核心组分及炎症反应调节器）的调控中发挥重要作用。 HDAC6在NLRP3调控中的核心作用 在启动阶段，HDAC6通过增强TLR信号、促进ROS产生和NF-κB激活来为NLRP3激活做准备。在激活阶段，它则通过调节氧化还原平衡和细胞骨架等直接影响炎症小体组装。特别值得注意的是，HDAC6是调控NLRP3最关键的HDAC亚型，它通过多种机制影响炎症小体，已成为NLRP3炎症小体的关键调节因子。该酶主要定位于细胞质，其结构特殊性在于拥有两个功能性去乙酰化催化结构域及C末端锌指泛素结合结构域。与I类酶不同，HDAC6主要靶向非组蛋白如α-微管蛋白、皮层肌动蛋白、热休克蛋白90、过氧化物还原酶I/II等。尽管HDAC6是NLRP3炎症小体背景下研究最深入的亚型，最新证据也提示其他组蛋白去乙酰化酶家族成员参与NLRP3炎症小体调节。然而，组蛋白去乙酰化酶在NLRP3炎症小体信号通路中的具体分子机制尚未完全阐明，仍存在学术争议。特别值得注意的是，不同研究间的结果差异可能源于实验设计的区别，包括巨噬细胞类型选择、小鼠模型或药理工具化合物的差异等因素。 最近的研究强调了 HDAC6 在调节 NLRP3 炎性体信号通路中的关键作用，尤其是在启动阶段。多项研究通过使用选择性 HDAC6 抑制剂、降解剂或基因敲减方法，已逐步揭示其相关机制。HDAC6在调节炎性体激活启动阶段（Priming）的作用 1. 与MyD88互作 → 增强TLR信号 → 激活NF-κB（图2A） 2. 激活Nox2 → 增加ROS产生 → 促进炎症（图2B） 3. 去乙酰化微管蛋白 → 影响IκBα降解 → 激活NF-κB（图2C） 4. 去乙酰化p65（NF-κB亚基）→ 促进其核转位 （图2D） 图2、HDAC6在NLRP3炎症小体的启动和NF-κB调节中的作用 新近研究表明，HDAC6不仅参与NLRP3炎症小体的启动阶段，也涉及其激活阶段。然而值得注意的是，这些抑制剂在人类巨噬细胞中未能显现相同效果，提示在人类巨噬细胞的NLRP3炎性体激活过程中，HDAC6对IL-1β释放并非必需，表明HDAC6在人类NLRP3炎症小体活化过程中的作用可能与小鼠存在本质差异。HDAC6在调节炎性体激活阶段（Activation）的作用 1. 氧化还原调节蛋白Prx I/II去乙酰化 → 降低抗氧化能力 → 增加ROS → 激活NLRP3（图3A） 2. 抑制F-actin表达 → F-actin负调控NLRP3 → 促进炎症小体组装（图3B） 3. 调控DDX3X → 影响应激颗粒形成 → 间接调控NLRP3（图3C） DDX3X被证实具有双重功能：一方面，在细胞应激条件下，DDX3X可通过与NLRP3的NACHT结构域相互作用促进炎症小体组装；另一方面，细胞应激也可诱导应激颗粒的形成，此时DDX3X会被隔离至其中参与促生存性应激颗粒的组装。这种竞争机制导致可用于激活炎症小体的DDX3X分子减少，从而抑制NLRP3炎症小体的活化。由于现有研究结论存在矛盾，且HDAC6在DDX3X调控中的具体作用尚不明确，未来需要采用更具选择性的抑制剂等工具开展深入研究，以更清晰地阐明HDAC6在DDX3X及NLRP3炎症小体调控网络中的作用机制。 图3、HDAC6在NLRP3炎症小体激活中的作用 HDAC6不仅依赖其酶活性，其泛素结合域也发挥着重要的支架功能。除了两个催化结构域外，HDAC6还拥有一个C端锌指泛素结合结构域（ZnF-UBD），使其能够独立于去乙酰化酶活性与泛素化底物相互作用。尽管部分研究认为HDAC6的去乙酰化酶活性至关重要，但其他研究则强调其泛素结合结构域及受调控的泛素化过程更为关键。锌指泛素结合结构域在NLRP3炎症小体中的作用 1. ZnF-UBD结构域直接结合 → NLRP3泛素化→ 抑制炎症小体激活（图4A） 2. 作为动力蛋白接头分子，介导NLRP3炎症小体组分向微管组织中心的逆向运输，并在该位置完成炎症小体的完全组装（图4B） 图4、锌指泛素结合结构域（简称：UBD）在NLRP3炎症小体中的作用HDAC6抑制剂与降解剂的研发进展 为了研究HDAC6的功能并开发潜在药物，科学家们开发了多种选择性抑制剂和降解剂。早期的抑制剂如Tubastatin A选择性不够理想，新一代抑制剂通过结构优化提高了选择性。PROTAC降解剂是新兴策略，它能彻底清除HDAC6蛋白。靶向HDAC6的抑制剂 • Tubastatin A：经典工具分子，但有一定HDAC10抑制活性 • Ricolinostat（ACY-1215）：进入临床试验，但选择性仍有争议 • CAY10603：高效力，但选择谱需进一步确认 • 新型抑制剂（如8k, 8m）：基于咪唑并吡啶骨架，选择性显著提高 图5、NLRP3 炎症小体调控相关研究中报道的 HDAC6 抑制剂及其选择性靶向HDAC6的PROTAC降解剂 传统的小分子HDAC6抑制剂仅靶向该酶的催化结构域，因而其作用仅限于抑制催化活性。相比之下，靶向降解HDAC6提供了一种更高效的策略，它可能同时消除其催化结构域和ZnF-UBD结构域的功能。PROTAC技术已成功应用于HDAC6的靶向降解，其双功能降解剂利用带有羟肟酸、乙基酰肼或二氟甲基-1,3,4-噁二唑弹头作为锌结合基团的各种配体组装而成。然而，它们在NLRP3炎性体信号通路中的功能影响尚未得到评估。 基于伏立诺他的选择性HDAC6的 PROTAC A6（图6）的开发，使得人们能够更深入地探究HDAC6缺失对NLRP3炎性体激活的影响。Bockstiegel等人通过使用该降解剂及其相应的阴性对照nc-A6证明，仅抑制HDAC6的第二个催化结构域，就足以减少Pam3CSK4介导的TNF释放和IL-1β释放。因此，在人THP-1巨噬细胞中，并不需要通过靶向降解HDAC6来抑制NLRP3炎性体激活。此外，NLRP3激活研究表明，HDAC6干扰TLR启动信号，因为当THP-1巨噬细胞已用Pam3CSK4启动后，再用tubastatin A处理并不会降低IL-1β水平。免疫调节药物（如沙利度胺）也可能负向调控TLR反应，从而降低NLRP3的激活。 另一个已报道的靶向HDAC6的PROTAC 14a（图6），衍生自基于靛红骨架的HDAC6抑制剂，也显示出能够减弱NLRP3炎症小体激活。在脂多糖启动的人THP-1细胞中，14a降低了切割型caspase-1的水平和IL-1β的分泌，表明其作用于炎性体激活阶段。然而，无论是基于靛红的HDAC6抑制剂还是其对应的PROTAC，都抑制了NLRP3介导的IL-1β释放；由于缺乏阴性对照化合物，尚不确定此效应是源于HDAC6的降解，还是仅源于对其催化去乙酰化酶活性的抑制。有趣的是，在脂多糖诱导的小鼠模型中，基于靛红的PROTAC处理能降低血清IL-1β水平，而抑制剂则未产生相同效果。 需要进一步的研究来阐明HDAC6的催化结构域或ZnF-UBD结构域是否参与调控NLRP3炎症小体。尽管抑制第二个催化结构域似乎足以抑制炎性体激活，但ZnF-UBD结构域的作用仍不清楚，因为抑制催化结构域也可能破坏HDAC6与动力蛋白之间的相互作用，从而使得其泛素结合功能变得不必要。 图6、HDAC6代表性PROTACs A6和14a 结构其他HDAC亚型对NLRP3的调控 除了HDAC6，其他HDAC亚型也参与NLRP3调控，但作用可能不同甚至相反。例如，HDAC2和HDAC10在某些情况下抑制NLRP3，而HDAC9则促进其激活。这说明HDAC家族对炎症小体的调控是一个精细而复杂的网络，单一亚型的抑制可能不足以完全控制炎症反应，也可能解释为何有些广谱抑制剂效果更好。 值得注意的是，选择性I类HDAC抑制剂恩替诺特（图7）已在脊髓损伤模型中展现出神经保护作用。在小鼠脊髓损伤模型中，该抑制剂能降低caspase-1活性、减少IL-1β与IL-18水平、抑制NLRP3表达，从而改善运动功能并减轻神经元损伤。同时另一项针对11种锌依赖性HDAC的系统性筛选研究发现，HDAC2对NLRP3炎症小体激活具有负向调控作用。在TLR4体外刺激及结核分枝杆菌感染小鼠模型中，推测为HDAC1/2抑制剂的4-(二甲氨基)-N-[6-(羟氨基)-6-氧代己基]苯甲酰胺（DHOB）（图7）通过增强NLRP3表达，促进了巨噬细胞与树突状细胞中IL-1β的产生。针对HDAC1和HDAC2的基因敲低实验表明，仅HDAC2（而非HDAC1）能够上调感染巨噬细胞中IL-1β与NLRP3的表达水平，提示HDAC2在调控NLRP3炎症小体激活中具有特定作用。但需要指出的是，DHOB的选择性特征尚未明确——除I类HDAC外，其还被报道可抑制HDAC6，这使得观察到的效应是否完全归因于HDAC2抑制仍存在不确定性。 通过质谱分析和免疫共沉淀技术，发现IIa类HDAC亚型HDAC4是GSDMD的特异性去乙酰化酶，这表明其在炎症小体相关通路及GSDMD介导的细胞焦亡翻译后修饰中发挥作用。在体外和体内模型中，HDAC4介导的GSDMD去乙酰化已被证实能够抑制细胞焦亡。此外，IIa类亚型HDAC9也被报道在NLRP3炎症小体激活及影响血管病理过程中起关键作用。在小鼠中删除保守调控元件（CRE）会增加骨髓细胞和骨髓源性巨噬细胞中HDAC9的表达，从而加剧动脉粥样硬化。无论是通过基因敲除还是使用IIa类HDAC抑制剂TMP195（图7）进行药理抑制HDAC9，均能降低剪切型caspase-1的水平，进而减少IL-1β的释放。免疫共沉淀实验和微量热泳动分析表明，HDAC9与NLRP3之间存在相互作用，其中HDAC9介导的NLRP3 NACHT和LRR结构域的去乙酰化在激活步骤中促进了NLRP3的寡聚化。 在脑出血背景下，HDAC10（IIb类）通过蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22（PTPN22）通路与NLRP3炎症小体抑制相关。PTPN22对NLRP3的去磷酸化会导致NLRP3激活和IL-1β分泌。该研究表明，HDAC10通过与PTPN22启动子结合并去酰化，下调PTPN22的表达，从而调控NLRP3炎症小体的激活。相反，近期一项研究提出HDAC10负向调控NLRP3炎症小体。HDAC10似乎能使NLRP3蛋白在Lys496位点去乙酰化，导致NLRP3泛素化并通过蛋白酶体介导降解。 与经典HDAC不同，去乙酰化酶SIRT1-7是NAD+依赖性的，也可能在调节炎症和先天免疫中发挥作用。通过抑制剂AGK2和shRNA介导的敲低抑制SIRT2，可提高乙酰化α-微管蛋白的水平，从而促进炎症小体激活。另一项使用多种去乙酰化酶抑制剂的研究发现，2-硫尿嘧啶衍生物cambinol（一种SIRT1/2抑制剂）能够抑制暴露于微生物产物的多种免疫细胞中细胞因子（TNF、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IFN-γ）及CD40的表达。Cambinol还抑制LPS诱导的NLRP3上调，这可能损害炎症小体激活的启动步骤。然而，其对ATP刺激后IL-1β释放的影响仍有待探索，以进一步阐明NLRP3炎症小体激活的相关机制。值得注意的是，选择性SIRT1抑制剂（EX-527、CHIC-35）和SIRT2抑制剂（AGK2、AK-7）并未复现这些效果，这表明需要更广泛地抑制去乙酰化酶才能产生作用。从机制上看，cambinol可能通过靶向MAPK和MEK激活来调节TLR信号通路。 综上所述，近期研究强调了多种HDAC亚型参与调控NLRP3炎症小体。尽管在理解亚型特异性作用方面已取得一定进展，但已有报道中存在相互矛盾的结果，提示I类、II类和IV类HDAC以及NAD+依赖性去乙酰化酶之间存在功能冗余的调控机制。未来研究需使用高选择性HDAC抑制剂或亚型特异性遗传学方法，以明确单个HDAC的具体作用，并阐明其在炎症小体驱动病理中的治疗潜力。 图7、已报道的与NLRP3炎性体调节有关的HDAC抑制剂HDAC抑制剂在疾病模型中的治疗潜力 大量的临床前研究证明了靶向HDAC-NLRP3轴的治疗潜力。从神经系统到代谢性疾病，多种HDAC抑制剂在动物模型中显示出良好的效果。这张表格精选了部分代表性研究，我们可以看到，针对不同疾病，可能需要选择不同的HDAC亚型作为靶点。这强调了开发亚型选择性药物的必要性。 表1、HDAC抑制剂在NLRP3驱动疾病的临床前模型中的应用 注：6-OHDA = 6-羟多巴胺, AKI = 急性肾损伤, ALF = 急性肝衰竭, ATL = 成人T细胞白血病/淋巴瘤, CFA = 弗氏完全佐剂, CIBP = 癌症痛, CKD = 慢性肾脏病, CS = 香烟烟雾, DSS = 硫酸钠右旋糖, HFD = 高脂饮食, IRI = 肝脏缺血再灌注损伤, IVH = 脑室内出血, n.d. = 不确定, PBMCs = 外周血单个核细胞, PCOS = 多囊卵巢综合症, SAH = 蛛网膜下腔出血, STZ = 链脲霉素.当前挑战与未来方向 NLRP3炎症小体信号通路与HDAC介导的表观遗传调控之间的复杂交互，是众多炎症及免疫疾病发病机制的核心。研究表明，HDAC各亚型（尤其HDAC6）通过催化与非催化双重机制，在NLRP3通路的启动与激活阶段发挥关键调控作用，且该机制在神经、心血管、代谢、自身免疫及肿瘤等疾病中具广泛病理意义。尽管亚型选择性抑制剂和PROTAC降解剂已展现治疗潜力，但物种差异、代偿性信号及HDAC结构域功能认知不足等因素导致研究结论存在矛盾。HDAC通过调控NLRP3/IL-1β表达及炎症小体组装实现多层次干预，而当前非选择性工具化合物与异质实验体系则增加了机制解析的难度。因此，亟需开发高选择性HDAC抑制剂与能区分催化/支架功能的蛋白降解剂，并借助新型锌结合基团等配体设计提升亚型选择性。同时，建立标准化的酶学与细胞分析平台，以获取可靠、可比的选择性数据。未来需结合亚型特异性化学探针、基因工具及人类疾病模型，以阐明各HDAC亚型的具体贡献，并探索HDAC靶向治疗与直接NLRP3抑制剂联用的协同策略，最终推动针对炎症小体驱动疾病的精准疗法发展。结论 总结来说，通过干预HDAC与NLRP3之间的对话，我们有可能为众多炎症性疾病开发出更有效、更精准的治疗方法。这不仅是一个基础科学问题，更是一个直接关系到未来药物研发和临床治疗的重要方向。核心结论 1. HDACs（尤其是HDAC6）是NLRP3炎症小体功能的关键调控因子，贯穿启动与激活全过程。 2. 针对特定HDAC亚型的精准调控，是治疗炎症性疾病极具前景的新策略。 3. 新型化学工具（亚型选择性抑制剂、PROTACs）的快速发展正在深化机制认知并推动药物发现。 4. 理解物种差异、功能冗余和细胞类型特异性是实现临床转化的前提。最终展望 • 推动“精准表观免疫学”发展，为基础与临床研究架起桥梁。 • 开发基于HDAC-NLRP3交互作用的创新疗法，用于神经系统疾病、自身免疫病、代谢综合征等多种顽疾。 Reference： Kathrin Tan, M. Mercedes Rodríguez-Fernández, Tim Keuler, Finn K. Hansen, Michael Gütschow, Günther Weindl, and José Marco-Contelles; Crosstalk between NLRP3 Signaling and Histone Deacetylases in Inflammasome-Driven Diseases;  https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c02657