CD40/EpCAM bispecific antibody(Alligator Bioscience AB)

fam-Trastuzumab deruxtecan-nxki (Enhertu®)是Daiichi Sankyo开发的一款靶向HER2的ADC药物，又称为DS-8201a或T-DXd，用于HER2+/Low表达/突变的实体瘤，其在业内广为人知。DS-8201a通过可酶切的四肽Linker (GGFG)将人源化抗HER2抗体(IgG1)与拓扑异构酶I抑制剂偶联制备而成。DS-8201a的成功离不开缜密的专利布局(图1)。所用抗体源头专利到期(Tras，WO9222653)和Linker、Payload的专利自有(US5658920/US6436912)，为其消除了大部分的产品侵权问题；ADC各种旧元素的新组合(WO2014057687/WO2015115091)带来了意想不到的活性效果，使得该款药物能在ADC日益激烈的HER2竞速赛道上得到破壁；对DS-8201a的专利进行迭代/衍生、提早布局等，延长了DS-8201a的市场独占期。诚然，不论如何布局，也会存在一定的破壁者(WO2022033578)，不过，DS-8201a本身就是一个破壁者。 图1. DS-8201a的专利布局相关阅读：DS-8201专利大战：第一三共 PK SeagenDS-8201a作为新一代ADC改良的标杆，DS-8201a已在不同肿瘤中体现了其卓越的治疗实力。市场方面也体现了凌厉的销售攻势，2022年销售额涨势如虹，全年营收为1616亿日元，约合12.38亿美元，同比上涨191% (2021年4.26亿美元)。随着其在乳腺癌领域(HER2+, HER2+/Low/HER2 Mutant, Triple-negative BC)的全线推进，以及其他肿瘤治疗领域(mNSCLC, GC)的开发，DS-8201a有可能成为ADC市场的超重磅炸弹(图2)[1]。图2. 已批准ADC的全球销量额预测  01  DS-8201a的成功：离不开早期设计DS-8201a能够如此成功，主要是其具有多项创新性特征[2]：高效的新型Payload (半衰期短、可发挥旁观者效应)，高DAR值，良好的同质性，肿瘤选择性可裂解Linker，血液循环中稳定的Linker-Payload。DS-8201a的Linker-Payload以Exatecan mesylate (DX8951f，8)作为起始原料，经两步成酰胺反应引入GGFG四肽Linker (Glycyn-Glycyn-Phenylalanyn-Glycyn)和可与巯基反应的马来酰亚胺基团(mc-GGFG-DXd，图3)[3]；然后采用传统的半胱氨酸偶联策略，利用TCEP打开链间二硫键，与mc-GGFG-DXd偶联得到DS-8201a (9，图3)。 图3. DS-8201a (9)及其相关衍生物的合成路线与活性评价早期研发阶段，研究人员构建不同种类的Linker-payload并通过控制TCEP、Linker-Payload的反应当量数构建含有不同DAR值的ADC，对其进行理化性质及抑制活性的验证(图3右下)。尽管所有ADC (9-17)在体外均表现出较强的细胞毒性，但与其他ADC相比，ADC (12)和(13)的细胞毒性较低，且ADC (12)的聚集程度较高(26%)。据推测，细胞毒性较低的原因是由于释放的药物部分的空间位阻导致肿瘤细胞中的降解酶可能无法有效发挥切割作用，释放的药物发挥毒性作用。因此，通过在GGFG与DXd之间添加不同长度的亚甲基链[(-CH2-)n]，使得可裂解的酰胺基团在空间上远离Payload，ADC (14-17，n=2-5)释放出具有亚甲基烷基链的烷基胺DXd衍生物，显示出较高的体外活性。然而，ADC (17，n=5)有较高的聚集倾向(20%)，可能是由于亚甲基烷基链的疏水性所导致的，低程度的亚甲基修饰(n=1-4)对聚集程度的影响无明显差异。因此可知DXd衍生物的烷基链的长度影响聚集程度。从ADC的物理化学性质的角度来看，优选烷基链的长度应2≤n≤4。此外，在mc段PEGylation修饰以及在GGFG与DXd之间引入氧亚甲基可显著降低聚集体的产生，ADC (9-11)显示出更低的聚集程度，即便是具有较高DAR值(7.7/6.2)也具有可接受的低聚集性和更高的体外抑制活性。传统观念认为较高的DAR值会导致ADC异源性增加，体内清除加快，导致治疗指数的降低[4]。但在DS-8201a的早期研发过程种并未采取将DAR值控制在4的策略，而是通过控制TCEP、Linker-Payload的反应当量数构建高DAR值(7.7) ADC药物，在提高载药量的同时也可降低ADC的异质性[5]。此外，研究人员也未采用活性最好的ADC进行后续的试验，而是选取ADC (9)的Linker-Payload结构进行后续的优化和临床试验评估。之所以选择ADC (9)进行研究是因为不同亚甲基修饰的ADC经酶切释放的Payload代谢物在结构中含有源自Linker部分的伯氨基(-NH2)，导致其细胞膜通透性受损；而ADC (9)经酶切释放的Payload虽然含有伯氨基(18)，但其作为自降解间隔子氨基亚甲基的一部分会自发消除，产生含有羟基的Payload (DXd，19)，具出膜通透性，使其在肿瘤异质性的环境中具有更高的疗效；然后在体内水解酶的作用下，DXd可能进一步水解产生具有更高活性的依喜替康(Exatecan，推断，图4A)。相较于DXd/SN-38，其母本药物Exatecan拥有诸多的优势：较高的TOP1抑制活性[6, 7](图4B)；对ABCG2G/P-gP等药物外排泵蛋白低敏感性，具有更少的Payload外排[8](图4C)；较高的渗透性和旁观者穿透效应[9, 10]。因此，DS-8201a在肿瘤异质性以及在含有ABCG2G或P-gP等多药耐药转运体的肿瘤中发挥良好的抗肿瘤效果，扩展了相关适应症。 图4. DS-8201a体内降解机制(A)及Exatecan活性(B)、克服耐药性(C)数据在同类靶向HER2的ADC药物中，DS-8201a活性优于T-DM1，其对T-DM1不敏感/耐药(Insensitive/Resistance)的肿瘤细胞有较好的治疗效果。一部分原因是由于Payload造成的，DS-8201a拥有较高的DAR值(~7.7)，T-DM1的DAR值相对较低(~3.5)，DS-8201a内化后所释放的Payload较多，高载药量可发挥更具杀伤力的细胞毒性作用；此外，DM1作为药物外排泵蛋白(ABCC2/ABCG2)的良好底物使肿瘤细胞内DM1浓度相对较低[11, 12]，但DXd/Exatecan的底物敏感性较差，外排较少，胞内浓度较高可以发挥足够的杀伤作用[13]。因此，针对T-DM1不敏感/耐受的肿瘤使用DS-8201a可以展示良好的抗肿瘤活性[14, 15]。DS-8201a与T-DM1进行了头对头临床试验(DESTINY-Breast03，NCT03529110，Phase III)，DS8201组和T-DM1组患者12个月的预估OS率分别为94.1%和85.9%，基于良好的临床试验结果，FDA也正式批准DS8201的二线适应症[14]；此外，用于评估DS8201与T-DM1新辅助治疗高危或有残留浸润性淋巴结的HER2阳性原发性乳腺癌患者的临床试验(DESTINY-Breast05，NCT04622319，Phase III)也正在招募患者中，期望DS-8201a能有良好的治疗效果。  02  DS-8201a：新颖的作用机制+旁观者效应DS-8201a的偶联方式是通过还原剂TCEP•HCl打开抗体链间的二硫键，将Linker-Payload连接到裸露的半胱氨酸残基上，产生高DAR值的偶联物。该种偶联方式可能会影响抗体的结构(Architecture)，从而进一步影响抗体的功能[16]。通过ELISA实验发现DS-8201a的Kd值为7.3 ng/mL，Trastuzumab的Kd值为7.8 ng/mL，表明高DAR值并不会过多的影响DS-8201a与HER2的结合活性(图5A)。Trastuzumab的主要作用机制涉及ADCC[17]以及下调磷酸化Akt (pAkt)水平并抑制细胞增殖[18]。实验表明DS-8201a仍然保留了与Trastuzumab相同的作用机制。DS-8201a在人外周血单核细胞(PBMC)介导的SK-BR-3细胞中显示出ADCC活性，最大ADCC活性可达48.6%，EC50为3.8 ng/mL (图5B)，与Trastuzumab相似。关于Akt磷酸化水平的抑制，DS-8201a以剂量依赖性方式诱导SK-BR-3细胞中胞内pAkt(Ser473)的下调，在相同条件下对照IgG ADC不影响Akt的磷酸化水平(图5C)；Trastuzumab降低了约70%的Akt磷酸化，表明DXd偶联可能增强未缀合的Trastuzumab对pAkt的下调作用。以上数据表明DS-8201a在DXd偶联后仍保留了Trastuzumab的功能。另一方面，DS-8201a (10 mg/mL)可诱导Chk1和组蛋白H2A.X的磷酸化(DNA损伤Marker[19, 20])以及PARP裂解(凋亡Marker[21])，10 mg/mL的抗HER2 Ab在相应时间点都不会引起任何目标蛋白的变化，这些结果表明DS-8201a以与DXd相同的方式诱导DNA损伤和细胞凋亡。因此，DS-8201a通过一种新颖的作用机制表现出HER2特异性细胞生长抑制和抗肿瘤活性。 图5. DS-8201a的作用机制另一部分高抗肿瘤活性的原因则是DS-8201a旁观者效应的加持，通过转移抗原表达肿瘤细胞释放的Payload (DXd/Exatecan，高渗透性)至邻近的抗原阴性细胞发挥“杀”屋及乌的毒性作用[22]；T-DM1由于裂解不完全，导致毒素上残留一个带正电的赖氨酸(Lys-SMCC-DM1，低渗透性)，这使其无法透过肿瘤细胞膜，因此其不会产生旁观者效应(图6A)[23-25]。通过体外共培养细胞实验验证DS-8201a的旁观者效应，将HER2+ KPL-4细胞和HER2- MDA-MB-468细胞以适当比例混合并培养过夜，用ADC处理细胞5天，然后测定活细胞的数量。T-DM1仅完全杀死HER2+ KPL-4细胞，但DS-8201a却可以同时杀死KPL-4和MDA-MB-468细胞；与未处理的孔相比，阴性对照ADC不会诱导细胞死亡(图6B)。以上数据表明MDA-MB-468细胞杀伤是由释放的DXd/Exatecan引起的，说明DS-8201a在细胞水平上具有旁观者杀伤作用。 图6. DS-8201a旁观者效应研究DS-8201a的旁观者效应在体外实验得到验证后，通过MDA-MB-468-Luc细胞构建的肿瘤异种移植模型(PDX)利用体内成像系统检测其体内旁观者效应(图6C)。将每种实验/对照ADC给予共同接种的异种移植小鼠，并测量每只小鼠的肿瘤体积和荧光素酶活性。在DS-8201a实验组中，可观察到荧光素酶信号明显减少，表明MDA-MB-468-Luc细胞被DS-8201a完全根除；其他HER2靶向ADC或对照ADC未观察到类似结果；就肿瘤体积变化而言，T-DM1抑制肿瘤生长，但不如DS-8201a有效，这可能是由于肿瘤消除有限，仅消除HER2+肿瘤(图6C)。免疫组化研究表明，T-DM1治疗组中HER2+细胞被根除，而HER2-癌细胞占据了肿瘤组织的大部分；在DS-8201a治疗组中，几乎所有HER2+和HER2-细胞消失，肿瘤中几乎没有癌细胞残留。这些结果证实，在共同接种条件下，DS-8201a不仅对HER2+肿瘤有效，而且对HER2-肿瘤也显示出抗肿瘤活性，而T-DM1对HER2-肿瘤没有作用。DS-8201a除对邻近HER2-细胞有旁观者作用外，对其远端癌细胞是否拥有旁观者效应进行验证。将NCI-N87和MDA-MB-468-Luc细胞的混合物接种到小鼠的右胁腹中，并且仅将MDA-MB-468-Luc细胞接种到同一小鼠的左胁腹中。DS-8201a治疗14天后，联合接种肿瘤的荧光信号减弱，但单独接种肿瘤的荧光信号没有变化，与未治疗组小鼠荧光信号相当(图6D)。这些结果表明，DS-8201a对HER2-细胞的影响仅在与HER2+细胞相邻的细胞中观察到，而在远端细胞中未观察到抗肿瘤作用。基于旁观者效应可以解决肿瘤异质性的问题[26]，DS-8201a被开发用于多种肿瘤异质性的癌症治疗(表1)。表1. 基于DS-8201a旁观者效应开展的临床试验  03  GGFG四肽Linker功不可没以上所提到高DAR值、旁观者效应均是Payload所贡献的，Payload能发挥如此作用，其多肽Linker发挥着重要的作用。Linker的重要性经常被忽略，大家仅仅认为其是Antibody和Payload中间部分(“the piece in the middle”)，其实Linker是ADC中较为关键的中间部分(Crucial “Part in the Middle”)[27]。Linker的化学和生物物理特性在ADC的设计中起着至关重要的作用，其化学特性会显著影响ADC的生物物理性质和生化稳定性，进而对药效学和药代动力学产生深远的影响[28]。为了使ADC具有选择性和抗肿瘤活性，所采用的Linker应努力实现三个关键特性：(1)循环稳定性高，避免Payload的过早释放；(2)高水溶性，有助于生物偶联并避免形成无活性的ADC聚集体；(3)能够有效地释放高细胞毒性的Linker-Payload代谢物[29, 30]。DS-8201a通过GGFG四肽Linker将抗体和Payload偶联在一起(图3)，该Linker在小鼠、大鼠、猴和人血浆中DS-8201a的DXd释放率为1.2%至3.9%，特别是在人血浆孵育21天后，DXd的释放率低至2.1% (图7A)，与其他ADC (如T-DM1、SGN-38）相当或相对较低[15]；同时在猕猴中研究DS-8201a的药代动力学(Pharmacokinetics，PK)特征，数据显示其与总抗体之间无明显差异(图7B)，即便是在不同的给药剂量下二者PK参数也无明显差异(图7C)[31]，这说明DS-8201a的GGFG四肽Linker即使在DAR=8的情况下在血浆中的稳定性也是极好的，仅在有限的时间点检测到低水平的DXd释放。 图7. DS-8201a体外(A)/体内(B/C)血浆稳定性研究  04  DS-8201a与肿瘤免疫检查点的combo上述数据主要讲述了DS-8201a作为ADC所发挥的抗肿瘤作用，除此之外，DS-8201a还可以引起免疫系统激活，从而提升抗肿瘤免疫[32]。在具有免疫能力的小鼠体内接种人HER2的CT26细胞(CT26.WT-hHER2, s.c.)，荷瘤小鼠使用DS-8201a进行抗肿瘤治疗，将获得完全缓解(Complete Response, CR)的小鼠再次接受CT26.WT-hHER2挑战后发现小鼠可以抵御新接种的肿瘤(图8A)；同时，细胞因子IFNγ (主要有活化的T细胞、自然杀伤细胞产生[33])的分泌也在增加(图8B)。以上数据说明DS-8201a诱导的T细胞不仅可以识别人HER2，还可以识别肿瘤细胞的其他抗原。即使是在对DS-8201a细胞毒活性不太敏感的肿瘤中，适应性免疫也可被激活，CD8+ T细胞(CD45+ CD3+ CD8+细胞)和颗粒酶B+的CD8+ T细胞比率明显增加(图8C)；当采用anti-CD8耗竭Ab消耗掉CD8+T细胞时，DS-8201a的抗肿瘤活性基本上消失(图8D)。与对照组相比，CD8+ T细胞显着增强DS-8201a在免疫活性小鼠模型中的抗肿瘤作用。 图8. DS-8201a引起免疫系统激活提升抗肿瘤免疫由于拓扑异构酶Ⅰ抑制剂可以激活树突状细胞(DC)[34]，所以DS-8201a内化后所释放的DXd也可以使DC成熟/活化标志物(CD86+MHC Ⅱ类)的标志物增加，说明DS-8201a发挥抗肿瘤作用需要DC参与；经DS-8201a处理的小鼠体内DC细胞(CD45+ CD11c+ MHC class II+)占比明显增加，其中CD86+的DC细胞也明显增加(图9A)；这说明DS-8201a除发挥细胞毒性作用外，DC体内激活也是其发挥抗肿瘤作用的重要机制。此外，DS-8201a还可以增加免疫相关分子(PD-L1/ MHC Ⅰ类)的表达(图9B)，MHC I类的表达增加抗原呈递，促进T细胞识别肿瘤[35]；另一方面，PD-L1表达增加可能是一种负性调节的结果，由于T细胞激活或体内产生抑制信号而降低体内抗肿瘤免疫力。因此，采用“万金油”-免疫位点阻断剂(ICI，尤其是抗PD-1/PD-L1阻断剂)与DS-8201a联用可以阻断抑制信号，发挥更好的抗肿瘤效果。利用抗PD-1抗体、DS-8201a或联用疗法治疗荷瘤小鼠(CT26.WT-hHER2, s.c.)，38天后各治疗方案的存活率分别为20%、20%和80% (图9C)；单一疗法虽然能够延长总生存时间，但联合疗法对总生存时间的延长明显增加。基于以上动物实验数据可以说明抗PD-1抗体可以阻断PD-1/PD-L1抑制信号通路，并且能提高DS-8201a的功效。图9. DS-8201a对免疫相关分子表达水平的影响及与抗PD-1抗体联用的抗肿瘤效果受到上述动物实验DS-8201a和抗PD-1抗体联合治疗所产生的良好效果的影响，Daiichi Sankyo和AstraZeneca联合多家药企开展了两项临床试验评估联合疗法的抗肿瘤活性(表2)[36-38]，目前暂未有临床结果披露。基于动物实验的良好活性，期待该种联合疗法能够成为治疗HER2+肿瘤的新的有效疗法。表2. DS-8201a和抗PD-1抗体联合疗法所涉及的临床试验针对DS-8201a临床前体内外抗肿瘤活性的其他研究，以及临床研究梳理，作者不再赘述。相关阅读：ADC“药王”：DS-8201临床研究全面梳理不可忽视！DS-8201a的临床前研究  05  DS-8201a：期待下一个破局者▌ 提高安全性在过去几年里，ADC的设计改进取得了重大进展，重塑了多种晚期实体瘤的治疗方法。ADC的预期原理是将细胞毒性分子与针对肿瘤特异性抗原的抗体连接来实现细胞毒性分子的靶向递送，预计其细胞毒性将低于传统化疗。然而，大多数ADC仍然面临着类似于细胞毒性Payload的脱靶毒性、靶向毒性和其他知之甚少且可能危及生命的不良反应，DS-8201a也不例外。DS-8201a自2019年12月20日批准用于HER2+不可切除或转移性乳腺癌以来，其临床适应症的迅速扩大，随之而来的是其安全性问题(表3)[14, 37, 39-41]，提高其安全性也势在必行。表3. DS-8201a所涉及的毒性副作用如何降低DS-8201a乃至其他FDA批准ADC药物的毒性问题成为目前ADC类药物研发所面临的重要问题。除了可以通过剂量优化策略(剂量封顶、限制性治疗持续时间、分次给药、治疗反应指导剂量调整、随机剂量探索研究)、实时诊断、药物基因组学指导的个体化用药等方法在实现疗效最大化的同时降低其副作用外，优化ADC的设计(抗体部分的创新、Linker化学的创新、Payload方面的创新)，ADC的每个元素组成的设计创新都可以实现药理学特性的微调，并对安全性和耐受性产生潜在影响。▌ 新一代ADC的优化对于ADC中的Linker而言，当然不存在“One size fits all”的情况。迄今为止获批的ADC药物的Linker具有多样性，包括可切割、不可切割的接头，酸敏感、蛋白酶敏感的Linker，在ADC的作用机制中发挥关键作用[42]。GGFG四肽Linker并非是“高山”不可逾越，它更像是一座“灯塔”指引我们前进，站在“药王”的肩膀上让我们走的更远。随着我们对ADC中使用的各种Linker的优化，并深入分析不同Linker的特性，解析其影响ADC功效和副作用的“特征图谱”，终会获得安全有效的ADC用于癌症治疗。对于ADC中的Payload而言，现阶段所批准ADC的Payload均为细胞毒性药物，涉及Calicheamicin、MMAE/F、DM1/4、DXd、SN-38、PBD SG3199、Duocarmycin。临床经验表明，与ADC相关的大多数不良事件(Off-target/Off-tumour)在谱系、发生率和严重程度方面与Payload的不良事件相似[43]，广为流传的治疗窗扩展概念也是不准确的（图10）[44]，并且拥有相同Payload的不同ADC通常具有相似的毒性特征，无论目标抗原有何不同[45]。ADC并非一定要以细胞毒性药物作为Payload，随着研究的深入，大家开始拓展新型Payload，构建了多种新型抗体偶联物-ISAC[46]、IM-ADC[47]、GC-ADC[48]等。随着我们对ADC技术研究的不断革新，采用不同种类Payload的ADC作为肿瘤学以外疾病领域治疗药物的开发也将会增加。图10. 传统版与修正版的ADC治疗优势对于ADC中的Antibody而言，我们似乎已经形成了思维定式：ADC中的Antibody只需要发挥靶向作用将细胞毒性Payload递送至目的细胞即可，其治疗作用可以不用考虑，试问最开始研发抗体药物的出发点是什么，难道只是为了增加靶向性、延长半衰期(部分GLP-1R药物[49])？随着大家对肿瘤生物学研究的深入，非内化(Non-internalising) ADC[50]开始进入我们的眼帘，这消除了对高抗原表达的依赖，避免了潜在的低效内化，并且可以极大地将癌症靶标范围扩大到细胞外肿瘤基质以及其他膜蛋白/胞外蛋白。此外，我们能否构建一种ADC使其既保留抗体的特异性又能维持抗体的活性，同时还能与Payload相辅相成发挥协同作用，这是一个值得深思的问题。结语“Magic Bullet”概念的提出者Paul Ehrlich认为科学的成功需要4G: Geduld、Geschick、Glück und Geld”(德语，耐心、能力、运气和金钱)，希望这4G格言赋能大家ADC药物的研发，在未来开发出更有效的“灵丹妙药”，让“High-hanging Fruit”变得触手可及。最后，借用周恩来总理的一首诗与诸君共勉！《无题·大江歌罢掉头东》大江歌罢掉头东，邃密群科济世穷。面壁十年图破壁，难酬蹈海亦英雄。免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表个人立场，亦不代表个人支持或反对文中观点。本文并非治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。刍荛之作，若有纰漏/不足，欢迎各位批评指正(dyc21@mails.tsinghua.edu.cn)，谢谢！ 参考文献 1. do Pazo, C., K. Nawaz, and R.M. Webster, The oncology market for antibody-drug conjugates. Nat Rev Drug Discov, 2021. 20(8): p. 583-584.2. Nakada, T., et al., The Latest Research and Development into the Antibody-Drug Conjugate, [fam-] Trastuzumab Deruxtecan (DS-8201a), for HER2 Cancer Therapy. Chem Pharm Bull (Tokyo), 2019. 67(3): p. 173-185.3. Nakada, T., et al., Novel antibody drug conjugates containing exatecan derivative-based cytotoxic payloads. Bioorg Med Chem Lett, 2016. 26(6): p. 1542-1545.4. Hamblett, K.J., et al., Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate. Clinical Cancer Research, 2004. 10(20): p. 7063-7070.5. Donaghy, H., Effects of antibody, drug and linker on the preclinical and clinical toxicities of antibody-drug conjugates. MAbs, 2016. 8(4): p. 659-71.6. Gupta, A., J.Z. Drago, and S. Chandarlapaty, ADCs or: How I Learned to Stop Worrying and Love Chemotherapy. Cancer Discov, 2023. 13(4): p. 817-818.7. Ogitani, Y., et al., Wide application of a novel topoisomerase I inhibitor-based drug conjugation technology. Bioorg Med Chem Lett, 2016. 26(20): p. 5069-5072.8. Jo, U., et al., TOP1-DNA Trapping by Exatecan and Combination Therapy with ATR Inhibitor. Mol Cancer Ther, 2022. 21(7): p. 1090-1102.9. Khera, E., et al., Cellular-Resolution Imaging of Bystander Payload Tissue Penetration from Antibody-Drug Conjugates. Mol Cancer Ther, 2022. 21(2): p. 310-321.10. Weng, W., et al., Antibody-Exatecan Conjugates with a Novel Self-immolative Moiety Overcome Resistance in Colon and Lung Cancer. Cancer Discov, 2023. 13(4): p. 950-973.11. Barok, M., H. Joensuu, and J. Isola, Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Res, 2014. 16(2): p. 209.12. Loganzo, F., et al., Tumor cells chronically treated with a trastuzumab-maytansinoid antibody-drug conjugate develop varied resistance mechanisms but respond to alternate treatments. Mol Cancer Ther, 2015. 14(4): p. 952-63.13. Takegawa, N., et al., DS-8201a, a new HER2-targeting antibody-drug conjugate incorporating a novel DNA topoisomerase I inhibitor, overcomes HER2-positive gastric cancer T-DM1 resistance. Int J Cancer, 2017. 141(8): p. 1682-1689.14. Cortés, J., et al., Trastuzumab Deruxtecan versus Trastuzumab Emtansine for Breast Cancer. N Engl J Med, 2022. 386(12): p. 1143-1154.15. Ogitani, Y., et al., DS-8201a, A Novel HER2-Targeting ADC with a Novel DNA Topoisomerase I Inhibitor, Demonstrates a Promising Antitumor Efficacy with Differentiation from T-DM1. Clin Cancer Res, 2016. 22(20): p. 5097-5108.16. Walsh, S.J., et al., General dual functionalisation of biomacromolecules via a cysteine bridging strategy. Org Biomol Chem, 2020. 18(22): p. 4224-4230.17. Clynes, R.A., et al., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytotoxicity against tumor targets. Nat Med, 2000. 6(4): p. 443-6.18. Yakes, F.M., et al., Herceptin-induced inhibition of phosphatidylinositol-3 kinase and Akt Is required for antibody-mediated effects on p27, cyclin D1, and antitumor action. Cancer Res, 2002. 62(14): p. 4132-41.19. Xiao, Z., et al., Chk1 mediates S and G2 arrests through Cdc25A degradation in response to DNA-damaging agents. J Biol Chem, 2003. 278(24): p. 21767-73.20. Furuta, T., et al., Phosphorylation of histone H2AX and activation of Mre11, Rad50, and Nbs1 in response to replication-dependent DNA double-strand breaks induced by mammalian DNA topoisomerase I cleavage complexes. J Biol Chem, 2003. 278(22): p. 20303-12.21. Kaufmann, S.H., et al., Specific proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-induced apoptosis. Cancer Res, 1993. 53(17): p. 3976-85.22. Giugliano, F., et al., Bystander effect of antibody-drug conjugates: fact or fiction? Curr Oncol Rep, 2022. 24(7): p. 809-817.23. van der Lee, M.M., et al., The Preclinical Profile of the Duocarmycin-Based HER2-Targeting ADC SYD985 Predicts for Clinical Benefit in Low HER2-Expressing Breast Cancers. Mol Cancer Ther, 2015. 14(3): p. 692-703.24. Li, J.Y., et al., A Biparatopic HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate Induces Tumor Regression in Primary Models Refractory to or Ineligible for HER2-Targeted Therapy. Cancer Cell, 2016. 29(1): p. 117-29.25. Xu, Z., et al., Novel HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugates of Trastuzumab Beyond T-DM1 in Breast Cancer: Trastuzumab Deruxtecan(DS-8201a) and (Vic-)Trastuzumab Duocarmazine (SYD985). Eur J Med Chem, 2019. 183: p. 111682.26. Suzuki, M., et al., Visualization of Intratumor Pharmacokinetics of [fam-] Trastuzumab Deruxtecan (DS-8201a) in HER2 Heterogeneous Model Using Phosphor-integrated Dots Imaging Analysis. Clinical Cancer Research, 2021. 27(14): p. 3970-3979.27. van Delft, F. and J.M. Lambert, Chemical Linkers in Antibody-Drug Conjugates (ADCs). Vol. 81. 2021: Royal Society of Chemistry.28. Bargh, J.D., et al., Cleavable linkers in antibody-drug conjugates. Chem Soc Rev, 2019. 48(16): p. 4361-4374.29. Sheyi, R., B.G. de la Torre, and F. Albericio, Linkers: An Assurance for Controlled Delivery of Antibody-Drug Conjugate. Pharmaceutics, 2022. 14(2).30. Kostova, V., et al., The Chemistry Behind ADCs. Pharmaceuticals (Basel), 2021. 14(5).31. Nagai, Y., et al., Comprehensive preclinical pharmacokinetic evaluations of trastuzumab deruxtecan (DS-8201a), a HER2-targeting antibody-drug conjugate, in cynomolgus monkeys. Xenobiotica, 2019. 49(9): p. 1086-1096.32. Iwata, T.N., et al., A HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate, Trastuzumab Deruxtecan (DS-8201a), Enhances Antitumor Immunity in a Mouse Model. Mol Cancer Ther, 2018. 17(7): p. 1494-1503.33. Farrar, M.A. and R.D. Schreiber, The molecular cell biology of interferon-gamma and its receptor. Annu Rev Immunol, 1993. 11: p. 571-611.34. Kitai, Y., et al., DNA-Containing Exosomes Derived from Cancer Cells Treated with Topotecan Activate a STING-Dependent Pathway and Reinforce Antitumor Immunity. J Immunol, 2017. 198(4): p. 1649-1659.35. Andersen, M.H., et al., Cytotoxic T cells. J Invest Dermatol, 2006. 126(1): p. 32-41.36. Galsky, M.D., et al., Primary analysis from DS8201-A-U105: A phase 1b, two-part, open-label study of trastuzumab deruxtecan (T-DXd) with nivolumab (nivo) in patients (pts) with HER2-expressing urothelial carcinoma (UC). 2022, American Society of Clinical Oncology.37. Hamilton, E., et al., Abstract PD3-07: trastuzumab deruxtecan (T-DXd; DS-8201) with nivolumab in patients with HER2-expressing, advanced breast cancer: a 2-part, phase 1b, multicenter, open-label study. Cancer Research, 2021. 81(4_Supplement): p. PD3-07-PD3-07.38. Tarantino, P., et al., Optimizing the safety of antibody-drug conjugates for patients with solid tumours. Nat Rev Clin Oncol, 2023.39. Goto, K., et al., LBA55 Trastuzumab deruxtecan (T-DXd) in patients (Pts) with HER2-mutant metastatic non-small cell lung cancer (NSCLC): Interim results from the phase 2 DESTINY-Lung02 trial. Annals of Oncology, 2022. 33: p. S1422.40. Modi, S., et al., Trastuzumab deruxtecan in previously treated HER2-low advanced breast cancer. New England Journal of Medicine, 2022. 387(1): p. 9-20.41. Modi, S., et al., Trastuzumab deruxtecan in previously treated HER2-positive breast cancer. New England Journal of Medicine, 2020. 382(7): p. 610-621.42. Dumontet, C., et al., Antibody-drug conjugates come of age in oncology. Nat Rev Drug Discov, 2023.43. Zhu, Y., et al., Treatment-related adverse events of antibody-drug conjugates in clinical trials: A systematic review and meta-analysis. Cancer, 2023. 129(2): p. 283-295.44. Colombo, R. and J.R. Rich, The therapeutic window of antibody drug conjugates: A dogma in need of revision. Cancer Cell, 2022. 40(11): p. 1255-1263.45. Nguyen, T.D., B.M. Bordeau, and J.P. Balthasar, Mechanisms of ADC Toxicity and Strategies to Increase ADC Tolerability. Cancers (Basel), 2023. 15(3).46. Sharma, M., et al., 164P Preliminary results from a phase I/II study of BDC-1001, a novel HER2 targeting TLR7/8 immune-stimulating antibody conjugate (ISAC), in patients (pts) with advanced HER2-expressing solid tumors. Annals of Oncology, 2021. 32: p. S1453-S1454.47. He, L., et al., Immune Modulating Antibody-Drug Conjugate (IM-ADC) for Cancer Immunotherapy. J Med Chem, 2021. 64(21): p. 15716-15726.48. Hobson, A.D., et al., Optimization of Drug-Linker to Enable Long-term Storage of Antibody-Drug Conjugate for Subcutaneous Dosing. J Med Chem, 2023.49. Li, C., et al., Glutazumab, a novel long-lasting GLP-1/anti-GLP-1R antibody fusion protein, exerts anti-diabetic effects through targeting dual receptor binding sites. Biochem Pharmacol, 2018. 150: p. 46-53.50. Ashman, N., J.D. Bargh, and D.R. Spring, Non-internalising antibody-drug conjugates. Chem Soc Rev, 2022. 51(22): p. 9182-9202.51. Strebhardt, K. and A. Ullrich, Paul Ehrlich's magic bullet concept: 100 years of progress. Nat Rev Cancer, 2008. 8(6): p. 473-80.52. Carter, P.J. and G.A. Lazar, Next generation antibody drugs: pursuit of the 'high-hanging fruit'. Nature Reviews Drug Discovery, 2018. 17(3): p. 197-223.

抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)结合了单克隆抗体的肿瘤靶向特异性和细胞毒性药物(Warhead/Payload)的强效细胞杀伤活性，通过精心设计的化学接头(Linker)将二者偶联在一起，在实现精确定位的同时展现出强大的抗肿瘤活性，以改善Warhead的治疗窗口[1]。基于ADC药物的临床成功[2]，研究人员对设计新样式的ADC的兴趣激增。除了ISAC[3]、IM-ADC[4]、PROTAB[5]、LYTAC[6]等外，双载荷ADC药物的构建也在不断取得进步。双载荷ADC通过不同的构建方法对其药抗比(Drug-Antibody Ratio, DAR)进行灵活调整，可以根据疾病类型及治疗目的微调ADC的理化特性、功效和毒性特征，充分利用ADC双药递送的优势，提高ADC活性；同时，在原子经济学的角度上可以减少所需试剂的摩尔用量构建具有高度同质性的双载荷ADC药物，在提高疗效的同时降低生产成本。目前，用于构建双载荷ADC的方法还是主要集中于第二代偶联技术[1]：工程化的反应性半胱氨酸残基、链间二硫键重塑技术、非天然氨基酸介导的点击化学、酶辅助连接、糖型重塑和糖缀合等[7]。文献报道的双载荷ADC的构建多是上述偶联方法的组合，对DAR值进行调整，接下来小编将简单介绍2016-2023年部分文献报道的双载荷ADC及其类似物的构建。  01  Engineered reactive cysteine residue & Disulfide re-bridging由于半胱氨酸(Cysteine，Cys)侧链基团的特殊性-巯基基团(-SH)，其与含有马来酰亚胺基团(-Mal)的Payloads偶联以实现对抗体的位点选择性修饰，二者的迈克尔加成反应选择性高、快速，同时条件也较为温和[8]。目前，利用Cys构建ADC的方法主要包括工程化的反应性Cys残基(Engineered reactive cysteine residue)和抗体自身链间二硫键重塑(Disulfide re-bridging)技术。工程化的反应性Cys的引入早见于Genentech公司的ThioMab™技术，通过还原-氧化-偶联三步反应构建DAR值为2的ADC药物(实际DAR值1.7~1.9)[9]，该方法目前有较多公司在其基础上进行优化，例如Zymeworks[10]，Byondis[11]等。二硫键重塑技术主要是利用TCEP/DTT还原IgG的链间二硫键，暴露出可用于偶联反应的Cys-SH。为了充分利用有限的结合位点，西雅图遗传学公司Peter D. Senter课题组[12]利用双Cys多路载体(Dual Cysteine multiplexing carrier)引入两个被保护的半胱氨酸基团[Cys (SiPr)+Cys (Acm)]，结合不同的脱保护反应构建双载荷ADC；同时该载体还包含PEG24片段，可在不伴随疏水性诱导的ADC聚集的情况下实现高载药量(DAR: 8+8)；用该方法构建的cAC10-(2+3)在小鼠异种移植模型(DEL-BVR细胞系)中展现出良好的抗肿瘤活性(图1)。 图1. 双载荷ADC的构建及其抗肿瘤活性评价上述方法利用线性Linker引入双载荷ADC，MedImmune Inc.则利用支链Linker引入双载荷(图2)[13]。偶联所需Cys插入到Trastuzumab/NIP228 (Ctrl Ab)的239位，引入含有炔基和酮基的Linker构建Ab-Linker平台，使其与NH2-O-vc-PAB-MMAE、N3-PEG8-PBD dimer (SG3457)反应得到双载荷ADC，其针对HER2+的乳腺癌细胞系展示出良好的细胞毒性。 图2. 利用支链Linker构建双载荷ADC剑桥大学David R. Spring课题组[14]利用二硫键重塑技术进行双载荷ADC的构建，以带有特定反应集团和FITC的二乙烯基嘧啶(divinylpyrimidine, dfDVP)衍生物与Trastuzumab的链间二硫键进行反应，再经铜催化的叠氮炔基环加成反应[Copper (I)-catalyzed Azide Alkyne Cycloaddition，CuAAC]得到DAR值为3 (针对MMAE而言)的Tras-FITC-MMAE(图3左)，对SK-BR3 (HER2+)细胞表现出剂量依赖性细胞毒性。尽管筛选了其他的几种反应条件，但仍然无法获得DAR>3的Tras-FITC-MMAE，该课题组认为所连接的接头大小仅允许在每个抗体的铰链区连接一个药物分子，由于已经结合的大尺寸连接子-有效载荷产生空间位阻，使得MMAE仅有一个与目的基团进行偶联。 图3. dfDVP用于双载荷ADC的构建(左)及其优化(右)在上述研究的基础上，该课题组对dfDVP Linker进行优化(图3右)，引入可以发生逆电子需求D-A反应(Inverse electron-demand Diels–Alder reaction, IEDDA[15])的甲基环丙烯基团(蓝色部分)和可以发生环张力驱动叠氮炔基环加成反应(Strain-Promoted Alkyne-Azide Cyclo-additions, SPAAC[16])的双环[6,1,0]壬炔(-BCN，绿色部分)，重塑抗体二硫键后，将产物与MMAE-PEG4-N3和TAMRA-PEG4-Bn-Tetrazine反应，构建新型双载荷ADC[17]；同样，该种ADC的活性也是在SK-BR3 (HER2+)细胞中进行验证，IC50为40 pM，其对HER2阴性的MCF7细胞无明显的细胞毒活性。类似于dfDVP衍生物，荣昌生物采用三丙烯基三嗪类(Triallyl triazines)构建单载荷ADC，在其研发管线中也得到应用[18, 19]。此外，针对TCEP或DDT还原的非选择性，Byondis公司利用其专有的ByonShieLD®[20]和ByonFoLD®[11]技术平台对工程化的Cys和链间二硫键进行选择性还原，然后与含有-Mal的细胞毒性药物反应得到双载荷ADC (图4)，但对其DAR值的明确还值得进一步研究。 图4. Byondis公司双载荷ADC的制备模式图(作者根据专利自行绘制)针对抗体的链间二硫键的改造，除dfDVP类似物外，还有二溴哒嗪二酮(dibromo- pyridazinedione, diBrPD)衍生物。伦敦大学Vijay Chudasama课题组利用diBrPD-PhN3(-Tz)作为桥接试剂构建含有不同载荷和DAR值的ADC药物，利用该方法可获得同质性高、多样化的ADC (图5)；同时，该方法具有一定的普适性，除对全长抗体进行偶联外，还可以应用到Fab’、Fc-偶联物的开发[21]。diBrPD衍生物较早见于ThioLogics公司，也是用于构建双载荷ADC，但其仅用于mAbs的偶联，未对应用范围做更多的扩展[22]。 图5. diBrPD衍生物由于单/双载荷ADC的构建与Cys类似，由丝氨酸转化而成的硒代半胱氨酸(Selenocysteine，Se-Cys)也可作为偶联位点进行ADC的构建[23]。美国国立卫生研究院国家癌症研究所及合作团队以Trastuzumab为模板，通过分子生物学技术在其特定位置引入工程化的Cys (HC A114C)和Se-Cys (HC S396U)构建Thio-selenomab，使引入的Se-Cys与PNU-159682-EDA-Gly3-IAM(Iodoacetamide，碘乙酰胺)偶联[24]，然后再将产物与MMAF-nc-MSODA偶联[25]得到双载荷ADC，经质谱表征，DARPNU-159682为1.9，DARMMAF为1.5 (图6左上)；该双载荷ADC对HER2+的细胞系表现出选择性和有效的细胞毒性(图6左下)，并表现出与偶联药物一致的双重作用机制：PNU-159682由于其DNA损伤活性导致S期细胞周期停滞，而MMAF同时抑制微管蛋白聚合并导致G2/M期细胞周期停滞(图6右)。尽管体外细胞毒性结果表明PNU-159682和MMAF的组合不会单独增强PNU-159682的效力，但ADC的双重机制特性可能在高度异质的体内肿瘤环境中仍具有治疗效用。 图6. 利用Cys和Se-Cys构建双载荷ADC及其活性、机制的研究除工程化的Cys、Se-Cys以及链间二硫键外，法国分子生物物理中心Vincent Aucagne课题组以化学合成的第三代抗HER2亲和体(Affibody)的N-端Cys为反应位点，经过两步反应一次纯化可以在温和条件下(无离液剂，中性pH值)构建双载荷ADC，引入DM1和MMAE；与两种单偶联物的组合相比，双载荷ADC对HER2+的细胞系表现出更强的细胞毒性，表明具有强大的协同作用(图7)[26]。 图7. 双载荷亲合体(Affibody)的构建及其活性评价  02  Unnatural Amino Acids (UAA)除了对Cys进行修饰外，抗体的位点特异性偶联还可以通过基因密码子扩增技术引入非天然氨基酸(Unnatural Amino Acids, UAA)来实现，利用不同的正交对[正交氨酰-tRNA合成酶(aaRS) / tRNA]引入UAA，再与目的分子偶联构建ADC，该种偶联是可控和定量的，可生成具有均一DAR值、高效、稳定性和安全性高的ADC[27]。波士顿学院Abhishek Chatterjee课题组利用大肠杆菌色氨酸对(EcTrp)作为TGA密码子抑制剂，与其他已有的正交对相结合，开发出双UAA引入的三种新途径，利用该方法可以极佳的效率将两种不同的UAA特异性地引入到抗体中，随后用两种不同的细胞毒性有效载荷对其进行偶联[28]。利用EcTrp+EcLeu (TAG)[29]系统分别将5-HTP和LCA引入到Trastuzumab重链的121和198位，然后经一锅法将两种不同的细胞毒药物(Diazo-MMAF +DBCO-PNU-159682[30])偶联到抗体上(CRACR[31]+SPAAC，图8. A+B)；分别用该方法构建的ADC对NCI-N87 (HER2受体高表达)和NCI-H520 (HER2受体低表达)细胞系进行初步细胞毒性研究，对NCI-N87的细胞毒性明显更高，证明其HER2依赖性的细胞杀伤；与MMAF相比，用PNU标记的ADC显示出显着更高的毒性(图8. C)。 图8. 利用基因密码子扩增技术构建双载荷ADC及其活性评价为了能够减少正交对(aaRS/tRNA对)的使用，北京大学刘涛研究院课题组开发了新型UAA-pTAF和mTAF，在一个UAA引入两种正交反应基团(-N3 + -Tetrazine)，可实现一锅化反应引入荧光基团、放射性同位素、细胞毒性药物等[32]。利用含有pTAF的HER2-scFv构建的scFv-MMAE-PEG40K，其在HER2+肿瘤模型(HCC1954)中对肿瘤生长表现出明显的抑制作用，而在scFv-MMAE处理组和PBS处理组中未观察到肿瘤生长抑制；在实验结束时切除肿瘤并称重，该结果也证明scFv-MMAE与PEG40K偶联后表现出优越的治疗效果(图9)；此外，经scFv-MMAE-PEG40K治疗后没有观察到体重和肝功能的显着变化，表明其具有良好的生物相容性。虽然该方法构建的双载荷偶联物并没有完全消除肿瘤，但作者认为可以通过调整剂量和注射频率来改善抗肿瘤活性。 图9. 基于UAA-p/mTAF构建双载荷ADC类似物及其抗肿瘤活性的研究除了单纯的利用UAA外，上海有机所王文远教授课题组通过组合的方法对工程化的Cys和对乙酰基苯丙氨酸(p-Acetyl-Phenylalanine)进行一锅法、连续反应构建双载荷ADC (图10)[33]。该策略使Trastuzumab通过不同的反应顺序与两种机制不同的细胞毒性药物结合，使新设计的ADC具有功能多样性，并有可能克服耐药性、提高治疗活性。该方法反应条件较为剧烈(pH 4，羟胺与羰基成肟)，在实际生产中可能存在一定的问题。 图10. 双策略(Cys+UAA)构建双载荷ADC类似物UAA虽然能实现定点均一的偶联，但由于其外源性的特征可能会使抗体诱导免疫原性[34]；UAA的疏水性也会增加抗体聚集的风险[35]。  03  Glycan remodeling and glycoconjugation & Enzyme-assisted ligation糖基化是抗体最重要的翻译后修饰之一，利用糖基化位点进行位点选择性修饰也是目前ADC构建的常用方法[36]。上海药物所黄蔚教授课题组开发了两种策略构建位点特异性的ADC，一种是通过endo-S2催化的一步糖工程合成糖基特异性ADC的化学酶法，另一种是通过配体导向的基于硫酯的酰基转移试剂的化学方法以无痕方式合成K248位点特异性ADC[37-39]。目前，该课题组利用上述技术优势，通过三种不同路线在糖基化位点(N297)和K248位点组装同质双载荷ADC (图11)[40]。A)首先通过endo-S2催化在糖基化位点引入MMAE/ MMAF，然后在存在FcBP接头-药物复合物的情况下在抗体的K248处偶联另一个载荷；B)首先在K248处偶联有效载荷，然后在糖基化位点进行偶联，但实验结果表明K248处的有效载荷在某种程度上影响endo-S2介导的转糖基活性，影响偶联；C)通过简单地将所有材料添加到反应混合物中，以一锅法同时在糖基化和K248位点组装两种不同的有效载荷，该条件下endo-S2的水解和转糖基活性被完全抑制，有效载荷在K248处的偶联效率也受到影响。最终，选择以路线A进行双载荷ADC的制备，所得ADC在稳定性及抗肿瘤活性方面有优秀的表现。 图11. 双载荷ADC构建路线的优化除N297位聚糖进行截短修饰外，酶辅助连接也是一种有效的位点特异性偶联策略。通过基因工程，人工诱导特定氨基酸序列在抗体中表达，这些序列可被某些酶识别，随后特定的氨基酸残基被酶修饰，以实现位点特异性结合。利用PNGase F (Peptide-N-Glycosidase F)对抗体进行去糖基化处理，使其暴露出295位谷氨酰胺(Q295)，其可被微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase，MTG)催化与含有氨基的底物反应，用于位点特异性的抗体修饰。辉瑞Edmund Graziani课题组利用含有Q295和工程化Cys的抗体分步构建含有BODIPY和Cy5.5的荧光抗体；此外，该课题组利用Trastuzumab A114C经木瓜蛋白酶切割得到含有工程化Cys的Fab，经过初次还原氧化使引入的Cys暴露出来，与mcVC-PABC_Aur-0101偶联，其产物再次还原打开Fab间的二硫键，暴露出的巯基与mc_Aur-0131偶联，该产物在体外N87细胞中的IC50为37−43 ng/mL，表现出优异的细胞毒性[41]。上述方法构建双载荷ADC类似物使用不同的偶联位点，康奈尔大学Christopher A. Alabi课题组仅利用抗体中的Q295作为反应位点，经MTG酶催化将含有-N3和-Tetrazine的双功能底物引入Trastuzumab中，通过正交反应一锅法引入MMAE和聚乙二醇(PEG)侧链，该类型的双载荷ADC药物在SKOV3细胞中表现出强大的体外活性(图12)[42]。 图12. MTG酶催化一锅法制备双载荷ADC类似物如何利用抗体Q295位点构建真正意义上的双载荷ADC成为目前研究的难点，德克萨斯大学休斯顿健康科学中心Kyoji Tsuchikama课题组通过引入含有点击化学反应基团的三臂Linker，构建含有MMAE+MMAF (4+2, DAR值)的双载荷ADC (图13. a)，同时也构建了DAR值为2+2、2+4的双载荷ADC，该类型的双载荷ADC的体内抗肿瘤活性要比单药联用效果好(图13. b-e)，可能对难治性、复发性乳腺癌或其他肿瘤有一定的治疗优势[43]。 图13. 利用三臂Linker构建双载荷ADC及其活性评价同样利用酶辅助偶联的方法，比勒费尔德大学Kristian M. Müller课题组及其合作者利用甲酰甘氨酸生成酶(Formylglycine-Generating Enzyme, FGE[44])在scFv425-Fc上引入醛基，将含有双反应基团的Linker引入到scFv中，经后续反应得到含有PEGylation修饰和MMAE的双载荷ADC类似物，其在人鳞癌来源的A431细胞中展现出亚纳摩尔细胞毒性(图14左)[45]；弗罗茨瓦夫大学Jacek Otlewski课题组利用人成纤维细胞生长因子2 (human fibroblast growth factor 2, FGF2)作为靶向蛋白进行偶联，而不是对抗体进行改造；利用分选酶-A (Sortase-A)介导的连接反应在FGF2上引入MMAE和α-鹅膏菌素(α-AMTN)，该种双载荷偶联物比单载荷偶联物对成纤维细胞生长因子受体阳性细胞系表现出更高的细胞毒效力(图14右)[46]。 图14. 酶辅助偶联方法构建双载荷ADC类似物总结起来，双载荷ADC及其类似物的构建：一种是利用两个反应位点分步进行构建；另一种就是利用单一反应位点引入分支Linker，再通过点击化学组装细胞毒性药物。虽然双载荷ADC构建方法目前已经较为成熟，但其药动药代方面的方面任重道远。免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表个人立场，亦不代表个人支持或反对文中观点。本文并非治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 主要参考文献 1. Fu, Z., et al., Antibody drug conjugate: the "biological missile" for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther, 2022. 7(1): p. 93.2. Mair, M.J., et al., Understanding the activity of antibody-drug conjugates in primary and secondary brain tumours. Nat Rev Clin Oncol, 2023.3. Ackerman, S.E., et al., Immune-stimulating antibody conjugates elicit robust myeloid activation and durable antitumor immunity. Nature Cancer, 2021. 2(1): p. 18-33.4. He, L., et al., Immune Modulating Antibody-Drug Conjugate (IM-ADC) for Cancer Immunotherapy. J Med Chem, 2021. 64(21): p. 15716-15726.5. Marei, H., et al., Antibody targeting of E3 ubiquitin ligases for receptor degradation. Nature, 2022. 610(7930): p. 182-189.6. Banik, S.M., et al., Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins. Nature, 2020. 584(7820): p. 291-297.7. Walsh, S.J., et al., Site-selective modification strategies in antibody-drug conjugates. Chem Soc Rev, 2021. 50(2): p. 1305-1353.8. Hoyle, C.E. and C.N. Bowman, Thiol–ene click chemistry. Angewandte Chemie International Edition, 2010. 49(9): p. 1540-1573.9. Junutula, J.R., et al., Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature biotechnology, 2008. 26(8): p. 925-932.10. Das, S., et al., Novel IgG1 Cysteine Insertion Sites Enable Site-Specific Conjugation and Precise Control of Drug to Antibody Ratio, in Antibody Engineering & Therapeutics Conference. December 5, 2022.11. Coumans, R.G.E., Dual conjugation process for preparing antibody-drug conjugates. 2018, Synthon Biopharmaceuticals B.V.12. Levengood, M.R., et al., Orthogonal Cysteine Protection Enables Homogeneous Multi-Drug Antibody-Drug Conjugates. Angew Chem Int Ed Engl, 2017. 56(3): p. 733-737.13. Kumar, A., et al., Synthesis of a heterotrifunctional linker for the site-specific preparation of antibody-drug conjugates with two distinct warheads. Bioorg Med Chem Lett, 2018. 28(23-24): p. 3617-3621.14. Walsh, S.J., et al., General dual functionalisation of biomacromolecules via a cysteine bridging strategy. Org Biomol Chem, 2020. 18(22): p. 4224-4230.15. Handula, M., K.T. Chen, and Y. Seimbille, IEDDA: An Attractive Bioorthogonal Reaction for Biomedical Applications. Molecules, 2021. 26(15).16. Ramsubhag, R.R. and G.B. Dudley, Orthogonal dual-click diyne for CuAAC and/or SPAAC couplings. Org Biomol Chem, 2016. 14(22): p. 5028-31.17. Hanby, A.R., et al., Antibody dual-functionalisation enabled through a modular divinylpyrimidine disulfide rebridging strategy. Chem Commun (Camb), 2022. 58(67): p. 9401-9404.18. Zhang, S., et al., A novel anti-DR5 antibody-drug conjugate possesses a high-potential therapeutic efficacy for leukemia and solid tumors. Theranostics, 2019. 9(18): p. 5412.19. Huang, C., et al., Covalent linkers in antibody-drug conjugates and methods of making and using the same. 2018, RC Biotechnologies, Inc.20. Coumans, R.G.E. and H.J. Spijker, Selective reduction of cysteine-engineered antibodies. 2017, Synthon Biopharmaceuticals B.V.21. Thoreau, F., et al., Enabling the formation of native mAb, Fab' and Fc-conjugates using a bis-disulfide bridging reagent to achieve tunable payload-to-antibody ratios (PARs). Chem Sci, 2023. 14(14): p. 3752-3762.22. Maruani, A., et al., A plug-and-play approach to antibody-based therapeutics via a chemoselective dual click strategy. Nat Commun, 2015. 6: p. 6645.23. Nilchan, N., et al., Dual-mechanistic antibody-drug conjugate via site-specific selenocysteine/cysteine conjugation. Antib Ther, 2019. 2(4): p. 71-78.24. Li, X., et al., Stable and potent selenomab-drug conjugates. Cell chemical biology, 2017. 24(4): p. 433-442. e6.25. Tumey, L.N., et al., Site selection: a case study in the identification of optimal cysteine engineered antibody drug conjugates. The AAPS journal, 2017. 19: p. 1123-1135.26. Novak, A., et al., N-terminal cysteine as minimalistic handle for dual, site-selective bioconjugation: application to an anti-HER2 affibody reveals synergy of two conjugated drugs. 2023.27. Manandhar, M., E. Chun, and F.E. Romesberg, Genetic code expansion: inception, development, commercialization. Journal of the American Chemical Society, 2021. 143(13): p. 4859-4878.28. Osgood, A.O., et al., An Efficient Opal-Suppressor Tryptophanyl Pair Creates New Routes for Simultaneously Incorporating up to Three Distinct Noncanonical Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl, 2023. 62(19): p. e202219269.29. Zheng, Y., et al., Expanding the scope of single-and double-noncanonical amino acid mutagenesis in mammalian cells using orthogonal polyspecific leucyl-tRNA synthetases. Biochemistry, 2018. 57(4): p. 441-445.30. Holte, D., et al., Evaluation of PNU-159682 antibody drug conjugates (ADCs). Bioorg Med Chem Lett, 2020. 30(24): p. 127640.31. Addy, P.S., et al., A chemoselective rapid azo-coupling reaction (CRACR) for unclickable bioconjugation. Journal of the American Chemical Society, 2017. 139(34): p. 11670-11673.32. Wang, Y., et al., Noncanonical amino acids as doubly bio-orthogonal handles for one-pot preparation of protein multiconjugates. Nat Commun, 2023. 14(1): p. 974.33. Zhang, L., et al., A Simple and Efficient Method to Generate Dual Site-Specific Conjugation ADCs with Cysteine Residue and an Unnatural Amino Acid. Bioconjug Chem, 2021. 32(6): p. 1094-1104.34. Hallam, T.J. and V.V. Smider, Unnatural amino acids in novel antibody conjugates. Future Med Chem, 2014. 6(11): p. 1309-24.35. Hallam, T.J., et al., Antibody conjugates with unnatural amino acids. Mol Pharm, 2015. 12(6): p. 1848-62.36. Li, C., et al., Site-Selective Chemoenzymatic Modification on the Core Fucose of an Antibody Enhances Its Fcgamma Receptor Affinity and ADCC Activity. J Am Chem Soc, 2021. 143(20): p. 7828-7838.37. Tang, F., L.X. Wang, and W. Huang, Chemoenzymatic synthesis of glycoengineered IgG antibodies and glycosite-specific antibody-drug conjugates. Nat Protoc, 2017. 12(8): p. 1702-1721.38. Shi, W., et al., One-step synthesis of site-specific antibody-drug conjugates by reprograming IgG glycoengineering with LacNAc-based substrates. Acta Pharm Sin B, 2022. 12(5): p. 2417-2428.39. Tang, F., et al., One-pot N-glycosylation remodeling of IgG with non-natural sialylglycopeptides enables glycosite-specific and dual-payload antibody-drug conjugates. Org Biomol Chem, 2016. 14(40): p. 9501-9518.40. Tang, C., et al., One-Pot Assembly of Dual-Site-Specific Antibody-Drug Conjugates via Glycan Remodeling and Affinity-Directed Traceless Conjugation. Bioconjug Chem, 2023.41. Puthenveetil, S., et al., Development of Solid-Phase Site-Specific Conjugation and Its Application toward Generation of Dual Labeled Antibody and Fab Drug Conjugates. Bioconjug Chem, 2016. 27(4): p. 1030-9.42. Walker, J.A., et al., Substrate Design Enables Heterobifunctional, Dual "Click" Antibody Modification via Microbial Transglutaminase. Bioconjug Chem, 2019. 30(9): p. 2452-2457.43. Yamazaki, C.M., et al., Antibody-drug conjugates with dual payloads for combating breast tumor heterogeneity and drug resistance. Nat Commun, 2021. 12(1): p. 3528.44. Wu, Y., et al., Mechanistic Insight into Peptidyl-Cysteine Oxidation by the Copper-Dependent Formylglycine-Generating Enzyme. Angew Chem Int Ed Engl, 2023. 62(7): p. e202212053.45. Karsten, L., et al., Bivalent EGFR-Targeting DARPin-MMAE Conjugates. Int J Mol Sci, 2022. 23(5).46. Krzyscik, M.A., L. Opalinski, and J. Otlewski, Novel Method for Preparation of Site-Specific, Stoichiometric-Controlled Dual Warhead Conjugate of FGF2 via Dimerization Employing Sortase A-Mediated Ligation. Mol Pharm, 2019. 16(8): p. 3588-3599.关联推荐  ▼