H5N1 influenza vaccine(The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute)

中文摘要流感是由流感病毒引发的急性呼吸道传染病，每年可引起季节性流行。疫苗接种是预防和控制流感流行和大流行期间病毒感染的主要方法，目前流感疫苗生产主要仍依赖鸡胚培养技术，但近年来，使用动物细胞基质代替鸡胚培养已成为流感疫苗技术创新的重要趋势。随着贴壁培养及无血清全悬浮培养等培养技术在生物制药领域的发展，已有多种动物细胞系用于流感疫苗生产。此文简要综述近年来动物细胞培养技术在流感疫苗研发中的应用进展。正文流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病。流感病毒可分为甲、乙、丙、丁型，又可根据表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶划分为若干亚型，能够通过适应性突变和基因重组突破种属屏障获得跨宿主传播[1]，曾在世界范围内引起5次有记录的大流行和每年重复的季节性流行，对全球经济和公共卫生都造成了严重的影响[2]。特别是近年来不断出现感染人类的高致病性禽流感病毒H5N1、H7N9等的流行，给人们敲响了警钟[3]。接种流感疫苗是预防流感病毒感染、降低发病率和死亡率最有效的策略之一。目前流感疫苗的生产仍主要采用传统鸡胚培养，该工艺成熟稳定，但过于依赖鸡胚的持续稳定供应，且培养周期长，难以满足流感大流行期间激增的疫苗需求，最重要的是，流感病毒在鸡胚传代适应过程中积累的突变会改变抗原性，可能降低疫苗的有效性[4]。此外，某些毒株如H3N2在鸡胚中复制效率不高、某些高致病性禽流感毒株对鸡胚具有致死性等因素也影响了疫苗的产量[5]。已有多项研究比较了基于动物细胞培养和鸡胚培养生产的流感疫苗效力结果，尽管存在样本量较小、未进行多个季节研究等不同缺陷，因而无法形成全面的判断，但仍可以看出，基于细胞培养的流感疫苗效力非劣效于鸡胚培养[6]。有研究发现细胞培养的流感病毒所有代次均未观察到抗原突变，而用鸡胚培养时，HA受体结合位点附近发生了氨基酸突变，因此利用细胞培养技术生产流感疫苗流行株突变的风险较低，生产的疫苗更安全有效[7]。此外，细胞培养不依赖诸如鸡胚等原料的供应和质量控制，具有更大的灵活性和可扩展性[8]，因此利用动物细胞培养技术快速生产流感疫苗仍逐渐成为一种有吸引力的选择。本文简要综述近年来动物细胞培养技术在流感疫苗研发中的应用进展。1动物细胞培养技术1.1贴壁培养贴壁培养主要适用于具有贴壁依赖性的细胞，细胞体外培养时需贴附于玻璃或塑料等无活性物质的表面生长，随着细胞数量不断增长，生长空间越来越小，营养环境恶化，会出现接触抑制[9]。细胞贴壁培养的放大可选择转瓶、细胞工厂等[10]，但二维细胞培养存在表面积与体积比低、培养参数难以监测等缺陷，可引入兼具贴壁培养和悬浮培养优势的微载体，在相对较小的培养体积中实现较高的细胞密度[11]。微载体带有适当电荷，细胞通过细胞膜与带电基质作用而黏附于其表面，以悬浮状态在搅拌槽生物反应器或其他支撑系统中生长，增加培养面积的同时获得均一的培养条件，实现了贴壁细胞培养的自动化可控管理[12]。1.2悬浮培养悬浮适应细胞、肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞在体外培养时不需要附着物，可悬浮于液体培养基中大量增殖。悬浮培养可借鉴微生物发酵的理论和经验，易于自动化操作，细胞传代培养只需新鲜培养基按比例稀释，是动物细胞大规模培养的理想模式。实现规模化悬浮培养的关键技术主要有4点：贴壁细胞的驯化改造，个性化培养基的研制，生物反应器及培养工艺的选择优化[13]。细胞驯化过程中一般通过逐渐降低培养基中血清浓度来保持细胞的稳定性，细胞的活力需维持在90%以上[14]。血清可为细胞生长提供营养物质，但也存在成本较高、批次间质量不稳定、成分不清晰、潜在微生物或致病因子污染、不利于下游纯化等问题[15]，在动物细胞悬浮培养过程中一般根据细胞营养需求采用个性化的无血清人工合成培养基。生物反应器作为悬浮培养的关键设备，有搅拌式、气升式、中空纤维式、波浪式、一次性、流化床、固定床、堆积床等类型，在实际生产过程中应结合各方面因素进行选择[16]。培养工艺有分批式培养、流加式培养、半连续式培养、连续式培养、灌流式培养等，可根据细胞生长特性及培养产物性质不同择优选择[17]。2动物细胞培养技术在流感疫苗研发中的应用2.1Madin-Darby 犬肾（Madin-Darby canine kidney，MDCK）细胞悬浮培养技术MDCK细胞系是从犬肾脏组织中分离培养获得的上皮样细胞，该细胞同时含有α-2，6-和α-2，3-连接的唾液酸受体，可以高效地支持人和禽流感病毒的感染和增殖，被广泛应用于流感病毒分离和疫苗生产研究[18]。目前已有基于MDCK细胞培养的成熟产品获得监管机构批准，如瑞士Novartis公司的Optaflu和Celtura疫苗，前者是含2株A型和1株B型流感病毒的三价疫苗，后者是含MF59佐剂的H1N1大流行流感疫苗；另外澳大利亚Seqirus公司的四价流感疫苗Flucelvax也是利用MDCK细胞培养技术生产的[19]。Tzeng等[20]将利用反向遗传技术构建的重组病毒接种到悬浮MDCK细胞中，发现病毒产量高于贴壁MDCK细胞中的产量，可能是因为重组病毒适应悬浮MDCK细胞的过程中，HA发生了促进病毒的生长的N-糖基化。Nakamura等[21]也发现在悬浮MDCK和贴壁MDCK细胞中扩增的流感病毒株之间氨基酸替换模式和抗原特性有很大差异，可能是不同培养条件下两种细胞系表面蛋白表达和糖基化不同所致。悬浮培养避免了细胞生长面的限制且易于实现大规模生产，悬浮MDCK细胞主要是通过无血清驯化培养获得，传统的驯化过程主要是贴壁细胞悬浮驯化、无血清驯化、生物反应器高密度驯化三步法[17]，费时又费力。Ye等[22]发现一些与细胞黏附相关的蛋白如钙黏蛋白1在贴壁MDCK细胞中的表达明显高于悬浮MDCK细胞，且在转录水平上进一步验证了这些蛋白在悬浮MDCK细胞中表达的降低，也就是说这些蛋白或可作为基因工程修饰靶点以建立稳定的MDCK悬浮细胞系。某些流感病毒在MDCK细胞中的复制效率较低，除了通过经典重组或反向遗传学构建高产且稳定性好的疫苗株以外，还可对细胞进行修饰来提高产量。如MDCK-SIAT1细胞系是通过人α-2，6-唾液酸转移的cDNA稳定转染MDCK细胞而获得的，高表达的α-2，6-连接唾液酸受体使其更适合临床流感样本的分离或扩增；而英国索尔兹伯里普通感冒实验室构建的MDCK-London细胞系生长速度更快，且对多种流感病毒株都很敏感[23]。Wen等[24]建立了 2个稳定表达人呼吸道跨膜丝氨酸蛋白水解酶的细胞系MDCK-TMPRSS2和MDCK-MSPL，能够自行水解病毒表面HA，将其切割成HA1和HA2亚基，进而介导病毒与细胞的受体结合及膜融合，支持H5和H9亚型禽流感病毒在无甲苯磺酰-苯丙氨酰氯甲基酮（tosyl-phenylalanine chloromethyl-ketone，TPCK)-胰蛋白酶（胰酶）的情况下多周期生长，且病毒滴度与外加TPCK-胰酶在MDCK细胞中生长的病毒滴度相当。郭寿清等[25]构建了组织转谷氨酰胺酶2 （transglutaminase 2，TGM2）过表达和敲除的MDCK稳定细胞系，探究TGM2对甲型H1N1流感病毒在MDCK细胞中增殖的影响，结果显示敲除TGM2基因可上调病毒核蛋白（nucleoprotein，NP）基因的表达，且病毒滴度显著增加。2.2Vero细胞微载体悬浮培养技术Vero细胞系是从健康成年非洲绿猴肾脏中分离培养而建立的上皮细胞，用于人类疫苗如脊髓灰质炎和狂犬病疫苗生产已有很长的历史，并被WHO推荐用于流感疫苗生产，其优点在于生长增殖快、遗传性状稳定、安全性好[26]。美国Baxter公司开发的基于Vero细胞培养的H5N1单价流感疫苗Celvapan于2009年获得欧洲批准，生产的另一款Vero细胞三价(H1N1、H3N2、B型)季节性流感灭活疫苗Preflucel于2010年获得欧洲批准[19]。Vero细胞是一种贴壁依赖性细胞，早期主要通过转瓶培养进行规模化生产，后来通过兼具贴壁和悬浮培养优点的微载体技术实现大规模高密度培养，目前主要采用生物反应器低血清微载体悬浮培养技术，以传统培养基为基础，在Vero细胞驯化过程中，逐步减少血清含量并添加一定量低成本且安全性高的血清替代物，在不影响细胞生长增殖的情况下大大降低了成本[27]。一些Vero细胞的无血清悬浮培养研究也在进行，如Alfano等[28]利用重组人转铁蛋白和重组人白蛋白取代胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的蛋白质组分来配制一种化学成分明确的无血清培养基OptiVERO并进行了优化，使Vero细胞在该培养基中的生长繁殖和病毒的增殖能力与在含10%FBS的EMEM培养基中基本一致。Vero细胞对多种病毒易感，接种后可得到大量扩增的病毒。研究发现，这是因为该细胞在病毒感染后无法表达可阻碍病毒复制的干扰素所致[29]，其细胞凋亡和诱导抗病毒免疫状态可能与能产生干扰素的MDCK细胞有所不同。流感病毒非结构蛋白（non-structural protein 1，NS1）可作为一种干扰素拮抗剂，可以拮抗视黄酸诱导基因蛋白I介导的I型干扰素的产生，NS1基因突变或截短的流感病毒缺乏对干扰素信号通路的抑制，可以在干扰素缺乏的Vero细胞中高效复制增殖[30]。与MDCK细胞相比，Vero细胞表面α-2，6-连接唾液酸受体相对较少，对某些流感病毒的敏感性较低，可通过筛选适应Vero细胞的高产流感病毒株或通过改造细胞来提高病毒产量。Zhou等[31]利用Vero细胞筛选出3株高产重组流感病毒，并均可以保持原始野生型流感病毒的免疫原性，通过鸡胚、小鼠、豚鼠和雪貂的生物安全性评价，所有重组病毒均为低毒力株。II型跨膜蛋白BST-2是一种宿主限制因子，能够抑制各种被包裹的病毒从感染的宿主细胞中出芽，Yi等[32]建立了BST-2基因缺陷的Vero细胞系以增加细胞培养中流感病毒颗粒的释放，与未改造的Vero细胞相比，其释放的病毒颗粒至少增加了2倍，最多可增加50倍。2.3PER.C6细胞悬浮培养技术PER.C6细胞系是通过转染人5型腺病毒E1基因而永生化的人胚胎视网膜上皮细胞系，在没有血清和微载体的情况下也可以在大型生物反应器中悬浮生长至高密度。因为细胞表面同时含有α-2，6-和α-2，3-连接的唾液酸受体，所以对多种人、禽流感病毒株都很敏感[33]。来自临床分离的人流感病毒包括那些不能在鸡胚中复制增殖的分离株，在PER.C6细胞中扩增不会诱导适应性突变，与所选择的临床分离株的抗原完全匹配，因此PER.C6细胞是制备流感疫苗毒种和大规模生产流感疫苗非常合适的底物[34]。Koudstaal等[35]利用反向遗传学通过不同的转染方法在PER.C6细胞中构建了多株重组流感病毒，将含有A/HK/156/97（H5N1）的HA和神经氨酸酶片段的重组体作为疫苗毒种生产全病毒灭活疫苗，疫苗的有效性结果显示，可以保护小鼠免受致死量的同源毒株攻击。Cox等[36]开发了第一个基于PER.C6细胞培养的人用候选H7N1流感大流行裂解疫苗，Ⅰ期剂量递增临床试验评估表明，该疫苗具有良好的安全性和耐受性，但是辅以氢氧化铝佐剂依旧只能诱导较低的免疫应答，有效性不符合欧盟人用药品委员会的标准。2.4其他细胞培养技术目前，除MDCK、Vero、PER.C6细胞在美国和欧盟国家已经获批可用于流感疫苗研发生产外，另一些细胞系也被提议用作生产流感疫苗的细胞基质。EB66细胞系来源于鸭胚胎干细胞，可以在无血清培养基中全悬浮培养，其细胞密度和产物表达量都较高，已被广泛用于生产人类和禽类的治疗性药物和疫苗[37]。Endo等[38]开发了一种基于EB66细胞辅以AS03佐剂的H5N1流感疫苗，在Ⅰ期临床研究中确认该疫苗安全且耐受性良好，并引发了广泛的交叉抗体反应，Ⅱ期和Ⅲ期临床研究进一步评估表明，3.75 mg HA + AS03佐剂耐受性好，免疫原性强，未见严重不良反应。DuckCelt-T17细胞系是利用转基因技术培育的一种新的禽类细胞系，该细胞系由鸭端粒酶逆转录酶组成型表达的原代鸭胚胎细胞培养而成，能在无血清条件下进行大规模悬浮培养。通过对感染条件的优化，大多数人、禽、猪流感病毒的毒株均能在DuckCelt-T17细胞系中扩增至高滴度[39]。AGE1.CR.pIX细胞系是通过将人5型腺病毒E1基因转染至鸭胚胎视网膜原代细胞而形成的永生化番鸭细胞，在无或低蛋白含量的无血清培养基中可以无限增殖。Folegatti等[40]开发了一种减毒的正痘病毒修饰的痘苗病毒安卡拉株（modified vaccinia virus Ankara，MVA）载体，用以表达高度保守的甲型流感病毒抗原NP和基质蛋白1（matrix protein-1，M1），并研发了基于AGE1.CR.pIX细胞悬浮培养的MVA-NP+M1通用流感疫苗，其安全性、耐受性、免疫原性均较好。Coussens等[41]介绍了 一种来源于永生化的鸡胚胎细胞系（PBS-1）的细胞，经过驯化适应无血清生长条件，命名为PBS-12SF。H1N1和H3N2人流感病毒以及重组H5N1流感病毒都可以在PBS-12SF细胞中扩增，病毒滴度与在MDCK、Vero细胞中扩增的滴度相当。此外，流感病毒在PBS-12SF细胞中不需要添加TPCK-胰酶即可复制增殖，从而减少污染的机会，并简化下游纯化过程。此外，昆虫细胞杆状病毒表达载体系统也可以用来生产流感疫苗，如2013年美国Protein Sciences公司获得FDA批准的Flublok流感疫苗便是利用这种系统生产的。先将expresSF+昆虫细胞在不含动物血清蛋白的培养基中悬浮培养至合适密度，然后感染插入流感病毒HA基因序列的重组杆状病毒，即可生产重组HA[42]。这一通用培养技术既可用于季节性流感疫苗的生产，也可用于大流行流感疫苗的生产,即便毒株快速突变，只需转换毒株HA的基因序列即可。3结语动物细胞培养技术生产流感疫苗表现出巨大优势，已被认为是新一代流感疫苗研发的主要方向，但该技术尚未完全成熟，各种培养方法都存在阻碍广泛应用的不足之处，还有优化和升级的空间。细胞株不同和培养条件存在差异，特别是从含血清培养基到无血清培养基的改变，可能会对细胞的特性产生重大影响。在长时间大规模人工培养过程中细胞群体的生理机能可能也会受到影响，如分泌和代谢能力的降低或丧失等。目前尚不清楚是否有特定动物细胞系在不改变其遗传和抗原特性的情况下扩增多种亚型流感病毒，有必要对细胞库进行检定测试，开发适合多种疫苗病毒株复制增殖的细胞底物。此外，动物细胞存在潜在病原体感染的风险，如呼吸道病毒、肠道病毒和疱疹病毒等，需要更严格的质量控制以确保细胞基质疫苗的安全性。动物细胞培养技术在未来发展中应注重优化细胞培养环境，改进细胞特性等，来扩大生产规模、提高疫苗产量。但仅采用某种特定的疫苗生产机制可能是不够的，特别是在大流行的情况下难以满足需求。除了基于鸡胚和细胞基质培养的经典疫苗外，对抗原结构设计、纳米颗粒、病毒载体等技术平台的部分或周期性依赖是不可避免的。作者彭婷1 综述    吴金妍2 审校1上海生物制品研究所有限责任公司第四研究室，上海  200051；2上海生物制品研究所有限责任公司合作部，上海  200051通信作者：吴金妍，Email：wujinyan1@sinopharm.com引用本文：彭婷，吴金妍. 动物细胞培养技术在流感疫苗研发中的应用进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(5):277-282.  DOI：10.3760/cma.j.cn311962-20220110-00003