ST-05

Engineering a hybrid chemical-biological system for efficient de novo taurine production via computational enzyme design and pathway engineering 文章信息：Li L, Li C, Chen Y, et al. Engineering a hybrid chemical-biological system for efficient de novo taurine production via computational enzyme design and pathway engineering[J]. Bioresource Technology, 2026: 134466. (IF2025 9.0) 研究团队：Congcong Li, Ge Qu, Liang Wei, Jun Liu Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences; State Key Laboratory of Engineering Biology for Low-Carbon Manufacturing, Tianjin 300308, China 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2026.134466 研究要点 牛磺酸是一种重要的含硫非蛋白氨基酸，广泛应用于食品、医药和饲料工业。当前工业主要依靠环境不友好的化学合成法生产，而微生物发酵虽具潜力，但受限于异源途径效率低、关键酶活性不足及前体供应有限，产量一直难以突破。 本研究在大肠杆菌中建立了高效的从头牛磺酸生物合成系统，整合途径工程、计算酶设计与化学-生物杂合策略：首先通过序列导向挖掘获得高效催化剂HcCDO（半胱氨酸双加氧酶）和AeCSAD（半胱氨酸亚磺酸脱羧酶）；针对AeCSAD催化瓶颈，采用"蛋白质语言模型（SaProt）+物理能量计算（FoldX）"双层级策略进行计算辅助改造，获得AeCSAD(T410P/T498W)突变体，活性较野生型提升3.19倍，催化效率（kcat/Km）提高4.25倍；为克服FMO1类酶在微生物宿主中溶解性差、活性低的问题，建立温和的H₂O₂驱动化学氧化模块，实现亚牛磺酸向牛磺酸的快速定量转化；同时通过多层代谢重编程协调碳代谢与硫同化模块，解除CysE反馈抑制并优化硫代硫酸盐利用途径，显著提升胞内半胱氨酸供应。 最终在5 L发酵罐补料分批发酵中，耦合优化生物合成途径与发酵后化学氧化，实现牛磺酸产量4.08 g/L，为目前报道的生物合成法最高产量。该研究为含磺酸类化合物的可持续制造提供了通用技术框架。 计算酶设计新范式：首创"蛋白质语言模型（SaProt）零样本预测 + FoldX物理能量计算"双层级计算蛋白工程策略，将突变体筛选范围从理论饱和突变库的数千个压缩至21个高置信度位点，高效获得远端变构激活突变体，为PLP依赖型酶的理性改造提供新思路。 化学-生物杂合系统突破：首次采用H₂O₂化学氧化替代传统FMO1酶催化步骤，解决哺乳动物膜结合单加氧酶在原核宿主中表达困难、易形成包涵体的瓶颈，建立"生物合成前体 + 化学终端修饰"的杂合制造新模式，1小时内实现亚牛磺酸100%转化率。 碳-硫代谢协调重编程：创新性解构半胱氨酸合成为"碳模块"（丝氨酸合成）与"硫模块"（硫代硫酸盐同化），通过启动子与RBS梯度工程精细调控两模块通量，避免活性硫中间体（硫化物、过硫化物）积累导致的细胞毒性，实现前体供应与产物合成的平衡。 序列导向的酶资源挖掘：基于系统发育分析与HMM搜索，从真菌（荚膜组织胞浆菌）和昆虫（埃及伊蚊）中挖掘获得HcCDO和AeCSAD，突破哺乳动物酶在微生物宿主中可溶性表达差、活性低的限制，其中HcCDO活性较人源酶高7.04倍。 变构机制的结构解析：通过分子动力学模拟揭示T410P/T498W突变通过长程变构效应（long-range allosteric effects）调控催化位点：T498W通过烷基-π相互作用稳定β-折叠并重塑底物氢键网络；T410P通过脯氨酸刚性约束稳定含催化残基Y400的α-螺旋，优化醌类中间体质子化几何构型，为理解PLP酶远端调控机制提供新见解。 图表解读 Fig. 1 工程化化学-生物杂合系统示意图 从葡萄糖到牛磺酸的完整代谢网络设计与策略布局。图中以不同颜色箭头区分代谢改造类型：红色粗箭头表示基因过表达（如serA、serC、serB、cysE、cysM、nrdH、cdo、csad）；红色"X"符号表示基因敲除（如tnaA、yhaM、sdaA、tauD）；红色剪刀符号表示反馈抑制解除（如抗性突变serA*、cysE*）。绿色圆角框突出显示H₂O₂介导的化学氧化模块，替代传统FMO1酶催化步骤。 硫源策略：左侧显示硫代硫酸盐（Thiosulfate）通过CysM-NrdH途径（橙色箭头）进入半胱氨酸合成，绕过能量消耗大的硫酸盐还原途径（常规需消耗~15 ATP，硫代硫酸盐途径仅需~5 ATP）。 碳流路径：3-磷酸甘油酸（3-PG）经SerA-SerC-SerB途径流向丝氨酸，与中心TCA循环解耦，减少碳流竞争。 区室化示意：中央嵌入工程化CSAD的三维结构模型，强调酶工程在途径中的核心地位。 该图直观呈现了"上游前体供应优化（碳-硫模块）→ 中游异源途径重构（CDO/CSAD）→ 下游终端氧化替代（化学模块）"的系统工程逻辑，为后续实验设计提供路线图。 Fig. 2 半胱氨酸双加氧酶（CDO）与半胱氨酸亚磺酸脱羧酶（CSAD）的筛选与功能表征 Fig. 2a & 2d（系统发育树）： 基于PF05995结构域隐马尔可夫模型（HMM）和BLASTP序列比对构建的CDO与CSAD系统发育树，展示候选酶跨越真菌（如Histoplasma capsulatum）、哺乳动物（Homo sapiens、Rattus norvegicus）、昆虫（Aedes aegypti、Tribolium castaneum）及细菌（Bacillus spp.）的多样性。红色星标标记本研究最终选择的HcCDO和AeCSAD。 Fig. 2b & 2e（酶活性比较）： 柱状图显示纯化酶的比活力（Specific Activity）。HcCDO（来自荚膜组织胞浆菌）活性达5.77 U/mg，较人源HsCDO（0.82 U/mg）提高7.04倍；AeCSAD（来自埃及伊蚊）活性达7.42 U/mg，较人源HsCSAD（0.85 U/mg）提高8.76倍，且可溶性表达显著改善（SDS-PAGE显示减少包涵体形成）。 Fig. 2c & 2f（全细胞转化时程曲线）： 不同CDO-CSAD组合在20 mM L-半胱氨酸底物下的代谢物积累动态： 对照组合（HsCDO+HsCSAD）：6小时仅积累0.94 mM CSA和0.15 mM亚牛磺酸，底物转化率5.45%；24小时CSA积累3.46 mM，亚牛磺酸仅0.51 mM，显示严重瓶颈。 优化组合（HcCDO+HsCSAD）：6小时CSA达17.22 mM（提升17.32倍），但亚牛磺酸仅0.31 mM，提示CSAD为下游瓶颈。 最优组合（HcCDO+AeCSAD）：24小时亚牛磺酸达7.91 mM，较对照提升3.57倍，但仍有10.67 mM CSA残留，表明需进一步改造CSAD以解除瓶颈。 通过跨物种酶挖掘突破哺乳动物酶在微生物宿主中的表达限制，定量识别途径瓶颈（CSAD步骤），为后续计算酶工程提供明确靶点。 Fig. 3 计算辅助蛋白工程工作流程与突变体筛选 Fig. 3a（工作流程示意图）： "双层级"计算策略：第一层级使用SaProt（基于结构感知的蛋白质语言模型）进行全序列单点饱和突变预测，输出适合度分数（Fitness Score）；第二层级使用FoldX对SaProt筛选出的51个高频位点进行ΔΔG计算，评估热力学稳定性。两者交集（A∩B）产生21个高置信度突变体进入实验验证。 Fig. 3b & 3c（热图分析）： SaProt热图：显示所有残基位点（x轴）替换为20种氨基酸（y轴）的Log似然比（LLR）分数，红色区域表示预测活性提升，蓝色表示降低。可见T410、T498等位点存在高评分突变（如T410P、T498W）。 FoldX热图：显示51个优先位点的ΔΔG值分布，绿色表示稳定化突变（ΔΔG < 0），红色表示去稳定化。两图交集筛选出既提升活性又保持稳定的突变。 Fig. 3d（位点频率分布）： 环形图展示SaProt（红色柱）与FoldX（蓝色柱）共同识别的关键残基位点，包括T410、T498、Q115、Y152等，这些位点位于活性口袋远端（>10 Å），暗示变构调控机制。 该图验证了"AI+物理"双模型筛选可高效压缩突变体库（从~10,000个理论突变压缩至21个），命中率显著提高，为远端变构位点挖掘提供可复现的计算流程。 Fig. 4 AeCSAD突变体功能表征与变构机制解析 Fig. 4a & 4b（突变体活性验证）： 单点突变：T410P活性最高（13.03 U/mg），较野生型（WT，7.42 U/mg）提升1.8倍；其他如Q115L、Y152R也有适度提升。 组合突变：在T410P背景上叠加第二突变，T410P/T498W双突变体活性达23.66 U/mg，提升3.19倍，动力学参数显示kcat从20.7 s⁻¹提升至73.8 s⁻¹（3.56倍），Km基本不变（7.07→7.57 mM），催化效率（kcat/Km）提升4.25倍。 Fig. 4c（全细胞转化验证）： 表达HcCDO与AeCSAD(T410P/T498W)的菌株在20 mM半胱氨酸条件下，6小时积累12.85 mM亚牛磺酸（较HsCSAD对照提升39.92倍），12小时达18.97 mM；CSA残留降至4.33 mM（降低74.85%），证实改造显著解除途径瓶颈。 Fig. 4d-f（分子动力学机制解析）： Fig. 4d（相互作用网络）：突变位点（T410、T498）通过长程路径（黑色箭头）与活性中心关键残基（Y400、R533、D413）的通讯网络。 Fig. 4e（T498W机制）：突变后W498与K528/P529形成烷基-π相互作用（距离4.4-5.8 Å），稳定β-折叠片，使R533与底物PLP-CSA复合物形成更强氢键（距离缩短），优化底物结合几何。 Fig. 4f（T410P机制）：脯氨酸的刚性约束稳定含催化残基Y400的α-螺旋，使Y400与D413距离从21.3 Å缩短至4.5 Å，促进醌类中间体的质子化，加速催化周转。 首次揭示CSAD远端变构调控机制，证明"动态变构"（通过稳定二级结构重塑活性位点微环境）可显著提升PLP依赖型酶催化效率，为同类酶改造提供范式。 Fig. 5 碳代谢与硫同化模块重编程 Fig. 5a（代谢策略示意图）： 三种底盘菌株（SC-JM109、SC-BW25113、SC-W3110）的构建策略：敲除tnaA（色氨酸酶）、yhaM（半胱氨酸脱巯基酶）、sdaA（丝氨酸脱氨酶）、tauD（牛磺酸双加氧酶），并整合反馈抗性serA*（解除丝氨酸抑制）与cysE*（L45Q/D250V，解除半胱氨酸抑制）。 Fig. 5b（底盘筛选）： 在含HcCDO与AeCSAD(T410P/T498W)的杂合系统中，ST-W3110表现最佳，牛磺酸产量252.25 mg/L，显著高于ST-JM109（149.66 mg/L）和ST-BW25113（220.60 mg/L），且无明显中间体积累，提示W3110遗传背景更适合硫代谢工程。 Fig. 5c（启动子工程）： 使用Anderson启动子库构建CysE-CysM-NrdH表达强度梯度：Ptrc（强，ST-01）、PJ23106（中，ST-02）、PJ23105（弱，ST-03）。ST-01产量最高（485.86 mg/L），较对照提升92.61%，证实强表达有利于前体供应；但过强表达（ST-01）伴随细胞生长抑制（OD₆₀₀降低）。 Fig. 5d（RBS工程平衡碳硫流）： 使用B0034（强，H）与B0032（中，M）RBS组合优化三基因表达比例。最优组合CysE(H)-CysM(M)-NrdH(H)（ST-07）产量达751.59 mg/L，较ST-01提升54.69%；而CysM过表达（H）会导致显著生长抑制（ST-05 OD₆₀₀仅~5），提示过量CysM产生活性硫中间体（硫化物、过硫化物）毒性。 Fig. 5e（丝氨酸模块强化）： 在ST-07基础上过表达serA、serC、serB（ST-13至ST-15）。ST-15（三基因共表达）表现最优，牛磺酸产量达969.16 mg/L，半胱氨酸积累70.96 mg/L，无CSA检出，表明碳流充分导向半胱氨酸合成。 系统展示"底盘筛选→启动子强度优化→RBS精细调谐→上游模块强化"的多层代谢重编程策略，揭示碳-硫代谢平衡对含硫氨基酸合成的关键作用，以及翻译水平调控（RBS）在避免代谢毒性中的重要性。 Fig. 6 补料分批发酵与化学氧化工艺 Fig. 6a（发酵-氧化工艺流程图）： 5 L发酵罐操作系统：工程菌分批发酵产亚牛磺酸→葡萄糖补料维持1-3 g/L→发酵终点通过蠕动泵控速加入20% H₂O₂（流速1.0 mL/min，摩尔比1:1.5）→温和搅拌（200 rpm）完成氧化。 Fig. 6b（发酵过程动力学）： 时间曲线显示ST-15在5 L罐中：0-28小时生物量（OD₆₀₀）持续增长至67.83；亚牛磺酸从12小时开始积累，48小时达峰值3.56 g/L；葡萄糖通过补料维持低浓度（<3 g/L），避免Crabtree效应。 Fig. 6c（副产物动态）： 半胱氨酸浓度在28小时达峰值0.64 g/L，随后下降（被转化为CSA及后续产物）；副产物β-丙氨酸（来自AeCSAD对天冬氨酸的脱羧）最终浓度0.32 g/L，占理论得率损失约8%；无CSA积累，显示途径通量顺畅。 Fig. 6d（化学氧化动力学）： H₂O₂控速添加后，亚牛磺酸浓度随时间下降，牛磺酸浓度上升：20分钟转化52.81%，60分钟实现100%完全转化，终产物牛磺酸浓度达4.08 g/L。LC-MS显示非选择性氧化极低，主要杂质为磺基丙氨酸（0.41 g/L，由残留半胱氨酸氧化产生）和甲硫氨酸亚砜（痕量）。 Fig. 6e（整体策略总结图）： 底部整合图展示五步策略：(1)途径构建→(2)序列导向酶挖掘→(3)计算辅助酶工程→(4)碳硫代谢平衡→(5)化学-生物杂合途径建立，形成从设计到应用的完整闭环。 证实杂合系统在放大规模下的稳定性与高效性，4.08 g/L产量为目前生物合成法报道最高值；化学氧化模块的定量转化特性（100%转化率，1小时完成）证明了化学-生物杂合制造在工业规模应用的可行性，为后续过程集成与经济性优化提供数据支撑。 启示与思考 "AI-物理"双模型驱动的酶工程范式确立 本研究展示的SaProt（蛋白质语言模型）与FoldX（物理力场）协同筛选策略，标志着酶工程从"随机突变-高通量筛选"向"理性设计-精准验证"的范式转移。特别是对于PLP依赖型脱羧酶这类活性位点高度保守、机制复杂的酶类，远端变构工程（distal allosteric engineering）比传统活性口袋改造更具潜力。T410P/T498W位点位于活性中心15 Å以外，却通过稳定二级结构元件实现kcat提升3.56倍，这提示我们应重新审视"保守残基"之外的结构空间。未来可引入AlphaFold3进行复合物动态预测，结合Rosetta酶设计算法探索双底物（CSA与PLP）协同识别机制，甚至开发针对PLP酶的专用变构预测工具。 化学-生物杂合制造的普适性框架 H₂O₂氧化策略的成功不仅解决了FMO1的表达难题，更重要的是建立了一种"生物合成高价值前体 + 化学选择性修饰"的通用范式。对于其他含磺酸、亚砜、氮氧化物等官能团的精细化学品（如磺胺类药物、牛磺胆酸、硫辛酸、蛋氨酸砜等），当生物催化的终端氧化步骤存在瓶颈时，可借鉴此策略。关键在于识别"生物-化学兼容窗口"：反应条件（pH 7.2、30°C、水相）需同时满足细胞存活（上游）和化学氧化（下游）的需求。未来可拓展至光催化-发酵杂合（利用光生H₂O₂原位氧化）或电化学-生物杂合（利用电极控制氧化还原态），实现更紧密的过程集成。 硫代谢网络精细调控的复杂性认知 研究揭示了硫代硫酸盐分流（thiosulfate shunt）在能量效率上的优势（减少~10 ATP消耗/分子半胱氨酸），但也暴露了活性硫物种（RSS/RSSPs）的代谢毒性。CysM过表达导致的生长抑制提示，静态强启动子并非最优解。这要求我们从"代谢流平衡"转向"代谢动力学平衡"，引入动态调控策略（如基于O-乙酰丝氨酸或硫化物浓度的核糖开关），实现硫供应与碳通量的实时匹配，避免氧化应激对细胞工厂的损伤。 声明：所载内容来源于互联网及业内人士投稿，微信公众号等公开渠道。文章仅供参考和交流。转载的稿件版权归原作者和机构所有。 01 ｜会议背景       酶作为高效、专一的生物催化剂，其核心在于精准的结构与功能机制。当前，酶技术已超越天然挖掘，进入“设计创造”时代。通过宏基因组学与高通量筛选，我们可发现新型酶资源；借助AlphaFold2等工具进行理性设计，能定向改造酶的活性、稳定性与特异性。      为实现工业应用，固定化技术为酶穿上“盔甲”，提升其重复使用性与稳定性，结合工艺优化与反应器设计，推动规模化生产。最终，这些技术汇聚于前沿应用：在食品工业创造新型风味酶，在医药领域实现手性精准合成，在绿色化工推动生物降解与能源转化，并与合成生物学、生物传感深度融合，开启从“发现酶”到“编程酶”的产业新纪元。为了紧跟产业链发展需求，加强人才建设，我单位决定于2026年4月24-26日在湖北武汉市举办第五期“新酶设计与酶技术应用专题培训班”。届时将邀请行业内知名专家安排授课分享，参会名额有限，望相关单位积极派员参加。具体安排如下： 02 ｜组织机构 主办单位：中科凯晟（北京）化工技术研究院 支持单位：中国科学院天津工业生物技术研究所、上海交通大学、武汉大学、华东理工大学、江南大学、河北工业大学、天津药物研究院有限公司、 贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司 03 ｜课程安排 会议地点 武汉（具体地点直接通知报名单位） 4月24日：全天报道 4月25日-26日：上午9：00-12：00，下午13：30-17：30培训课程 培训内容 模块一：酶学基础与工业酶概述 酶的结构、功能与催化机制 工业酶的分类、特性与应用领域 酶催化反应动力学与稳定性优化策略 模块二：新酶发现与筛选技术   宏基因组学与数据库挖掘技术 高通量筛选平台（微流控、液滴筛选等） 定向进化策略（易错PCR、基因重组等） 模块三：理性设计与计算酶学    蛋白结构预测与功能分析工具（AlphaFold2等） 计算机辅助酶设计（Rosetta、分子对接等） 活性位点工程与底物特异性改造 模块四：酶固定化与工艺优化    固定化方法（载体选择、交联技术） 酶反应器设计与规模化生产流程  工艺参数优化（pH、温度、溶剂工程） 模块五：前沿应用与案例分析  合成生物学中的酶模块构建 医药领域（手性合成、前体催化） 绿色化工（生物降解、生物燃料） 食品工业（风味酶、高效转化） 诊断与生物传感器中的酶技术 培训对象 1.生物技术与生物工程研发人员 2.工业生物技术与绿色化工从业者 3.生物医药与诊断试剂开发者 4.高校及科研院所师生 5.企业技术管理与战略规划人员 6.科技投资与产业分析人士 会议注册     2800元/人，同一单位两人以上报名 2600元/人，高校科研院所2200元/人（含会务费、资料费、会议期间中餐等）住宿统一安排，费用自理。 问题及报告征集 （截止到4月17日） 请在回执表问题征集栏填写您所关注及遇到的问题，以便讲师在备课时更具备针对性。 课程表 扫码可以直接提交报名：收到报名联系会务组联系您安排详细会务流程。 扫码咨询！！！                                        张立 18701692140