MB-002

大家好，今天分享一篇发表在Nature Communications上的文章：Selective CK1α degraders exert antiproliferative activity against a broad range of human cancer cell lines. 文章的通讯作者为美国圣犹达儿童研究医院（St. Jude Children's Research Hospital）的Marcus Fischer , Jeffery M. Klco 和 Zoran Rankovic 三位教授.酰亚胺类免疫调节药物（immunomodulatory imide drugs, IMiDs）：thalidomide, lenalidomide, 和pomalidomide最先被发现通过结合CRBN诱导蛋白降解来发挥药理作用。改变其特异性导致招募、泛素化和降解通常不被E3连接酶靶向的蛋白称为新底物 (Neosubstrate).转录因子IKZF1和IKZF3是首先发现的IMiDs的neosubstrates,这为IMiDs在多发性骨髓瘤中发挥药效提供了合理解释。随后,发现IMiDs会影响许多蛋白包括SALL44, ZBTB165, p636, ZFP917, ZNF827, RAB28, 和 RNF166的水平。有趣地是，lenalidomide是唯一一款能够诱导casein kinase 1A1 (CK1α)降解地IMiD，尽管表现出中等强度的降解活。然而，CK1α的降解为lenalidomide治疗骨髓增生异常的5q (del(5q))染色体缺失综合征（MDS）患者提供了独特临床疗效的机制基础。CK1α是一种普遍表达的胞质丝氨酸/苏氨酸激酶，参与Wnt/β-catenin 和 p53 信号传导的调节。在del(5q) MDS 中CK1α 杂合缺失(heterozygous loss)可稳定β-连环蛋白，驱动del(5q)克隆的自我更新，而纯合(homozygous loss) CK1α 丢失，如lenalidomide诱导降解所发生的情况,会诱导p53和选择性克隆停滞。同样有趣的是，用siRNA 沉默CK1α，可增强lenalidomide诱导的细胞凋亡和生长抑制，这就表明更有效的CK1α 降解剂可能会表现出更好的治疗效果。此外，CK1α对于AML 细胞在体外和体内的存活至关重要，CK1α抑制剂或敲低CK1α会抑制增殖和克隆形成，增强AML 细胞系和细胞系的自噬通量和细胞凋亡。除了MDS 和AML 之外，还发现CK1α促进淋巴瘤细胞以及多种固体细胞的存活肿瘤，例如肺癌、肾癌和结直肠癌，这表明能够影响CK1α水平或活性化合物具有广泛的潜在临床应用。表型筛选（Phenotypic screening）确定Hit compounds作者接下来针对9种小儿癌细胞系筛选了含有3630个化合物的分子胶。这9株细胞除了之前的MB002, MB004, HD-MB03, and MHHCALL-4), 还包括5株AML cell lines (MOLM-13, TF-1,HEL,OCI-AML3, and AML193。结果表明，lenalidomide和pomalidomide并不能杀死这些细胞（蓝色框），表明经典IMiD降解新底物对于这些细胞的生存能力并不是必需的。CC-88528和之前披露的GSPT 降解剂(SJ6986)对组中的所有细胞系均具有细胞毒性（黄色框，图 1a），与先前观察到的抗增殖作用一致。由于独特的细胞选择性特征和高。对 MOLM-13 细胞的毒性，作者选择化合物 SJ7095进一步分析（图1b）。CK1α, IKZF1 and IKZF3是SJ7095的主要targets, CK1α是癌症主要驱动因素由于 SJ7095 可以非常有效的抗MOLM-13细胞增殖，作者接下来研究观察到的抗增殖效果是否是CRBN依赖性的。在配体竞争实验中，40μM的lenalidomide可以消除SJ7095的抗增殖活性，在CRBN Knockout细胞中，SJ7095的活性也消失。这些结果表明，SJ7095 的抗增殖活性是CRBN-dependent.接下来，proteomics study结果表明，MOLM-13 cells 在经过5 μM SJ7095 处理4h后，在所有分析的9000多种蛋白中，只有CK1α, IKZF1, and IKZF3被显著降解。WB试验结果也表明SJ7095可以降解CK1α，其DC50为15 nM. 此外，作者也发现CK1α 的降解会伴随着 p21 的剂量依赖性上调，这与之前的研究一致，CK1α 失活导致 p21 依赖性细胞毒性。Demap数据的分析显示MOLM-13细胞高度依赖CK1α而对IKZF1 和IKZF3 CRISPR 敲除不太敏感. 重要的是，有效的IKZF1 降解剂，例如经典IMiD，最近开发的伊贝多胺(CC-220) 显示对 MOLM-13 细胞活力的影响非常小。基于这些观察，作者假SJ7095介导CK1α降解是产生细胞活力表型的主要驱动因素.此外，作者进一步验证了这个设想。高浓度下Lenalidomide对MOLM-13并没有表现出很强的细胞毒性. 100 nM的SJ7095 4小时几乎可以诱导CK1α完全降解，而Lenalidomide则需要1000倍以上的浓度和更长的时间。构效关系研究发现选择性CK1α 降解剂尽管SJ7095 非常有效的降解CK1α 和IKZF1/3, 作者更有兴趣开发选择性CK1α降解剂来研究其生物学功能，以及探索潜在的治疗方法。作者基于先前报道的lenalidomide与CRBN/DDB1 和 CK1α复合物晶体结构的研究,模拟了SJ7095与其复合体的结合模式，结果表明SJ7095的远端芳香基团与CRBN表面平齐，并与F150发生相互作用。作者假设这种额外的相互作用会导致CRBN 稳定性增加，从而使得三元复合物的稳定性更高，最终表现出比Lenalidomide更强的IKZF1 和CK1α 降解活性。重要的是,处于溶剂暴露区的邻苯二甲酰亚胺环的C7和CK1α N lobe 上 β-发夹环G40之间有着lenalidomide样作用外，化合物SJ7095仅与CRBN 建立联系。作者假设与新底物之间建立额外的稳定或不稳定接触可能显示不同的降解选择性曲线。具体来说，作者优先考虑C5 的取代来增加与CK1α的β-发夹环中残基的相互作用，而不干扰关键的C7 与G40相互作用.为了验证这个假设，作者合成了一系列在C5位置取代的衍生物，并在MOLM-13细胞进行了活性评价，化合物3甲基苯甲酰胺SJ0040的活性最好，抑制MOLM-13的IC50为 14 nM, CK1α的DC50为11 nM, Dmax为88%. 接下来的优化是将SJ0040的苯甲酰胺替换成不同的芳杂环生物等排体，化合物SH3149表现出最强的CK1α降解活性，DC50为3.7 nM，Dmax为95%。虽然SJ3149 (13 nM) 的 IC50 与 SJ0040 (14 nM) 相似，但 SJ3149 对 MOLM-13 细胞的活力产生更强的抑制。IKZF1 HiBiT (Jurkat cells)试验结果表明lenalidomide and the original hit, SJ7095可以有效降解IKZF1, DC50为 0.033 μM 和0.069 μM。但是，SJ0040和SJ3149 均未对 IKZF1 蛋白丰度产生明显影响（Dmax<10%），验证了优化策略。CK1α HiBit 实验结果表明，SJ3149表现出最强的CK1α degradation potency 和 rate (e, f), 但对CRBN的结合力下降了8倍（g）。作者解释了CRBN亲和力不能很好地预测降解能力，三元复合物稳定性是降解效率更好的预测指标。接下来一系列实验结果表明，所有化合物都诱导了与 CRBN 的三元复合物的形成（h）。值得注意的是，三元复合物形成的排名强烈反映了在降解率、Dmax 和效力方面观察到的趋势，其中 SJ3149 诱导的复合物最稳定。Proteomics study表明，在 1 μM 浓度下孵育 4 小时后，在超过 9000 种蛋白质中，SJ0040和 SJ3419 仅显著降低了 MOLM-13 细胞中 CK1α 。此外，在处理的细胞中检测到 p53、p21 和 b-catenin 水平的增加。为了进一步验证SJ3149介导CK1α的降解是细胞活性的原因，作者进行了G40N突变实验。含有G40N突变的细胞对SJ3149的敏感度大大降低，验证了SJ3149介导CK1α的降解是必须的。SJ3149表现出出广谱抗增殖活性后续的一系列实验表明，SJ3149对血液瘤和实体瘤都具有良好的抗增殖活性，而且SJ3149优先靶向具有野生型 TP53 和某些TP53 突变的细胞系，并与nutlin-3a 相比具有显著的效力和选择性差异。此外，作者对CK1α-CRBN-DDB1-SJ3149 四元复合物进行了晶体学研究，以及体内降解活性研究。总结：作者针对CRBN配体小分子库进行筛选，发现CK1α、IKZF1和 IKZF3 降解剂SJ7095。通过构效关系研究和理性设计，发现了SJ3149，一种选择性的、有效的CK1α蛋白的体外和体内降解剂，并对SJ3149 与 CK1α + CRBN + DDB1进行了晶体研究。SJ3149显示出广谱的抗增殖活性，对血液瘤和实体瘤都具有良好的抗增殖活性，而且SJ3149优先靶向具有野生型 TP53 和某些TP53 突变的细胞系，并与 nutlin-3a 相比具有显著的效力和选择性差异。这些发现表明选择性CK1α降解剂在治疗血液瘤和实体瘤具有很大的潜力。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓