HIV vaccine(Crucell Holdings, Inc.)

▲生物工艺人的年度盛会即将开启！内容概要  目前，重组蛋白大多以哺乳动物细胞培养工艺进行生产，速度、成本和安全是当今上下游工艺开发和优化的主要关注点。唯有通过细胞工程化改造、细胞培养工艺优化、化学成分明确培养基的开发以及对产品性质的严格监控，才能在有效提高产量和降低成本的基础上生产更加安全有效的药物。本文重点介绍了体内外细胞工程方法的应用、连续化生产等现代工艺的开发和优化、培养基开发进展和产品关键质量属性（PQA）监控技术的发展。【撰文/孤毒药师】知识要点    治疗性重组蛋白表达系统：载体及转染方法、表达系统、细胞工程化改造、体外糖基化工程等/ 动物细胞培养工艺：细胞培养技术、规模放大/缩小、工艺监测技术等/培养基：培养基种类和新兴开发方向/关键质量属性：关键质量属性的内涵和监管要求、控制策略、挑战和发展趋势/简介    单抗等治疗性重组蛋白药物的发现和工艺开发的成功取决于以下几个方面（图 1）：细胞株开发、上游工艺、下游工艺、蛋白工程化设计、生物分析、制剂开发和质量控制，这些都是生物药一体化设计和开发中不可或缺的部分。图1 单抗的发现和工艺开发 其中，细胞培养工艺相关的开发与优化是重组蛋白药物开发中的重要环节，包括蛋白表达系统、上游工艺开发和优化、培养基开发、关键质量属性及其控制等四个方面。因此，本文逐一展开论述，详细分析了产重组蛋白药物的细胞培养工艺中的核心技术和关键步骤。其中，蛋白表达系统方面主要介绍了载体类型及转染方法、各种不同的表达系统、体内外细胞工程化改造等内容；上游细胞培养工艺开发部分主要介绍了细胞培养方法及关键控制策略、规模缩小与放大、离线/在线工艺监测技术等；培养基开发部分介绍了培养基的种类、特性以及新兴的培养基开发和优化方法；关键质量属性部分主要介绍了关键质量属性的监管要求、控制方法（以糖基化为例）、挑战和技术发展方向。 主要论述    治疗性蛋白的表达系统虽然产量是生物药生产过程中追求的重要指标，但这些分子的结构和质量会决定其疗效和安全性。因此，除了开发高产细胞系外，还须考虑翻译后修饰（PTM），尤其是糖基化修饰。表达系统的选择会对PTM的类型和程度产生深远影响，所以需要基于细胞工程技术开发和选择合适的表达系统，并以之设计结构明确和产量高的蛋白质。 表达系统是指通过特定的细胞和转染的DNA载体合成重组蛋白的系统，其可将提供的DNA遗传信息翻译成目标蛋白质特有的氨基酸序列。翻译后，这些分子会受到PTM的影响。原核生物和真核生物的PTM的频率和复杂性有显著差异，PTM对后者的影响更为广泛。尽管真菌、昆虫和植物细胞均可进行糖基化，但其聚糖结构与人类蛋白明显不同，故可能产生不良的免疫原性。所以，目前批准的大多数生物治疗药物都采用哺乳动物细胞表达，至少其中大多数具有“类人”糖基化修饰。载体生产所用细胞系的开发皆起始于表达载体的构建。载体是能够自主复制的DNA元件，其中引入了一段外源DNA。除了转入的外源基因外，载体中通常还包括一些表达元件，例如：启动子、增强子、多克隆位点（MSC）、内含子序列、转录终止子、选择性标记以及一些调控染色质结构DNA元件。此外，可能还包括一些表观遗传元件，用于优化蛋白质表达过程和缓解沉默效应。 其中，最常用的位点控制元件是遍在染色质开放表达元件（UCOE）、核骨架基质结合区S/MAR（S/MAR）和稳定和抗阻遏元件（STAR）。 在选择载体和基因递送方法时，需考虑细胞类型、产品表达量需求、安全性、经济性、工艺放大、周转时间和法规要求等多方面因素。载体基因递送方法包括基于试剂的方法、基于仪器的方法和病毒介导法。基于试剂的方法包括基于阳离子脂质的转染、磷酸钙沉淀、二乙氨基乙基（DEAE）-葡聚糖/聚乙烯亚胺（PEI）/聚合物/树状大分子介导的技术等；基于仪器的方法包括电穿孔和微量注射法；病毒介导法包括腺相关病毒、慢病毒等介导的基因递送方法。其中，非病毒基因递送方法大多已获得监管许可，是蛋白类药物生产中的首选方法。基于试剂的转染方法基于试剂的转染方法的共同原理为：带正电的化学物质与带负电的核酸形成复合物，然后将其吸引至带负电的细胞膜上。之后，复合物通过内吞或吞噬作用进入胞内。磷酸钙沉淀法和DEAE-葡聚糖法是最古老的DNA递送方法，虽然成本较低，但常存在转染效率低和细胞毒性高的问题。而且，磷酸钙法需要采用有血清培养基，因而限制了该方法在生物药生产中的应用。聚乙烯亚胺（PEI）等阳离子聚合物为非细胞毒性试剂，成本较低，染效率高达100%，且可放大至数百升，因此应用较为广泛。 另一种广为流行的DNA递送方法为基于阳离子脂质的技术，其具有转染效率高、易于使用、步骤最少、容易放大等优势。其成本相对较高，故在大规模转染中应用较少。不过，由于在培养皿中的转染效率很高，而且适用于高通量系统，所以在研发的早期阶段比较常用。电穿孔电穿孔（电转染）是通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而使细胞吸收外源DNA分子的方法。采用最佳的电场强度、脉冲长度、缓冲液电导率、波形、脉冲数等参数，可以在不改变生物结构/功能/宿主细胞的前提下保证高转染效率和高存活率，而且其简单易用，并具有广泛的细胞系适用性。该方法可用于引入外源蛋白、mRNA、siRNA等其它生物分子，适用于稳定转化和瞬时基因表达，故其应用非常广泛。病毒介导法病毒介导法主要依赖于病毒感染细胞的机制，这与上述化学和物理转染方法不同。插入容量因病毒类型甚至同一病毒的血清型而异，通常用于瞬时基因表达。复制缺陷的重组病毒载体是第一个能将无细胞毒性的基因高效转移至人体细胞的工具，由于病毒具有天然的细胞入侵能力和较高的基因传递效率，因而是体内基因治疗中最常用的方法。其中，发展最完善的是腺相关病毒（AAV）载体。AAV是持续性病毒，可诱导低致病性和毒性，存在于多种血清型中，可以通过染色体整合而促进转基因的长期表达。其它病毒传递系统中采用一些单链（ss）或双链（ds）RNA和DNA病毒，例如：腺病毒、α病毒、黄病毒、单纯疱疹病毒、棒状病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、慢病毒等。选择载体时，需重点考察其外源DNA的包装能力、毒性、免疫原性、裂解能力、长期或短期转基因表达、感染非分裂细胞、肿瘤细胞中特异性复制能力等因素。过去，研究者普遍认为非病毒基因传递法的效率较低，且表达时间短，故其应用并不广泛。后来，随着物理转染方法和载体开发技术的不断进步，非病毒载体因其低免疫原性优势而成为了潜力巨大的新一代基因转移工具。对于病毒载体，虽然其在活性基因治疗相关的临床试验中占主导地位，但其也有一些缺点，包括：克隆策略更复杂、生物安全问题、可能的病毒载体和重组蛋白相关的健康风险等。哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞生产工艺成本较高，规模放大难度大，且具有微生物污染风险。不过，由于其可进行复杂的翻译后修饰，因此应用仍然非常广泛，市场上绝大多数（70%）重组蛋白皆采用哺乳动物细胞培养工艺进行生产。哺乳动物细胞中最常用的选择性标记为谷氨酰胺合成酶（GS）、二氢叶酸还原酶（DHFR）基因和耐抗生素基因。在转染和选择性培养后，将存活的细胞进行单细胞分离，用于产生克隆群体。然后进行克隆筛选，选择最高产和最稳定的克隆创建细胞库，用于大规模蛋白质生产。 哺乳动物表达系统可利用瞬时或稳定转染的细胞系产生蛋白质，二者的表达载体不同。在瞬时基因表达（TGE）中，载体并不整合至细胞基因组中，因此转染的基因仅在有限的时间内表达蛋白，其一般用于实验室研究和快速大量筛选重组蛋白分子。大规模生产中首选稳定细胞系，将目的基因整合至宿主基因组中，从而可以大量稳定表达质量一致且符合监管要求的重组蛋白。建立稳定克隆需要较长时间，且需要劳动密集型的克隆选择过程或复杂而昂贵的高通量自动化实验设备。不过，通过第三代慢病毒等新方法可以大大提高效率，缩短筛选时间。鼠源细胞系CHO细胞目前应用最广的细胞系，其具有悬浮生长能力强、产量高、可无血清培养等优点。此外，CHO细胞不易受人类病毒感染，故其生物安全风险较低。不过，CHO细胞也可能存在一些缺点，例如：虽其所产蛋白中的聚糖大多为人源化或类人聚糖，但仍可能出现半乳糖-α（1,3）-半乳糖（α-Gal）、N-甘氨酰神经氨酸（Neu5Gc）等非人类的免疫原性结构。此外，CHO细胞无法合成α（2-6）-唾液酸等人类糖蛋白中的聚糖残基。CHO-K1基因组测序促进了CHO细胞工程的开发和优化，使其发展成了成熟的高效蛋白表达平台。 BHK是另一种来源于仓鼠的细胞系，常用于凝血因子VIIa、凝血因子VIII和疫苗生产。不过，与CHO一样，这些细胞也可能表达Neu5Gc、α-Gal等具有免疫原性的聚糖。NS0和SP2/0是小鼠骨髓瘤细胞，也被广泛用于生产重组蛋白。其不足之处在于，所表达的蛋白中免疫原性聚糖α-Gal和Neu5Gc比例较高。不过，可通过严格的克隆筛选系统选择聚糖符合要求的细胞。此外，也可以通过培养基组分和上游工艺条件的优化来调控糖型分布。人类细胞系与上述仓鼠和小鼠来源的细胞相反，人类细胞系不会产生免疫原性聚糖。不过，其易受人类病毒感染，故具有一定的安全隐患，需进行严格的病毒灭活。 人类胚胎肾293细胞（HEK293）是一种转染病毒DNA的人类细胞系，是应用最广泛的人类细胞系，其所表达的蛋白中聚糖均为人类聚糖。 人纤维瘤细胞（HT-1080）也是一种比较常用的人类细胞系，其来源于具有上皮样表型的纤维瘤细胞。PER.C6是另一种人源性细胞系，由转染E1微基因的人视网膜母细胞产生，最初用于生产用于疫苗开发的腺病毒载体。由于其能以悬浮方式高密度生长，并且蛋白产量较高，故常用于重组蛋白生产。 CEVEC公司的羊膜细胞生产系统（CAP）是来源于转染腺病毒5型E1基因的人羊膜细胞，其以高蛋白产量和类人糖基化而称著于世。 最后，人类肝癌细胞（HuH-7）是最近开发的一种人类细胞系，其也能够产生类人糖蛋白。转基因动物除了细胞，转基因动物也常用于生产治疗性蛋白质。例如：ATryn®是一种在转基因山羊奶中产生的重组抗凝血酶；Ruconest®是一种转基因兔子的乳汁中产生的重组人C1酯酶抑制剂蛋白；以转基因母鸡获得的蛋清生产人类β干扰素、治疗LAL缺乏症的重组人溶酶体酸性脂肪酶以及一种用于治疗粘多糖病的重组人α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。转基因动物不仅可以用于生产单抗等简单的蛋白质，还可以生产一些目前可用的商业化抗体，例如：曲妥珠单抗、阿达木单抗和西妥昔单抗。此外，转基因动物还可用于临床前治疗性蛋白质的发现过程。其中，转基因小鼠是应用最广的抗体发现平台，FDA批准的单抗药物中大约有70%来自转基因小鼠。非哺乳动物细胞表达系统尽管FDA批准的大多数重组糖蛋白是由哺乳动物细胞生产的，但很多情况下仍需采用细菌、酵母、昆虫、植物细胞等非哺乳动物表达系统。后者的优势在于：产量高，易放大，成本低，且不易受哺乳动物病原体污染。然而，这些异源表达系统有一个共同的缺点，即：缺乏合成糖基化等类人PTM所需的机制。因此，若所需的治疗性蛋白质很小，且其临床功能不需要类人糖基化，则非哺乳动物系统是最经济的选择。细菌表达系统细菌是最常用的表达简单异源蛋白（不含PTM）的宿主细胞，其具有培养基成本低、分裂迅速、规模易放大、产量高等优点，因此是最受欢迎的非哺乳动物细胞表达系统。目前，约30%的治疗蛋白是通过细菌宿主产生的。不过，由于生产过程中会形成包涵体，所以蛋白容易聚集而失活。此外，如前所述，该系统中PTM不足，故难以生产复杂的治疗性蛋白质。大肠杆菌（E. coli）是生物药生产中所使用的第一个表达宿主，目前被用作简单蛋白质的大量表达系统。酵母细胞表达系统与细菌类似，酵母细胞亦具有细胞分裂快和蛋白表达量高等优点。不过，其所产蛋白中低聚甘露糖结构比例较高，故其其在体内的清除速率可能较快。最新的一些糖基化工程技术已使酵母能够生产人源化的唾液酸糖蛋白，但类人糖基化蛋白仍难以表达。其中一种酵母系统为面包酵母（SS. cerevisiae），所表达的治疗性重组蛋白包括胰岛素肽、肝炎疫苗、人血清白蛋白和病毒样颗粒。另一种为巴斯德毕赤酵母（P. pastoris），其能产生克级的重组蛋白产物。目前，P. pastoris主要用于生产胰岛素、人血清白蛋白、α-IL6受体单域抗体片段等小蛋白质。昆虫杆状病毒表达系统昆虫杆状病毒表达系统 (BEVS) 也可用于生产具有复杂糖型的重组蛋白，其为以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫或Sf9、Sf21、BTI 5B1-4等昆虫细胞为受体而建立的表达系统。由于昆虫细胞的翻译和翻译后蛋白修饰模式与哺乳动物细胞相似，因此所产重组蛋白的抗原性、免疫原性和功能等生物学活性与天然蛋白相似。而且，其成本较低，容易实现大规模生产。不过，其生产的蛋白中低聚甘露糖、无甘露糖聚糖等疑似免疫原性糖结构的比例较高，而且无法进行唾液酸基化修饰。除重组蛋白以外，该系统也被广泛用于生产疫苗、病毒样颗粒、病毒载体等产品。植物表达系统与昆虫细胞相似，植物亦不能进行唾液酸基化修饰。此外，该系统还会合成α（1,3）-果糖和β（1,2）-木糖等免疫原性聚糖。因此，植物表达系统主要用于生产不含唾液酸的重组蛋白（如：酸性β-葡萄糖苷酶）。 除了上述各种表达系统以外，为了降低蛋白表达过程的复杂性和缩短开发时间，近年来正在尝试以无细胞蛋白质合成系统（SFPS）生产简单的蛋白质分子。 每种表达系统在疗效和安全性方面都有其相对的优势和劣势（表 1），例如：哺乳动物细胞的类人PTM功能更强，但病毒污染风险更高；非哺乳动物细胞生长更快且产量更高，但表达的蛋白可能会含有对患者有潜在风险的免疫原性表位。因此，通常需要根据产物的分子特性、质量需求、疗效和安全性来选择最合适的表达系统。 表1 各种表达系统在疗效和安全性方面的优劣比较细胞工程化改造随着基因组学的持续进展，已能够通过细胞工程技术添加或删除可能影响蛋白结构的基因，进而设计具有特定特征的表达系统。 单抗的治疗活性通常与效应子功能相关，例如：抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）等。而且，每种作用都与依赖于聚糖结构的结合作用。 利用细胞工程技术可以插入或敲除一些糖基化相关的基因，从而有效地调控聚糖结构的糖基化途径，以获得糖基化修饰符合需求的重组蛋白。例如：敲除CHO细胞中岩藻糖基转移酶FUT8基因可以生产去岩藻糖基化抗体，进而增强其ADCC活性；同时表达ST6Gal1和β4GalT1可以产生高度唾液酸基化的IgG，以增强其免疫功能。体外糖基化工程除了前述细胞工程、培养基和培养工艺优化以外，体外糖基化工程（IVGE)）也是调控哺乳动物细胞糖基化修饰的重要策略。 IVGE需要使用相关的酶（如：糖基转移酶、糖基水解酶等）和参与糖基化途径的相应底物，该方法最大的优点是能够高效生产糖基化修饰比较均一的重组蛋白。因此，体外糖工程可以用于生产具有特定功能的抗体，在新一代抗体、生物药或治疗方法（图 2）的生产中具有很大的应用价值。 图 2 新的生物药/治疗方法发展方向 此外，一些新的酶和底物正在不断被发掘出来，这使得IVGE又有了更多新的应用方向。例如：将IVGE整合至下游纯化工艺中，可以有效提高产品的药效和安全性，而且能够大幅降低生产成本。 在研究和开发层面上，与基因工程技术相比，IVGE技术有许多优势，例如：可以通过IVGE生产具有不同糖基化修饰的蛋白分子库，然后对各种分子分别进行结构和功能测试，而无需从头调整分子设计和工艺策略。此外，通过此法可以快速确定最有效的糖基化修饰，并据此有针对性地指导生产工艺的开发。 哺乳动物细胞培养工艺开发哺乳动物细胞培养工艺是最常见的重组蛋白生产工艺，细胞株、培养基、培养模式等是影响该工艺稳定性、一致性和可放大性的关键因素。细胞株的重要性显而易见，可以通过基因工程改造和筛选过程获得性能符合要求的细胞系，本文不予赘述。培养基是重要的生产材料，其组分直接决定细胞的生长、代谢、产量和质量，后文将展开讨论。细胞培养过程中，工艺参数变化会直接影响产品的质量属性和一致性。而且，在一些培养模式下，培养环境会随着培养时间的推移而不断变化，故细胞密度、比生产率和蛋白质量均可能受到影响。一些培养环境或参数变化甚至可能影响蛋白的关键质量属性（PQA），例如：折叠错误、氨基酸序列变化、糖基化修饰类型改变等。因此，需要选择合适的培养模式，并对工艺参数进行适当优化以确保其稳定性、一致性和可放大性。细胞培养工艺及其主要开发内容目前，工业化生产中所使用的哺乳动物细胞大多以悬浮方式生长，培养模式主要有批式培养、流加培养（图 3）和灌流培养（图 4）。图 3 批式培养模式（左）和流加培养模式（右）示意图 图 4 灌流培养模式示意图 其中，批式培养模式中无营养补给，故其生产周期短，产量较低，多用于种子链扩增。流加培养模式中，会分批添加营养物质以维持细胞生长和活率，从而能够大大延长培养周期和提高产量。灌流培养模式通过细胞截留装置将细胞阻滞在生物反应器内，并通过恒定速率连续更换新鲜培养基以维持相对稳定的培养环境，从而可进一步提高细胞密度、改善细胞活率、提高比生产速率和延长培养周期。无论采用那种培养模式，在采用生物反应器培养细胞的过程中，必须有稳定的反馈回路用于控制关键工艺参数。其中，影响产品质量的关键工艺参数包括温度、溶解氧含量（DO）、pH值、搅拌等。此外，灌流培养中还必须考虑细胞的截留和循环再利用，故其最为复杂。细胞截留过程中需要避免污染和过度的剪切力，否则灌流系统的效率可能会随着时间的推移而降低。如果细胞无法维持稳定状态，则产率也会受到严重影响，故必须持续监测细胞活率和密度。此外，营养补给决定了细胞的生长速率、生理状态和产率。因此，需要根据细胞消耗速率设置与代谢废物去除率相匹配的灌流速率，既需要保持培养体积恒定不变，也要在无浪费的前提下保证有足够的营养满足细胞需求。 在灌流培养系统中，最常用的细胞截留装置是多孔膜。一般而言，随着培养时间的延长，由于堵塞，过滤器的预期流速与实际流速可能出现偏差。为了防止堵塞，通常必须适当增大过滤器的孔径，但这又会导致产品流失。当前流行的自清洁膜可以在一定程度上降低过滤器污染或堵塞的可能性，最常见的膜为切向过滤流（TFF）和交替切向流（ATF）膜系统。二者原理相似，即：将培养液切向注入至具有特定孔径的膜上，膜的孔径仅允许培养液流过（滤液），而细胞（滞留物）则继续沿进料流体流动。如此可使含细胞的滞留液返回生物反应器，同时连续收获滤液。二者相同之处在于：两种膜系统中培养物在膜上均以切向流动，从而可以降低过滤器被污染和堵塞的风险。区别在于：在TFF中，进料流体沿单个方向穿过膜；ATF系统包括一个泵，可在膜上产生双向流动，进一步降低过滤器污染和堵塞的可能性。所以，后者对产品的截留率更低，产品分离效率更高。总之，二者操作均较简单，污染和堵塞的风险较小，非常易于进行规模放大。将上游灌流培养系统与下游多层析柱装置进行有机整合，可以建立一体化的集成型连续生产平台。其优势在于：可以缩短抗体在培养液中的停留时间，使所得产品的质量更加均一；快速将培养液中的蛋白酶和分泌酶与抗体分离，从而避免影响聚糖结构等蛋白质量属性。集成型连续工艺的规模一般较小，因此常用一次性技术替代不锈钢设备进行生产。为了配合上游连续工艺，必须设计连续的纯化工艺来处理上游的收获液。通常会采用多根层析柱，在过程中进行切换以防止树脂过载而造成产品损失。与传统的批式捕获循环相比，该操作方式可以大幅提高树脂利用率。不过，在连续系统中病毒灭活仍是一个很大的挑战，尤其是病毒过滤器的污染和堵塞的风险较高，仍需继续优化和改善。规模放大/缩小中的主要考量哺乳动物细胞在生长过程中会产生一些生长因子，足够的生长因子才能激活葡萄糖和氨基酸转运等代谢途径，进而促进细胞生长和维持细胞活率。大规模细胞培养中种子链扩增过程通常须连续传代多次，若种子链设计不合理则可能导致生长因子不足，使细胞生长变缓。而且，种子链并非一成不变，而需要根据具体的细胞和工艺进行调整和优化。此外，设备结构和体积的变化也会影响培养环境，故亦需据此合理调节相关的控制参数。因此，应当开发高通量实验设计方法，以筛选、分析和优化各种过程变量，尽可能保证细胞在各种规模下的传代和生长条件一致。 传统的生产中，一般会通过规模放大来满足产能需求，常采用20000升及以上规模的不锈钢生物反应器及相关设备进行生产。但是，规模太大往往会导致产率下降，且工艺开发工作的负担较重。而且，由于流速、处理量、静水压等因素，其对上下游设备的要求也较高。此外，还需要额外的准备时间和清洗步骤。因此，近年来相对灵活的一次性技术的应用越来越普遍。由于一次性生物反应器的规模更小，一般约为不锈钢反应器的1/10，故有时也需要缩小工艺规模以满足一次性生产的需求。另外，为了更好地进行工艺规模放大，也需要选择合适的小规模培养模型来模拟大规模生产条件，并基于此优化工艺，以降低规模放大的风险。在设计规模缩小模型时，需充分考虑流速、静水压、混合、传质等因素造成的规模间差异。 工艺监测细胞培养过程中需要采用适当的控制策略，只有将所有关键工艺参数保持在特征范围内才能保证工艺的稳健性。因此，应采用高精度检测设备或传感器实时监测这些数据，以识别工艺条件的变化，并据此进行相应的反馈控制。目前，一些高灵敏度的探头已能连续监测DO、pH值和温度，可以满足实时控制的需求。未来，下一代生产工艺旨在通过稳健的过程分析技术（PAT）实现自动化分析，避免人工取样操作和离线检测，而且可以方便实时调节工艺控制参数、营养供给策略等工艺条件。 以细胞密度和活率的检测为例，其通用的检测技术如图 5所示。细胞密度和细胞活率是细胞培养的关键指标，大多以台盼蓝拒染法进行离线检测。这种离线检测方法虽已能满足流加培养的需求，但在一些工艺中可能需要实时检测细胞密度和活率。例如：在连续灌流培养中，可能需要实时检测细胞密度以确定细胞放流和培养基灌流速率，以防止细胞过度损失和满足细胞的营养需求。通常会采用可在线检测细胞生物量或密度的传感器，以便实现实时反馈控制。一般以细胞电容表征生物量，在细胞指数生长期其结果与台盼蓝拒染法基本一致。此外，还可以通过光学系统实时捕获细胞图像，并对形态变化进行深入分析，以确定细胞的生理状态。图 5 细胞密度和细胞活率检测示意图 培养基开发培养基及其种类培养基是细胞培养的关键原材料，本质上为支持细胞生长并为细胞提供适量生长因子、维生素、矿物质、葡萄糖、氨基酸等营养物质的液体或凝胶，可简单分为有血清培养基和不含血清的而培养基两大类。有血清培养基有血清培养基是以胎牛血清（FBS）作为基础培养基的唯一或主要添加组分的最常用培养基之一。一般而言，小动物血清优于成人血清，因为其含有较少的γ-球蛋白，抗体相互作用较少，故其对细胞生长的负面影响更小。血清中含有蛋白质、维生素、矿物质、生长因子、激素等大量的生物活性成分，可为细胞提供必需营养物，促进细胞增殖，改善细胞功能。其中也含有白蛋白、转铁蛋白等多种载体介体，可将多种维生素、激素和亲脂性分子输送至胞内。而且，血清还可通过纤连蛋白改善细胞的贴壁能力，其中的蛋白酶抑制剂和一些金属（如钙、铁、锌和镁）可保护细胞免受蛋白质水解。此外，血清还是一种粘度增强剂和缓冲剂，可保护细胞免受剪切应力和极端酸碱环境损伤。不过，血清也有一些缺点：1、批次间差异大，重现性差。这种差异是由于血清中的生物活性成分种类和含量不明确所致，其中可能含有各种生长因子、微量元素、激素和促增殖转录因子。这些成分在不同批次血清中的差异很大，可能导致细胞生长不一致，并改变细胞对化学物质的反应。因此，不同研究组或实验室结果之间的可比性较差。 2、血清是重要的微生物污染源，包括支原体、病毒、朊病毒、真菌和酵母菌、内毒素等。3、一些血清组分可以通过代谢结合至细胞中，并表达为抗体、受体等表面连接分子，从而对细胞与周围环境的相互作用和反应产生不利影响。 4、伦理道德方面，通过心脏穿刺从小牛、胎牛等动物采集血清的方式会给动物带来痛苦，并不人道。5、经济成本相对较高。尽管一些生产商开始转而采用无血清培养基，但是有血清培养基的需求仍在不断上升。而且，为了满足GMP标准，需要加大基础设施和动物繁殖设施方面的投入，这使得血清的成本一直居高不下。 6、血清中的一些成分可与其它培养基添加物相互作用，形成剧毒化合物，例如：多胺氧化酶可以与培养基中多胺（如：精胺和亚精胺）相互作用，形成剧毒的聚精胺。不含血清的培养基第二类为不含血清的培养基，可进一步细分为无血清培养基、无动物源性成分培养基、无蛋白质培养基和化学成分明确培养基。 无血清培养基：指的是使用除血清以外的添加物替代血清，例如：来源于植物或动物组织的离散大蛋白分子。不过，其仍含有一些成分不明的物质，例如：动物或植物水解物。 无动物源性成分培养基：不含任何动物或人类成分，而是含有催化剂、非动物源蛋白胨、酶、植物水解物，以及激素、生长因子和细胞因子等一些细胞培养源性重组蛋白。 无蛋白培养基：仅包水解物或消化蛋白质，以及胰岛素等低分子量蛋白质。这些培养基除了支持细胞生长和产物表达外，还可以减轻下游分离纯化的负担。不过，其中的水解物、脂质中组分无法一一鉴别，因此仍非化学成分明确培养基。 化学成分明确培养基：仅包含化学和结构明确的有机或无机成分。其中可能还含有由特定细胞系、细菌或酵母生产的重组蛋白质，例如：激素、生长因子和细胞因子。其主要优点是重现性好、无伦理问题、成分明确。因此，许多生物制药公司正在从现有的动物源性产品转向化学成分明确培养基。然而，其也有一些缺点：成本更高；大多具有细胞类型特异性；需要更长的细胞适应期。培养基开发的新方法“组学”技术目前，在培养基优化领域引入了几种新方法，包括蛋白质组学、基因组学、表观基因组学、代谢组学等多种“组学”技术。此外，转录组学和糖组学有助于更好地理解细胞代谢及其分子机制，并据此制定改善细胞生产机制的策略。例如： 可以比较不同培养基配方下产单抗细胞的基因表达情况，以确定影响基因表达和产物产量的关键组分。然后，根据转录组学数据优化关键组分，改善导致差异的基因的表达水平，进而改善细胞生长和提高产量。利用蛋白质组学方法优化培养基组成，最大限度地减少有毒副产物和生长抑制剂的积累。例如：结合高效液相色谱法（HPLC）与质谱法（MS）检测培养基组分和胞内外代谢物，据此表征对细胞生长和产物表达不利的代谢途径和代谢物。在乳酸、NH4+和渗透压水平均控制良好的工艺中，采用核磁共振（NMR）和MS定性和定量分析由氨基酸等营养物代谢所产生的有害代谢物，据此优化培养基中营养物的添加策略，从而可以在不产生有害代谢物的前提下满足细胞代谢需求。根据鉴定，某些有毒代谢物的积累和营养物质的消耗会激活自噬、凋亡等信号通路，故可据此添加自噬抑制剂或凋亡抑制剂以改善细胞状态和延长培养周期。然而，这些抑制剂相当昂贵，会增加生产成本。因此，可以尝试添加胰岛素、IGF-1、LongR3等简单的物质抑制自噬和凋亡，促进细胞生长和提高产率。化学添加物还可向培养基中添加一些化学物质。例如：添加丙戊酸钠、丁酸钠等组蛋白去乙酰化酶抑制剂，一方面可以将细胞阻滞在G1期以增加生产期的细胞数量，另一方面也可使细胞状态更利于基因转录，从而提高细胞产率。不过，需要对这些化学添加物的浓度和添加时间进行细致的优化，避免添加策略不合适而对细胞生长和产率产生不利影响。此外，添加一些核苷酸类物质也可以提高产量。例如：添加脱氧尿苷可以提高CHO中IgG的产量；添加脱氧胞苷、脱氧尿苷和胸苷等嘧啶核苷也可大幅提高抗体和融合蛋白的产量。按“需”优化培养基和流加策略根据细胞对营养的消耗速率优化培养基和流加策略可有效减少抑制性代谢物和废物，降低渗透压，进而促进细胞生长和提高产量。例如：一种通过pH上限控制葡萄糖流加策略的方法（HIPDOG）可显著提高细胞生长速率、比产率和总产量。基于在线细胞密度或葡萄糖浓度检测的结果计算比消耗速率，据此优化培养基和开发动态流加策略，可以大幅提高产量。根据pH变化情况优化培养基，并且采用乳酸和丙酮酸控制pH，可以显著减少CO2的注入和NH4+的积累，从而提高细胞密度和抗体产量。CQA控制人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）在《Q8（R2）制药开发》文件中将关键质量属性（CQA）定义为：CQA是物理、化学、生物学或微生物学性质或特征，应具备适当的限度、范围或分布，以确保所需产品的质量。CQA与药用物质、药品、辅料、中间产品（中间物料）、容器及其密封材料相关。 评估生物药物CQA所需的测试分为三大类：分析测试（糖基化修饰、聚集体、片段化）、结合分析（如：酶联免疫吸附试验（ELISA））和基于细胞的效价测试。除了评估最终产品的PQA外，还需要通过这些分析测试评估工艺过程中的CQA。另外，必须测试所有的培养基、缓冲体系、添加物等原材料，以确保其纯度达标且无任何污染物。生产过程中可能会引入一些宿主蛋白质（HCP）、DNA等杂质，必须通过下游纯化工艺将其去除，并通过这些分析测试证明去除效果已达标。以糖基化为例介绍CQA控制糖基化修饰能够改变药物的稳定性、半衰期、生物活性和其它理化性质，因此可能是生物药物的CQA。哺乳动物细胞产生的蛋白质的糖基化修饰属于PTM过程，涉及到一系列的细胞机制。聚糖异质性与许多因素有关：内质网和高尔基体中的细胞反应过程、底物的可及性、糖基转移酶和糖基水解酶等相关酶的功能等。而且，糖基化修饰亦受胞外培养条件影响，培养基组成、pH值、搅拌、培养基流加策略等的差异均可能导致糖基化特征变化。此外，如前所述，虽然哺乳动物细胞可以生产具有类人聚糖的治疗性蛋白质，但也可能产生对人类有不良免疫原性作用的非人类聚糖，例如：α-半乳糖表位和N-甘氨酰神经氨酸（NGNA）。 上述变化与特定位点上聚糖模式的变化有关，即所谓微观异质性。此外，也会采用宏观异质性描述糖基化位点变化及蛋白质上所含聚糖的数量。鉴于聚糖谱中固有的异质性和细胞产生非人类聚糖的潜在风险，生产过程中需要准确确定聚糖谱，并保证其一致性，所以须根据需要将其指定为CQA。当今PQA控制中的挑战生物药物一般为是复杂的大分子物质，因此评估CQA具有一定的难度。除了各种异质性外，药物的分子量可跨越3个数量级，例如：胰岛素的分子量约为5 kDa，而单抗的分子量约150 kDa。因此，用于小分子药物的传统检测技术很难直接应用至生物制药领域。 核磁共振（NMR）是常用的小分子结构解析方法，但现代生物药物的分子量太大，一般无法采用传统的NMR进行分析。然而，采用现代的固相NMR则可以开发更多的新检测方法。NMR的局限性在于：其只能提供整个蛋白质的平均信号，故传统的1D NMR无法检测折叠错误区域或低浓度污染物。而采用2D NMR则可确定治疗蛋白质的一级、二级、三级和四级结构，典型的实验方法包括异核1H、15N-或1H、13C相关的NMR。除了确保生产的治疗性蛋白符合CQA要求以外，还必须注意确认最终药物配方中的杂质低于可接受的限度。生物药生产中最主要的污染物为HCP，其会降低产品纯度，因此为生物生产中的另一个CQA。虽然美国或欧洲监管指南均未规定HCP的可接受水平，但业界皆努力将最终药品中的HCP总量控制至100 ppm以下。目前，HCP检测的金标准是ELISA，不过其无法确定具体的HCP信息。因此，也可以使用LC-MS检测HCP，其优点在于：可鉴定HCP的具体信息、灵敏度高、可定量等。不过，其开发过程需要丰富的经验，对于规模较小的实验室而言LC-MS仪器的成本较高。 此外，还必须对细胞系进行全面评估，以确保在常规细胞培养过程中未发生突变。而且，细胞系也必须无细菌、病毒、支原体等微生物污染。新兴的CQA评估技术CQA的评估过程比较耗时，使得批次放行所需时间较长，因此当今的技术开发方向主要聚焦于缩短分析时间。可以通过两种方式来实现这一目标：1、改进仪器设备和检测方法；2、开发高通量样品制备和分析方法。 反相和亲水相互作用色谱（HILIC）色谱分离方法已广泛应用于生物药物分析，从确定蛋白质中的氨基酸序列到评估聚糖图谱均可采用此法，其可用于评估各种CQA。问题在于，一套标准仪器中每次仅可通过一个固定相分析样品。采用2D-LC则可以通过色谱图的“中心切割”部分并将其转移至第二个正交固定相，从而在一定程度上改善这一问题。 为了缩短分析时间，高通量方法的开发也受到了越来越多的关注，尤其是针对N-聚糖的分析。通常，需要先通过酶切方法将N-聚糖从抗体上分离出来，然后再采用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）衍生以增强荧光检测或质谱检测的可操作性。最近开发出一种新的方法，在微流控光盘平台上平行分析转铁蛋白及含有N-连接聚糖的样品，随后通过MALDI-MS进行检测。单个光盘上装载的样品可在3.5小时内处理，且具有较高的可重复性，相对标准偏差（RSD）小于15%。在未来，类似这样的微型化技术可以作为传统LC的补充分析方法。思惟延伸      过去几年，治疗性重组蛋白的生产技术发展迅猛，各种新技术层出不穷，但迄今最受欢迎的工艺仍为基于哺乳动物细胞培养的工艺。推其原因：一方面是因为大部分生物制药公司都希望利用现有的设备设施进行生产；另一方面，重组蛋白的糖基化修饰与其生物功能密切相关，可能会影响产品的安全性和有效性，采用该类工艺所产重组蛋白的糖基化修饰与人类糖基化非常相似。若今后采用其它表达系统便足以模拟人类糖基化，或能开发更有利于治疗效果的糖基化修饰，则未来工艺开发趋势或许会发生巨大变化。 目前，细胞工程改造、化学成分明确培养基的开发和产品表征方面已取得很大进展。当今哺乳动物细胞生物生产工艺正在向一体化集成型连续工艺转变，旨在进一步增加产能、提高生产速度和降低生产成本。上游连续工艺发展已趋于完善，而下游全封闭式连续工艺仍然是发展瓶颈，需要更多的时间和资金成本投入。最后，基于哺乳动物细胞的治疗性重组蛋白生产工艺会持续快速发展，其势必会推动融合蛋白、双特异性、细胞及基因治疗产品等下一代生物制品生物工艺的发展。当然，各种产品的开发中也可能面临更多新的挑战，需要持续不断地进行技术升级，以满足日益增长的新需求。(发布于2021/08/16, 重新整理于2022/10/19)参考资料：1. O'Flaherty R, Bergin A, Flampouri E, Mota LM, Obaidi I, Quigley A, Xie Y, Butler M. 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Wang, L., Zheng, W.F., Liu, S.Q., Li, B., Jiang, X.Y., 2019.  Chembiochem 20 (5), 634 - 643. 关于2022第四届生物工艺年度峰会 About Bio-ONE2022 2022年11月17-18日（周四、周五），由中国微生物学会指导，华东理工大学、佰傲谷BioValley主办，上海市生物工程协会、科创中国生物医药产业科技服团支持的Bio-ONE2022第四届生物工艺产业年度峰会将在上海举办。作为生物工艺的行业标杆会议之一，2022第四届生物工艺产业年度峰会以“技术追新，跃变在途”为大会主旨，在抗体药物、细胞基因产品的工艺开发和强化基础上，聚焦大规模生产、连续工艺、智能制造等领域，邀您一起开启生物工艺技术探新之旅，推动下一代生物药生产工艺的发展进程！点击“阅读原文”，了解更多会议信息~