NU-7427

鼻咽癌对放射治疗高度敏感，但“同分期、同方案、不同结局”的临床差异始终存在。传统病理分型能够确认肿瘤性质，却很难解释复发、转移与放疗抵抗为何集中发生于部分患者。基因组学揭示了NF-κB通路、EB病毒感染和基因组不稳定性等重要线索，但DNA与RNA层面的改变并不等同于真正执行生物学功能的蛋白质状态，更无法完整呈现磷酸化介导的激酶活性。 这项研究以临床组织为起点，整合大规模蛋白质组、磷酸化蛋白质组、机器学习分型、药物再定位及体内外功能验证，构建了一个从“分子图谱”走向“诊断—预后—治疗”的闭环。研究将鼻咽癌划分为S1与S2两个分子亚型，其中S2呈现更强的补体—凝血通路激活和免疫抑制特征，患者生存结局更差；与此同时，研究团队筛得泛组蛋白去乙酰化酶抑制剂帕比司他（Panobinostat），并提出其通过抑制MYC—同源重组修复轴增强放疗敏感性的机制。 这不是一篇单纯“做分型”的蛋白质组学论文，而是试图把鼻咽癌的分子异质性、组织诊断标志物、药物筛选和放疗增敏机制串联起来。其临床价值仍处于转化前阶段，但为高危分层和个体化放疗研究提供了清晰路线。作者与研究团队 论文由厦门大学及厦门大学附属第一医院多学科团队完成。Yi-Ping Wu、Yao-Hui He、Guo-Sheng Hu和Zhi-Qin Li为共同第一作者，刘文教授与林勤教授为共同通讯作者。样本来源、放射肿瘤学问题、质谱平台、生物信息学建模和药理机制验证在同一研究框架内协同推进，这是本文能够形成完整证据链的重要原因。 刘文教授现任厦门大学药学院院长、南强特聘教授、博士生导师及福建省药物新靶点研究重点实验室主任，长期从事癌症表观遗传调控、基因转录与剪接机制及靶向药物研发。其团队擅长将分子生物学、质谱分析、高通量测序、生物信息学和小分子药物筛选结合，用机制研究反向推动治疗靶点发现。 林勤教授为厦门大学附属第一医院肿瘤放疗科主任医师、厦门大学副教授，长期聚焦鼻咽癌、肺癌和肝癌的精准放疗及立体定向放疗。临床放疗团队参与，使研究问题从一开始就围绕鼻咽癌分层、放疗敏感性及临床可转化标志物展开，而不是停留在组学描述。这项工作的真正优势并非单项技术“更大”，而是临床问题、蛋白质组学、药物再定位和放疗机制形成了连续证据链。 文章概览：研究如何展开 研究纳入87例鼻咽癌组织和56例非肿瘤鼻咽组织，采用TMTpro 16-plex定量策略完成蛋白质组与磷酸化蛋白质组分析。研究共鉴定12,141种蛋白和30,106个磷酸化位点；质量控制后，79例肿瘤和52例非肿瘤样本进入主要下游分析。 在发现层面，作者比较肿瘤与非肿瘤组织的蛋白表达、磷酸化位点和激酶活性，描绘鼻咽癌的细胞周期、免疫、代谢、转移及病毒应答网络。在分型层面，作者基于变化度最高的5,000种蛋白进行一致性聚类，将鼻咽癌划分为S1和S2两个亚型，并比较其生存结局与免疫微环境。 在诊断与预后层面，研究利用顺序前向特征选择和支持向量机建立肿瘤诊断模型及亚型判定模型。IGF2BP3与FERMT1用于区分肿瘤与非肿瘤组织，ACTBL2与UNC13D用于识别S1/S2亚型。 在治疗层面，作者将差异蛋白签名输入Connectivity Map数据库，预测能够逆转肿瘤表达谱的候选药物。筛选结果经过细胞增殖、克隆形成、凋亡、类器官和裸鼠移植瘤验证，最终将帕比司他确定为最具潜力的候选药物。RNA测序和功能实验进一步提出“帕比司他抑制MYC，降低ATR、CHK1、RAD51与BRCA1表达，削弱同源重组修复，促进DNA双链断裂累积，从而增强放疗效应”的机制。 研究创新点 创新点一：以临床组织建立目前规模最大的鼻咽癌蛋白质组与磷酸化蛋白质组数据集之一 既往鼻咽癌蛋白质组研究样本量有限，难以稳定识别分子亚型。本文以143份临床组织为起点，同时观察蛋白丰度和磷酸化状态，使“表达多少”与“是否被激活”得到区分。 创新点二：分型结果不仅关联生存，还揭示不同的免疫逃逸模式 S1更偏向肿瘤细胞自主增殖，S2则呈现补体—凝血通路活化、基质增多和免疫抑制性浸润。研究特别强调一个容易被误判的现象：免疫细胞多并不代表抗肿瘤免疫有效。S2虽然免疫评分更高，却缺乏活化CD8⁺T细胞，提示其属于“免疫丰富但功能受抑”的微环境。 创新点三：将组学差异转化为可降维的组织标志物 研究没有把临床应用寄托在全量质谱上，而是筛选IGF2BP3/FERMT1与ACTBL2/UNC13D，尝试以免疫荧光或免疫组化实现低成本检测。尽管模型尚未达到临床验证要求，这种“组学发现—组织病理降维”的路径具有明确转化价值。 创新点四：药物预测并未停留在数据库层面 作者从CMAP预测出候选药物后，完成多种鼻咽癌细胞、类器官和动物模型验证，并对帕比司他开展机制追踪和放疗联合实验。由此，论文从相关性组学推进到可干预机制。 研究结果解析：逐图解读 FIG 1｜鼻咽癌的蛋白质组与磷酸化网络全景 图1a：研究平台与样本规模 作者将87例鼻咽癌组织和56例非肿瘤组织分为10个TMT标记批次，并在每个批次设置混合内参。肽段经高pH分级后，一部分用于全蛋白质组分析，另一部分经Fe-IMAC富集磷酸化肽段。该设计既扩大了覆盖深度，也尽量控制跨批次偏差。 研究共鉴定12,141种蛋白和30,106个磷酸化位点，89.2%的磷酸化蛋白能够与相应蛋白丰度数据匹配。质量控制剔除12份样本后，主要分析基于79例肿瘤和52例非肿瘤组织。这里需要注意，样本量虽在鼻咽癌蛋白质组研究中较大，但仍属于单中心、探索性队列。 图1b-e：肿瘤组织的核心蛋白变化 肿瘤组织中有1,038种蛋白上调、1,158种蛋白下调。上调蛋白集中于细胞周期、细胞外基质重塑、炎症和免疫反应；下调蛋白则涉及纤毛运动、淋巴细胞活化、代谢和细胞黏附。热图进一步将差异蛋白归入细胞周期、纤毛功能、免疫、代谢、转移、mTOR信号和病毒应答七个功能簇。 值得注意的是，STAT1、MX1、CXCL10、IFIT3、ISG15和OASL等干扰素刺激基因在肿瘤组织中升高。这与EB病毒持续感染背景相吻合，但其生物学意义并非单纯“抗病毒”。部分干扰素相关基因可参与DNA损伤耐受，因而可能连接EBV相关炎症与放疗抵抗。 图1f-i：磷酸化变化比蛋白丰度更接近功能状态 作者识别出1,785个显著异常的磷酸化位点，其中791个位点升高、994个位点降低。多数位点的磷酸化变化幅度超过对应蛋白丰度变化，说明鼻咽癌的信号异常并不完全由“蛋白表达增加”解释，许多通路可能通过激酶活化被快速重编程。 肿瘤组织中升高的磷酸化事件主要富集于E2F靶基因、G2/M检查点、MYC靶基因和上皮—间质转化；非肿瘤组织则相对保留紫外应答、KRAS相关信号等特征。这一结果把细胞周期失控和侵袭表型从转录层面推进到翻译后修饰层面。 图1j-l：CDK1、CDK2与AURKA构成可干预的激酶轴 蛋白表达和KSEA激酶底物富集分析共同指向CDK1、CDK2和AURKA活化。PBK、CDK1、EGFR、CHEK2等激酶不仅表达升高，部分还伴随更明显的磷酸化改变。临床研究者应关注这一点：真正具有药物学意义的靶点，往往需要同时满足蛋白表达、磷酸化状态和下游底物活性一致改变。 结论｜鼻咽癌的主轴并非单一基因异常，而是细胞周期、DNA损伤应答、病毒相关炎症与基质重塑共同构成的网络。磷酸化蛋白质组为CDK/AURKA抑制剂与放疗联合提供了机制依据。 FIG 2｜IGF2BP3与FERMT1：从全量蛋白组到双标志物诊断模型 图2a-c：机器学习筛出最小特征组合 作者将肿瘤与非肿瘤组织的差异蛋白作为候选特征，采用顺序前向选择和支持向量机反复训练。FERMT1单标志物模型的AUC为0.991，IGF2BP3与FERMT1双标志物模型的平均AUC达到1.000。双标志物组合在内部交叉验证中表现最优，说明其能够高度区分本研究队列中的肿瘤与非肿瘤组织。 图2d-e：蛋白表达与组织染色相互验证 质谱数据显示IGF2BP3和FERMT1在鼻咽癌中明显升高。10例肿瘤和10例非肿瘤组织的免疫荧光也显示，肿瘤组织阳性细胞比例显著增加。IGF2BP3是一类肿瘤胚胎性RNA结合蛋白，可稳定促增殖和转移相关mRNA；FERMT1参与整合素活化、细胞黏附和迁移，两者在生物学上均具有合理性。 临床意义：更适合作为“病理辅助标志物”，而非替代病理 鼻咽癌诊断仍依赖内镜活检、组织形态、上皮标志物和EBER检测。IGF2BP3/FERMT1的潜在价值，可能出现在组织量有限、坏死明显、异型性不足或初次活检结果不典型的场景，用于增强恶性证据。然而，内部AUC达到1.0也提示过拟合风险。真正进入临床前，需要在独立多中心队列中预设阈值，并与慢性炎症、淋巴组织增生及其他头颈肿瘤进行鉴别验证。 结论｜双标志物模型展示了组学结果向常规病理检测转化的可能性，但当前证据仅支持“候选辅助标志物”，尚不能替代组织病理与EBV相关检测。 FIG 3｜S1与S2：同为鼻咽癌，却拥有不同的生物学与免疫生态 图3a-b：一致性聚类支持两个分子亚型 基于变化度最高的5,000种蛋白，一致性聚类在分为两类时获得最大平均轮廓系数。S1包含56例，S2包含23例。两类在主成分空间中能够分离，提示蛋白表达结构存在系统差异，而非少数标志物的偶然波动。 图3c-d：S2患者的OS和PFS更差 S2亚型总体生存和无进展生存均低于S1，OS的log-rank P值为0.0018，PFS的P值为0.034。两组除吸烟史外，多数临床变量没有显著差异，这提示分型可能捕捉到传统TNM和病理分型未能体现的生物学风险。 图3e-g：S1偏向自主增殖，S2偏向补体—凝血与侵袭 S2较S1上调1,187种蛋白、下调774种蛋白。S2上调通路以凝血、补体、异生物代谢、KRAS/JAK-STAT3和EMT为主；下调通路涉及MYC靶基因、G2/M检查点、E2F和氧化磷酸化。由此可见，S1更像“高肿瘤纯度、高增殖”的细胞自主型肿瘤，S2则更依赖基质、炎症和免疫抑制微环境。 图3h-k：S2是“免疫丰富但免疫无效”的肿瘤 ESTIMATE分析显示S2的免疫评分、基质评分和总评分更高，肿瘤纯度更低。ssGSEA提示S2富集MDSC、Treg和Th2等免疫抑制细胞，同时活化CD8⁺T细胞减少。多重免疫荧光进一步证实，S2组织中的CD8⁺T细胞显著降低；Treg和MDSC虽呈上升趋势，但组间差异未达到统计学显著。 这一结果具有重要临床启示：免疫细胞浸润多并不等于免疫治疗一定有效。若浸润主体是抑制性髓系细胞和Treg，且CD8⁺T细胞缺失，肿瘤仍可处于功能性“冷”状态。S2中C3、C5、C5AR1和多种MMP升高，为“补体激活—髓系细胞募集—基质重塑—转移”的链条提供了蛋白层证据。 结论｜S2亚型的风险可能不来自更强的肿瘤细胞增殖，而来自补体—凝血驱动的免疫抑制、血管与基质重塑。对这类患者，仅用“免疫热/冷”二分法可能低估其复杂性。 FIG 4｜ACTBL2与UNC13D：用常规免疫组化识别高风险S2亚型 图4a-e：双标志物模型区分S1与S2 ACTBL2与UNC13D组合在内部交叉验证中的AUC为0.998，两种蛋白在S2中的表达均高于S1。ACTBL2是β-actin同源蛋白，可能通过细胞骨架和EMT促进迁移；UNC13D参与囊泡分泌和细胞毒颗粒释放，在实体瘤中也可能参与黏附与迁移。 图4f-i：89例外部组织芯片显示PFS分层 作者在89例外部鼻咽癌组织中检测ACTBL2和UNC13D，并根据H-score输入模型，将57例判为S1、32例判为S2。预测的S2组PFS显著更差（P=0.0047），OS呈不良趋势但未达到统计学显著（P=0.057）。这一结果说明双标志物有望成为临床可操作的风险分层工具。 然而，这一外部验证并不存在独立的“真实亚型标签”。研究先用ACTBL2/UNC13D的IHC值定义亚型，再比较两组的IHC表达，后者在逻辑上具有一定循环性。真正具有说服力的验证，应在独立队列中同步完成蛋白质组或预先定义的多标志物分型，再检验双IHC标志物的一致性、敏感度和特异度。当前最有价值的证据是生存曲线能够被分开，而不是“诊断准确率已经达到临床标准”。 结论｜ACTBL2/UNC13D可能把复杂蛋白质组分型压缩为两项IHC检测，但其临床定位更接近“候选预后分层工具”，仍需独立金标准和多中心验证。 FIG 5｜从蛋白表达签名到候选药物：帕比司他脱颖而出 图5a：CMAP寻找“逆转肿瘤表达谱”的药物 作者选取肿瘤与非肿瘤组织中变化最显著的上、下调蛋白，将其映射至Connectivity Map药物扰动数据库。连接分数越负，意味着药物诱导的表达变化越可能逆转鼻咽癌蛋白签名。排名靠前的药物涵盖HDAC、mTOR、PI3K/AKT、MEK/MAPK、PLK1和IGF1R等通路。 图5b-h：帕比司他在细胞和裸鼠模型中表现最强 研究从预测结果中选择Droxinostat、KU-0063794和Panobinostat进行验证。三种药物均抑制C666-1与HK1细胞增殖和克隆形成，并诱导凋亡；帕比司他的促凋亡作用最明显。在C666-1皮下移植瘤中，三种药物均降低肿瘤体积和重量，帕比司他抑制最显著。补充实验还显示其可抑制5-8F、HNE2细胞和鼻咽癌类器官活性。 图5i-k：为S2亚型寻找更具选择性的药物 研究以S1/S2差异蛋白进行第二轮CMAP分析，预测Treprostinil、Evodiamine、Griseofulvin、GW-843682和Emetine等候选药物。ACTBL2/UNC13D在5-8F和HNE2细胞中较高，在HK1和C666-1中较低。除Treprostinil外，其余四种药物对高标志物细胞系表现出更强细胞毒性，提示亚型标志物可能参与药物选择。 不过，这一结论仍较初步。四种细胞系仅以ACTBL2/UNC13D表达代替完整亚型，样本数量有限；不同药物的浓度范围并不一致，观察到的细胞毒性也未必来自亚型特异靶点。进一步研究需要使用患者来源类器官、PDX或更多细胞模型，并通过基因敲降或过表达验证药物敏感性与标志物之间的因果关系。 结论｜CMAP的价值在于缩小药物搜索空间，真正决定可信度的是后续功能验证。帕比司他目前仍属于鼻咽癌的临床前候选药物。 FIG 6｜帕比司他如何增强放疗：MYC—同源重组修复轴 图6a-b：RNA测序指向细胞周期、DNA复制与同源重组修复 HK1细胞接受100 nM帕比司他处理48小时后，E2F靶基因、G2/M检查点、MYC靶基因、DNA复制和同源重组修复通路显著下调。该结果解释了为何HDAC抑制不仅影响染色质状态，也可重塑DNA损伤应答。 图6c-g：MYC位于帕比司他与HR修复之间 帕比司他降低ATR、CHK1、RAD51和BRCA1的mRNA与蛋白表达，同时下调c-MYC。敲低MYC可同步降低四种HR相关蛋白，过表达MYC则产生相反变化；MYC抑制剂MYCi975也复现了该表型。由此，MYC被置于帕比司他与HR通路之间。 图6h-j：HR修复效率下降，DNA双链断裂累积 DR-GFP报告系统显示，帕比司他和MYCi975均降低GFP阳性细胞比例，提示同源重组修复效率下降。与此同时，γH2AX水平升高，说明DNA双链断裂增加。研究还观察到S/G2期阻滞，因此作者认为HR蛋白下降并非由细胞退出S/G2期所致。 图6k-o：与放疗联合产生协同抑瘤作用 帕比司他与电离辐射联合后，γH2AX和凋亡均高于单药或单纯照射。在C666-1裸鼠移植瘤中，8 Gy单次照射联合帕比司他显著降低肿瘤体积和重量，且研究期间未观察到明显体重下降。机制模型可以概括为：帕比司他抑制MYC，降低ATR/CHK1/RAD51/BRCA1表达，削弱同源重组修复，使放疗造成的DNA双链断裂难以被修复，从而增加肿瘤细胞死亡。 这条机制链具有较强连贯性，但仍存在缺口。研究尚未完成“在帕比司他处理背景下恢复MYC能否挽救HR修复和放疗敏感性”的关键救援实验，也未通过ChIP-seq、ATAC-seq或超级增强子分析直接证明HDAC抑制如何压低MYC转录。因而，MYC是重要中介的证据较充分，但其是否为唯一或决定性中介仍需验证。 结论｜帕比司他的核心价值并非单纯抑制增殖，而是制造“同源重组修复缺陷样状态”，使鼻咽癌细胞更难修复放疗造成的DNA损伤。 讨论：这项研究对临床工作意味着什么 1. 分子分型有望补充TNM，但目前不能替代临床分期 TNM分期描述肿瘤负荷与解剖范围，却难以完整解释相同分期患者的复发和转移差异。S1/S2分型提供了另一维度：S1以肿瘤细胞增殖为主，S2则由免疫抑制与基质生态驱动。未来若在多中心队列中得到验证，S2可能用于识别需要更密集随访、强化全身治疗或进入转化试验的高风险人群。 然而，当前分型来自研究级质谱平台，尚缺乏统一的检测流程、固定阈值和前瞻性验证。临床上不能仅凭ACTBL2/UNC13D高表达调整放疗剂量或治疗方案。合理的下一步是将分型与TNM、血浆EBV DNA、影像组学、治疗反应和复发模式联合建模，而不是与现有体系相互替代。 2. S2亚型提示“免疫抑制性炎症”可能是鼻咽癌治疗盲区 S2的免疫评分较高，但CD8⁺T细胞减少，补体、凝血和MMP通路增强。这意味着单纯提高免疫细胞浸润可能不足以恢复抗肿瘤效应。未来研究可围绕C3/C5-C3AR/C5AR1、MDSC募集、Treg扩增与基质屏障开展干预，并评估其与PD-1/PD-L1抑制剂、抗血管生成治疗或放疗的联合。 对临床医生而言，本文最值得吸收的观念是：肿瘤微环境评估不能只看“有无浸润”，还需要识别浸润细胞的功能状态和空间位置。若S2分型最终成立，其临床试验设计应优先纳入免疫抑制解除或髓系细胞重塑策略。 3. 帕比司他联合放疗具有机制合理性，但距离临床应用仍较远 鼻咽癌的治疗优势建立在放疗敏感性之上，复发和远处转移往往与DNA损伤修复增强有关。通过抑制MYC和HR修复提高放疗效应，符合疾病治疗逻辑。潜在适用人群可能包括局部晚期、放疗反应差、复发高风险或HR修复活跃的患者。 真正进入临床前，必须回答三类问题。其一，帕比司他是否同时增强正常黏膜、唾液腺、颞叶和骨髓的放射损伤；其二，给药时序、剂量和分割方式如何兼顾增敏与安全；其三，哪些生物标志物能够预测获益。体重稳定不足以替代系统毒性评价，后续需要血液学、生化、组织病理及长期放射损伤监测。 4. IGF2BP3/FERMT1与ACTBL2/UNC13D更适合走“伴随病理检测”路线 若要转化为临床工具，最现实的方式不是在每位患者中进行全蛋白质组学，而是建立标准化IHC或靶向质谱检测。IGF2BP3/FERMT1可作为疑难诊断的辅助组合；ACTBL2/UNC13D可作为风险分层候选组合。转化过程中应建立批次校准、阳性阈值、观察者一致性和外部质控，并检验其相对于现有临床变量的增量价值。 对科研工作的启发 1. 组学研究需要从“描述差异”走向“可干预闭环” 本文的路线值得借鉴：临床样本发现差异，机器学习压缩标志物，CMAP预测药物，细胞和动物实验验证效应，RNA测序和功能实验解释机制，最后回到放疗联合。高水平组学论文的关键不在于差异蛋白数量，而在于能否形成可验证的因果问题。 2. 蛋白质组与磷酸化蛋白质组应被视为互补信息 单看蛋白丰度容易遗漏“表达不变但活性改变”的靶点。本文通过KSEA识别CDK1/CDK2/AURKA活化，展示了磷酸化组学在寻找激酶靶点和联合治疗中的价值。类似设计可推广至免疫治疗耐药、放疗抵抗和药物压力模型。 3. 分型标志物必须经历“降维—验证—标准化” 全量组学分型难以直接临床化。可行路径是先建立稳定亚型，再筛选少量蛋白组合，随后使用IHC、PRM/SRM靶向质谱或数字病理验证。验证队列必须拥有独立亚型金标准，避免用同一标志物既定义亚型又证明其表达差异。 4. 药物再定位不能止于数据库预测 CMAP只提供“表达谱逆转”的统计线索，无法保证药物在目标组织中的有效性、选择性和安全性。高质量验证应包括多细胞系、类器官、PDX、药效标志物、剂量暴露关系及机制救援实验。本文已完成了重要的体内外验证，但免疫完整模型和患者来源模型仍是下一步。 5. 放疗增敏机制研究应同时评估肿瘤效应与正常组织效应 许多候选增敏剂可以增加肿瘤DNA损伤，却也可能放大正常组织毒性。科研设计中应加入正常鼻咽上皮、成纤维细胞、唾液腺类器官或正常组织照射模型，并通过克隆形成、γH2AX消退、微核、衰老和长期组织学评价计算治疗窗。 结语： 本文建立了鼻咽癌大规模蛋白质组和磷酸化蛋白质组图谱，将肿瘤分为S1与S2两个具有不同预后和免疫生态的亚型，并提出可由少量IHC标志物进行降维识别。其更具转化吸引力的部分，是从组学签名中筛得帕比司他，并将其作用机制连接至MYC抑制、同源重组修复缺陷和放疗增敏。 这项研究尚不足以改变现行诊疗流程，却给出了一个值得持续验证的精准医学框架：用蛋白功能状态解释鼻咽癌异质性，用亚型标志物识别高风险患者，用DNA修复脆弱性寻找放疗增敏策略。后续多中心前瞻性队列、患者来源模型和早期临床试验，将决定这一框架能否真正进入临床。 核心要点｜S1偏增殖，S2偏补体—凝血与免疫抑制；IGF2BP3/FERMT1和ACTBL2/UNC13D是候选组织标志物；帕比司他可通过MYC—HR修复轴增强放疗，但目前仅有临床前证据。

点击上方“蓝字”，关注更多精彩 2026年5月21日，兰州大学第二医院等团队的Huili Ye（第一作者），Long Qin（通讯作者）等研究人员在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF=10.6）上发表了其研究成果：Targeting ATF4 overcomes dual resistance to chemo-immunotherapy in gastric cancer by disrupting the DNA damage response. 01  研究背景 胃癌全球高发且预后较差，5 年生存率不足30%。5-氟尿嘧啶是胃癌主流化疗药物，PD-1抑制剂为常用免疫疗法，但二者联合方案常因化疗耐药、肿瘤免疫逃逸形成双重抵抗，且目前缺少可靠的疗效预测标志物，相关协同机制尚不明确。已知DNA损伤应答通路、HSPA、ATF4均与肿瘤耐药及免疫调控相关，但三者的关联通路未被阐明。本研究借助多组学及多种体内外模型，旨在探究胃癌放免双重耐药的分子机制，挖掘核心调控基因，寻找新型预后标志物与治疗靶点。 02  方案设计 实验材料：胃癌及癌旁新鲜组织 涉及主要技术：ChIP-seq、scRNA-seq、RNA-seq 技术路线 03 主要结果展示 3.1 筛选5-FU耐药细胞亚群，确定ATF4为核心驱动分子 对胃癌单细胞转录组数据进行质控、降维与聚类，最终得到31个细胞亚群，注释为13种细胞类型。差异基因及通路富集分析显示，耐药细胞群的差异基因显著富集于DNA损伤应答通路；DNA损伤修复评分结果证实，5-FU耐药细胞的修复活性显著高于敏感细胞。细胞组分分析发现，5-FU 敏感群中CD8⁺T细胞占比更高，耐药群则以上皮细胞为主。进一步分析耐药上皮细胞中差异基因与CD8⁺T细胞功能的关联性，并结合患者生存数据，最终锁定ATF4为关键候选基因。单细胞表达分析证实，ATF4在5-FU耐药上皮细胞中显著上调。 图1 3.2 ATF4在转录水平直接上调HSPA9，调控DNA损伤应答通路 ATF4的ChIP-seq结果显示，ATF4结合峰主要富集于基因启动子区域，结合基因显著富集于DNA复制、DNA损伤应答通路；在所有DDR相关靶基因中，HSPA9的上调倍数最高（倍数变化= 82.45）。序列分析、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告实验证实：ATF4可特异性结合HSPA9启动子区域的保守序列，在转录水平直接激活HSPA9表达；ATF4敲除后，胃癌细胞中HSPA9的mRNA及蛋白表达水平显著降低。 图2 3.3 ATM是ATF4-HSPA9 轴调控DNA损伤修复的关键下游效应蛋白 基于HSPA9高低表达胃癌样本的转录组分析发现，DDR核心激酶ATM在HSPA9高表达组显著富集。免疫共沉淀实验证实，HSPA9与ATM存在直接蛋白相互作用。5-FU处理可促进HSPA9向细胞核转位，并激活ATM（Ser1981 位点磷酸化水平升高）。蛋白半衰期、泛素化实验证实，HSPA9可通过抑制ATM的泛素-蛋白酶体降解，延长ATM蛋白半衰期、维持ATM蛋白稳态。使用ATM特异性抑制剂KU-55933进行阻断实验：抑制ATM活性后，HSPA9介导的DNA修复能力、5-FU 耐药表型均被逆转；同时，ATM阻断可恢复CD8⁺T细胞的杀伤功能，下调T细胞耗竭标志物及肿瘤细胞PD-L1表达。该结果明ATM是HSPA9发挥功能的必需下游分子。 图3 04 文章总结 该研究依托ChIP-seq、scRNA-seq、RNA-seq等多组学技术，探究胃癌化疗联合免疫治疗双重耐药机制。通过多组学整合分析，筛选出应激转录因子ATF4是介导5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药与CD8⁺T细胞耗竭的核心分子。机制实验证实，ATF4可直接结合并转录激活下游HSPA9，后者通过结合、稳定DDR通路关键激酶ATM，增强DNA损伤修复能力，一方面造成化疗抵抗，另一方面诱导免疫抑制微环境。体内外模型均验证，敲除ATF4可显著恢复肿瘤对5-FU联合抗PD-1治疗的敏感性。临床数据显示，ATF4高表达患者预后更差，可作为疗效预测标志物。该研究明确ATF4-HSPA9-ATM信号轴为双重耐药关键通路，为胃癌逆转耐药、精准治疗提供了新靶点与理论依据。 概念： 染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是一种适用于研究白质与生物体细胞中DNA相互作用的经典方法，采用特异性抗体将目的蛋白进行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所结合的基因组DNA片段也富集下来。通过与高通量测序技术的结合，对ChIP后的DNA产物进行测序分析，从全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点，以高效率的测序手段得到高通量的数据结果。  实验方法： （1）交联固定：收获植株后，植物组织立即固定，以交联蛋白质-DNA相互作用。甲醛是最常用的交联剂，交联完成后加入甘氨酸以终止反应； （2）染色质片段化：通过超声破碎或者微球菌核酸酶消化将染色质打断为200-500bp的片段； （3）孵育：抗体免疫沉淀，实验组加入预先结合了特异性抗体的beads进行孵育，最终形成beads-抗体-目的蛋白-DNA复合物； （4）解交联：洗脱得到抗体-目的蛋白-DNA复合物，去除非特异性结合的DNA片段，使用蛋白酶K/NaCl处理进行解交联，最后将DNA片段纯化回收 （5）准备好ChIP后的DNA样品用于ChIP-seq建库，质检及测序。。 应用方向： 1.转录因子全基因组结合位点鉴定； 2.组蛋白修饰图谱绘制； 3.表观药物靶点发现与机制研究。 奥百诺CHIP-seq收样指南： END 公司简介 重庆奥百诺生物科技有限公司成立于2019年12月，是一家专注于以表观遗传多组学联合检测、分析为导向的高新技术企业。公司包含表观多组学、单细胞转录组、空间转录组、蛋白质组学与代谢组等核心产品，旨在为生命科学研究和生物医药领域提供专业高效的服务。 公司核心团队来自于北海道大学、武汉大学，西南大学，重庆大学，重庆邮电大学等高校的研究生和博士生，核心人员具有在测序行业8年及以上的工作经验，包括生物信息分析人员，营销人员及产品科学顾问等，为公司在客户服务端提供强有力的保障。 本公司可提供以下科研服务：Hi-C、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq、HiChIP、Meta-HiC、PCHi-C、WGBS、Fiber-seq、RNA-seq、scRNA-seq、scATAC-seq、空转及多组学联合分析等。