NRF2 Inhibitors(Dracen Pharmaceuticals)

11月5日，成都医学院陈虎研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“ΔNp63α promotes radioresistance in esophageal squamous cell carcinoma through the PLEC-KEAP1-NRF2 feedback loop”，在本研究中，研究人员发现ΔNP63α在ESCC中高度表达，并与放射耐药相关。此外，ΔNP63α在放射耐药中发挥关键作用，可直接激活PLEC的表达。PLEC与KEAP1竞争性相互作用，导致NRF2从KEAP1中释放并从细胞质转移到核内，在那里激活基因表达以促进ROS消除。此外，放射治疗诱导的ROS还可通过NRF2激活ΔNP63α的表达。通过抑制NRF2，可有效改善裸鼠的放射敏感性。综合研究结果，强烈表明ΔNp63α/PLEC/NRF2轴在ESCC的放射耐药中起着关键作用，这表明靶向NRF2是治疗ESCC的一种有前途的治疗方法。 https://www.nature.com/articles/s41419-024-07194-4 背景信息 01 食管癌是全球第六大癌症相关死亡原因。根据组织病理学特征，食管癌可分为鳞状细胞癌（ESCC）和腺癌（ESCA）两种类型。全球近70%的食管癌病例发生在中国，其中90%为ESCC病例。在过去的十年中，靶向ESCC的早期诊断和治疗的临床方法已经发生了演变，在所有阶段都出现了新的范式取代传统方法。然而，超过50%的ESCC患者对目前的治疗方法反应不佳，大多数患者死于复发性癌症。ESCC被认为对抗癌疗法具有耐药性。越来越多的证据表明，ESCC容易产生放射性耐药，导致放疗失败。因此，了解放射性耐药的机制对于开发ESCC的新型治疗策略至关重要。 p63蛋白是由TP63基因编码的，是p53/p63/p73家族的成员，是表皮分化过程中的关键调节因子。p63也是鳞状细胞癌（SCC）中依赖于谱系的癌基因。TP63基因通过不同的启动子产生两种主要的异构体，TAp63和N-端截短的ΔNp63。ΔNp63α是TP63在表皮细胞和SCC（包括ESCC）中表达的主要异构体。ΔNp63α通过激活β-连环蛋白/c-Myc信号通路来促进ESCC细胞的侵袭和转移。ΔNp63α还通过Akt信号通路或DKK3/CKAP4促进ESCC细胞的生长。据报道，ΔNp63α在ESCC患者中的表达与生存率相关。然而，ΔNp63α是否参与ESCC的治疗耐药目前尚不清楚。 ΔNp63α通过降低放疗诱导的ROS来促进食管鳞癌的辐射耐药 02 为了评估ΔNp63α在放疗中的关键作用，研究人员首先筛选了一组ESCC细胞系，并选择了表达低水平（KYSE30和KYSE150）和高水平（KYSE180和KYSE450）ΔNp63α的两个细胞系。接下来，研究人员对细胞进行照射并测量细胞存活率。如图1B所示，ΔNp63α表达水平较高的KYSE450细胞在照射后表现出较高的存活率，而ΔNp63α表达水平较低的KYSE150细胞则没有。10 Gy的照射导致KYSE150细胞中ΔNp63α蛋白轻微升高，但未影响KYSE450细胞中的ΔNp63α表达。相反，ΔNp63α敲低显著降低了细胞在放疗后的存活率。另外，野生型ΔNp63α的过表达，但不是转录激活缺陷型突变体（R304W），在放疗时显著提高了细胞存活率。这些结果表明，ΔNp63α在ESCC的放疗耐药中起着关键作用。 图1：ΔNp63α通过抑制放疗诱导的ROS来促进辐射耐药性 放射疗法主要通过离子辐射和活性氧分子（ROS）引起的DNA损伤来发挥治疗作用，通过自由基破坏DNA的化学键。因此，DNA损伤检查点响应在细胞辐射敏感性中起着关键作用。在ΔNp63α过表达的KYSE150细胞中，由辐射引起的检查点蛋白ATM和CHK2的激活磷酸化显著增加，而在ΔNp63α敲除的KYSE450细胞中则降低，这表明ΔNp63α促进对DNA损伤的检查点激活。此外，在ΔNp63α敲除的KYSE450细胞中，由辐射引起的活性氧分子显著升高。通过N-乙酰半胱氨酸（NAC）清除活性氧分子可显著提高细胞存活率，并抑制由辐射引起的p-AMT和p-CHK2的表达。据报道，ΔNp63α激活RAD51（一种重组酶）以维持基因组完整性。研究人员在ΔNp63α敲除的KYSE450细胞中恢复了RAD51的表达，发现RAD51在一定程度上，但并非完全逆转了辐射治疗后的细胞存活率。然而，RAD51的恢复结合ROS清除完全恢复了辐射引起的细胞生存抑制，这表明RAD51在不解决ROS诱导的损伤的情况下并不足以发挥作用。总之，这些数据表明ΔNp63α通过减少放疗诱导的ROS来促进放射耐药性。 靶向NRF2抑制ΔNp63α介导的辐射耐药 03 为了研究激活或抑制NRF2对ROS水平和细胞存活率的影响，研究人员分别用SFN或ML385处理KYSE150或KYSE450细胞。研究显示，SFN激活NRF2明显降低了ROS水平，尽管这并未显著改善细胞存活率。相反，ML385抑制NRF2导致ROS水平显著升高，细胞存活率显著降低。这些结果表明，较低的内源性ROS水平可能不会显著影响细胞存活率。然而，在KYSE150细胞接受辐射治疗后，随着ROS水平的升高，细胞存活率明显降低。使用SFN或NAC可有效中和辐射诱导的ROS并显著改善细胞存活率。相反，ML385抑制NRF2进一步升高了辐射诱导的ROS。尤其是，NAC治疗几乎完全恢复了辐射后的细胞存活率。这些发现强调了NRF2在维持ROS水平和支持细胞存活方面的关键作用。 为了研究ΔNp63α和NRF2对食管鳞状细胞癌（ESCC）进展的影响，研究人员通过向裸鼠皮下注射转染的ESCC细胞来建立异种移植模型，并通过照射和NRF2抑制剂ML385进行治疗。研究显示，ΔNp63α的过表达可促进肿瘤生长和体重增加。照射显著降低了肿瘤生长和体重，而过表达ΔNp63α则在照射后促进肿瘤生长。照射结合NRF2抑制可显著抑制ΔNp63α介导的肿瘤生长，表明NRF2抑制可对抗ΔNp63α介导的辐射耐药。此外，免疫组织化学检测显示，照射后，ΔNp63α增加了Ki67+细胞并减少了Cleaved Caspase-3+（CC3）凋亡细胞，而NRF2抑制剂与照射结合则显著减少了Ki67+细胞并增加了CC3+凋亡细胞。这些结果表明，NRF2抑制可对抗ΔNp63α介导的ESCC辐射耐药。 结论 04 本研究结果表明，ΔNp63α/PLEC/NRF2信号通路和抗氧化防御机制可能是癌症治疗的有前景的治疗策略。（转化医学网360zhyx.com） 【参考资料】 https://www.nature.com/articles/s41419-024-07194-4 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。

蛋白质与小分子相互作用的调节是近年药物发现中发展最快的领域之一。在这篇综述中，讨论了过去十年（2014-2023）的进展，重点是分子胶（MG）——通过稳定天然蛋白相互作用或诱导蛋白新形态相互作用来诱导接近的单价小分子。分子胶进一步可分为三大类：降解型分子胶、非降解性 分子胶 或 蛋白互作稳定剂，以及诱导自缔合(induce self-association)的分子胶。这里首先介绍降解型分子胶的分子机制。 1. 背景介绍 蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络在生物过程中发挥着核心作用，包括细胞信号传导、稳态、细胞增殖和分化。它们在疾病中经常失调，因此已成为化学生物学和药物发现的重要焦点。 在过去十年中，PPI 调节领域迅速发展并扩展到新的、令人着迷的方向。稳定（而不是抑制）PPI 有可能靶向本质上无序的蛋白质（IDP）。然而，在与蛋白质伴侣结合后，无序结构域可能在 PPI 界面上形成有序且可配位的结构。此外，靶向蛋白质对可以调节与许多蛋白相互作用的支架蛋白的单一复合物。 最近出现了许多术语来描述这些新兴概念，包括“化学诱导接近”、“分子胶”、“分子胶降解剂”和“PPI 稳定剂”。尽管这些模式存在根本差异，但这些术语经常可以互换使用。在这里，我们将“分子胶”（MG）视为在 PPI 界面上协同结合的单价小分子。通常，分子胶 对至少一种蛋白质伴侣具有低或无法测量的亲和力；结合后，它们增强或加强界面处的相互作用。分子胶 可以与天然或非天然/新形态的PPI 结合。术语“分子胶降解剂”（MGD）是指 分子胶 的亚类，其中结合配偶体是 E3 泛素连接酶（E3 连接酶）。E3 连接酶将泛素转移到底物蛋白上，通常通过蛋白酶体靶向该蛋白进行降解。降解型分子胶 诱导天然或非天然目的蛋白 (POI) 被 E3 泛素化，并导致蛋白质的蛋白酶体降解。 “PPI 稳定剂”是 分子胶 的另一种亚型，通常是指在没有分子胶的情况下具有内在亲和力的两种蛋白质伙伴，表明天然 PPI 是靶标。在这里，将 PPI 稳定剂与单一蛋白质的变构稳定剂区分开来。分子胶的另一种亚型包括诱导自缔合的化合物，其结果是靶标降解或不降解。在这种情况下，分子胶的结合通常会以意想不到的方式产生高聚蛋白质组装。形成的（三元）复合物与蛋白质靶标的天然状态显著不同。 文献中没有使用特定术语来描述这些分子胶，但偶尔会出现术语“靶标聚合”。在我们看来，“靶标聚集”与能量稳定的蛋白质组装体的形成有关，其中错误折叠或错误组装的蛋白质聚集，通常与疾病表型相关，而不是与化合物诱导的状态相关。最后，术语“诱导接近”更广泛，尽管在某些情况下适用于分子胶，但它还包括不一定属于胶合型作用机制的变构效应。 2. 天然类降解型分子胶  2001 年，发现植物激素生长素促进转录抑制因子AUX/IAA的降解。2007 年，解析了基于生长素的结构的作用机制。晶体结构表明，植物生长素通过与 AUX/IAA 结合位点下方 TIR1 的 β 螺旋桨结构域结合，增强了 AUX/IAA 和 TIR1 之间形成的弱相互作用，TIR1 是 E3 连接酶复合物 SCFTIR1 的一部分。2010 年，研究表明植物激素茉莉酸甲酯通过类似的机制发挥作用，并通过招募E3连接酶SCFCOI1 来降解转录阻遏物JAZ。这些早期的例子表明小分子能够诱导接近 E3 泛素连接酶并降解结合配偶体。激发了对天然降解胶的鉴定的进一步研究。例如，2020 年，报道了链霉菌衍生的手霉素聚酮化合物（手霉素 A 和明日香霉素）可作为共价降解型分子胶，靶向假定的 E3 连接酶UBR7 的 Cys374，并促进与新底物肿瘤抑制因子TP53 的相互作用。  3. 人工合成降解型分子胶 1.  降解型分子胶CRL4CRBN 2010 年，首次描述了人工合成的降解型分子胶 的作用机制。使用沙利度胺包被的珠子对 HeLa 细胞提取物进行亲和纯化，然后在体内模型中进行实验，他们鉴定了cereblon (CRBN)，它是 CUL4-RBX1-DDB1-CRBN (CRL4 CRBN ) E3 泛素连接酶作为药物沙利度胺的分子靶点。沙利度胺于 1957 年在西德被用作孕妇的止吐剂和镇静剂，但由于其致畸副作用于 1962 年从市场上撤出。目前，沙利度胺及其类似物（泊马度胺、来那度胺，也称为免疫调节药物(IMiDs)或CRBN E3连接酶调节药物(CELMoDs）用于治疗多发性骨髓瘤和其他血液恶性肿瘤。2014年，Chamberlain等人的关键结构研究。阐明了来那度胺、沙利度胺和泊马度胺与 CRBN-DDB1（DNA 损伤结合蛋白-1，DDB1-CUL4-Rbx1泛素连接酶 [CRL4] 的接头蛋白成分）的三元复合物的结构。晶体学数据表明，IMiD 结合在 CRBN 表面的浅疏水口袋中，包含三个色氨酸残基（Trp380、Trp386、Trp400）。这个浅袋容纳了戊二酰亚胺环，它与 His378 和 Trp380 (CRBN) 形成氢键。异吲哚酮环暴露在 CRBN-来那度胺复合物的表面，表明该部分参与了用于底物招募的新形态界面的形成。与CRBN 结合后，IMiD 抑制内源性 CRL4 CRBN 底物的泛素化，同时重新编程E3连接酶以靶向新蛋白质进行降解。IMiD 促进与 C2H2 型锌指转录因子 Ikaros (IKZF1) 和 Aiolos (IKZF3)的新形态相互作用，导致它们被 E3 连接酶 CRL4  CRBN 泛素化以及随后的蛋白酶体降解。  后续研究表明，IMiD 具有不同的降解特征，并且可以招募不同的新底物，包括酪蛋白激酶 1A1 (CK1α) 和翻译终止因子 GSPT1。晶体学研究支持这样的假设：新相互作用形成的特异性确实是由 IMiD/CRBN 二元结构中化合物的溶剂暴露面积决定的。来那度胺/DDB1-CRBN/CK1α的晶体结构表明这种结合是协同的，因为CK1α与CRBN的结合严格依赖于来那度胺的存在。CRBN 和来那度胺为位于激酶 N 叶的 CK1α β-发夹环提供了结合界面。除了前面描述的与 CRBN 的相互作用外，CK1α 还通过残基 Ile37、Thr38和 Gly40 与化合物的溶剂暴露部分相互作用。 就CC-885而言，一种具有改善的抗肿瘤活性的新型 CRBN 调节剂 GSPT1 被招募到 CRL4 CRBN 并被降解。晶体学显示 CC-885 保持了与 CRBN 的关键相互作用，并与 Glu377 (CRBN)、Val570 和 Gly575 (GSPT1) 形成了额外的相互作用，以及 CRBN 和 GSPT1 之间的直接相互作用，从而参与GSPT1 的招募。 介导GSPT1 与 CRBN 结合的关键特征是含有关键甘氨酸残基(Gly575) 的表面转角。还报道了一种可改善 Ikaros 和 Aiolos 降解的 CRBN 调节剂CC-220。 戊二酰亚胺环与 CRBN 具有类似的结合模式，而溶剂暴露区域中的其他环则与 CRBN 形成更多相互作用（Glu377、Pro352、Phe102、Phe150）这些额外的相互作用与观察到的 CRBN 亲和力增加相关。 总的来说，对 IMiD 招募看似不同的新底物的观察得出了降解决定子假说。尽管 Ikaros、Aiolos、CK1α 和 GSPT1 在结构和功能上不相关，并且缺乏明显的序列同源性，但同源序列的存在相互作用的结构特征（降解决定子）由关键位置含有甘氨酸残基的特定环定义，足以招募它们。关键的甘氨酸突变为丙氨酸导致功能丧失。进一步的研究表明，IMiD 被定义为降解几个 C2H2 锌指转录因子、 和人类 C2H2 锌指片段。 沙利度胺及其代谢物 5-羟基沙利度胺的致畸作用与其诱导胚胎转录因子 SALL4 的降解有关。 此后不久，SALL4-pomalidomide-CRBN-DDB1的晶体结构得到解析，为设计降低致畸风险的IMiD提供了合理的基础。  新型 CRBN 调制剂的合理优化催生了新一代 IMiD/CELMoD。2020 年报道了两种靶向转录因子 ZBTB16 的 CELMoD（CC-3060 和CC-647）。 有趣的是，这两种化合物识别ZBTB16 不同锌指结构域（1 和 3）内不同的结构降解决定子。 随后发现了 CC-92480，CC-92480 是一种专为高效快速降解动力学而设计的 CELMoD，目前正在进行多发性髓瘤的临床试验。还报道了具有更高效力和选择性的改进的 GSPT1 降解剂，例如 ZXH-1-161  和 CC-90009 。CC-90009是第一个选择性靶向 GSPT1 的临床候选药物。在结构上，CC-90009 与 CC-220 的结合模式相似，包括与 CRBN 和 GSPT1 的相互作用。一个显著的结构差异是缺乏与 Glu377 (CRBN) 的相互作用；相反，与 His353 形成了新的键。总之，这些晶体学研究对于定义 IMiD 与 CRBN 及其新底物的结合模式，以及基于降解决定子假说建立合理的药物开发至关重要。 2022 年，Watson 等进行了一项开创性研究， 表明IMiD/CELMoD化合物调节CRBN的构象。使用冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 将 DDB1-CRBN 的 apo 复合物与有或没有新底物的 CELMoD-DDB1-CRBN 的结构进行比较。CELMoD 与 CRBN 的沙利度胺结合域的结合足以诱导 CRBN 从开放构象到晶体结构中可见的闭合构象的变构重排。使用 CELMoD 在晶体结构中观察到的闭合构象使得 CELMoD 的结构引导优化能够产生更有效和更具新底物特异性的化合物。值得注意的是，在冷冻电镜研究中，Ikaros 仅与闭合 CRBN 构象相关。三种化合物（pomalidomide、iberdomide [CC-220] 和 mezigdomide [CC-92480]）对观察到的 CRBN 构象有明显影响，这与化合物的效力相关。泊马度胺仅足以诱导约 20% 的颗粒形成 CRBN 的闭合构象。Iberdomide 的亲和力提高了约 20 倍，Ikaros 降解能力提高了约 24 倍，将近 50% 的颗粒转变为 CRBNclosed 构象异构体。对于美齐格多胺(mezigdomide)，它能诱导新底物快速降解，并且对对来那度胺和/或泊马度胺的主要治疗不再有反应的复发或难治性患者有效，其100% 的颗粒处于闭合构象。因此，该研究阐明了变构的神秘作用以及 CRBN 降解型分子胶 构象控制的重要性，从而可以进一步合理设计降解型分子胶，提高新底物选择性和功效。 2. 降解型分子胶（ CRL4DCAF15 ） 在 IMiD/CELMoD 之后，发现将新底物招募到 E3 连接酶的第二种分子胶是剪接抑制剂磺酰胺（SPLAMS：indisulam、tasisulam、E7820 [NSC 719239] 和氯喹喔啉磺酰胺 [CQS 或NSC 339004]）。 2017年，两个研究小组报告说，SPLAMS促进了RBM39（RNA结合基序蛋白39，也称为CAPERα）向E3泛素连接酶CUL4-RBX1-DDB1-DCAF15（CRL4DCAF15 ）的募集，导致RBM39多聚泛素化和蛋白酶体降解。生化和结构研究，包括通过晶体学解析的三元复合物和两种冷冻电镜结构，并阐明了分子胶作用机制。这些研究表明磺胺类药物对单个蛋白质的结合亲和力较低，并强调了磺胺类药物与三元复合物的结构互补性。例如，DCAF15-DDB1-DDA1 复合物的 indisulam Kd 值 >50 μM，而 RBM39 存在时其Kd值下降至 187 nM，增强 >100 倍（由 ITC 测定）。在所有三项结构研究中，芳基磺酰胺协同结合，促进 DCAF15 与 RBM39 (RBM39 RRM2 ) 的RNA 识别基序 (RRM) 的结合，并通过功能化浅层、非- DCAF15 表面的保守空腔。  RBM39 与 DCAF15-磺酰胺界面的结合和募集是通过 RBM39 的单个 α 螺旋介导的，该螺旋通过主链羰基氧和侧链与 DCAF15-磺酰胺相互作用。RBM39 RRM2 -DCAF15 PPI (1,150 Å2 ) 的埋藏表面积能够补偿化合物单独与 DCAF15 的弱结合亲和力。所有报道的 RBM39 降解剂共有的芳基磺酰胺部分通过氧原子与 DCAF15 的 Ala234 和Phe235 主链形成氢键。通过磺酰胺的氮原子与 RBM39 的 Thr262 和 Asp264 形成水介导的氢键。此外，DCAF15-RBM39 侧链之间广泛的非极性疏水网络形成了高亲和力的三元复合物。值得注意的是，在冷冻电镜结构中，DCAF15 与 RBM39 的第二个RRM 结构域接合，其具有扩展的非保守表面积，这在 CRL（Cullin-Ring E3 连接酶）底物受体中并不常见。除了 RBM39 之外，在检测到的约 11,000 个蛋白质中，只有所有相互作用残基具有 100% 序列同一性的 RBM23 被降解。 2020 年，报道了一种可扩展的化学分析方法，作为使用 E3 连接酶不可知方法发现降解型分子胶的合理策略。该策略利用了CRL的 neddylation 被激活的要求，通过比较低水平neddylated(UBE2MmutKBM7) 与 高水平的neddylation  (KBM7) 的细胞对化合物的敏感性- 介导的细胞死亡。在野生型和 UBE2M mut KBM7细胞中筛选约 2,000 个细胞抑制/细胞毒性小分子，鉴定出化学骨架，这些化学骨架似乎在功能上依赖于不间断的 neddylation 水平。其中，一种新型磺酰胺 dCeMM1 被鉴定为能够重编程 CRL4 DCAF15 连接酶并选择性降解RBM39，而不影响 RBM23。 令人兴奋的是，靶向 CRL4 DCAF15 的 降解型分子胶 在化学结构、E3 连接酶靶标、新底物结构和 PPI 界面大小方面与 IMiD 不同。两种完全不同类别的 降解型分子胶 的存在表明，如果人们知道如何寻找它们，那么分子胶可能无处不在。 3.  细胞周期蛋白 K 的降解型分子胶 另一种发现新的降解型分子胶的成功方法侧重于已知抑制剂，以识别可疑缺失的降解蛋白。2020 年，三项独立且几乎同时进行的研究报道了结构多样的小分子，这些小分子诱导了细胞周期蛋白的降解。研究人员假设细胞毒性化合物可以根据所需但未鉴定的泛素连接酶成分的表达来证明细胞系选择性。他们进行了系统的数据库挖掘，将 4,518 种临床和临床前小分子的细胞系敏感性与 578 种人类癌细胞系中 E3 连接酶成分各自的 mRNA 水平关联起来。他们观察到细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 抑制剂 CR8 的细胞毒性与 CUL4 接头蛋白 DDB1 的mRNA 水平之间的相关性。进一步的机制研究证明，CR8 通过诱导 CDK12/cyclin K 和 DDB1 之间复合物的形成而发挥 降解型分子胶 的作用。值得注意的是，在 ITC 实验中，DDB1+CDK12 形成了一个弱蛋白质复合物，具有一个大的、结构互补的界面(2,100 Å2 )，基础亲和力约为 50 μM。CR8 将相互作用增强了 500 至1,000 倍 (Kd = 100–500 nM)。在结构上，CR8 占据 CDK12 的 ATP 结合位点，桥接 CDK12-DDB1 界面并与 DDB1 的 β 螺旋桨结构域之一形成离散接触。  CR8 的关键结构特征是疏水性苯基吡啶环系统，该系统暴露在激酶表面的溶剂中，并通过与 Arg928 (DDB1) 相互作用诱导与连接酶接头 DDB1 形成复合物。细胞周期蛋白 K 结合在 CDK12 的反面，不与DDB1 直接相互作用。值得注意的是，CDK12 不是组成型E3 连接酶组分。结构引导突变分析和 TR-FRET 分析表明，在 CR8 存在的情况下，CDK12 承担了胶诱导底物受体的角色，并将细胞周期蛋白 K 置于通常由 CRL4 底物占据的位置；因此，与典型 DCAF 底物受体的结合是相互排斥的。 Mayor-Ruiz 等人采用了不同的方法。在连接酶活性广泛敲除的hyponeddylated细胞模型中建立了一种比较化学筛选测定法。如前所述，该策略通过降解 RBM39 的磺酰胺 dCeMM1 的鉴定得到验证。此外，三种小分子 (dCeMM2/3/4) 被确定依赖于功能性 CRL 来发挥毒性。细胞处理和定量表达蛋白质组学表明，dCeMM2/3/4 严重破坏了细胞周期蛋白 K 的稳定性，并且更轻微地破坏了相关激酶 CDK12 和 CDK13 的稳定性。通过正交测定的进一步验证，包括定量蛋白质组学、功能基因组学、药物亲和色谱法和细胞邻近测定法，揭示了化合物诱导的 CDK12-细胞周期蛋白 K 和DDB1-CUL4B 的关联。 与此同时，Lv 等报道了一种NRF2 抑制剂的高通量表型筛选方法，该方法令人惊讶地鉴定出 HQ461，即相同 CDK12/细胞周期蛋白 K/DDB1 复合物的降解型分子胶。基于超突变的功能获得筛选、CRISPR-cas9 筛选、生化测定和交联证实了分子胶作用机制。 2021 年，报道了一个由 80,000 个小分子组成的文库的高通量筛选，该文库对来自患者的转移性结直肠癌类球体的异质细胞集的活性筛选。后续转录组学和化学蛋白质组学验证了化合物 NCT02 是一种分子胶，可诱导细胞周期蛋白 K 泛素化及其伴侣 CDK12 的蛋白酶体降解。与 CR8 的显著差异是 NCT02 缺乏可检测的 CDK12 激酶抑制活性。 2022 年，Jorda等报道了一系列基于3,5,7-取代吡唑[4,3-d]嘧啶的CDK抑制剂。其中，化合物24 诱导细胞周期蛋白K的降解。分子对接研究表明与CR8有类似的结合模式。必须指出的是，除了CR8的晶体结构外，原始研究中没有报道其他细胞周期蛋白K降解剂的晶体结构。 这些研究的一个显著观察结果是，具有相同分子胶作用机制的降解细胞周期蛋白 K 的化合物具有结构多样性。 2023 年，Kozicka 等彻底研究了细胞周期蛋白 K 降解剂的结构-活性关系 (SAR)。对 90 多种结构不同的化合物进行了评估；首先，在体外使用 TR-FRET 测定法测量小分子存在下 CDK12-细胞周期蛋白 K 和DDB1 之间的复合物形成，然后进行细胞测定。其中 40 种化合物对 CDK12-DDB1 复合物表现出低纳摩尔亲和力（体外<100 nM），并且通过晶体学解析了 28 种三元复合物的结构。DDB1 中的 Arg928 作为粘合部分的热点残基的作用得到了证实。这些分子胶优先通过 π-阳离子与Arg928相互作用，在某些情况下通过氢键和疏水相互作用。总体而言，不同大小的芳烃和杂芳烃甚至较弱的脂肪族基团能够与 Arg928 结合并实现 CDK12/DDB1 相互作用。π-阳离子与 DDB1 相互作用的适当电子和空间效应对于形成高亲和力复合物至关重要。值得注意的是，与铰链激酶残基（CDK12 中的 Met816、Glu814、Tyr815）相互作用的嘌呤部分无法独立增强粘合活性，而仅在 Arg928（DDB1 中）被适当靶向的情况下才具有协同作用。甚至更小的类似物（如化合物 919278所示）缺乏典型的基于嘌呤的激酶抑制剂部分，也能够与激酶铰链残基和 Arg928 形成足够的相互作用，从而充当降解型分子胶。这些观察结果表明，细胞周期蛋白 K 降解剂的最小药效基团是铰链相互作用的受体-供体基序（这对于激酶抑制剂来说很常见），以及一个额外的粘合部分，包括从氢键供体延伸的芳香系统。 4.  β-catenin的分子胶降解剂 2019 年，描述了分子胶的鉴定和合理设计，该 分子胶恢复了致癌转录因子 β-catenin 与其同源 E3 连接酶 SCF β-TrCP 之间的天然 PPI。WNT 通路在癌症中经常失调，多种机制导致磷酸降解子残基 Ser33 和 Ser37 处的β-catenin 磷酸化减少。磷酸化的丧失会损害其有效结合 SCF β-TrCP 的能力并阻止其降解。利用 β-catenin 磷酸化残基和重组 β-TrCP/Skp1 复合物（以下简称β-TrCP）开发了荧光偏振 (FP) 结合测定。单磷酸化肽（磷酸化 Ser33/Ser37）的结合亲和力比未磷酸化或磷酸化 Ser37 肽更适合 HTS 测定的开发。通过筛选 350,000 种化合物库，鉴定出四种结构相似的化合物，其中包括 NRX-1532。该化合物通过 TR-FRET 和SPR 测定进一步验证。β-catenin/β-TrCP/NRX-1933（一种结构相似但更易溶解的四唑类似物）三元复合物的晶体结构已被解析。该化合物结合在 PPI 界面上并与双方形成相互作用。三氟甲基吡啶酮基团填充了一个额外的小疏水袋，该疏水袋由于缺乏 Ser37 磷酸化而显露出来，并充当磷酸盐模拟物。 TR-FRET 测定进一步支持了协同结合模式。 晶体结构表明 β-连环蛋白肽的 N 末端结合不紧密，可能会揭示更大且更容易成药的结合袋。这一假设已经用 NRX-2633 等包含苯氧基取代基的化合物进行了测试，这些化合物能够诱导 Leu31重排，从而产生更大的口袋。NRX-2633 在结合测定中显示出改进的效力和增强的协同性（13 倍）。苯氧基取代基对二芳基硫醚进行结构引导优化，得到了类似物 NRX-252114和 NRX-252262，两种效力均显著提高（NRX-252114的 EC 50 值为6.5 nM，NRX-252262 的 EC 50 值为 3.8 nM ；与筛选命中相比，提高了 >10,000 倍）和协作性（>1,500 倍）。这两种化合物在细胞测定中进行了进一步评估，能够增强 S37A 突变型 β-连环蛋白与 β-TrCP 的结合，增加突变型 β-连环蛋白的 K48 连接泛素化，并恢复其蛋白酶体降解。 该研究强调了协同性的重要性，因为分子胶与三元复合物结合，但不单独与 β-TrCP 结合。如此处所示，用 分子胶 恢复天然 PPI 的一个重要优势是，底物上存在天然存在的界面和可接近的赖氨酸残基，可用于泛素化和降解。此外，分子胶 对 β-连环蛋白的突变形式具有选择性。因此，正常组织中的野生型功能不应受到该策略的影响。这项工作代表了分子胶靶向天然底物-E3 连接酶相互作用的第一个合理例子。该策略可应用于因 PPI 界面突变而减弱的其他天然 PPI。β-连环蛋白的例子还凸显了弱质子泵抑制剂生化筛选的潜在陷阱；也就是说，如果结合太弱而无法检测，则可能难以开发检测方法，并且生物学相关性可能会受到损害。 参考： https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(24)00130-2 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓