Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a hematological malignancy characterized by aberrant proliferation and accumulation of lymphoid precursor cells within the bone marrow. The tyrosine kinase inhibitor (TKI), imatinib mesylate, has played a significant role in the treatment of Philadelphia chromosome-positive ALL (Ph + ALL). However, the achievement of durable and sustained therapeutic success remains a challenge due to the development of TKI resistance during the clinical course.The primary objective of this investigation is to propose a novel and efficacious treatment approach through drug repositioning, targeting ALL and its Ph + subtype by identifying and addressing differentially expressed genes (DEGs). This study involves a comprehensive analysis of transcriptome datasets pertaining to ALL and Ph + ALL in order to identify DEGs associated with the progression of these diseases to identify possible repurposable drugs that target identified hub proteins.The outcomes of this research have unveiled 698 disease-related DEGs for ALL and 100 for Ph + ALL. Furthermore, a subset of drugs, specifically glipizide for Ph + ALL, and maytansine and isoprenaline for ALL, have been identified as potential candidates for therapeutic intervention. Subsequently, cytotoxicity assessments were performed to confirm the in vitro cytotoxic effects of these selected drugs on both ALL and Ph + ALL cell lines.In conclusion, this study offers a promising avenue for the management of ALL and Ph + ALL through drug repurposed drugs. Further investigations are necessary to elucidate the mechanisms underlying cell death, and clinical trials are recommended to validate the promising results obtained through drug repositioning strategies.

2024-06-01·JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY

Bridging the maytansine and vinca sites: Cryptophycins target β-tubulin’s T5-loop

Article

作者: Abel, Anne-Catherine ; Sewald, Norbert ; Schachtsiek, Thomas ; Sharpe, Timothy ; Dessin, Cedric ; Sammet, Benedikt ; Prota, Andrea E ; Mühlethaler, Tobias ; Steinmetz, Michel O

Cryptophycins are microtubule-targeting agents (MTAs) that belong to the most potent antimitotic compounds known to date; however, their exact molecular mechanism of action remains unclear. Here, we present the 2.2 Å resolution X-ray crystal structure of a potent cryptophycin derivative bound to the αβ-tubulin heterodimer. The structure addresses conformational issues present in a previous 3.3 Å resolution cryo-electron microscopy structure of cryptophycin-52 bound to the maytansine site of β-tubulin. It further provides atomic details on interactions of cryptophycins, which had not been described previously, including ones that are in line with structure-activity relationship studies. Interestingly, we discovered a second cryptophycin-binding site that involves the T5-loop of β-tubulin, a critical secondary structure element involved in the exchange of the guanosine nucleotide and in the formation of longitudinal tubulin contacts in microtubules. Cryptophycins are the first natural ligands found to bind to this new "βT5-loop site" that bridges the maytansine and vinca sites. Our results offer unique avenues to rationally design novel MTAs with the capacity to modulate T5-loop dynamics and to simultaneously engage multiple β-tubulin binding sites.

2024-05-01·Analytica chimica acta

Quantifying payloads of antibody‒drug conjugates using a postcolumn infused-internal standard strategy with LC‒MS

Article

作者: Lin, Ching-Hung ; Liao, Hsiao-Wei ; Chen, I-Chun ; Chang, Wen-Chi ; Cheng, Chih-Ning ; Lu, Yen-Shen ; Kuo, Ching-Hua

BACKGROUND:

Antibody‒drug conjugates (ADCs) are innovative biopharmaceutics consisting of a monoclonal antibody, linkers, and cytotoxic payloads. Monitoring circulating payload concentrations has the potential to identify ADC toxicity; however, accurate quantification faces challenges, including low plasma concentrations, severe matrix effects, and the absence of stable isotope-labeled internal standards (SIL-IS) for payloads and their derivatives. Previous studies used structural analogs as internal standards, but different retention times between structural analogs and target analytes may hinder effective matrix correction. Therefore, a more flexible approach is required for precise payload quantification.

RESULTS:

We developed an LC‒MS/MS method incorporating a postcolumn-infused internal standard (PCI-IS) strategy for quantifying payloads and their derivatives of trastuzumab emtansine, trastuzumab deruxtecan, and sacituzumab govitecan, including DM1, MCC-DM1, DXd, SN-38, and SN-38G. Structural analogs (maytansine, Lys-MCC-DM1, and exatecan) were selected as PCI-IS candidates, and their accuracy performance was evaluated based on the percentage of samples within 80%-120% quantification accuracy. Compared to the approach without PCI-IS correction, exatecan enhanced the accuracy performance from 30-40%-100% for SN-38 and DXd, while maytansine and Lys-MCC-DM1 showed comparable accuracy for DM1 and MCC-DM1. This validated PCI-IS analytical method showed superior normalization of matrix effect in all analytes compared to the conventional internal standard approach. The clinical application of this approach showed pronounced differences in DXd and SN-38 concentrations before and after PCI-IS correction. Moreover, only DXd concentrations after PCI-IS correction were significantly higher in patients with thrombocytopenia (p = 0.037).

SIGNIFICANCE:

This approach effectively addressed the issue of unavailability of SIL-IS for novel ADC payloads and provided more accurate quantification, potentially yielding more robust statistical outcomes for understanding the exposure-toxicity relationship in ADCs. It is anticipated that this PCI-IS strategy may be extrapolated to quantify payloads and derivatives in diverse ADCs, thereby providing invaluable insights into drug toxicity and fortifying patient safety in ADC usage.

项与 Antibody-drug conjugate of maytansine(AngioChem) 相关的新闻（医药）

2024-05-25

·生物制品圈

高效杀手，浅谈ADC创新之路——有效载荷

前言有效载荷（payload）是ADC发挥肿瘤杀伤作用的重要武器，其作用机制很大程度上决定了ADC药物的性能，而其活性和理化性质对抗肿瘤疗效也有直接影响，因此其重要性不言而喻。在日趋成熟的技术驱动下，有效载荷已经历了三代创新，从第一代ADC使用的细胞毒性载荷如甲氨蝶呤（Methotrexate）、长春花碱（Vinblastine）和阿霉素（Doxorubicin），发展到以微管蛋白抑制剂（Maytansine）为主的第二代新型高效有效载荷，以及以DNA损伤剂为代表的第三代有效载荷。当前，基于不同的作用机制和功能需求，有更多的新型载荷在探索和开发中（如图1所示）。本文从有效载荷的理想特征、多样性、作用机制等方面认识和探索其未来的创新之路。图1 ADC有效载荷的发展之路理想的有效载荷理想的有效载荷应具备以下几点：有足够强的细胞毒性有较低的免疫原性在循环系统有较高的稳定性有可修饰的功能结构提供偶联位点且不影响效力有旁观者杀伤效应有适当的水溶性作用靶点在胞内有效载荷的多样性目前，已获批ADC所使用的有效载荷包括了3种DNA损伤剂（2个calicheamicin, 1个pyrolobenzodiazepine dimer (PBD)和2个拓扑异构酶抑制剂），2种微管抑制剂（4个aurisatins和2个maytansinoids）和1种细菌毒素，前两者是现在临床试验中最常选择的有效载荷，但其他类型的有效载荷也在开发中。根据作用机制可大致分为如下几类：靶向微管的有效载荷、靶向DNA的有效载荷、靶向RNA的有效载荷、免疫类ADC有效载荷和其他新型潜力有效载荷（如图2所示）。图2 有效载荷的种类1. 靶向微管的有效载荷微管是真核细胞骨架的重要组成部分，参与多种细胞功能，包括维持细胞形态、信号转导、细胞器运输、细胞运动、细胞有丝分裂等，从而成为肿瘤治疗的重要靶点。靶向微管蛋白的抑制剂通过与微管蛋白结合，干扰微管的动态结合，使细胞生长停滞于细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡。其中，微管蛋白聚合增强剂，如奥瑞他汀类化合物MMAE和MMAF，作用于α,β微管蛋白二聚体的β亚基，使微管的生长不受调节。与之相反，微管蛋白聚合抑制剂，如美登素类化合物DM1和DM4，通过抑制微管的成熟，阻断微管蛋白二聚体的聚合。美登素类化合物（Maytansinoids）美登素最初是从非洲灌木卵圆梅藤（Maytenus ovatus）的树皮中分离出来的，是一类与微管蛋白结合并抑制微管组装的安莎类抗生素。在体外试验中，其皮摩尔级的IC50值表明美登素有很强的抑制肿瘤增殖分化的能力，同时具备很好的稳定性和水溶性使其成为ADC理想的候选有效载荷。由于天然美登素缺少反应功能结构，无法与抗体偶联，因此需要进行化学修饰。例如，将美登素C3侧链的N-乙酰基团替代为3-（甲硫基）丙醛基团，得到美登素衍生物DM1（如图3A-2），接着在DM1二硫键旁增加两个甲基基团即得到DM4（如图3A-3）。DM1和DM4通过二硫键与连接子偶联，并成为ADC药物开发中广泛使用的一类有效载荷。因为C3位点引入的修饰不会干扰药物的结合状态、亲和力和药效，因此更多针对C3位点的化学修饰研究正在开展。例如，酰化反应（如图3A-5）能进一步优化美登素衍生物的合成策略并降低多重耐药蛋白1（MDR1）介导的耐药性。图3 Maytansinoids类化合物结构示意图奥瑞他汀类化合物（Auristatins）海兔毒素（Dolastatin 10）于1987年从印度洋软体动物Dolabella auricularia中分离出来，有很强的的抗肿瘤细胞增殖作用，在纳摩尔浓度下可有效诱导肺癌细胞和其他肿瘤细胞凋亡。其水溶性合成类似物-奥瑞他汀（Auristatin），包括使用最广泛的MMAE和MMAF。MMAE由四个氨基酸构成，包括单甲基缬氨酸（MeVal）、缬氨酸（Val）、dolaisoleuine (Dil)和dolaproine (Dap)，以及C端的氨基去甲黄麻碱。把C端的氨基去甲黄麻碱替换为苯丙氨酸即得到MMAF，其结合亲和力增强，药效降低。目前，对于auristatin类似物的研究主要集中在C端或N端的化学修饰，以增强效力、提高膜渗透性、以及抑制膜外排泵作用等。例如将MMAF C端苯丙氨酸的羧酸替换成四唑或磷酸盐，其效价与MMAF作为有效载荷的效价相似。将海兔毒素N端用丙醇或叠氮化物修饰，细胞试验也显示出其不错的效力。此外，偶联位点（P2、P4）的化学修饰（如叠氮化修饰等）也为下一代auristatin衍生物的开发提供了新方向。图4 Auristatin类化合物结构示意图艾瑞布林（Eribulin）Halichondrin B是一种聚醚大环内酯类天然产物，其人工合成的新型紫杉烷类似物-甲磺酸艾瑞布林（Eribulin）于2010年被批准用于局部晚期和转移性乳腺癌患者治疗。Eribulin通过与β微管蛋白疏水和极性残基结合，抑制细胞有丝分裂。在不同的体外模型中，ADC- Eribulin对肿瘤细胞高效的清除使得eribulin成为有潜力的有效载荷。目前，第二代eribulin类似物的改造主要集中在C32侧链（如图5）。例如在C32引入低碱性胺或提高eribulin的亲脂性可以获得更好的抗肿瘤活性或扩展药物治疗的肿瘤类型。图5 Eribulin类化合物结构示意图微管蛋白抑素（Tubulysins）微管蛋白抑素（Tubulysins）是从黏菌培养基中分离出来的一种天然抗有丝分裂的线性四肽，由Mep、L-Ile、Tuv和Tup/Tut组成（如图6）。Tubulysins的化学修饰多位于Mep、Tuv和含有偶联位点的Tup。例如用五环取代N端Mep的六环对药物活性影响很小；而将Tuv残基的C11进行乙酰化修饰则会显著降低活性。图6 Tubulysins类化合物结构示意图驱动蛋白抑制剂（EG5 inhibitors）EG5在血液瘤和实体瘤中高表达，且与预后不良有关，因此成为有吸引力的癌症治疗靶点。多个EG5抑制剂如SB-715992（Ispinesib）和Filanesib（ARRY-520）都已用于临床研究中。作为ADC有效载荷，EG5抑制剂可以减少其单独使用带来的副反应，如嗜中性白血球减少症、粘膜炎、胃炎以及治疗窗口窄等。2. 靶向DNA的有效载荷与微管蛋白抑制剂相比，DNA抑制剂通过使双链DNA断裂、烷基化、嵌合、交联等，作用于整个细胞周期，引起细胞毒性作用，对实体瘤有良好的治疗效果。此外，DNA抑制剂的靶点远少于微管蛋白抑制剂，当ADC携带相同数量的有效载荷进入细胞时，DNA抑制剂可以显示出更好的杀伤效果。而且以DNA抑制剂为有效载荷的ADC可以靶向低抗原表达的肿瘤细胞。烯二炔类（Enediyne）从细菌中分离出的烯二炔是迄今为止发现的最具细胞毒性的天然产物之一，通过破坏细胞单链或双链DNA，导致细胞死亡，因此成为常用的ADC有效载荷。其中，开发最成功的卡奇霉素（Calicheamicins）是已上市ADC药物Mylotarg和Besponsa的有效载荷。卡奇霉素通过靶向与DNA结合的小沟，特异性诱导DNA双链断裂，引发自噬。虽然卡奇霉素对正常细胞的杀伤阻碍了其在临床应用中的进展，但高细胞毒性、小分子量和明确的作用机制使其成为有吸引力的有效载荷。拓扑异构酶I抑制剂（Topoisomerase I inhibitors）拓扑异构酶I（TOPO-I）是一种重要的稳定基因组和保护DNA结构的核酶，已成为ADC的热门靶点。晶体结构研究发现临床批准的抗癌药物-拓扑替康（topotecan）是一种非竞争性抑制剂，通过在酶诱导缺口处的两条DNA链之间插入碱基，与酶-底物复合物结合。因此拓扑替康类似物成为一类特别有吸引力的ADC有效载荷，例如天然五环产物喜树碱(CPT)，极低的溶解度阻碍了其被广泛使用；半合成的喜树碱SN-38（伊立替康CPT-11的活性成分），其较高的疏水性和有限的偶联位点数量增加了偶联物制备的挑战性；水溶性的CPT类似物-甲磺酸依喜替康（DX-8951f）具有很强的TOPO-I抑制和抗肿瘤活性；新型高膜渗透性TOPO-I抑制剂DXd（DX-8951衍生物）能抵制P糖蛋白介导的多重耐药性，且有较强的疗效，但其F环含有第二个手性中心，增加了合成和衍生化难度。对CPT的化学修饰主要围绕C7-C11位点，例如研究显示C10位点的羟基修饰可增强抗肿瘤活性；C11位点的氟修饰会数倍增强细胞毒性；一些化学修饰为偶联提供了可选位点。图7 TOPO-I结构示意图吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮杂卓（PBD）PBD是在链球菌中发现的一类具有抗肿瘤活性的天然产物，主要由芳香A环、B环和吡咯烷C环组成。PBD在DNA小沟中进行选择性烷基化，DNA链交联导致DNA损伤，引起细胞凋亡。基于强大的细胞毒性，PBD二聚体具有成为ADC有效载荷的潜力，且正在通过一系列结构修饰以改进PBD作为有效载荷的性能。例如，C8位置进行侧链修饰可以得到多种有活性的化合物，而且侧链长度缩短也具备充足的细胞毒性。在结构中引入酸性或碱性基团能改变化合物的理化性质，通过引入磺酸会导致PBD二聚体从胞质溶酶体转运至胞质和/或胞核内。二硫化修饰的PBD二聚体在GSH水平较高的细胞内表现出更好的稳定性。从结构可以看出（如下图8），PBD类化合物的偶联位点是C2和N10。其中B环的N10位点能与DNA共价连接，比C2位点更安全。未来其偶联位点的修饰或许也是研究方向之一。图8 PBD及衍生物结构示意图3. 靶向RNA的有效载荷以RNA为靶点的小分子抑制剂既能杀死处于分裂状态的肿瘤细胞，也能杀死处于休眠状态的肿瘤细胞，作为ADC有效载荷有望解决无效肿瘤休眠细胞导致的肿瘤耐药和肿瘤复发扩散问题。目前，可作为ADC有效载荷的RNA抑制剂有两种主要类型：RNA剪接抑制剂（泰兰斯他汀及其类似物）和RNA聚合酶II抑制剂（毒伞肽）。泰兰斯他汀（Thailanstatin）RNA剪接抑制剂是一种有效的抗增殖药物，能够靶向分裂活跃和静止的细胞。Thailanstatin是一种从泰国布鲁氏菌中分离出来的天然产物，通过与剪接体U2snRNA复合物的SF3b亚基结合而激活。Thailanstatin家族化合物经抑制真核mRNA剪接途径，对剪接体有较强的结合和抑制作用，从而成为ADC的潜在有效载荷。辉瑞首次探索将RNA剪接抑制剂用作与曲妥珠单抗偶联的有效载荷（如图9-87），并在体外动物模型和细胞系药效研究中取得了不错的结果。图9 Thailanstatin类化合物结构示意图毒伞肽（Amatoxins）毒伞肽（Amatoxins）是一种由核糖体合成的毒性环状八肽，是真核RNA聚合酶 II的选择性抑制剂，能导致细胞凋亡。Amatoxins含有一个由八个L型氨基酸残基构成的大环，通过亚砜部分连接色氨酸和半胱氨酸残基，其三个侧链被羟基化，因此具有良好的水溶性。迄今，研究最深入也最有效的是α-Amatoxin（如图10-88），能显著抑制肿瘤转移和复发，是抗肿瘤耐药性的潜在化合物，目前已被用于靶向BCMA的ADC药物（HDP-101），且正在进行I/Ia期临床试验，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤。此外，将β-amanitin的羧基（如图10-89）偶联到IgG赖氨酸的氨基上，也能得到具有良好血浆稳定性和高细胞毒性的ADC。图10 Amatoxins类化合物结构示意图4. 免疫类ADC有效载荷ADC在肿瘤临床治疗中的成功，激发了研究者对ADC在其他治疗领域的探索，尤其是免疫学。肿瘤免疫包括T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，通过免疫调节将冷肿瘤转化为热肿瘤，最终增强免疫治疗的效果。然而，对于不能产生自发性T细胞应答和T细胞浸润的癌症患者（冷肿瘤）来说，免疫检查抑制剂并不能很好地发挥作用。因此，开发出能够刺激患者先天性免疫应答，以及促进肿瘤特异性T细胞招募的免疫疗法成为研究热点。与传统ADC不同，免疫刺激抗体偶联物(ISACs)既有抗体的精度靶向特点，又能基于小分子调控先天性和适应性免疫系统。一方面，偶联的免疫激动型小分子能增强免疫应答。另一方面，抗体的靶向性降低了小分子免疫激动剂的毒性。此外，传统的ADC是依赖抗原介导的内吞作用杀死癌细胞，而免疫调节ADC是通过细胞表面FcγR介导的内吞作用激活免疫细胞。目前，正在研究的免疫调节ADC的有效载荷主要包括toll样受体(TLR)激动剂和干扰素刺激因子(STING)激动剂。Toll样受体激动剂Toll样受体(TLRs)是一类重要的参与先天免疫的蛋白分子，是机体抵抗传染病的第一道屏障。激活TLR受体可以改善肿瘤微环境中树突状细胞和巨噬细胞的抗原呈递，促进CD8+T细胞的增殖。Toll样受体激动剂作为一种免疫增强剂，在肺癌、黑色素瘤、白血病和胶质瘤中直接或间接地诱导和增强抗肿瘤免疫反应，从而有效地抑制肿瘤生长。因此，TLR激动剂（主要是TLR7/8/9）成为肿瘤免疫治疗的热点之一。将其应用于ADC也能有效降低毒副作用，提高肿瘤杀伤效果。例如，以TLR8激动剂 (如下图11-91)为有效载荷的抗Her2抗体偶联物，在体外以Her2依赖的方式驱动多种抗肿瘤免疫机制，并在小鼠肿瘤模型中显示出良好的抗肿瘤效果。以TLR7激动剂 (如下图11-92)构建的一类新的免疫调节ADC（HE-S2）在体外试验中也有非常显著的抗肿瘤作用。目前，越来越多的国内外药企开始布局这一ADC差异化开发新赛道，包括恒瑞、百济、InnoventBio、Silverback等。图11 Toll样受体激动剂结构示意图STING激动剂干扰素刺激因子(STING)是天然免疫信号通路中的关键调控因子，具有启动机体自然免疫防御反应，促进T细胞形成适应性免疫的功能。STING介导的I型干扰素信号通路是自然免疫领域的重大发现，为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点。鉴于游离STING激动剂的全身给药受到毒性限制，且广泛的生物分布可能不理想，因此可以通过与抗体偶联实现STING激动剂的肿瘤靶向递送、降低毒性，并发挥抗肿瘤作用。环二核苷酸（CDN）是STING蛋白的天然配体（如下图12-93），可通过磷酸酯、糖环和碱偶联抗体。例如，SPEROVIE通过将CDN中的硫代磷酸盐或甲酸酯与PD-1或CTLA-4抗体偶联形成了ADC药物（WO2021046426A1,2021.03.11）。此外，Mersana使用STING激动剂（图12-94）作为有效载荷获得的ADC候选药物XMT-2056也已经进入临床前研究阶段，并且基于其优秀的临床前数据，XMT-2056被FDA授予治疗胃癌的孤儿药称号。还有日本小野制药开发的一种非核酸STING激动剂（图12-95），作为有效载荷通过药物结构中的吡唑环与连接子偶联。图12 STING激动剂结构示意图5. 新型潜力有效载荷Bcl-xL抑制剂Bcl-xL是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤形成、转移和耐药过程中发挥重要作用。理论上可以通过阻断Bcl-xL的BH3结合域，诱导癌细胞凋亡。将Bcl-xL抑制剂作为ADC药物的有效载荷，既可以保留活性，又能降低对血小板的毒性。通过一系列晶体结构和构效关系研究，发现因为Bcl-xL上E单元的抑制作用，其比W单元更重要，特别是B环。2017年，AbbVie首此将Bcl-xL抑制剂（如下图13-104）与抗B7H3抗体偶联，获得靶向EGFR 的ADC（ABBV-155），目前仍在临床研究中（ClinicalTrials.gov identifier: NCT03595059）。图13 Bcl-xL抑制剂结构示意图烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）抑制剂烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是一种控制细胞内NAD+浓度的限速酶，能将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸。当NAMPT被抑制时，NAD+水平下降到代谢所需的水平以下，导致能量危机，最终引起细胞死亡。虽然NAMPT抑制剂是强效的细胞毒性分子，但它们作为化疗药物在癌症治疗中的使用受到毒性的限制。但鉴于它们不同于其他有效载荷的作用机制、简单的结构和高效价，NAMPT抑制剂可以作为ADC有效载荷应用于临床。蛋白酶体抑制剂（Carmaphycins）蛋白酶体抑制剂是一类新兴的抗癌药物，对某些癌细胞具有超强的细胞毒性，如环氧酮类蛋白酶体抑制剂-carmaphycins。Carmaphycins A和B是从海洋蓝藻菌（Symploca sp.）中分离鉴定出的，它们的α,β-环氧酮可直接与甲基硫氨酸亚砜或甲基硫氨酸砜结合，抑制蛋白酶体的β5亚基。但由于较差的选择性，carmaphycins常表现出毒副作用。而作为ADC有效载荷，高毒性的carmaphycins衍生物可保持理想的效力并获得更好的耐受性。酪氨酸激酶抑制剂人类基因组包括500多种激酶，其中150多种与包括癌症在内的各种疾病有关。蛋白激酶是催化磷酸化的酶，分为3类：丝氨酸激酶、苏氨酸激酶和酪氨酸激酶。目前在临床试验中研究的小分子中有超过四分之一是蛋白激酶抑制剂，超过30种FDA批准用于癌症治疗的分子是激酶抑制剂。但是由于蛋白激酶抑制剂的效力低，因此尚未在ADC有效载荷领域进行广泛的探索。对有效载荷创新的思考除了上文介绍的有效载荷类型和一些经典的化合物，还有很多新的开发思路，如以PROTAC分子作为有效载荷，以近红外光免疫疗法（NIR-PIT）药物作为有效载荷，或开发双载荷ADC、放射性核素药物偶联物（RDC）、抗体-螯合物偶联物（ACC）、抗体-寡核苷酸偶联物（AOC）和肽-药物偶联物（PDCs）等。纵观整个ADC有效载荷开发历程，可以看到以问题为导向，不管是对天然化合物的优化改造还是对不同作用机制的探索，只要“脑洞大开”敢于尝试，终能走出自己的路。参考文献：[1] Shapiro MA. Regulatory considerations in the design, development and quality of monoclonal antibodies and related products for the diagnosis and treatment of cancer. Front Oncol. 2024 Apr 30;14:1379738. doi: 10.3389/fonc.2024.1379738. PMID: 38746685; PMCID: PMC11091260.[2] Wang Z, Li H, Gou L, Li W, Wang Y. Antibody-drug conjugates: Recent advances in payloads. Acta Pharm Sin B. 2023 Oct;13(10):4025-4059. doi: 10.1016/j.apsb.2023.06.015. Epub 2023 Jun 30. PMID: 37799390; PMCID: PMC10547921.[3] Choi Y, Choi Y, Hong S. Recent Technological and Intellectual Property Trends in Antibody-Drug Conjugate Research. Pharmaceutics. 2024 Feb 3;16(2):221. doi: 10.3390/pharmaceutics16020221. PMID: 38399275; PMCID: PMC10892729.[4] Conilh L, Sadilkova L, Viricel W, Dumontet C. Payload diversification: a key step in the development of antibody-drug conjugates. J Hematol Oncol. 2023 Jan 17;16(1):3. doi: 10.1186/s13045-022-01397-y. PMID: 36650546; PMCID: PMC9847035.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

抗体药物偶联物

2024-02-04

·生物制品圈

ADC到XDC，抗体偶联药物5大要素，挖掘创新根本源泉

从ADC到XDC，偶联药物未来趋势，将聚焦于新的靶抗原、具有新作用机制的有效载荷、新的抗体和载体形式等方面。靶点适应症选择+最优结构组合，是目前研发重点。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是将肿瘤靶向抗体(Tumor Targeted Antibody)和小分子细胞毒性药物(Cytotoxic Drug)利用特定的偶联技术通过连接物(Linker)偶联的一类药物。已有不少文章从各个维度介绍过抗体偶联药物，本篇将再次概述抗体偶联药物的五大基本要素（抗原靶点、抗体、连接子、有效载荷及偶联方式）。作用机制：ADC药物，其抗体高特异性靶向识别肿瘤抗原，静脉注射给药后，药物通过血液循环，分布到肿瘤组织并与肿瘤表面抗原结合。ADC与抗原的复合物通过内吞，将其携带的有效载荷内化到肿瘤细胞中，被转运到溶酶体以高效活性形式被释放，通过DNA损伤或抑制微管合成进而诱导癌细胞凋亡。一、靶点ADC制备起点是靶点选择，药物安全性和有效性主要依赖于靶抗原的选择，及与其相互作用。考虑因素：1，靶抗原是否在肿瘤中高表达，而在正常细胞中无或低表达；2，目标抗原是否在肿瘤细胞的细胞膜表面分布，因而才可以被特异性抗体所识别；3，抗原是否不易脱落，以防止抗体与循环内的抗原结合；4，目标抗原是否具有内化特性。已有超过五十来种抗原，被作为ADC所识别的靶抗原，对于靶抗原位点的选择，科学家们探索不同设计策略。肿瘤细胞/肿瘤微环境的重要靶抗原1、癌症细胞中过度表达的靶抗原（分布癌细胞）：GPNMB,CD70,CD56,Trop-2,FRα,Tissue factor，ENPP3，p-cadherin，mesothelin，STEAP1，CEACAM5，Mucin 1,Nectin 4,SLC44A4,PSMA，LIV1,5T4,SC-16,Guanylyl cyclase C；2、驱动致癌基因（分布肿瘤相关成纤维细胞）HER2,EGFR3、肿瘤血管系统中靶抗原（分布蛋白多糖）EDB,ETB,PSMA VEGFR2，ROBO4，Tissue factor4、基质内靶抗原（分布胶原蛋白）Tenascin C、Collagen IV, Periostin5、血液系统恶性肿瘤中靶抗原（分布血细胞）CD22,CD30,CD33，CD79b,CD19,CD138，CD74，CD37，CD19，CD98临床阶段ADC药物靶点分布目前ADC靶点， HER2 赛道愈发激烈，全球已有 3 款 HER2 ADC 获批上市，全球进入临床阶段的HER2，占比超过20%。TROP-2、EGFR、Claudin18.2等靶点也有多家企业在研中，而中国企业迈入了全球研发前列。此外，全球临床前ADC药物已超过400款，临床前的靶点布局较为分散。TROP2 ，全球有1 款 ADC （戈沙妥珠单抗）获批，国产在研管线众多。Nectin-4 ，全球有 1 款ADC（维恩妥尤单抗）获批上市。CLDN18.2 ADC，全球有十多款进入临床阶段，多数均处于早期临床。2023年ESMO大会呈现的ADC靶点多样化。除了传统靶点外，PTK7、FolRα等新靶点也开始崭露头角。二、抗体（Antibody）抗体是ADC设计重要组成部分，应能够特异性的识别肿瘤细胞的靶抗原，并与靶抗原存在较高亲和力。抗体还应具有免疫原性弱、半衰期长、促进有效内化，血液循环稳定性好的特点。抗体根据其重链恒定区序列可分为IgG、 IgA、IgD、IgE和IgM共五类。目前已批准的ADC基本采用免疫球蛋白G（IgG）抗体，亚型包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。其中IgG1由于其分子量适中、半衰期长、亲和力高、制备简便，发挥较强的Fc效应子功能等特点，在偶联研发中应用最多的亚型。IgG1在血清中含量最高，可通过与Fc受体的高结合亲和力，诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）等强效应功能。ADC的抗体部分可以采用双特异性抗体或单域抗体等多种形式。双抗可针对同一靶抗原的两个不同表位，也可针对两个不同的靶抗原。ADC也可采用单域抗体偶联杀伤性放射性元素或毒性分子等，以开发新型偶联药物。三、连接子（Linker）连接子是ADC重要组成部分，将抗体与有效载荷连接起来。连接子在血液中的稳定性非常重要，当ADC进入肿瘤细胞或被运输到溶酶体，连接子应迅速分解以释放有效载荷。连接子会影响药物-抗体比值（DAR）、有效载荷释放时间、治疗指数和药代动力学/药效学等。连接子可分为可切割和不可切割两种类型。常见连接子包括：缬氨酸-瓜氨酸（VC）连接子、N-琥珀酰亚胺4-（2-吡啶基二硫基）丁酸酯（SPDB）连接子、腙连接子、4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺（SMCC）连接子、马来酰亚胺己酰基（MC）连接子、N-琥珀酰亚胺基-4-（2-吡啶基二硫）戊酸酯（SPP）连接子、硫醚连接子、四肽连接子和碳酸酯连接子等。1、可切割连接子可切割的连接子通过多种机制进行裂解，包括腙键的酸不稳定裂解、二硫键的还原裂解和多肽键的酶解等。可切割连接子并非一定会产生旁观者效应，主要取决于释放载荷的膜穿透性和电荷特性。2、不可切割连接子不可切割连接子的ADC，只有在进入肿瘤细胞的溶酶体被蛋白酶降解后，才会释放有效载荷。不可切割连接子被内吞入溶酶体后，连接子不会被降解，连接的抗体则会被降解为氨基酸，形成氨基酸-连接子-小分子细胞毒复合物。该类型由于“连接子-氨基酸残基”带有电荷，限制了其透膜及扩散，因而通常不会产生旁观者效应。连接子优化，主要是为了增加在血浆中的稳定性以及适配旁观者效应；以及适配不同作用机制的毒素。可裂解连接体成为目前ADC应用的主流趋势，然而由于高毒性载荷对循环稳定性的严格要求，“酶敏感多肽技术”逐渐取代“酸敏感连接子技术”。四、有效载荷ADC有效载荷是其最重要的效应组分，常用的分子包括：微管生成抑制剂、DNA损伤因子和DNA转录抑制剂等。微管生成抑制剂，通过与微管结合阻止微管的聚合，从而阻滞细胞周期，产生细胞毒性，发挥抗肿瘤作用。如：au⁃ ristatin、美登素（Maytansine）及其类似物。DNA损伤因子，通过与DNA的小沟结合并促进DNA链烷基化、断裂或交联。如：Calicheamicin、Duocarmycins、 Anthracyclines、Pyrrolobenzodiazepine dimers。DNA转录抑制剂，如：Quinoline Alkaloid （SN-38）和Amatoxin等。其它新型：凋亡诱导剂，RNA剪接抑制剂，烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂等。随着技术发展的不断进步，有效载荷类型的探索越来越多。现有毒素进行改构提高疗效难度较大，主要通过毒素的多样化，实现ADC治疗方案及治疗窗口的拓展。基于拓扑异构酶2抑制剂的蒽环类毒素，以及基于RNApolⅡ抑制剂的阿马毒素（α-Amanitin）具有较好的临床前数据。五、偶联方式（Conjugation）偶联方式包括非定点偶联和定点偶联。非定点偶联法，主要有赖氨酸及半胱氨酸偶联。定点偶联，通过基因工程位点进行特异性偶联，实现更均一的ADC，能在特定位点实现细胞毒素的连接。1、非定点偶联偶联选择性差，产品均一性差。最早利用亲电基团，如马来酰亚胺或者N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxy Succinimide，NHS）和暴露赖氨酸的氨基反应。呈现随机性，抗体上携带的药物分子数量不相同，产品异质性大，影响PD/PK等参数。还原二硫键的半胱氨酸非定点偶联，是目前使用较多的偶联方式，Enhertu、Trodelvy、Adcetris均使用此方法。单克隆抗体IgG1含有12个链内二硫键和4个链间二硫键。链内二硫键处于抗体两层反向平行的β折叠结构之间，导致较低的反应性。链间二硫键易被还原剂作用，可还原出8个巯基，进一步与连接着反应基团的毒素分子偶联，形成0、2、4、6、8几种主要的药物偶联形式。2、定点偶联定点偶联是未来 ADC 的研发趋势，定点偶联技术可获得均一性更好的ADC药物，提高ADC药物稳定性，降低脱靶毒性。定点偶联技术主要包括：特异性位点偶联技术、非天然氨基酸偶联技术、聚糖偶联技术以及短肽标签偶联技术等。特异性位点偶联技术，如基因泰克的Thiomab技术，通过基因工程技术在抗体特定位置插入半胱氨酸残基，将半胱氨酸上的巯基与小分子毒物偶联，形成DAR值稳定的高均一性的ADC药物。相比于传统随机偶联得到的ADC药物，该技术ADC药物在血浆中具有低聚集性、高稳定性，以及较强的体内外抗肿瘤活性。基于非天然氨基酸（non-natural Amino Acid, nnAA）的技术，为ADC的制备提供了位点特异性的解决方案。人工合成相比天然氨基酸，特异性和稳定性更好的nnAA，通过正交tRNA合成酶、正交tRNA、独特的密码子系统在蛋白质特定位点引入nnAA。聚糖偶联（GlycoConnect）技术，利用大多数IgG单克隆抗体Fc段中含有天门冬酰胺297残基的糖基化修饰，这是一个很适合的特异性药物偶联位点。抗体通过糖苷内切酶切除N端聚糖，剩下糖胺（GlcNAc），添加N-叠氮乙酰半乳糖胺（N-Azidoacetylga-lactosamine，GalNAz）。短肽标签偶联技术，通过将细胞毒素，偶联到含有4到6个氨基酸残基的特定短肽标签上。在抗体中引入独特的短肽标签，在体内或体外进行酶修饰。允许肽标签中的特定氨基酸功能化，并与药物连接剂耦合。将谷氨酰胺标签（Leu-Leu-Gln-Gly， LLQG）引入到抗体分子中，使标签中的谷氨酰胺被mTG识别，转移含胺药物。在抗体的N端或C端，插入被甲酰基甘氨酸生成酶（Formylglycine-Generating Enzyme，FGE）识别的短肽标签LCx⁃ PxR。抗体与FGE共表达后，短肽标签中的半胱氨酸被细胞内酶氧化为含醛甲酰基甘氨酸，可与氨基功能化试剂偶联。引入的位于抗体不同区域的短肽标签，可能会产生免疫原性。从ADC到XDCADC药物技术，通过对原有药物设计，拓展至XDC万物偶联。目前多肽-药物偶联物，以及抗体-放射性核素偶联物关注度较高，其它多种新型偶联药物也在加速研发中。ADC药物通过拆解优化五大核心要素，筛选高表达的靶抗原，特异性平衡的抗体，代谢稳定的连接子，高抗肿瘤活性的有效载荷，以及DAR值均一的偶联技术，以此打造技术壁垒。随着多种新型偶联药物的快速推进，靶向药物也将迈入新时代。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

抗体药物偶联物

100 项与 Antibody-drug conjugate of maytansine(AngioChem) 相关的药物交易

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