R-NbF8-2

可溶性生理蛋白质转变为病理性聚集体是许多神经退行性疾病的基础。Tau蛋白的聚集与阿尔茨海默病等疾病相关。现有的治疗方法，如反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs），虽然能减少tau蛋白，但也会减少生理性蛋白，可能带来问题。前期研究发现TRIM21是一种E3泛素连接酶，可以介导抗体结合靶标的破坏（如tau聚集体）。来自剑桥大学的研究团队开发了将TRIM21的RING结构域与靶标特异性纳米抗体融合的RING-纳米抗体（RING-nanobody, R-Nb）降解剂。这些降解剂在核质中表达，能够抑制tau聚集并降解不溶性聚集体，同时对可溶性单体tau几乎没有影响。 研究假设纤维状tau聚集体的重复性质可能允许R-Nb降解剂在其表面密集聚集，诱导RING交叉激活并随后降解。选择了优化后的抗tau C端纳米抗体F8-2变体（S54L+T127A）作为靶向域，命名为R-NbF8-2。该构建体由N端TRIM21 RING结构域、纳米抗体和自切割的mCherry报告基因组成。为了创建含有持续聚集的荧光标记tau的细胞模型，研究人员在HEK293细胞中过表达可溶性P301S tau-venus蛋白（tau-venus soluble, TVS细胞），并用来自老年Tg2541 P301S tau转基因小鼠大脑的tau聚集体进行种子化，克隆扩增后得到tau-venus聚集细胞（tau-venus aggregated, TVA细胞）。免疫金电子显微镜确认了TVA细胞中存在纤维状tau聚集体。 为了评估R-NbF8-2降解预先形成的tau-venus聚集体的能力，他们将TVA细胞改造为在强力霉素（doxycycline, DOX）诱导下表达R-NbF8-2或对照。添加DOX后，纳米抗体与tau聚集体结合，快速减少点状tau-venus聚集体，同时表达R-NbF8-2和mCherry。DOX添加15小时后，tau-venus重新溶解并与微管相关。尽管构建体表达相当，单独的TRIM21 RING或F8-2并未显著改变tau-venus聚集体的数量。 为了研究R-NbF8-2降解的tau-venus聚集体的性质，他们检查了DOX处理后这些细胞的十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl）可溶和不可溶部分。结果显示，仅在R-NbF8-2表达的细胞中，不溶性总tau和磷酸化tau（AT8, pSer202, pThr205）减少。可溶性tau种类在R-NbF8-2表达后也部分减少。进一步研究发现，减少的种类表现为一个明显的高分子量条带，并被磷酸化tau抗体识别，可能代表小的高磷酸化tau聚集体。使用单分子拉下超分辨率显微镜进一步分析TVA裂解物中的tau种类，结果显示R-NbF8-2表达后（+DOX），所有大小的tau聚集体均减少。 因为tau蛋白在生理状态下是可溶的，存在于细胞质或与微管结合，所以研究人员假设R-Nb降解剂对可溶性tau的招募可能不会引起降解，因为RING结构域的空间分离会阻止交叉激活。此外，他们进一步假设，纳米抗体的亲和力会决定聚集物的选择性。为了验证这一假设，他们评估了一组R-Nb构建体，它们对tau-venus的体外亲和力范围从1.3 μM到32 nM。实验中使用了不同的纳米抗体（如F8-2、H3-2、vhhGFP4）和一个针对无关目标（p53）的纳米抗体作为对照。 实验结果显示，R-Nb构建体在HEK293细胞中表达时是可溶的，并且能够结合tau-venus的R-Nb在TVA细胞中引起聚集物的降解。然而，只有包含高亲和力纳米抗体的R-Nb构建体在TVS细胞中引起可溶性tau-venus的降解。这表明低亲和力的R-Nb构建体可能允许聚集物选择性降解，而高亲和力的R-Nb构建体则对更分散的目标有更高的招募能力。 为了评估R-NbF8-2降解的选择性，他们通过质谱分析了TVA R-NbF8-2细胞的蛋白质组，发现只有两个内源性蛋白（HMGCR和PNMA1）在R-NbF8-2表达后受到中度影响。此外，R-NbF8-2不会降解可溶性tau，但能防止种子tau聚集。 已有研究表明，去折叠酶VCP和蛋白酶体降解聚集的tau会产生更多具有种子能力的tau种类。因此，研究人员将表达R-NbF8-2或对照的TVA细胞裂解物和上清液引入TVS细胞，以诱导种子tau-venus聚集。结果显示，只有R-NbF8-2的表达减少了具有种子能力的tau种类。 为了研究R-Nb构建体是否能在大脑中降解蛋白质，他们选择了绿色荧光蛋白标记的组蛋白2B（H2B-GFP）作为目标，这是一种适合TRIM21介导降解的寡聚底物。研究团队生产了编码GFP靶向降解剂（R-NbvhhGFP4）和自切割T2A-mCherry报告基因的腺病毒1/2（AAV1/2）。TRIM21 RING和vhhGFP4被用作对照。所有构建体的表达均由通用CAG启动子驱动。AAV1/2被单侧注射到2个月大的转基因H2B-GFP小鼠的海马体中。30天后，取出海马体并制备注射侧和对侧的匀浆。GFP酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，注射编码R-NbvhhGFP4的AAV1/2导致注射侧海马体中的H2B-GFP减少。 为了确定降解是否能在更短时间内发生，研究人员比较了AAV1/2 R-NbvhhGFP4注射后10天和30天的H2B-GFP表达。结果显示，注射后10天，注射侧海马体中的H2B-GFP已经减少，与30天后的结果无差异，证实了R-Nb介导降解的快速性。荧光显微镜成像结果证实，构建体的表达主要局限于注射半球，且只有AAV1/2 R-NbvhhGFP4能够减少H2B-GFP的表达。因此，R-Nb构建体适合通过AAV递送，并可用于在体内降解中枢神经系统（CNS）中的寡聚蛋白底物。 他们接下来探究了通过AAV递送tau靶向的R-NbF8-2降解剂来对抗老年Tg2541小鼠中的tau病理。将携带R-NbF8-2的AAV1/2载体注射到5.5个月大的小鼠额叶皮层，30天或10天后，通过免疫荧光检查发现R-NbF8-2的表达主要限于注射的半球，并且与对侧相比，R-NbF8-2（但不是TRIM21 RING或仅F8-2）的表达减少了注射侧的AT8染色，pTau量减少，而总tau未受影响。 在原代神经元中，加入肝素组装的P301S tau纤维诱导了tau聚集。用携带R-NbF8-2的AAV1/2预处理减少了种子聚集，而且这种减少在神经元细胞体和树突区都可以观察到。相反，仅含TRIM21 RING或F8-2的AAV1/2预处理对种子tau聚集没有影响，尽管其表达与R-NbF8-2相似。R-NbF8-2的表达或AAV1/2载体本身不影响细胞活力。 R-NbF8-2在AAV1/2给药后仅几天就能减少老年小鼠中的tau病理，表明现有的神经元tau聚集物正在被降解。原代小鼠神经元被肝素组装的P301S tau聚集物处理并在原位纵向成像，发现种子聚集物可检测为明亮的venus斑点，固定后与AT8染色共定位。加入R-NbF8-2  AAV1/2后，大的tau-venus聚集物迅速清除。这些结果表明，R-NbF8-2表达可以预防和逆转神经元中的tau聚集，并迅速减少老年小鼠tau病模型中的tau病理。 接下来，他们将R-NbF8-2包装到AAV9P31中，并通过尾静脉注射到Tg2541小鼠体内，以评估其在减少tau病理方面的效果。在短期（10天）实验中，5.5月龄的小鼠接受了R-NbF8-2 AAV9P31治疗，10天后通过免疫荧光和Western blot评估tau病理。结果显示，R-NbF8-2 AAV9P31的注射导致额叶皮层中的磷酸化tau病理减少，而对照组小鼠则没有这种变化。此外，5.5月龄的小鼠脊髓中也出现了严重的tau病理，而R-NbF8-2  AAV9P31治疗组的小鼠脊髓tau病理也减少了。全脑裂解物的免疫印迹显示，R-NbF8-2 AAV9P31治疗的小鼠中磷酸化tau减少，而总tau未受影响。类似的结果也在脊髓裂解物中观察到。 在长期（2个月）实验中，4月龄的小鼠接受了R-NbF8-2 AAV9P31治疗。两个月后，研究人员从全脑裂解物中制备了十二烷基肌氨酸钠可溶和不可溶的部分。结果显示，R-NbF8-2 AAV9P31治疗的小鼠中，Ser396、Ser422和Ser202/Thr205（AT8）的磷酸化在不溶性tau中显著减少，不溶性总tau和可溶性总tau也有所减少，而对照组小鼠则没有这种变化。通过将脑裂解物递送到TVS细胞，他们发现R-NbF8-2 AAV9P31治疗减少了脑中的种子能力tau。这些结果表明，R-Nb策略可以在哺乳动物大脑中快速且持久地减少蛋白质聚集体。 综上，通过将TRIM21的E3 RING结构域与tau特异性纳米抗体融合，研究人员设计了R-NbF8-2等降解剂，从而能够快速清除细胞内的高磷酸化和种子能力tau聚集体，同时对天然可溶性tau几乎没有影响。R-Nb构建体的特异性靶向能力有助于研究蛋白质聚集体对神经退行性过程的影响。进一步研究R-Nb介导的聚集体消耗的表型后果和长期毒性分析将有助于评估其作为治疗手段的可行性。 参考文献 [1] Benn J, Cheng S, Keeling S, et al. Aggregate-selective removal of pathological tau by clustering-activated degraders. Science. 2024;385(6712):1009-1016. doi:10.1126/science.adp5186 [2] Mallery DL, McEwan WA, Bidgood SR, Towers GJ, Johnson CM, James LC. Antibodies mediate intracellular immunity through tripartite motif-containing 21 (TRIM21). Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(46):19985-19990. doi:10.1073/pnas.1014074107 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。